JPS59125895A - ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法及びそのク
ローニングに関するものである。

ヒト生長ホルモンは、アミノ酸７７７個からなるポリイ
グチドであるが、治療用の天然物は少量にしか存在せず
大量入手が極めて困難である。そこで、最近遺伝子工学
により、一部合成遺伝子を用い、一部天然メッセンジャ
ーＲＮ　Ａ　（ｍ　ＲＮＡ　）より酵素的に合成した相
補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いてヒト生長ホルモンを合
成する方法が報告されている［　Ｄ、Ｖ、　Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　　２ｇ／、Ｓケグ
（／デ７デ）参照〕。この方法により天然ｒｎ　ＲＮＡ
を用いて合成したアミノ酸コダ〜／？／に対応する遺伝
子は、ヒトの脳下垂体において使用ざｎでいる遺伝暗号
（アミノ酸コドン）を含むものであり、従ってこｎを、
宿主である大腸菌中でベクターのプラスミドに組込んだ
ものからペグチドを合成きせる発現方法は最善のもので
はない。

本発明者らは、上記の観点から、大腸菌中での発現に有
利である方法について鋭意研究を行った結果、本発明を
完成したものである。すなわち、本発明のヒト生長ホル
モンのアミノ酸７９１個に対応する遺伝子は、大腸菌に
おいて高頻度に使われるアミノ配コドンに従って合成し
た人工遺伝子であシ、大腸菌中での発現に極めて有利で
あると考えられる。

以下に本発明を説明する。

ヒト生長ホルモンのアミノ酸／９／個に対応する遺伝子
の塩基配列は、次のスキーム／に示すとおシである。

ｒｌ：で ・”・′・　　８ふｕ　Ｂ　　　３　Ｕ’ｃ４　　　詫
巨職　　に０８８　　　、−　＜← ｉ’　ｅｆｌ　　　ｊ牡　　だ４シ５璽ド　　５１、く
い ”！廿””’　　　Ｌ’　ｇ　８　　　Ｊ　Ｅ　３−　
　４８８　　　？。〉 −賞日　　　　　　：＜　　　”４１’　　　　　　５
　　　％ｉ　　　　　　　ど　　■　　　　　５閃　　
ｃＪＣ すｉ菖　　　６　ご籾　　　緊　１５　５　託ａｊ　　
　二４’Ｏｉｇ＜　、　　Ｊ　６　’ＦＪ　５　ｅ”Ｆ
’　５　’３１Ｅ　　　Ｕｌ　ｈ　＜　　’ｊ　Ｑ、ｐ
− ヨご拓　　Ｃ訛１　　；す！ｂ　　　　ｙ＝　ｙごイコ
　υｏ、　　　　　、ｇ 二ｉ：、、！宵と〜　　５ｒ「　５ イ、ａｕ　　　　　　η　　　＋、ＣＩ：ＪＣ＜　８Ｌ
Ｉ　　　Ｐ＋−？＜＜　　　Ｐ　？”Ｉ　　　Ｑ＋　Ｅ
３　　．３試　晃８ −３　　　　　　　　　　　、〉。。、　　　　〉５ｉ
扉　　３井　　、；　、ｌｊ；、ｊ　　　６８１　５２
　？宅　　　；、！　　壮　　　　、！　社　　　Ｌ　
ご判メ、ｌ＜ｔ−ｃｂ＞ｕｏ　　　　ａ　　ｃ＋ｕ　　
　　＞　　ａｃ＋　　　　３５″′囲〈　　５韮−′　
　ジＩ　　　よ・８８　　　°・〈　　　　　　　　　
／　　　　七 ５　　′４”ｔ　　　　５　荘　　　５　瑚１　　　電
　８　　。

５＞３．　　　だ１強　　　′、ｌ　　３七ご　　・く
　　　　　　　　の　、←　＜　。

−ｒｌ１．：　　三鴨戸　　、Ｅ　Ｉｇ“　５１％３　
ζ鉛ドχ　　　試ミ８Ｓふｌ　　　　；［８＝’；１１
屍３　上用！　　、、ｅｊ’　　５Ｑに（＜ｇ、；３Ｌ
　　　　上目　　　二［で ＋＜ト　　　　　　　　−　　イ←　　　　　　　よｊ
　ｃ　　　；韮　　　謂　■〜　　ｊ　同　　。

