JPS59125895A - ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法 - Google Patents
ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法Info
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Classifications
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法及びそのク
ローニングに関するものである。
ローニングに関するものである。
ヒト生長ホルモンは、アミノ酸777個からなるポリイ
グチドであるが、治療用の天然物は少量にしか存在せず
大量入手が極めて困難である。そこで、最近遺伝子工学
により、一部合成遺伝子を用い、一部天然メッセンジャ
ーRN A (m RNA )より酵素的に合成した相
補的DNA(cDNA)を用いてヒト生長ホルモンを合
成する方法が報告されている[ D、V、 Goedd
el et al、 Nature 2g/、Sケグ
(/デ7デ)参照〕。この方法により天然rn RNA
を用いて合成したアミノ酸コダ〜/?/に対応する遺伝
子は、ヒトの脳下垂体において使用ざnでいる遺伝暗号
(アミノ酸コドン)を含むものであり、従ってこnを、
宿主である大腸菌中でベクターのプラスミドに組込んだ
ものからペグチドを合成きせる発現方法は最善のもので
はない。
グチドであるが、治療用の天然物は少量にしか存在せず
大量入手が極めて困難である。そこで、最近遺伝子工学
により、一部合成遺伝子を用い、一部天然メッセンジャ
ーRN A (m RNA )より酵素的に合成した相
補的DNA(cDNA)を用いてヒト生長ホルモンを合
成する方法が報告されている[ D、V、 Goedd
el et al、 Nature 2g/、Sケグ
(/デ7デ)参照〕。この方法により天然rn RNA
を用いて合成したアミノ酸コダ〜/?/に対応する遺伝
子は、ヒトの脳下垂体において使用ざnでいる遺伝暗号
(アミノ酸コドン)を含むものであり、従ってこnを、
宿主である大腸菌中でベクターのプラスミドに組込んだ
ものからペグチドを合成きせる発現方法は最善のもので
はない。
本発明者らは、上記の観点から、大腸菌中での発現に有
利である方法について鋭意研究を行った結果、本発明を
完成したものである。すなわち、本発明のヒト生長ホル
モンのアミノ酸791個に対応する遺伝子は、大腸菌に
おいて高頻度に使われるアミノ配コドンに従って合成し
た人工遺伝子であシ、大腸菌中での発現に極めて有利で
あると考えられる。
利である方法について鋭意研究を行った結果、本発明を
完成したものである。すなわち、本発明のヒト生長ホル
モンのアミノ酸791個に対応する遺伝子は、大腸菌に
おいて高頻度に使われるアミノ配コドンに従って合成し
た人工遺伝子であシ、大腸菌中での発現に極めて有利で
あると考えられる。
以下に本発明を説明する。
ヒト生長ホルモンのアミノ酸/9/個に対応する遺伝子
の塩基配列は、次のスキーム/に示すとおシである。
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rl:で
・”・′・ 8ふu B 3 U’c4 詫
巨職 に088 、− <← i’ efl j牡 だ4シ5璽ド 51、く
い ”!廿””’ L’ g 8 J E 3−
488 ?。〉 −賞日 :< ”41’ 5
%i ど ■ 5閃
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二4’Oig< 、 J 6 ’FJ 5 e”F
’ 5 ’31E Ul h < ’j Q、p
− ヨご拓 C訛1 ;す!b y= yごイコ
υo、 、g 二i:、、!宵と〜 5r「 5 イ、au η +、CI:JC< 8L
I P+−?<< P ?”I Q+ E
3 .3試 晃8 −3 、〉。。、 〉5i
扉 3井 、; 、lj;、j 681 52
?宅 ;、! 壮 、! 社 L
ご判メ、l<t−cb>uo a c+u
> ac+ 35″′囲〈 5韮−′
ジI よ・88 °・〈
/ 七 5 ′4”t 5 荘 5 瑚1 電
8 。
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〜I+t+−d+、〜−・− ¥城 侶−同 と リ 6藁 −96°浦ドく 5:1〈翳
註′ C豚 i関 し >9 社 ぢ−井 91 舗■ °P ? 蝙 >ミ に 謔ビ よ88 5荘 5■ 謔 >0 七 開基 1圓 ;騎−時耘a ニジと冒く 88、 5ξJI 起l −イトく 藁ど゛ : 8會 、ご、< 、■(I)’A
、B、C部分の合成 まず、全遺伝子を3つの部分、A、B、Cに分け、それ
ぞれ/A、39..2!;個のオリゴヌクレオチド鎖を
合成する(スキームコ′参照)。
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ぞれ/A、39..2!;個のオリゴヌクレオチド鎖を
合成する(スキームコ′参照)。
これらは、固相法によシ合成することができる。
固相法の担体としては、7%ジビニルベンゼンを含むポ
リスチレン樹脂(K、 Miyoshi at al。
リスチレン樹脂(K、 Miyoshi at al。
Nualeic Ac1ds Res、 g 、 左3
0’7(19g0)参照〕又はシリカゲル[M、D、
Matteucci、 M、 H,Caruthers
。
0’7(19g0)参照〕又はシリカゲル[M、D、
Matteucci、 M、 H,Caruthers
。
J、 Am、 Chem、 Soc、、 10.3
、3/g3(/ワgl)参照〕が好ましい。
、3/g3(/ワgl)参照〕が好ましい。
ダ種類のデオキシヌクレオシド、すなわち、デオキシシ
チジン、 デオキシアデノシン、 デオキシグアノシン
、 チミジンを、常法によシそnぞれ3′−コハク酸エ
ステルとする(Broka C,etal、 Nucl
eic Ac1ds Rss、 g 、!;’IA/
〜、!;’17/(/9KO)参照〕。こnを前記担
体のアミノ基と結合したもの(ヌクレオシド担体)を、
前記オリゴヌクレオチドの3′末端に用いる。次いで、
こ扛らの3′末末端ヌクレオシド体に、種々の組合せの
ジクレオチドを、縮合剤を用いて順次左′方向に結合さ
せる。縮合剤としては、メシチレンスルホニル−3−ニ
トロトリアゾリド(MSNT) 、2 、グ。
チジン、 デオキシアデノシン、 デオキシグアノシン
、 チミジンを、常法によシそnぞれ3′−コハク酸エ
ステルとする(Broka C,etal、 Nucl
eic Ac1ds Rss、 g 、!;’IA/
〜、!;’17/(/9KO)参照〕。こnを前記担
体のアミノ基と結合したもの(ヌクレオシド担体)を、
前記オリゴヌクレオチドの3′末端に用いる。次いで、
こ扛らの3′末末端ヌクレオシド体に、種々の組合せの
ジクレオチドを、縮合剤を用いて順次左′方向に結合さ
せる。縮合剤としては、メシチレンスルホニル−3−ニ
トロトリアゾリド(MSNT) 、2 、グ。
A’−)す4ソゾロビルベンゼンスルホニル−3−二ト
ロトリアゾリド(TPSNT)、 メチシチレンスルホ
ニルーテトラゾリド(MSTe)、 2,11゜乙−ト
リイングロビルベンゼンスルホニルーテトラゾリド(T
PSTe) 等が適当である。
ロトリアゾリド(TPSNT)、 メチシチレンスルホ
ニルーテトラゾリド(MSTe)、 2,11゜乙−ト
リイングロビルベンゼンスルホニルーテトラゾリド(T
PSTe) 等が適当である。
上記、ノヌクレオシドは、17種類のヌクレオシドの順
列により76種類が必要であるが、その合成法は、例え
ば次のスキームコに示す方法によることができる。
列により76種類が必要であるが、その合成法は、例え
ば次のスキームコに示す方法によることができる。
又、テトラヌクレオチドの場合は、上記得られたジヌク
レオチドを適宜組合せて、前記と同様に縮合剤を用いて
縮合することにより得られる。
レオチドを適宜組合せて、前記と同様に縮合剤を用いて
縮合することにより得られる。
ただし、DMTr は、+’、+’−ジメトキシトリ
チル基、B及びB′はA−N−ベンゾイルアデニン−q
−イル基、 +−N−ベンゾイルシトシン−/−イル基
、 J、N−イソ−ブチリルグアニン−ターイル基、
チミン−7−イル基から選ばれ、゛同−又は異ってもよ
い。MSN’Tはメシチレンスルホニル−3−ニトロト
リアゾリドを示す。
チル基、B及びB′はA−N−ベンゾイルアデニン−q
−イル基、 +−N−ベンゾイルシトシン−/−イル基
、 J、N−イソ−ブチリルグアニン−ターイル基、
チミン−7−イル基から選ばれ、゛同−又は異ってもよ
い。MSN’Tはメシチレンスルホニル−3−ニトロト
リアゾリドを示す。
得られり3′−ヌクレオシド担体と各種ジヌクレオチド
を出発物質として、前記オリゴヌクレオチドを合成する
が、C部分のオリゴヌクレオチド(U8)の場合を例に
して具体的に述べる。
を出発物質として、前記オリゴヌクレオチドを合成する
が、C部分のオリゴヌクレオチド(U8)の場合を例に
して具体的に述べる。
(d赫醇買替赫―夏C(U8)の合成例)−デオキシシ
チジン担体(前記ポリスチレン樹脂に担持したもの)を
ピリジン中室温で放置後、次の操作により反応を行う。
チジン担体(前記ポリスチレン樹脂に担持したもの)を
ピリジン中室温で放置後、次の操作により反応を行う。
l)デオキシシチジン担体をジクロロメタン−メタノー
ルで洗浄する。
ルで洗浄する。
、I)2%ベンゼンスルホン酸(ジクロロメタン−メタ
ノール)溶液を加えた後、同じ溶媒で洗浄し、操作をく
り返して発色の消えるまで行う。
ノール)溶液を加えた後、同じ溶媒で洗浄し、操作をく
り返して発色の消えるまで行う。
ン溶液を加え、減圧溶媒留去し、更にメシチレンスルホ
ニル−3−ニトロトリアゾリド(縮合剤)のピリジン溶
液を加え放置した後、ビリシンで洗浄する。
ニル−3−ニトロトリアゾリド(縮合剤)のピリジン溶
液を加え放置した後、ビリシンで洗浄する。
l/−)θ、/Mツメチルアミノビリノン溶液及び無水
酢酸を加えて放置後ピリジンにより洗浄する。
酢酸を加えて放置後ピリジンにより洗浄する。
このような操作を、各ジヌクレオチドについて順次繰り
返して7回行った後、樹脂を。、左Mトリメチルシリル
グアニノウムービリジンーコーアルドオキシメート[:
C,B、 Reere et al、。
返して7回行った後、樹脂を。、左Mトリメチルシリル
グアニノウムービリジンーコーアルドオキシメート[:
C,B、 Reere et al、。
Tetrahedron Lett、、2727(19
7g)参照〕のジオキサン−水の溶液中で振とぅする。
7g)参照〕のジオキサン−水の溶液中で振とぅする。
樹脂をピリジン−水で洗浄し、P液と洗液を合わせて減
圧濃縮し、残渣に濃アンモニア水を加え、加温する。ア
ンモニアを留去し、Dowex !r Oなどのピリジ
ニウム型樹脂を加え、樹脂をピリジン−水により洗浄し
、f液と洗液を合わせて濃縮する。濃縮液に少量の水を
加え酢酸エチルでオキシムを抽出除去する。水層を一定
量に希釈し、その1部を用いてジメトキシメチルトリチ
ル基の定t’を行って全体量を推定する。
圧濃縮し、残渣に濃アンモニア水を加え、加温する。ア
ンモニアを留去し、Dowex !r Oなどのピリジ
ニウム型樹脂を加え、樹脂をピリジン−水により洗浄し
、f液と洗液を合わせて濃縮する。濃縮液に少量の水を
加え酢酸エチルでオキシムを抽出除去する。水層を一定
量に希釈し、その1部を用いてジメトキシメチルトリチ
ル基の定t’を行って全体量を推定する。
次いで、水層を減圧乾固し、残渣にgθ%酢酸を加えた
後、溶媒留去し、残渣を水と酢酸エチルに溶解し、水層
を濃縮した後、DEAE−1ヨパ〜ル(Toyopea
rl)等を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行う
。
後、溶媒留去し、残渣を水と酢酸エチルに溶解し、水層
を濃縮した後、DEAE−1ヨパ〜ル(Toyopea
rl)等を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行う
。
適当な緩衝液中、食塩の濃度勾配で溶出し、U、V、
吸収によシオリゴヌクレオチドを検出した後、透析脱
塩する。HPLC(高速液体クロマトグラフィー:C1
8シリカゲル担体)及び−次元ホモクロマトグラフィー
で単一であることによシ純度を判定する。
吸収によシオリゴヌクレオチドを検出した後、透析脱
塩する。HPLC(高速液体クロマトグラフィー:C1
8シリカゲル担体)及び−次元ホモクロマトグラフィー
で単一であることによシ純度を判定する。
同様の操作を行って、C部分のU、〜U1□、L。
〜L11のオリゴヌクレオチドを合成する。同様にB部
分のU −U 、L −L 、A部分のU。〜1
901B U 、Lo−L、を合成する。
分のU −U 、L −L 、A部分のU。〜1
901B U 、Lo−L、を合成する。
このようにして得ら孔り各オリゴヌクレオチドを適当な
群、例えば三群に分け(B部分は四群、A部分は三群が
適当である。)3′−酵素的リン酸化とD N A リ
ガーゼによる結合反応を行う。
群、例えば三群に分け(B部分は四群、A部分は三群が
適当である。)3′−酵素的リン酸化とD N A リ
ガーゼによる結合反応を行う。
すなわち、例えば(7−32PIATPをそれぞれのオ
リゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドキナーゼと共に
、キナーゼ緩衝液中、37°Cでインキュベーションす
る。それから、ATP及びキナーゼを加え、更にインキ
ュベーション’tJ7eける。
リゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドキナーゼと共に
、キナーゼ緩衝液中、37°Cでインキュベーションす
る。それから、ATP及びキナーゼを加え、更にインキ
ュベーション’tJ7eける。
次いで加熱してキナーゼを不活性化する。
上記51−リン酸化した後、ATP、メルカプトエタノ
ールの一度を調節し、DNAリガーゼを加えて、37c
cでインキュベーションする。反応停止徒、生成したD
NA断片を、エタノールで沈殿させ、ダル電気泳動を行
って精製する。必・くして、C部分の のフラグメント群を得る。同様の操作を行って、B部分
、A部分の相当するフラグメント群を得る。
ールの一度を調節し、DNAリガーゼを加えて、37c
cでインキュベーションする。反応停止徒、生成したD
NA断片を、エタノールで沈殿させ、ダル電気泳動を行
って精製する。必・くして、C部分の のフラグメント群を得る。同様の操作を行って、B部分
、A部分の相当するフラグメント群を得る。
これらのフラグメント群を、再びDNAリガーゼを用い
て前記と同様に結合させて、本発明のヒト生長ホルモン
C部分の遺伝子を得る。次に得らnた各部分を制限酵素
を加えて処理する。これは必要でない両末端部分の塩基
配列を取シ除き、頭部及び尾部を、目的とする塩基配列
に揃えるためである。例えば、A部分ではC1a I
−Alu I系、B部分では、Hlnd m −Sal
I系、 C部分ではC1a I −Sal I系を用
いる。
て前記と同様に結合させて、本発明のヒト生長ホルモン
C部分の遺伝子を得る。次に得らnた各部分を制限酵素
を加えて処理する。これは必要でない両末端部分の塩基
配列を取シ除き、頭部及び尾部を、目的とする塩基配列
に揃えるためである。例えば、A部分ではC1a I
−Alu I系、B部分では、Hlnd m −Sal
I系、 C部分ではC1a I −Sal I系を用
いる。
かくして得られるA、B、C部分の塩基配列をスキーム
3.’I、!;にそれぞれ示す。又、以上の反応’iA
、 B 、 C部分それぞれについてスキーム乙、7
1gに示す。
3.’I、!;にそれぞれ示す。又、以上の反応’iA
、 B 、 C部分それぞれについてスキーム乙、7
1gに示す。
スキー
A 部
10
スキームク
8部分
スキームS
1!10
1(io
18(1190
+50
70
スキーム6
A部分
□←1 ←−−1□ □□□
□−−−−−−−タ′
スキーム7
B部分
一一一一μ−−←←−−ト←←←−トー←←M+−4M
−−一−4M −一一一 −一一一−LOL5
’−’10 Li2 ”18左′ スキーム、g (I ) (II)
(IIυC1ai /7乙””
5alIS′□ □ 左′ (6) 次に本発明の遺伝子の発現及び各部分の遺伝子
の増量に有用なベクタープラスミドについて説明する。
−−一−4M −一一一 −一一一−LOL5
’−’10 Li2 ”18左′ スキーム、g (I ) (II)
(IIυC1ai /7乙””
5alIS′□ □ 左′ (6) 次に本発明の遺伝子の発現及び各部分の遺伝子
の増量に有用なベクタープラスミドについて説明する。
クローニングに用いるベクターは、プラスミドpBR3
,22のEcoR1部位に、大腸菌のトリプトファン−
オペロン(trp −operon) のブロモ−タ
ー−オペレーターL −E (promotor −o
perator −L−E) の領域を含んでいる約
300個の塩基対を通常のpBR312の表現法におい
て時計回り(clockwlse)方向に挿入し、更に
制限酵素BAL3/でオ< o 7の下流側挿入点より
処理してtrpE のS、D、部位(リポソームが結合
し易い部位)の後部に、制限酵素C4aIリンカ−(l
inker) を結合したものである。この新規なベ
クタープラスミドを’ pCT / ″と呼称する。
,22のEcoR1部位に、大腸菌のトリプトファン−
オペロン(trp −operon) のブロモ−タ
ー−オペレーターL −E (promotor −o
perator −L−E) の領域を含んでいる約
300個の塩基対を通常のpBR312の表現法におい
て時計回り(clockwlse)方向に挿入し、更に
制限酵素BAL3/でオ< o 7の下流側挿入点より
処理してtrpE のS、D、部位(リポソームが結合
し易い部位)の後部に、制限酵素C4aIリンカ−(l
inker) を結合したものである。この新規なベ
クタープラスミドを’ pCT / ″と呼称する。
このようなプラスミドpCT /を有するようになった
菌株の代表例として、ニジエリチア・コリCT/(以下
、“CT/株″と称する。)を挙げることができる。
菌株の代表例として、ニジエリチア・コリCT/(以下
、“CT/株″と称する。)を挙げることができる。
上記の宿主菌株はE、Co11 K /2の誘導体KM
del 7.23 (str his rec A/ sup
gal ) (J、 Mol。
del 7.23 (str his rec A/ sup
gal ) (J、 Mol。
Blol、 (/97乙) io、2、’127−1I
39 参照)であシ、菌学的性質において大腸菌E、
Co1t K / :1株と全く変りがない。上記C
T/株は、昭和57年/2月6日付にて工業技術院微生
物工業技術研究所に究託され、その受託番号は、微工研
菌寄第6g77号(F’ERM P−tg/7)であ
る。
39 参照)であシ、菌学的性質において大腸菌E、
Co1t K / :1株と全く変りがない。上記C
T/株は、昭和57年/2月6日付にて工業技術院微生
物工業技術研究所に究託され、その受託番号は、微工研
菌寄第6g77号(F’ERM P−tg/7)であ
る。
得られたpCT/ プラスミドを制限酵素C1al
−8al I で切断し、前記合成したヒト生長ホルモ
ンC部分遺伝子フラグメントを挿入すると、ヒト生長ホ
ルモンの前記C部分遺伝子の発現及び増量に有用な新規
プラスミド−が得られる。この新規なプラスミドを’
pHGHC/ ’″と略称する。このようなグラスミド
1)HG)(C/を有するようになった菌株の代表例と
してニジエリシア・コIJ I(GHC/(以下、”H
GHC/株“と称する。)を挙げることができる。
−8al I で切断し、前記合成したヒト生長ホルモ
ンC部分遺伝子フラグメントを挿入すると、ヒト生長ホ
ルモンの前記C部分遺伝子の発現及び増量に有用な新規
プラスミド−が得られる。この新規なプラスミドを’
pHGHC/ ’″と略称する。このようなグラスミド
1)HG)(C/を有するようになった菌株の代表例と
してニジエリシア・コIJ I(GHC/(以下、”H
GHC/株“と称する。)を挙げることができる。
上記HGHC/ 株の宿主菌株は前記KM’7コ3で
あり、菌学的性質において前°記E、co目に/u株と
全く変りがなく、昭和57年/′2月6日付にて、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託され、その受託番号
は、微工研菌第6g76号(FERM P−Aid)で
ある。
あり、菌学的性質において前°記E、co目に/u株と
全く変りがなく、昭和57年/′2月6日付にて、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託され、その受託番号
は、微工研菌第6g76号(FERM P−Aid)で
ある。
又、前記8部分遺伝子フラグメントを、pBR3,:)
、2のHind III 、 Sal I切断部位に結
合すると、新規プラスミドが得られる。この新規プラス
ミドを″pHGHB2 ”と呼称する。このようなプラ
スミドpHGHB、2を有するようになった菌株の代表
例としてニジエリシア・コリHGHBユ (以下、”
)(GHB:を株″と称する)を挙げることができる。
、2のHind III 、 Sal I切断部位に結
合すると、新規プラスミドが得られる。この新規プラス
ミドを″pHGHB2 ”と呼称する。このようなプラ
スミドpHGHB、2を有するようになった菌株の代表
例としてニジエリシア・コリHGHBユ (以下、”
)(GHB:を株″と称する)を挙げることができる。
このプラスミドはヒト生長ホルモ78部分遺伝子の増量
((有用である。培養後プラスミドpHGHB、2を単
離し、Alu I 、Bgl I+処理してヒト生長ホ
ルモ78部分遺伝子を得る。一部をMaxam −G1
1bert法〔A、M。
((有用である。培養後プラスミドpHGHB、2を単
離し、Alu I 、Bgl I+処理してヒト生長ホ
ルモ78部分遺伝子を得る。一部をMaxam −G1
1bert法〔A、M。
Maxam &W、G11bert、 Proc、Na
tl、Acad、5ci−USC74、& 40 (/
97?) )により塩基配列をしらべ、構造が正しいこ
とを確認する。
tl、Acad、5ci−USC74、& 40 (/
97?) )により塩基配列をしらべ、構造が正しいこ
とを確認する。
以下に、これらのプラスミドを調製する方法について、
更に詳細に説明する。
更に詳細に説明する。
大腸菌トリシトファンオペロンは、培地中にトリプトフ
ァン除去又はインドールアクリル酸(IAA)添加によ
って誘導され、強力にメツセンジャーRNA (m R
NA )合成を開始する。
ァン除去又はインドールアクリル酸(IAA)添加によ
って誘導され、強力にメツセンジャーRNA (m R
NA )合成を開始する。
(1)まず、このプロモーター領域を、既知のプラスミ
ドptrpE’D4−/(Gene 9 27 (19
gの参照〕から、制限酵素Hinf I −Hinf”
Iで、約300塩基対をとり出す(第1図参照)。
ドptrpE’D4−/(Gene 9 27 (19
gの参照〕から、制限酵素Hinf I −Hinf”
Iで、約300塩基対をとり出す(第1図参照)。
第1図ニはptrpE D5−/のトリプトファンプロ
モーター領域のみを示す。b、p、は塩基対を示す。
モーター領域のみを示す。b、p、は塩基対を示す。
(2) 切り出した3θθb、p、の断片の両末端を
TりDNAIリメラーゼで修復した後EcoRIリンカ
−を介しプラスミドpBR322[: Gene 、2
ワ左(/q7り)]のEcoRI切断部に挿入する(第
2図参照)。
TりDNAIリメラーゼで修復した後EcoRIリンカ
−を介しプラスミドpBR322[: Gene 、2
ワ左(/q7り)]のEcoRI切断部に挿入する(第
2図参照)。
(3) 次に第2図の■のEcoRT部位のみを切断
し、TグDNAポリメラーゼで修復後、Tり[)NAり
が一ゼにより接着を行い、E’coRIで切断できない
ようにする。続いてpBR322のEcoRIとBam
H部位の間の領域(第2図の斜線部分)をも欠失させる
。このようにして得られるプラスミドを−pOcT、2
−9”と略称する。pOcTニー9は、tt、3Kb
(K base pair) を有し、細胞当りのコ
ピー数は、λθ〜30個/cell である(第3図
参照)。
し、TグDNAポリメラーゼで修復後、Tり[)NAり
が一ゼにより接着を行い、E’coRIで切断できない
ようにする。続いてpBR322のEcoRIとBam
H部位の間の領域(第2図の斜線部分)をも欠失させる
。このようにして得られるプラスミドを−pOcT、2
−9”と略称する。pOcTニー9は、tt、3Kb
(K base pair) を有し、細胞当りのコ
ピー数は、λθ〜30個/cell である(第3図
参照)。
0部分の12)から(3)のpQCT、2−9 を得
る工程は次のとおりである。
る工程は次のとおりである。
■のEcoR1部位
・・・・・・GAATT C・・・・・・・・・・
・・CTTAAG・・・・・・・・・・・・GAATT
AATTC・・・・・・・・・・・
・GAATTAATTC・・・・・・・・・・・・CT
TAATTAAG・・・・・・(4) p OCT
2−9 においてtrpE遺伝子はアミノ酸をコード
(cocle ) する領域の一部しか持たないので不
完全である。
・・CTTAAG・・・・・・・・・・・・GAATT
AATTC・・・・・・・・・・・
・GAATTAATTC・・・・・・・・・・・・CT
TAATTAAG・・・・・・(4) p OCT
2−9 においてtrpE遺伝子はアミノ酸をコード
(cocle ) する領域の一部しか持たないので不
完全である。
■のpBR,3,2,2ベクターとの接続部をEcoR
I テ切断する。
I テ切断する。
次いで、制限酵素BAL3/で3・Ob、pを除去し、
除去した部分に化学合成したC1al !Jンカーロ
ロI可q日をTグDNAりが−ゼを用いて挿入閉環する
(第グ図参照)。
除去した部分に化学合成したC1al !Jンカーロ
ロI可q日をTグDNAりが−ゼを用いて挿入閉環する
(第グ図参照)。
pCT/プラスミドのマツプ(map) を第6図に示
す。
す。
以上のようにして得られるプラスミドpC’T/は、マ
キサム及ギルバート法(Maxam & G11ber
t)法[PNAS7叉、界0 (/9クク)〕によって
分析確認する。
キサム及ギルバート法(Maxam & G11ber
t)法[PNAS7叉、界0 (/9クク)〕によって
分析確認する。
得られたプラスミドpCT/の特長は、次のとおりであ
る。
る。
1) ’1.a Kb を有し、シピー数は;θ〜
、J’ Ocellである。
、J’ Ocellである。
II) Clal部位に、ATGで始まるヌクレオチ
ド配列を有するDNA断片を組み込めば、ATG以下の
コドンで指令されるたんばく合成を行う。
ド配列を有するDNA断片を組み込めば、ATG以下の
コドンで指令されるたんばく合成を行う。
生成するたんばくは、単一のたんばくであり、ハイブリ
ツ) (hybrid) たんばくではない。
ツ) (hybrid) たんばくではない。
In) (−の調節は、トリプトファンプロモーター
による支配を受け、培地からトリプト7アンの除去、又
けIAAの添加によって強い形質発現ができる。
による支配を受け、培地からトリプト7アンの除去、又
けIAAの添加によって強い形質発現ができる。
IV) pBR32,27°ラスミド上に元来存在し
た非テトラサイクリン耐性(TcR)遺伝子を除去する
ために、EcoRI −BamH1部位の間〔第2図の
斜線部分〕を欠失させる。従ってトリプトファンプロモ
ーターからの強い転写が時計回りの方向に進入してきて
もテトラサイクリン遺伝子の最大発現による宿主へ悪影
警がない。
た非テトラサイクリン耐性(TcR)遺伝子を除去する
ために、EcoRI −BamH1部位の間〔第2図の
斜線部分〕を欠失させる。従ってトリプトファンプロモ
ーターからの強い転写が時計回りの方向に進入してきて
もテトラサイクリン遺伝子の最大発現による宿主へ悪影
警がない。
■)アンピシリン耐性(ApR)遺伝子は、そのままで
ある。
ある。
vl) 本プラスミドは、1)BR,3,22の有し
ていた増殖ドライブにより増殖し、大腸菌体内で安定に
保持される; (5) 得られたプラスミドpCT/を、C1alと
5allで切断し、ここで、先に合成した頭部末端がC
1ar 構造、尾部が5all 構造を有するヒト
生長ホルモンのC部分の遺伝子断片を挿入し、DNAり
が一部で接着すると、ヒト生長ホルモンの前記C部分遺
伝子の発現及び増量に有用な新規プラスミドT)HGH
C/を得ることができる(第6図参照)。
ていた増殖ドライブにより増殖し、大腸菌体内で安定に
保持される; (5) 得られたプラスミドpCT/を、C1alと
5allで切断し、ここで、先に合成した頭部末端がC
1ar 構造、尾部が5all 構造を有するヒト
生長ホルモンのC部分の遺伝子断片を挿入し、DNAり
が一部で接着すると、ヒト生長ホルモンの前記C部分遺
伝子の発現及び増量に有用な新規プラスミドT)HGH
C/を得ることができる(第6図参照)。
このpHGHC/は、り、1lKbを有し1.20〜3
0 / cellのコピー数を有する。pHGHC/を
含む菌(ニジエリチア・コリHGI(C/ )を培養後
、常法によりプラスミドを抽出し、次いでBgl ll
−8al Iで処理することにより、増量したC部分の
遺伝子を取り出すことができる。
0 / cellのコピー数を有する。pHGHC/を
含む菌(ニジエリチア・コリHGI(C/ )を培養後
、常法によりプラスミドを抽出し、次いでBgl ll
−8al Iで処理することにより、増量したC部分の
遺伝子を取り出すことができる。
次にプラスミドpBR32,2を、Hlnd ![1と
5allで切断し、ここで、先に合成した頭部末端がH
lnd III 構造、尾部が5all 構造を有
するヒト生長ホルモンのB部分の遺伝子断片を挿入し、
DNAりが一部で接着すると、ヒト生長ホルモンの前記
8部分遺伝子の増量に有用な新矧プラスミドpHGHB
Jを得ることができる・r第7図参照)。
5allで切断し、ここで、先に合成した頭部末端がH
lnd III 構造、尾部が5all 構造を有
するヒト生長ホルモンのB部分の遺伝子断片を挿入し、
DNAりが一部で接着すると、ヒト生長ホルモンの前記
8部分遺伝子の増量に有用な新矧プラスミドpHGHB
Jを得ることができる・r第7図参照)。
このpHGH8,2は、グ、0’Kb を有I71.2
0〜30 / cell の、コピー数を有する。
0〜30 / cell の、コピー数を有する。
p HG H8,2を含む菌(ニジエリチア・コリHG
HR,2)を培養後、常法によりプラスミドを抽出し、
次いでAlul −Bglllで処理することにより増
量したB部分の遺伝子を取り出すことができる。
HR,2)を培養後、常法によりプラスミドを抽出し、
次いでAlul −Bglllで処理することにより増
量したB部分の遺伝子を取り出すことができる。
(TH)8部分遺伝子とC部分遺伝子の結合前記プラス
ミドpHGHB、2より1月1d JBgl E1次い
でAlu +処理によって得られた:1g!;b−p−
を有する8部分遺伝子DNA (直接前記合成したB部
分から取り出す場合はAlu T−Rgl II処理で
よい)とプラスミドpHcHc/よりBgl n 、S
al I処理によって得られた//、3b、p、を有す
るC部分遺伝子DNAをDNAリガーゼによって結合し
、+lIx b、p、を有するB、C部分結合遺伝子を
得、これをアクリルアミドグ5ル電気泳動により単離す
る。
ミドpHGHB、2より1月1d JBgl E1次い
でAlu +処理によって得られた:1g!;b−p−
を有する8部分遺伝子DNA (直接前記合成したB部
分から取り出す場合はAlu T−Rgl II処理で
よい)とプラスミドpHcHc/よりBgl n 、S
al I処理によって得られた//、3b、p、を有す
るC部分遺伝子DNAをDNAリガーゼによって結合し
、+lIx b、p、を有するB、C部分結合遺伝子を
得、これをアクリルアミドグ5ル電気泳動により単離す
る。
0V′)ヒト生長ホルモン遺伝子の合成とプラスミドp
CT/への挿入Cff) 、 (TIT)で得られfc
A、B−C結合遺伝子DNAをD N A +7ガーゼ
により結合すると、5g1lb、p、を有するヒト生長
ホルモン遺伝子を得る。
CT/への挿入Cff) 、 (TIT)で得られfc
A、B−C結合遺伝子DNAをD N A +7ガーゼ
により結合すると、5g1lb、p、を有するヒト生長
ホルモン遺伝子を得る。
更に、これをC1al、5ail処理して、頭部、尾部
を目的の塩基配列に揃え、前記グラスミドpCT/のC
1al、5all切断部位に結合すると、本発明のヒト
生長ホルモンの遺伝子の発現及び増量に有用なベクター
プラスミドを得る。
を目的の塩基配列に揃え、前記グラスミドpCT/のC
1al、5all切断部位に結合すると、本発明のヒト
生長ホルモンの遺伝子の発現及び増量に有用なベクター
プラスミドを得る。
この新規なベクタープラスミドヲ”’ pHG)T−/
″′と呼称する(第3図参照)。
″′と呼称する(第3図参照)。
このようなプラスミドpHG)T−/を有するようなっ
た菌株の代表例として、ニジエリチア・コリHGT(−
/(以下、” T(GH−/株”と称する。)を挙げる
ことができる。
た菌株の代表例として、ニジエリチア・コリHGT(−
/(以下、” T(GH−/株”と称する。)を挙げる
ことができる。
上記HGH−/株の宿主菌株はE、Co11 K /
2の誘導体HB/θ/ [pro ’Ieu thi
”−1ac Y−hsd R−end A−recA−
rps L+20 ara−/41 gal KAx
yl−3mtl−/ 811pE 411I; R,M
eyer et、 al、 Methods菌学的性質
において大腸菌E、Co11 K /コ株と全く変シが
ない。上記HGH−/株は、委託のため昭和sg年7月
7U付にて工業技術院微生物工業技術研究所に郵送され
た(昭和!g年/月7日付和光郵便局書留郵便物引受番
号3!rλ)。
2の誘導体HB/θ/ [pro ’Ieu thi
”−1ac Y−hsd R−end A−recA−
rps L+20 ara−/41 gal KAx
yl−3mtl−/ 811pE 411I; R,M
eyer et、 al、 Methods菌学的性質
において大腸菌E、Co11 K /コ株と全く変シが
ない。上記HGH−/株は、委託のため昭和sg年7月
7U付にて工業技術院微生物工業技術研究所に郵送され
た(昭和!g年/月7日付和光郵便局書留郵便物引受番
号3!rλ)。
次に、これらのプラスミドpCT/あるいはpHGHC
/、pHGHB、2及びpHGH/を含む大腸菌を培養
し、その培養物よりプラスミドDNAを請判する方法に
ついて具体的に説明する。
/、pHGHB、2及びpHGH/を含む大腸菌を培養
し、その培養物よりプラスミドDNAを請判する方法に
ついて具体的に説明する。
/)調製性全般について
プラスミドDNAを得るためにはできるだけそのDNA
含量の高い菌体から出発する。菌体をおだやかに壊して
宿主染色体DNAを残し、細胞質内の物質をヌクレアー
ゼ活性を抑えた条件下で選択的に抽出し°Cから混入す
る蛋白質、R,N Aを除去し、次に宿主染色体DNA
断片を主K E B −CsC1遠心で除き、最後にオ
リゴヌクレオチドなどを除くと分子生物学的実験に使用
できる標品が得られる。
含量の高い菌体から出発する。菌体をおだやかに壊して
宿主染色体DNAを残し、細胞質内の物質をヌクレアー
ゼ活性を抑えた条件下で選択的に抽出し°Cから混入す
る蛋白質、R,N Aを除去し、次に宿主染色体DNA
断片を主K E B −CsC1遠心で除き、最後にオ
リゴヌクレオチドなどを除くと分子生物学的実験に使用
できる標品が得られる。
コ)培養
プラスミドを保持する大腸菌を例えばFRB(ポリ4デ
トン1011肉エキス/θg1NaCI 、2.左p
1必要ならイーストエキス、2gを加える;水/ /
Spnり、θ)培畑グθ0プに37史で通気培養する菌
がユ〜り×/θ / m1才で生えたところでクロラム
フェニコールを最終濃度で約/左0μfl/mノになる
ように加え、その寸ま37ヤでg〜76時間培養する。
トン1011肉エキス/θg1NaCI 、2.左p
1必要ならイーストエキス、2gを加える;水/ /
Spnり、θ)培畑グθ0プに37史で通気培養する菌
がユ〜り×/θ / m1才で生えたところでクロラム
フェニコールを最終濃度で約/左0μfl/mノになる
ように加え、その寸ま37ヤでg〜76時間培養する。
集菌後、数日内に処理するならば菌体をθ〜1lCCで
保存し、そうでない場合には一70実で凍結保存する。
保存し、そうでない場合には一70実で凍結保存する。
3)選択柚−出
培伴液1700 mlから集めた菌体(OA; −/、
5g)を約30−のTris −NaC1に懸濁し、容
器lIQ mlの冷却遠心機用遠心管に移し、’7、.
000rpm、’7分間遠心して沈殿させる。IO鑓の
TE−蔗糖を加えて゛懸濁し、0.0!;ml RNa
se 、 /fi/ IJゾチームを混ぜ、0ac5分
間放置する。その後:1mlの0.!;M EDTA
を加、<−、サラVCoc′C。
5g)を約30−のTris −NaC1に懸濁し、容
器lIQ mlの冷却遠心機用遠心管に移し、’7、.
000rpm、’7分間遠心して沈殿させる。IO鑓の
TE−蔗糖を加えて゛懸濁し、0.0!;ml RNa
se 、 /fi/ IJゾチームを混ぜ、0ac5分
間放置する。その後:1mlの0.!;M EDTA
を加、<−、サラVCoc′C。
70分間置く。この処理で懸濁液″は・、やや粘性をも
つ、これに/乙mlのLytic Mixjureを一
気に加え、ただちに遠心管の口を閉じて容器を数回反転
して全体を均一にする。懸濁液は透明で粘性をもった溶
菌液となる。このま−!Occで7s分間程度あるいは
それ以上放置後、0旬で73.000〜7g、0θ0r
prn、、30分間遠心する。
つ、これに/乙mlのLytic Mixjureを一
気に加え、ただちに遠心管の口を閉じて容器を数回反転
して全体を均一にする。懸濁液は透明で粘性をもった溶
菌液となる。このま−!Occで7s分間程度あるいは
それ以上放置後、0旬で73.000〜7g、0θ0r
prn、、30分間遠心する。
これでプラスミドDNAが含1れる上清とゲル状になっ
た宿主染色体DNAや細胞表面物質が含まれる沈殿に分
かれる。上清を静かに同じ大きさの遠心管に移す。液の
重さを計り、比重/として体積に概算する。約304の
clearedlysate が得られる。
た宿主染色体DNAや細胞表面物質が含まれる沈殿に分
かれる。上清を静かに同じ大きさの遠心管に移す。液の
重さを計り、比重/として体積に概算する。約304の
clearedlysate が得られる。
tl)&lJエチレングリコール(PEG)による濃縮
およびEB−CsC1平衡密度勾配遠心cleared
”、+ysate にその7710重骨のPEG粉
末および//10容量のkM NaC1を加え、マグネ
チツクスターラーで完全に溶解させる。マグネットを取
り除きOccで3時間以上/晩程度放置した後、10.
θOθrpm、10分間遠心するとうす茶色の粘稠な沈
殿が得ら力る。上溝には蛋白質とRNA断片の大半が含
まれているのでこれを傾けて捨てる。沈殿にはシラスミ
ドDNAが回収される。遠心管の口を下にして斜めにね
かして置き上清をできるだけ除く、ダθ01培養の標準
スケールから調製した場合、この沈殿f 、7 tni
のTEによく溶かしスビンコのりθ凍りは50番の遠心
管に移す。さらに少量のTEを加えて全体を正確にダ、
7U(比重/としてL74II!/)にする。これに5
−00g5−0O,0,3ml F B溶液を加えよく
混合する。多量、たとえばglの培養液から出発した場
合、前記処決に従って300dのcleared Iy
sate を調製し、PEGでDNAを沈殿させた段
階でいったんフェノール処理を施した方がよい。どのた
めに沈殿を/3;mlのTEに溶かし、/θmlの水飽
和フェノールを加えて乳化後、低速遠心して、2層に分
ける。上にくる水層を回収し、コ容のエタノールを加え
る。Qcc、、20分後10.θθθrpmで10分間
遠心し、上清をよく除き(沈殿が流出しなジケータ−内
で脱気によりアルコール分を除けばよい)、沈殿を9
ml (7j T E −5ark −osylによく
溶かし、さらに少量のT E −5ark −osyl
でq、sxyに調製する。これに/ 01! CsC1
、/ m1EB溶液を混ぜて1本の遠心管で遠心する。
およびEB−CsC1平衡密度勾配遠心cleared
”、+ysate にその7710重骨のPEG粉
末および//10容量のkM NaC1を加え、マグネ
チツクスターラーで完全に溶解させる。マグネットを取
り除きOccで3時間以上/晩程度放置した後、10.
θOθrpm、10分間遠心するとうす茶色の粘稠な沈
殿が得ら力る。上溝には蛋白質とRNA断片の大半が含
まれているのでこれを傾けて捨てる。沈殿にはシラスミ
ドDNAが回収される。遠心管の口を下にして斜めにね
かして置き上清をできるだけ除く、ダθ01培養の標準
スケールから調製した場合、この沈殿f 、7 tni
のTEによく溶かしスビンコのりθ凍りは50番の遠心
管に移す。さらに少量のTEを加えて全体を正確にダ、
7U(比重/としてL74II!/)にする。これに5
−00g5−0O,0,3ml F B溶液を加えよく
混合する。多量、たとえばglの培養液から出発した場
合、前記処決に従って300dのcleared Iy
sate を調製し、PEGでDNAを沈殿させた段
階でいったんフェノール処理を施した方がよい。どのた
めに沈殿を/3;mlのTEに溶かし、/θmlの水飽
和フェノールを加えて乳化後、低速遠心して、2層に分
ける。上にくる水層を回収し、コ容のエタノールを加え
る。Qcc、、20分後10.θθθrpmで10分間
遠心し、上清をよく除き(沈殿が流出しなジケータ−内
で脱気によりアルコール分を除けばよい)、沈殿を9
ml (7j T E −5ark −osylによく
溶かし、さらに少量のT E −5ark −osyl
でq、sxyに調製する。これに/ 01! CsC1
、/ m1EB溶液を混ぜて1本の遠心管で遠心する。
遠心は約20cc、3乙、C00rpmで/g〜36時
間行なう。遠心後ブレーキを使わずに停止させ、遠心管
を静かに取り出す。EBの色が遠心管の上部から底にか
けて薄くなっており密度勾配ができていることがわかる
う暗室でグラツクランデ(,3A Onm ) で照
らすと試料の下から/の位置にプラスミドccDNAの
バンド、上からAの位置にocおよび染色体断片のDN
Aのバンドが黄緑体に光って見える(/μy のDNA
があれば十分検出できる)。下のccDNAバンドを注
意してなるべく幅狭く回収する。
間行なう。遠心後ブレーキを使わずに停止させ、遠心管
を静かに取り出す。EBの色が遠心管の上部から底にか
けて薄くなっており密度勾配ができていることがわかる
う暗室でグラツクランデ(,3A Onm ) で照
らすと試料の下から/の位置にプラスミドccDNAの
バンド、上からAの位置にocおよび染色体断片のDN
Aのバンドが黄緑体に光って見える(/μy のDNA
があれば十分検出できる)。下のccDNAバンドを注
意してなるべく幅狭く回収する。
3)ゲル濾過法による除RNA 操作
T E N (/ OmMTris−塩酸緩衝液、/m
MEDTA、θ、/ M NaCl 、 pH7,り)
で平衡化した5epharose CL −II Bカ
ラム< 0.gx、:)、0ryrt>を用意する。こ
れにE B −CsCl 遠心で得たccDNA両分
(0,5〜0.g ml )をそのまま加え、TENで
自然流出法によ!llrル濾過を行なう。
MEDTA、θ、/ M NaCl 、 pH7,り)
で平衡化した5epharose CL −II Bカ
ラム< 0.gx、:)、0ryrt>を用意する。こ
れにE B −CsCl 遠心で得たccDNA両分
(0,5〜0.g ml )をそのまま加え、TENで
自然流出法によ!llrル濾過を行なう。
波長−左り皿における吸光度でモニターすると約3m/
のvoid volurneが流出したところでDNA
画分が出、遅れてR,N A画分、さらに続いて、FB
やCsC1が出てくる。DNA両分に相当する最初のピ
ークを集めてTEK透析するかエタノール沈殿で燃線す
るとともにエチジウムブロマイドを除く。こねてプラス
ミドDNAはほぼ純粋りものとして扱うことができる。
のvoid volurneが流出したところでDNA
画分が出、遅れてR,N A画分、さらに続いて、FB
やCsC1が出てくる。DNA両分に相当する最初のピ
ークを集めてTEK透析するかエタノール沈殿で燃線す
るとともにエチジウムブロマイドを除く。こねてプラス
ミドDNAはほぼ純粋りものとして扱うことができる。
以上の全工程を第g図に示→−0
以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明は何
らこれらに限定されるものではない。
らこれらに限定されるものではない。
実施例/(C部分のオリゴヌクレオチドU[l”UL’
、Lo〜L1.の合成) オリゴヌクレオチドの合成例 d配9に画もりJす■ユC(U8)の合成デオキシシチ
ジン担体(1層ユμmol/g前記ポリスチレン樹脂、
33rrQ)をぎリジソ゛φ−夜室温で放置し次のよう
な操作により縮合反応を行う。
、Lo〜L1.の合成) オリゴヌクレオチドの合成例 d配9に画もりJす■ユC(U8)の合成デオキシシチ
ジン担体(1層ユμmol/g前記ポリスチレン樹脂、
33rrQ)をぎリジソ゛φ−夜室温で放置し次のよう
な操作により縮合反応を行う。
用いるジヌクレオチドは各20mgである。最初に用い
るのはこの場合チミジンジヌクレオチド(スキームコ、
■、B=チミン−/−イル)である。
るのはこの場合チミジンジヌクレオチド(スキームコ、
■、B=チミン−/−イル)である。
s′方向に順次鎖を延長する。
操作/)ジクロロメタン−メタノール(り;3、V/V
)ニーにより3回洗滌。
)ニーにより3回洗滌。
2)コチベンゼンスルホン酸(ジクロロメタン−メチル
アルコール、7:3)溶液2miと2分間処理した後、
同じ混合溶媒で3回洗滌する操作を繰返して発色のなく
なることを確める。
アルコール、7:3)溶液2miと2分間処理した後、
同じ混合溶媒で3回洗滌する操作を繰返して発色のなく
なることを確める。
3)ビリシン、2m/により3回洗滌。
り)ジヌクレオチドのぎりシン溶液(O2/〜0・コゴ
)を加え溶媒を減圧留去する。
)を加え溶媒を減圧留去する。
、t>m合剤、メシチレンスルホニル−3−ニトロトリ
アゾリド(コOmg)のピリ・シン溶液(0,,2〜θ
、3m1)を加えSO分放置する。
アゾリド(コOmg)のピリ・シン溶液(0,,2〜θ
、3m1)を加えSO分放置する。
乙)ビリジンユmlにより2回洗滌。
7)0:1Mジメチルアミノピリジンのピリジン溶液C
1,gmt)および無水酢酸(θ、、2’d )を加え
70分間放置する。
1,gmt)および無水酢酸(θ、、2’d )を加え
70分間放置する。
g)ビリノン、2−により3回洗滌。
以」二の操作を各ジヌクレオチドについて計7回行った
後、樹脂をθ、&M)リメチルグアニジウムーピリジン
ーコーアルドオキシメート(C,B。
後、樹脂をθ、&M)リメチルグアニジウムーピリジン
ーコーアルドオキシメート(C,B。
Reere et al、、Tetrahedrn
Lett、、 、27.27(797g)〕の〕
ジオキサンー水1/)の溶液(/d)中3g時間振とう
する。樹脂を左θチビリジン水により洗滌しf液と洗液
を合せて減圧濃縮し、残渣に濃アンモニア水(13m1
)を加え密栓して夕S%でS時間加温する。アンモニア
を留去し、Dowex A; 0ピリジニウム型樹脂(
ユme )を加え、樹脂をSOチビリジン水により洗滌
し、P液と洗液を合せて濃縮する。濃縮液に少量の水を
加え酢酸エチルでオキシムを抽出して除く。水層を一定
量に希釈し、その一部を用いてジメトキシトリチル基の
定量を行い全体め量を推定する。ジメトキシトリチル基
の分子吸光係数を77、り0θとすると77、’lAユ
ニットから/、Ogμmolの阻オリゴヌクレオチドが
合成されたことがわかる。
Lett、、 、27.27(797g)〕の〕
ジオキサンー水1/)の溶液(/d)中3g時間振とう
する。樹脂を左θチビリジン水により洗滌しf液と洗液
を合せて減圧濃縮し、残渣に濃アンモニア水(13m1
)を加え密栓して夕S%でS時間加温する。アンモニア
を留去し、Dowex A; 0ピリジニウム型樹脂(
ユme )を加え、樹脂をSOチビリジン水により洗滌
し、P液と洗液を合せて濃縮する。濃縮液に少量の水を
加え酢酸エチルでオキシムを抽出して除く。水層を一定
量に希釈し、その一部を用いてジメトキシトリチル基の
定量を行い全体め量を推定する。ジメトキシトリチル基
の分子吸光係数を77、り0θとすると77、’lAユ
ニットから/、Ogμmolの阻オリゴヌクレオチドが
合成されたことがわかる。
水層を減圧乾固し残渣にgOチ酢酸/Qynlを加え:
15%、30分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢
酸エチ/ヒに溶解し、水層を濃縮した後、イオン交換ク
ロマトグラフィーにかける。イオン交換体はDEAE−
Toyopearl A!;O8を用いる。カラム(
θ、7 x 、2/(:m)につめ7M尿素、20mM
hリスー塩酸緩衝液(pH7,y)中、θ、/〜0.3
Mの食塩濃度勾配で溶出する。紫外線吸収によりオリ
ゴヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース膜を
用いて透析によシ脱塩し、A2..9 A 26oユニ
ツトを得る。HPLC(C18シO力rル担体)および
−次元ホモクロマトグラフィーで単一であることにより
純度を判定する。HPLCにおけるリテンションタイム
はdAAAGTTGAAACTTTC(U8の場合は/
/、7 分である。ホモクロマトグラフィーのRf値(
Rm;色素マーカー、ブロムフェノールブルーの動きに
対する相対値)は0.左/ である。
15%、30分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢
酸エチ/ヒに溶解し、水層を濃縮した後、イオン交換ク
ロマトグラフィーにかける。イオン交換体はDEAE−
Toyopearl A!;O8を用いる。カラム(
θ、7 x 、2/(:m)につめ7M尿素、20mM
hリスー塩酸緩衝液(pH7,y)中、θ、/〜0.3
Mの食塩濃度勾配で溶出する。紫外線吸収によりオリ
ゴヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース膜を
用いて透析によシ脱塩し、A2..9 A 26oユニ
ツトを得る。HPLC(C18シO力rル担体)および
−次元ホモクロマトグラフィーで単一であることにより
純度を判定する。HPLCにおけるリテンションタイム
はdAAAGTTGAAACTTTC(U8の場合は/
/、7 分である。ホモクロマトグラフィーのRf値(
Rm;色素マーカー、ブロムフェノールブルーの動きに
対する相対値)は0.左/ である。
展開溶媒はホモミックスI (E、 Jayet al
、INucleic Ac1ds Res、、 / 、
33/ (/q711.) ]を使用した。
、INucleic Ac1ds Res、、 / 、
33/ (/q711.) ]を使用した。
同様な反応を行ってU o = U12.’(’U’e
を除く)、LO−Lllに相当するオリゴ“ヌクレオ
チドを合成した。
を除く)、LO−Lllに相当するオリゴ“ヌクレオ
チドを合成した。
UO””’U12、LO〜L11のリテンションタイム
とRf値を第1表に示す・ 実施例、2(B部分のオリゴ“ヌクレオチドUO〜U1
9゜L ”LlBの合成) 実施例/と同様に反応を行って、B部分のU。
とRf値を第1表に示す・ 実施例、2(B部分のオリゴ“ヌクレオチドUO〜U1
9゜L ”LlBの合成) 実施例/と同様に反応を行って、B部分のU。
〜■J17.L−L18に相当するオリゴ“ヌクレオチ
ドを合成した。UO””−U19 ’ ” ”LlB
のりテンションタイムとRf=を第2表に示す。
ドを合成した。UO””−U19 ’ ” ”LlB
のりテンションタイムとRf=を第2表に示す。
実施例3(A部分のオリゴヌクレオチ、′ドUO”””
U7 +Lo〜L7の合成) 実施例/と同様に反応を行って、A部分のU。
U7 +Lo〜L7の合成) 実施例/と同様に反応を行って、A部分のU。
〜U7 s LO”、”、7 に相当するオリがヌク
レオチドを合成した。UO”’=U7 + LO〜L
7のリテンションタイムとRf値を第3表に示す。
レオチドを合成した。UO”’=U7 + LO〜L
7のリテンションタイムとRf値を第3表に示す。
実施例り(オリゴヌクレオチドの3′−酵素的リン酸化
とDNA りが−ゼによる結合反応) 実施例/で得られたC部分のオリゴヌクレオ看ドを 01 CIO(FIT)の三群に分け
て、それぞれの群につき次の反応を行った。
とDNA りが−ゼによる結合反応) 実施例/で得られたC部分のオリゴヌクレオ看ドを 01 CIO(FIT)の三群に分け
て、それぞれの群につき次の反応を行った。
スθθマイクロキューリーの〔γ−p IATP(:
S:’7’100 C1/mmol、Amersham
)オリゴヌクレオチド(70μ!りと3UのT+ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(宝酒造(株)製)をAOμlの
キナーゼ緩衝液(&θmM)リス−HC/、piざ、0
7’ 10mMMg(J2 / 10 mM ジチオ
スレイトール(DTT)/、1.mMス4ルミジン/θ
、/ MKCl )に溶解したものを混合し、37°C
でコ°θ分間インキュベートした。
S:’7’100 C1/mmol、Amersham
)オリゴヌクレオチド(70μ!りと3UのT+ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(宝酒造(株)製)をAOμlの
キナーゼ緩衝液(&θmM)リス−HC/、piざ、0
7’ 10mMMg(J2 / 10 mM ジチオ
スレイトール(DTT)/、1.mMス4ルミジン/θ
、/ MKCl )に溶解したものを混合し、37°C
でコ°θ分間インキュベートした。
それからATP(/7ナノモル)とT4’キナーゼ(/
U)を加え、更に7時間反応させた。ワθ(、り分間加
熱して、キナーゼを失活させた。
U)を加え、更に7時間反応させた。ワθ(、り分間加
熱して、キナーゼを失活させた。
これらの7ラグメントをアニールするため、反応混合物
を、DTTを除いたligation buffet(
66mM )リス−HC6、p)! 7.乙/6.乙m
MMgC/2/ / OmM DTT /θ−左mM
ATP )中で、70ocで一分間加熱し、それから
ゆっくり室温寸で冷却した。次にATPとDTTを、そ
れぞれ0.4’ mMと70mMの濃度で反応混合液に
加えた。反応混合液/3°Cに冷却後、TllDNAリ
ガーゼ(宝酒造(株)製)(/、、2U)を加え、73
時間同じ温度でインキュベートした。乙5’Cで左分間
加熱して反応を停止した。DNAの7ラグメントをエタ
ノールで沈殿させ、/θチアクリルアミドグル電気泳動
に付し、その後、ダルかへ抽出を行って精製した。
を、DTTを除いたligation buffet(
66mM )リス−HC6、p)! 7.乙/6.乙m
MMgC/2/ / OmM DTT /θ−左mM
ATP )中で、70ocで一分間加熱し、それから
ゆっくり室温寸で冷却した。次にATPとDTTを、そ
れぞれ0.4’ mMと70mMの濃度で反応混合液に
加えた。反応混合液/3°Cに冷却後、TllDNAリ
ガーゼ(宝酒造(株)製)(/、、2U)を加え、73
時間同じ温度でインキュベートした。乙5’Cで左分間
加熱して反応を停止した。DNAの7ラグメントをエタ
ノールで沈殿させ、/θチアクリルアミドグル電気泳動
に付し、その後、ダルかへ抽出を行って精製した。
それぞれ相当するフラグメントが、7.スμy(I群)
、?、、!、μg(■群)、7.2μ#(Tl1群)得
られた。ただし、■群のフラグメントについては、沈殿
によ9精製品が得られたので、電気泳動は行わなかった
。
、?、、!、μg(■群)、7.2μ#(Tl1群)得
られた。ただし、■群のフラグメントについては、沈殿
によ9精製品が得られたので、電気泳動は行わなかった
。
得らねたフラグメント(T) 、?、/、 fill
、 (II) 3.A fig及び@)7・、2 tt
9 を用い、上記と同様にリン酸化反応、結合反応を
行った後、制限酵素C1a + (ぺ−リンが−・マン
ハイム社f!l!! ) Il、S−ユニットを加えて
1.?7CCで乙時間インキュベートした。次いで、制
限#素Sal T (宝酒造(株)m)ixoユ=ット
、NaC1/3!; mM SD T T 5mMを加
えて37%で/g時間インキユペートシ、反応停止後、
DNAをエタノールで沈殿させ1.!i′%ポリアクリ
ルアミドデル電気泳動に付し、その後ダルから抽出を行
って精製した。この結果、第1図に示す本発明のヒト生
長ホルモンのB部分の遺伝子0.sμg を得た。
、 (II) 3.A fig及び@)7・、2 tt
9 を用い、上記と同様にリン酸化反応、結合反応を
行った後、制限酵素C1a + (ぺ−リンが−・マン
ハイム社f!l!! ) Il、S−ユニットを加えて
1.?7CCで乙時間インキュベートした。次いで、制
限#素Sal T (宝酒造(株)m)ixoユ=ット
、NaC1/3!; mM SD T T 5mMを加
えて37%で/g時間インキユペートシ、反応停止後、
DNAをエタノールで沈殿させ1.!i′%ポリアクリ
ルアミドデル電気泳動に付し、その後ダルから抽出を行
って精製した。この結果、第1図に示す本発明のヒト生
長ホルモンのB部分の遺伝子0.sμg を得た。
実施例り
実施例ユで得られたB部分のオリゴヌクレオチドを、
(1) (U) (III)
(TV)のダつの群に分けて、実施例グと
同様に反応を行つて、捷ずフラグメント/ Ottjj
(T群′)、 //μg (yr群)、ゲ0.2μg
(III群)、3μg(rv群)を得た。得られたフラ
グメント(■)3μ91αf)3μy1(■)3μg
及び(■)3μg を用い、実施例ダと同様にリン酸化
反応、結合反応を行った後、制限酵素H1ndlll(
宝酒造@)製)SOユニットを加えて37ccで1時間
インキュベートした。次いで、制限酵素Sal l (
宝酒造(株)製)/θ0ユニット、NaCA’ /!;
OmMを加えて37ccで79時間インキュベートし、
反応停止後、DNAをエタノールで沈殿させ1.3−%
ポリアクリルアミドケ゛ルー電気泳動に付1〜、その後
ゲルから抽出を行゛つて精製した。この結果、第1図に
示す本発明のヒト生長ホルモ78部分の遺伝子3μg
を得た。
(TV)のダつの群に分けて、実施例グと
同様に反応を行つて、捷ずフラグメント/ Ottjj
(T群′)、 //μg (yr群)、ゲ0.2μg
(III群)、3μg(rv群)を得た。得られたフラ
グメント(■)3μ91αf)3μy1(■)3μg
及び(■)3μg を用い、実施例ダと同様にリン酸化
反応、結合反応を行った後、制限酵素H1ndlll(
宝酒造@)製)SOユニットを加えて37ccで1時間
インキュベートした。次いで、制限酵素Sal l (
宝酒造(株)製)/θ0ユニット、NaCA’ /!;
OmMを加えて37ccで79時間インキュベートし、
反応停止後、DNAをエタノールで沈殿させ1.3−%
ポリアクリルアミドケ゛ルー電気泳動に付1〜、その後
ゲルから抽出を行゛つて精製した。この結果、第1図に
示す本発明のヒト生長ホルモ78部分の遺伝子3μg
を得た。
実施例乙
実施例3で得られたA部分のオリゴヌクレオチ03つの
群に分けて、実施例ダと同様に(ただしUOとLoはリ
ン酸化しない)反応を行い、次いで得られたフラグメン
トをそのまま用い、実施例yと同様にリン酸化反応、結
合反応を行った後、制限酵素Alu I (宝酒造(株
)製)/!;0ユニットを加えて、370cで/グ時間
インキュベートした。
群に分けて、実施例ダと同様に(ただしUOとLoはリ
ン酸化しない)反応を行い、次いで得られたフラグメン
トをそのまま用い、実施例yと同様にリン酸化反応、結
合反応を行った後、制限酵素Alu I (宝酒造(株
)製)/!;0ユニットを加えて、370cで/グ時間
インキュベートした。
次いで、制限酵素Alu T (宝酒造(株)製) /
、20ユニツト、NaC/ /3!rmM 、 D T
T !;mMを加えて37旬で711時間インキュベ
ートし、63旬でS分間処理し、次いでフェノールを加
えて除たん白して反応停止後、DNAをエタノールで沈
殿させ、/θチポリアクリルアミドrル電気泳動に付し
、その後ゲルから抽出を行って精製した。この結果、第
1図に示す本発明のヒト生長ホルモンA部分の遺伝子0
.3μg を得た。
、20ユニツト、NaC/ /3!rmM 、 D T
T !;mMを加えて37旬で711時間インキュベ
ートし、63旬でS分間処理し、次いでフェノールを加
えて除たん白して反応停止後、DNAをエタノールで沈
殿させ、/θチポリアクリルアミドrル電気泳動に付し
、その後ゲルから抽出を行って精製した。この結果、第
1図に示す本発明のヒト生長ホルモンA部分の遺伝子0
.3μg を得た。
プラスミドの調製
実施例7
(、)培 養
前記CT/株(微工研菌寄第1.g/7号)をPBB
(プリ4デトン10g、肉エキス/θg。
(プリ4デトン10g、肉エキス/θg。
NaCA! :A−左9 、必要ならイーストエキス2
gを加える;水/l、p■’7.0)培地goo−に3
7°Cで通気培養する。菌がλ〜3X / 08/dt
で生えたところマクロラムフェニコールを最終濃度約/
SOμl/atになるように加え、そのまま37°Cで
g〜76時間培養する。
gを加える;水/l、p■’7.0)培地goo−に3
7°Cで通気培養する。菌がλ〜3X / 08/dt
で生えたところマクロラムフェニコールを最終濃度約/
SOμl/atになるように加え、そのまま37°Cで
g〜76時間培養する。
(b) 抽 出
培伴液qθθmlから集めた菌体(θ、S〜/、5g)
を約30mlのTris −NaC6に懸濁し、容i
4’ Omlの冷却遠心機用遠心管に移し、’t、oo
。
を約30mlのTris −NaC6に懸濁し、容i
4’ Omlの冷却遠心機用遠心管に移し、’t、oo
。
rpm、7分間遠心して沈殿させる。70−のTE−蔗
糖を加えて懸濁し、θ、θj ml RNase、/−
リゾチームを混ぜ、ocCs分間放置する。
糖を加えて懸濁し、θ、θj ml RNase、/−
リゾチームを混ぜ、ocCs分間放置する。
その後、3. mlのθ、、tM EDTA を加え、
さらにO(,70分間置く。この処理で懸濁液はやや粘
性をもつ。これに/AmlのLytic Mixtur
eを一気に加え、ただちに遠心管の口を閉じて容器を数
回反転して全体を均一にする。懸濁液は透明で粘性をも
った溶菌液と々る。このままθccで/5分間程度ある
いはそれ以上放置後、θ(で/左、000〜/g、θ0
0 rpm、 30分間遠心する。
さらにO(,70分間置く。この処理で懸濁液はやや粘
性をもつ。これに/AmlのLytic Mixtur
eを一気に加え、ただちに遠心管の口を閉じて容器を数
回反転して全体を均一にする。懸濁液は透明で粘性をも
った溶菌液と々る。このままθccで/5分間程度ある
いはそれ以上放置後、θ(で/左、000〜/g、θ0
0 rpm、 30分間遠心する。
30分間遠心する。これでプラスミドDNAカニ含まれ
る上清とゲル状に々つだ宿主染色体DNAや#l胞売面
物質が含まれる沈殿に分かね、る。上′mを静かに同じ
大きさの遠心管に移す。液の重さを計り、比重/として
体積に概算する。約3Qmlのcleared 1ys
ate が得られる。
る上清とゲル状に々つだ宿主染色体DNAや#l胞売面
物質が含まれる沈殿に分かね、る。上′mを静かに同じ
大きさの遠心管に移す。液の重さを計り、比重/として
体積に概算する。約3Qmlのcleared 1ys
ate が得られる。
用いた試薬は、それぞれ次のものを示す。
Tris −NaCr: / OmM Tris−塩酸
緩衝液、0、 /’f’ M NaC+!、pHg 。
緩衝液、0、 /’f’ M NaC+!、pHg 。
TE−蔗糖:8〕蔗糖(w/v )、30 rnMTr
is−塩酸緩衝液、1mM EDTA、 pHgo リゾチーム:10■/ mlリゾチーム、θ、Q3−M
Tris−塩酸緩衝液、pHg 0 θ、りMEDTA: pHgo RNase : 0−011 M酢酸緩衝液pH
、tに10■/ mlめ濃度に溶かし、/θθ実 でS分間加熱処理する。
is−塩酸緩衝液、1mM EDTA、 pHgo リゾチーム:10■/ mlリゾチーム、θ、Q3−M
Tris−塩酸緩衝液、pHg 0 θ、りMEDTA: pHgo RNase : 0−011 M酢酸緩衝液pH
、tに10■/ mlめ濃度に溶かし、/θθ実 でS分間加熱処理する。
Ly t、i cλ41xture : 0−/ %
Triton X −/θθ、!; OmM Tris
−塩酸緩衝液、62、Ar mM EDTA、 pHざ
。
Triton X −/θθ、!; OmM Tris
−塩酸緩衝液、62、Ar mM EDTA、 pHざ
。
(C) ポリエチレングリコール(PEG)による濃
縮およびE R−CsC/ 平衡密度勾配遠心clea
red 1Ysate にその4重量のPEG粉末お
よび4容量の3 M NaC1を加え、マグネチツクス
ターラーで完全に溶解させる。マグネットを刺り除きθ
旬で3時間以上/晩8度放置した後、10.00Orp
m、 / 0分間遠心するとうす茶色の粘枯々沈殿が得
られる。上清には蛋白質とRNA断片の大半が含まれて
いるのでこれを傾けて捨てる。沈殿にはプラスミドDN
Aが回収される。
縮およびE R−CsC/ 平衡密度勾配遠心clea
red 1Ysate にその4重量のPEG粉末お
よび4容量の3 M NaC1を加え、マグネチツクス
ターラーで完全に溶解させる。マグネットを刺り除きθ
旬で3時間以上/晩8度放置した後、10.00Orp
m、 / 0分間遠心するとうす茶色の粘枯々沈殿が得
られる。上清には蛋白質とRNA断片の大半が含まれて
いるのでこれを傾けて捨てる。沈殿にはプラスミドDN
Aが回収される。
遠心管の口を下にして斜めにねかして置き上清をできる
だけ除く、400ml培養の標準スケールから調製した
場合、この沈殿を3dのTEによく溶かしスぎンコの1
Io−+たは30番の遠心管に移す。さらに少量のTE
を加えて全体を正確にグ、76g (比重/としてグ、
り乙ml ) にする。
だけ除く、400ml培養の標準スケールから調製した
場合、この沈殿を3dのTEによく溶かしスぎンコの1
Io−+たは30番の遠心管に移す。さらに少量のTE
を加えて全体を正確にグ、76g (比重/としてグ、
り乙ml ) にする。
これに!;−0011C8Cl、 0.タブEB溶液を
加えよく混合する。多量、たとえばgeの培養液から出
発した場合、前記処決に従って300m1のC1ear
ed 1ysate を調製し、PEGでDNAを沈
殿させた段階でいったんフェノール処理を施した方がよ
い。このために沈殿を/II/のTEに溶かし、/Qm
lの水飽和フェノールを加えて乳化後、イ氏速遠心して
、2層に分ける。上にくる水層を回収し、コ容のエタノ
ールを加える。θ℃1.20分後10 、00Or p
mで10分間遠心し、上清をよく除き(沈殿が流出しな
いよう釦注意して倒立しておくか、あるいはデシケータ
−内で脱気によりアルコール分を除けばよい)、沈殿を
qmtのTE −5arkosY1によく溶かし、さら
に少量のTE −5arkosy1で7.忙gに調整す
る。こ力、に/ 01 C5CA’ 、 / m1E
B溶液を混ぜてj本の遠心管で遠心する。
加えよく混合する。多量、たとえばgeの培養液から出
発した場合、前記処決に従って300m1のC1ear
ed 1ysate を調製し、PEGでDNAを沈
殿させた段階でいったんフェノール処理を施した方がよ
い。このために沈殿を/II/のTEに溶かし、/Qm
lの水飽和フェノールを加えて乳化後、イ氏速遠心して
、2層に分ける。上にくる水層を回収し、コ容のエタノ
ールを加える。θ℃1.20分後10 、00Or p
mで10分間遠心し、上清をよく除き(沈殿が流出しな
いよう釦注意して倒立しておくか、あるいはデシケータ
−内で脱気によりアルコール分を除けばよい)、沈殿を
qmtのTE −5arkosY1によく溶かし、さら
に少量のTE −5arkosy1で7.忙gに調整す
る。こ力、に/ 01 C5CA’ 、 / m1E
B溶液を混ぜてj本の遠心管で遠心する。
遠心は約コθヤ、3A、C00rpm で/g〜36
時間行々時間連々後ブレーキを使わずに停止させ、遠心
管を静゛かに取シ出す。EBの色が遠心管の上部から底
にかけて薄くなっており密度勾配ができていることがわ
かる。暗室でブラックランデ(3乙Onm ) で照
らすと試料の下からλの位置にプラスミドccDNAの
・ぐンド、上から/の位置にOe および染色体断片の
DNAのバンドが黄緑1体に光って見える(/μy の
D N Aがあれば十分検出できる)。下のccDNA
バンドを注意してなるべく幅狭く回収する。
時間行々時間連々後ブレーキを使わずに停止させ、遠心
管を静゛かに取シ出す。EBの色が遠心管の上部から底
にかけて薄くなっており密度勾配ができていることがわ
かる。暗室でブラックランデ(3乙Onm ) で照
らすと試料の下からλの位置にプラスミドccDNAの
・ぐンド、上から/の位置にOe および染色体断片の
DNAのバンドが黄緑1体に光って見える(/μy の
D N Aがあれば十分検出できる)。下のccDNA
バンドを注意してなるべく幅狭く回収する。
用いた試薬は、それぞれ、次のものを示す。
、+q IJエチレングリコール(PEG) AOθ0
:7級の粉末でよい。
:7級の粉末でよい。
3 M NaC1、Cs C1固体。
EB溶液:エチジウムブロマイドを水に対してL乙7
m9 / ml VCなるよう?1lJl、光をさえぎ
ったビンに入れlI旬で保存。
m9 / ml VCなるよう?1lJl、光をさえぎ
ったビンに入れlI旬で保存。
T E ; / OmM Tris−塩酸緩衝液、/m
ME D T A 、 pH7,ゲ。
ME D T A 、 pH7,ゲ。
TE −5arkosyl : / OrnM Tri
s=塩酸緩衝液、/ mM EDTA、 0−.3g
%5odiurn N−Lauroyl Rarkosinate 、 pH7,tI。
s=塩酸緩衝液、/ mM EDTA、 0−.3g
%5odiurn N−Lauroyl Rarkosinate 、 pH7,tI。
((1) rル濾過法による除RN A 41v!作
TEN(/θr1M Tris−塩酸緩衝液、/ mM
E D T A 、 0./ MNaCl、 pH7,
1りで平衡化した5epharose CL −lIB
カラム(o、gxxoc−m>を用意する。これにEB
−CsCl遠心で得たc c DNA画分(θ、s〜θ
、gml)をそのま捷加え、TENで自然流出法により
rル濾過を行なう。波長、2 g ’I nmにおける
吸光度でモニターすると約3 mlのvoid vol
umeが流出したところでDNA両分が出、遅れてRN
A画分、さらに続いてEBやC8Clが出てくる。DN
A画分に和尚する吊初のピークを集めてTEに透析する
かエタノール沈殿で濃縮するとともにエチジウムブロマ
イドを除くと約700μg のプラスミドpcT/が得
られた。
TEN(/θr1M Tris−塩酸緩衝液、/ mM
E D T A 、 0./ MNaCl、 pH7,
1りで平衡化した5epharose CL −lIB
カラム(o、gxxoc−m>を用意する。これにEB
−CsCl遠心で得たc c DNA画分(θ、s〜θ
、gml)をそのま捷加え、TENで自然流出法により
rル濾過を行なう。波長、2 g ’I nmにおける
吸光度でモニターすると約3 mlのvoid vol
umeが流出したところでDNA両分が出、遅れてRN
A画分、さらに続いてEBやC8Clが出てくる。DN
A画分に和尚する吊初のピークを集めてTEに透析する
かエタノール沈殿で濃縮するとともにエチジウムブロマ
イドを除くと約700μg のプラスミドpcT/が得
られた。
実施例g
前記T(GHC/株(微工研菌寄x<bgib号)を、
実施例7と同様に培養□及び後処理を行って、プラスミ
ドpT(GHC/を約lθ0)tg 得た。
実施例7と同様に培養□及び後処理を行って、プラスミ
ドpT(GHC/を約lθ0)tg 得た。
実施例ヲ
前記HGHBJ株を、実施例7と同様に培養及び後処理
を行って、プラスミドpHGT(:lを約/、IOμ2
得た。
を行って、プラスミドpHGT(:lを約/、IOμ2
得た。
実施例/θ
B部分遺伝子(/μg)・とC部分遺伝子(/μg)を
前記1igation パシファー中TqDNAリガ
ーゼ(宝酒造(株)製)(&U)を加え70時間、コθ
%でインキュベートし、6!rccで3分間加熱して反
応を停止した。得られたB、C部分結合遺伝子フラグメ
ントをエタノールで沈殿させ、制限酵素5ail(宝酒
造(株)製)(50’U)を加え、577(で9時間イ
ンキュベートした。次いで制限酵素Alu 1 (宝酒
造(株)製)(/、M7U)を加えて、37旬で3時間
インキュベートし、A&’Cf&分間処理して反応を停
止した。得られたDNAをエタノールで沈殿させ、10
%#リアクリルアミドrル電気泳動に付し、その後、ゲ
ルから抽出を行って精製し、B、C部分結合遺伝子θ、
75μgを得た。
前記1igation パシファー中TqDNAリガ
ーゼ(宝酒造(株)製)(&U)を加え70時間、コθ
%でインキュベートし、6!rccで3分間加熱して反
応を停止した。得られたB、C部分結合遺伝子フラグメ
ントをエタノールで沈殿させ、制限酵素5ail(宝酒
造(株)製)(50’U)を加え、577(で9時間イ
ンキュベートした。次いで制限酵素Alu 1 (宝酒
造(株)製)(/、M7U)を加えて、37旬で3時間
インキュベートし、A&’Cf&分間処理して反応を停
止した。得られたDNAをエタノールで沈殿させ、10
%#リアクリルアミドrル電気泳動に付し、その後、ゲ
ルから抽出を行って精製し、B、C部分結合遺伝子θ、
75μgを得た。
実施例//
B部分とC部分遺伝子の結合遺伝子0.7μgとA部分
の遺伝子θ、/μI をTllDNAりが一部(全酒造
@)製)jUを加え、前記11gationバッファ中
、70時間、20ccでインキュベートしたt3旬で3
分間加熱して反応を停止点せた後、得られたDNAフラ
グメントをエタノールで沈殿させ、制限酵素C1a I
(ペーリンガーマンハイム社製)/3Uを加え、37
cc、、3時間インキュベートした。次いで制限酵素S
at T (全酒造(株)製)左θU 、 NaC1/
7 j mM、 β−EtSH7mMを加えて、更
に37ocで3時間インキュベートシ、上記と同様に反
応停止後DNAをエタノールで沈殿させ、本発明のヒト
生長ホルモン遺伝子を得た。これは、そのまま次のプラ
スミドの挿入に用いた。
の遺伝子θ、/μI をTllDNAりが一部(全酒造
@)製)jUを加え、前記11gationバッファ中
、70時間、20ccでインキュベートしたt3旬で3
分間加熱して反応を停止点せた後、得られたDNAフラ
グメントをエタノールで沈殿させ、制限酵素C1a I
(ペーリンガーマンハイム社製)/3Uを加え、37
cc、、3時間インキュベートした。次いで制限酵素S
at T (全酒造(株)製)左θU 、 NaC1/
7 j mM、 β−EtSH7mMを加えて、更
に37ocで3時間インキュベートシ、上記と同様に反
応停止後DNAをエタノールで沈殿させ、本発明のヒト
生長ホルモン遺伝子を得た。これは、そのまま次のプラ
スミドの挿入に用いた。
実施例7.2
前記プラスミドpCT/ /θμ11緩衝液(3□mM
)リス−HC/ o pH7,、t)、(,7m
Mβ−E t SH)/θμi 、水30.73μl
、制限酵素C1a E (ヘーリンガーマンハイム社與
)9U(総量30μ))を加え、37(で左〜A時間時
間インキュトート。その後、θ1.2Mβ−EtSH3
tilS!rM−Nacl 2ttl制限酵素Sal
g 2θU、水/ ml (総量/ Oalj を加
工、更に37°Cで、/夜インキュベーションした。
)リス−HC/ o pH7,、t)、(,7m
Mβ−E t SH)/θμi 、水30.73μl
、制限酵素C1a E (ヘーリンガーマンハイム社與
)9U(総量30μ))を加え、37(で左〜A時間時
間インキュトート。その後、θ1.2Mβ−EtSH3
tilS!rM−Nacl 2ttl制限酵素Sal
g 2θU、水/ ml (総量/ Oalj を加
工、更に37°Cで、/夜インキュベーションした。
次いでフェノールを加えて逆抽出した後DNAをエタノ
ールで沈殿させ、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に付した。その後、低融点アガロースゲルに、上記電気
泳動のバンドを移し2、バンド・トランスファー抽出を
行い、はぼ定量的に、開環したプラスミド(第6同左か
ら二番目参照)を得た。次いで実施例//で得られたヒ
ト生長ホルモン遺伝子と、上記開環したプラスミド及び
TllDNAりが一部3Uを、前記11gation
バッファー中に加え、20Oc、1時間反応させて、
ヒト生長ホルモン遺伝子を挿入した(プラスミドpHG
H/)次いで、前記ニジエリチア・コリHB10/ (
宿主菌株)を、実施例りと同様に、O,D O,θ
6〜0.θg°650 (〜3 X / 08 cell/ ml )tで培養
し、集菌した。
ールで沈殿させ、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に付した。その後、低融点アガロースゲルに、上記電気
泳動のバンドを移し2、バンド・トランスファー抽出を
行い、はぼ定量的に、開環したプラスミド(第6同左か
ら二番目参照)を得た。次いで実施例//で得られたヒ
ト生長ホルモン遺伝子と、上記開環したプラスミド及び
TllDNAりが一部3Uを、前記11gation
バッファー中に加え、20Oc、1時間反応させて、
ヒト生長ホルモン遺伝子を挿入した(プラスミドpHG
H/)次いで、前記ニジエリチア・コリHB10/ (
宿主菌株)を、実施例りと同様に、O,D O,θ
6〜0.θg°650 (〜3 X / 08 cell/ ml )tで培養
し、集菌した。
これに前記得られたプラスミド及びSθnIM CaC
l2を加え、0°Cで30分間処理してトランス7オー
ムした。アン2シリン(Ap) J Oμ、i7 /
mlを含む寒天培地上に、)ランスフオームした菌を植
え、ApRの細胞を選定し、集めた。かくして、本発明
のヒト生長ホルモン遺伝子を含むプラスミドpHGH/
を含む菌、ニジエリテア・コリFT G )J /
を得た。
l2を加え、0°Cで30分間処理してトランス7オー
ムした。アン2シリン(Ap) J Oμ、i7 /
mlを含む寒天培地上に、)ランスフオームした菌を植
え、ApRの細胞を選定し、集めた。かくして、本発明
のヒト生長ホルモン遺伝子を含むプラスミドpHGH/
を含む菌、ニジエリテア・コリFT G )J /
を得た。
実施例/3
前記HGH/株(昭和sg年7月7日付和光郵便局書留
郵便物引受番号3左2)を実施例7と同様に培養及び後
処理を行って、プラスミドpHGH/を約/り0μg得
た・
郵便物引受番号3左2)を実施例7と同様に培養及び後
処理を行って、プラスミドpHGH/を約/り0μg得
た・
第7図は、プラスミドptrpED 3− /のトリプ
トファンプロモーター領域から切り出される約30θの
塩基対を示す模式図であり、第2図は切り出された3θ
Oの塩基対を、リンカ−を介してシラスミドpBR32
2のEcoRI 切断部に挿入した状態を示す模式図
であり、汝3図は、プラスミドpoc’rx −9の模
式図であり、第グ図■はプラスミドpOcT2−9から
プラスミドpCT/ を合成する経路を示す模式図、
■はの部分の拡大詳′踊図、■は0部分の拡大詳細図で
あり、第夕図IはプラスミドpCT/のマツプを示し、
■は0部分の拡大詳細図であり、第6図はプラスミドp
CT/からプラスミドp)(GHC/を合成する経路を
示す模式図であり、第7図は、プラスミドpBR3,2
−からプラスミドpHGHBuを合成する経路を示す模
式図であり、第g図は、本発明方法によりヒト生長ホル
モン遺伝子を合成する全経路を示す模式図である。 手続補正書(方式) 1 事イ′1の表示 昭和 5g 年 特4′「願
第 76 グ 号2 発明の名称 ヒト生長
ホルモン遺伝子の合成法j3 補正をする省゛ 事件との関係 出願人 名称 (679)理化学研究所 4、代理人 5、補正命令の日付 昭泪11’年lA月!乙日6、
補正の対象 明細1甫 全図面■、小事件表示 昭
和j♂年特許願第 タ乙7 号2、発明の名称 ヒ
ト生長ホルモン遺伝子の合成法3 補正をする者 事件との関係 出屡1人 名称(679)理化学研究所 4代理人 7 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄8
補正の内容 、て1て]キ\、(1
)昭和jg年j月72日付提出の全文訂正明細書の記載
を下表のとおシ訂正する。 (2)同書第37貞乙行の1引受番号33.2)。′の
次に下記の文を加入する・ 「上記HGH−/株の受託番号は機工′研菌寄第乙と6
を号(FERM P−乙ど6乙)(受託日昭和よざ年
り月/θ日)である。」 (3)同書第乙0頁/行の130分間遠心する。、′を
削除する。 添付書類 (1) 微生物受託証 (2)微生物寄託証明願及び証明書 昭和 年 月 日 4.7.71 ”1“1官 若 杉 和 夫
ヶ3、補正ヤする者 事件との関係 出願人 名称 (679)理化学研究酒 4、代理人 7 補正の対象 明矧1書の発明の詳a1なIv52
BAの欄8、補j「の内容 −1
−′″黴゛。 ・°$3庁“〜 書第32頁第6行とml−行の間に次の文章を挿入する
。 「本発明のヒト生長ホルモンの遺伝子の発現は、通常の
方法によシ行うことができる。すなわち、カザアミノ酸
、グルコース等を含む培地で、30〜37℃でインキュ
ベートシ、菌体濃度が一定の値(例えば0D66o〜0
.θ): 、5’ X / 07celll / ml
) VCなった時、trpプロモーターのインデユー
ザーであるβ−インドールアクリル酸等′ft加工、更
にインキュベートシ続ける。その後、菌体濃度が一定値
に乏った時(例えば、3.3 X / Ocell /
vt )、集菌、リゾチーム等による溶菌処理後、ラジ
オイムノアッセイ法によって)IGH抗体への結合活性
でタンパク量を求めることができる。」(2)同明細書
第6r頁第1I行と第1.l!行の間に次の文章を挿入
する。 「実施例/≠ 実施例/、2で得られた・8087株(微工研菌寄第6
に乙6号)をjψターo、j%カザアミノ酸−〇、、2
9(、グルコース培地で、37℃でインキュベートシ、
OD 〜0.0:2CJX10’60 cell /lni )になった時、β−インドールア
クリル酸(IAA : trpプロモーターのインデュ
ーザー〕を添加しく )Juえない場合は、等量のエタ
ノールfr刀11える〕、更に、インキュベートを続け
、OD −0,/〜0./ / (3,6X60 / Ocell/ld )にlった時に集菌した。 集菌した細胞をリゾチームで溶菌し、得られた溶菌物を
PHADEBAS :ヒト生長ホルモン(HG H)φ
アッセイ・キットを用いて調べた。 Ha HM、体の結合しているペーパm−ディスクに、
この゛溶菌物の希釈液を加え、反応後、更に[IIHG
H抗体を加え反応した。標準曲線から、HGH抗体への
結合活性で、タンパク■を求めると第4L表のような結
果を得た。なお、CT/株も同様な条件にて反応を行い
、比較した。
トファンプロモーター領域から切り出される約30θの
塩基対を示す模式図であり、第2図は切り出された3θ
Oの塩基対を、リンカ−を介してシラスミドpBR32
2のEcoRI 切断部に挿入した状態を示す模式図
であり、汝3図は、プラスミドpoc’rx −9の模
式図であり、第グ図■はプラスミドpOcT2−9から
プラスミドpCT/ を合成する経路を示す模式図、
■はの部分の拡大詳′踊図、■は0部分の拡大詳細図で
あり、第夕図IはプラスミドpCT/のマツプを示し、
■は0部分の拡大詳細図であり、第6図はプラスミドp
CT/からプラスミドp)(GHC/を合成する経路を
示す模式図であり、第7図は、プラスミドpBR3,2
−からプラスミドpHGHBuを合成する経路を示す模
式図であり、第g図は、本発明方法によりヒト生長ホル
モン遺伝子を合成する全経路を示す模式図である。 手続補正書(方式) 1 事イ′1の表示 昭和 5g 年 特4′「願
第 76 グ 号2 発明の名称 ヒト生長
ホルモン遺伝子の合成法j3 補正をする省゛ 事件との関係 出願人 名称 (679)理化学研究所 4、代理人 5、補正命令の日付 昭泪11’年lA月!乙日6、
補正の対象 明細1甫 全図面■、小事件表示 昭
和j♂年特許願第 タ乙7 号2、発明の名称 ヒ
ト生長ホルモン遺伝子の合成法3 補正をする者 事件との関係 出屡1人 名称(679)理化学研究所 4代理人 7 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄8
補正の内容 、て1て]キ\、(1
)昭和jg年j月72日付提出の全文訂正明細書の記載
を下表のとおシ訂正する。 (2)同書第37貞乙行の1引受番号33.2)。′の
次に下記の文を加入する・ 「上記HGH−/株の受託番号は機工′研菌寄第乙と6
を号(FERM P−乙ど6乙)(受託日昭和よざ年
り月/θ日)である。」 (3)同書第乙0頁/行の130分間遠心する。、′を
削除する。 添付書類 (1) 微生物受託証 (2)微生物寄託証明願及び証明書 昭和 年 月 日 4.7.71 ”1“1官 若 杉 和 夫
ヶ3、補正ヤする者 事件との関係 出願人 名称 (679)理化学研究酒 4、代理人 7 補正の対象 明矧1書の発明の詳a1なIv52
BAの欄8、補j「の内容 −1
−′″黴゛。 ・°$3庁“〜 書第32頁第6行とml−行の間に次の文章を挿入する
。 「本発明のヒト生長ホルモンの遺伝子の発現は、通常の
方法によシ行うことができる。すなわち、カザアミノ酸
、グルコース等を含む培地で、30〜37℃でインキュ
ベートシ、菌体濃度が一定の値(例えば0D66o〜0
.θ): 、5’ X / 07celll / ml
) VCなった時、trpプロモーターのインデユー
ザーであるβ−インドールアクリル酸等′ft加工、更
にインキュベートシ続ける。その後、菌体濃度が一定値
に乏った時(例えば、3.3 X / Ocell /
vt )、集菌、リゾチーム等による溶菌処理後、ラジ
オイムノアッセイ法によって)IGH抗体への結合活性
でタンパク量を求めることができる。」(2)同明細書
第6r頁第1I行と第1.l!行の間に次の文章を挿入
する。 「実施例/≠ 実施例/、2で得られた・8087株(微工研菌寄第6
に乙6号)をjψターo、j%カザアミノ酸−〇、、2
9(、グルコース培地で、37℃でインキュベートシ、
OD 〜0.0:2CJX10’60 cell /lni )になった時、β−インドールア
クリル酸(IAA : trpプロモーターのインデュ
ーザー〕を添加しく )Juえない場合は、等量のエタ
ノールfr刀11える〕、更に、インキュベートを続け
、OD −0,/〜0./ / (3,6X60 / Ocell/ld )にlった時に集菌した。 集菌した細胞をリゾチームで溶菌し、得られた溶菌物を
PHADEBAS :ヒト生長ホルモン(HG H)φ
アッセイ・キットを用いて調べた。 Ha HM、体の結合しているペーパm−ディスクに、
この゛溶菌物の希釈液を加え、反応後、更に[IIHG
H抗体を加え反応した。標準曲線から、HGH抗体への
結合活性で、タンパク■を求めると第4L表のような結
果を得た。なお、CT/株も同様な条件にて反応を行い
、比較した。
Claims (1)
- (1)デオキシグアノシン、デオキシシチジン、デオキ
シアデノシン及びチミジンのそれぞれの37−エステル
から選ばnる7種と、一般式:(ただし、式中、B及び
B′は、4−N−ベンゾイルアデニン−デーイル、
4−N−ベンゾイルシトシン−/−イル、 2−N−
イ;ツブチリルグアニンーデーイル、 チミン−/−イ
ル基を示し、同−又は異っていてもよい。)で表わさn
るジヌクレオシドを固相法により順次縮合させ−で得ら
れるフラグメント群を j/ −酵素的リン酸化とD
N A リガーゼによる結合反応を行って、塩基配列: 1
10Met Phe Pro Thr Ile Pro
Leu Ser Arg Leu Phe AspC
la I UoHinf U10 Asp Thr Tyr Gin Glu Phe G
lu Glu Ala Tyr Ile Pr。 5U6 CTG TGA ATG GTCCTCAAG CTT
CTT CGT ATG TAG GGC△
△ L4 L5Asn Ala
Met Leu Arg Ala His Arg
Leu His Gln Leu Ala Phe2U
3U4 0 Lys Glu Gin Lys Tyr Ser7 ハ L6 L7 を有するヒト生長ホルモン遺伝子A部分(以下“A部分
”と称する)、塩基配列: 30 120 ”+4 ハ I、15
△を有するヒト生長ホルモン遺伝子3部分
(以下、”B部分”と称する・)及び塩基配列:140 16す 180
19050 70 を有するヒト生長ホルモン遺伝子C部分(以下”C部分
”と称する)をそれぞれ合成し、A部分、B部分、C部
分を順次DNA!Jガーゼで結合せしめることを特徴と
する、塩基配列:a HQ < 、 gB g、= gi ; g:) 峰jj
j : H”=Σ <ト :・h 号ミE 8名8U 七 882;
に1+5′)CJ Q ← ト< ←
く← l ←クー〉 じOi轢J く3妊
:七ご 弓片禅 二8)3ω −<
く 。Q層重 む同 2り戸 P Q gc、 5−3ト a 哩 = 目 〉 00 會:、 3E 、 ・・ ・・・・Cu8定
=688 よ 渋ゴ 3 荘 r しご <o(6 魯、2計 ;騎鍔 時kg 00 3t 石・−a、 二δ目
く5ピ「:(ご < 叩 々 88 を有するヒト生長ホルモン遺伝子の合成法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP96483A JPS59125895A (ja) | 1983-01-07 | 1983-01-07 | ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP96483A JPS59125895A (ja) | 1983-01-07 | 1983-01-07 | ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59125895A true JPS59125895A (ja) | 1984-07-20 |
JPH0317475B2 JPH0317475B2 (ja) | 1991-03-08 |
Family
ID=11488318
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP96483A Granted JPS59125895A (ja) | 1983-01-07 | 1983-01-07 | ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59125895A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990010066A1 (fr) * | 1989-02-22 | 1990-09-07 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Nouvel inhibiteur de protease et production de ce compose |
JPH09224685A (ja) * | 1986-04-10 | 1997-09-02 | Sanofi Sa | 細菌株及びプラスミド |
EP0794781A4 (en) * | 1994-12-29 | 1998-04-22 | Univ Massachusetts Medical | PREVENTIVE MEDICINES FOR RECURRING HERPES VIRUS INFECTIONS |
WO2012121291A1 (ja) | 2011-03-09 | 2012-09-13 | 三井化学株式会社 | ペンタメチレンジイソシアネート、ペンタメチレンジイソシアネートの製造方法、ポリイソシアネート組成物、ポリウレタン樹脂およびポリウレア樹脂 |
-
1983
- 1983-01-07 JP JP96483A patent/JPS59125895A/ja active Granted
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09224685A (ja) * | 1986-04-10 | 1997-09-02 | Sanofi Sa | 細菌株及びプラスミド |
WO1990010066A1 (fr) * | 1989-02-22 | 1990-09-07 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Nouvel inhibiteur de protease et production de ce compose |
EP0794781A4 (en) * | 1994-12-29 | 1998-04-22 | Univ Massachusetts Medical | PREVENTIVE MEDICINES FOR RECURRING HERPES VIRUS INFECTIONS |
WO2012121291A1 (ja) | 2011-03-09 | 2012-09-13 | 三井化学株式会社 | ペンタメチレンジイソシアネート、ペンタメチレンジイソシアネートの製造方法、ポリイソシアネート組成物、ポリウレタン樹脂およびポリウレア樹脂 |
EP3486230A1 (en) | 2011-03-09 | 2019-05-22 | Mitsui Chemicals, Inc. | Pentamethylenediisocyanate, method for producing pentamethylenediisocyanate, polyisocyanate composition, polyurethane resin, and polyurea resin |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0317475B2 (ja) | 1991-03-08 |
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