：ご←　　・・♂　　、！廿　　Ｊ　Ｅ　ＪＪ　　Ａ２
　　。８　　　　　　ａ謬゛口詣　　　　　　。ン。。

＝１２　　　目５１　　　λ■　　月日　　５ａ　ＣＪ
ＬＬｊ　　　−＜Ｉ−、＃Ｊｍ”　　　Ａｂｌａ嚢Ｂ：
。

−？＜　ロ　　　　　　　Ｉ！Ｉ　　Ｃυ１″′。＜Ｆ
″　　　　Ｃ！ｌ　　ｕｃｂ二８ｆｆｌ＜ よ圓　　９〉■　　　むげ足　　−＜７　　よ−９０［
〜Ｉ＋ｔ＋−ｄ＋、〜−・− ￥城　　侶−同　　　と　リ ６藁　　　　　　−９６°浦ドく　　　　　５：１〈翳
註′　　Ｃ豚　　ｉ関 し ＞９ 社　ぢ−井　　９１　舗■ °Ｐ ？ 蝙 ＞ミ に 謔ビ　　　よ８８　　５荘　　　５■ 謔 ＞０ 七 開基　　１圓　　；騎−時耘ａ ニジと冒く ８８、　　５ξＪＩ　　　　起ｌ　　　　−イトく 藁ど゛　　：　８會　　　、ご、＜　　、■（Ｉ）’Ａ
、Ｂ、Ｃ部分の合成 まず、全遺伝子を３つの部分、Ａ、Ｂ、Ｃに分け、それ
ぞれ／Ａ、３９．．２！；個のオリゴヌクレオチド鎖を
合成する（スキームコ′参照）。

これらは、固相法によシ合成することができる。

固相法の担体としては、７％ジビニルベンゼンを含むポ
リスチレン樹脂（Ｋ、　Ｍｉｙｏｓｈｉ　ａｔ　ａｌ。

Ｎｕａｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｇ　、　左３
０’７（１９ｇ０）参照〕又はシリカゲル［Ｍ、Ｄ、　
Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ
。

Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、　　１０．３
　、３／ｇ３（／ワｇｌ）参照〕が好ましい。

ダ種類のデオキシヌクレオシド、すなわち、デオキシシ
チジン、　デオキシアデノシン、　デオキシグアノシン
、　チミジンを、常法によシそｎぞれ３′−コハク酸エ
ステルとする（Ｂｒｏｋａ　Ｃ，ｅｔａｌ、　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓｓ、　ｇ　　、！；’ＩＡ／
　〜、！；’１７／（／９ＫＯ）参照〕。こｎを前記担
体のアミノ基と結合したもの（ヌクレオシド担体）を、
前記オリゴヌクレオチドの３′末端に用いる。次いで、
こ扛らの３′末末端ヌクレオシド体に、種々の組合せの
ジクレオチドを、縮合剤を用いて順次左′方向に結合さ
せる。縮合剤としては、メシチレンスルホニル−３−ニ
トロトリアゾリド（ＭＳＮＴ）　、２　、グ。

Ａ’−）す４ソゾロビルベンゼンスルホニル−３−二ト
ロトリアゾリド（ＴＰＳＮＴ）、　メチシチレンスルホ
ニルーテトラゾリド（ＭＳＴｅ）、　２，１１゜乙−ト
リイングロビルベンゼンスルホニルーテトラゾリド（Ｔ
ＰＳＴｅ）　　等が適当である。

上記、ノヌクレオシドは、１７種類のヌクレオシドの順
列により７６種類が必要であるが、その合成法は、例え
ば次のスキームコに示す方法によることができる。

又、テトラヌクレオチドの場合は、上記得られたジヌク
レオチドを適宜組合せて、前記と同様に縮合剤を用いて
縮合することにより得られる。

ただし、ＤＭＴｒ　　は、＋’、＋’−ジメトキシトリ
チル基、Ｂ及びＢ′はＡ−Ｎ−ベンゾイルアデニン−ｑ
−イル基、　＋−Ｎ−ベンゾイルシトシン−／−イル基
、　Ｊ、Ｎ−イソ−ブチリルグアニン−ターイル基、　
チミン−７−イル基から選ばれ、゛同−又は異ってもよ
い。ＭＳＮ’Ｔはメシチレンスルホニル−３−ニトロト
リアゾリドを示す。

得られり３′−ヌクレオシド担体と各種ジヌクレオチド
を出発物質として、前記オリゴヌクレオチドを合成する
が、Ｃ部分のオリゴヌクレオチド（Ｕ８）の場合を例に
して具体的に述べる。

（ｄ赫醇買替赫―夏Ｃ（Ｕ８）の合成例）−デオキシシ
チジン担体（前記ポリスチレン樹脂に担持したもの）を
ピリジン中室温で放置後、次の操作により反応を行う。

ｌ）デオキシシチジン担体をジクロロメタン−メタノー
ルで洗浄する。

、Ｉ）２％ベンゼンスルホン酸（ジクロロメタン−メタ
ノール）溶液を加えた後、同じ溶媒で洗浄し、操作をく
り返して発色の消えるまで行う。

ン溶液を加え、減圧溶媒留去し、更にメシチレンスルホ
ニル−３−ニトロトリアゾリド（縮合剤）のピリジン溶
液を加え放置した後、ビリシンで洗浄する。

ｌ／−）θ、／Ｍツメチルアミノビリノン溶液及び無水
酢酸を加えて放置後ピリジンにより洗浄する。

このような操作を、各ジヌクレオチドについて順次繰り
返して７回行った後、樹脂を。、左Ｍトリメチルシリル
グアニノウムービリジンーコーアルドオキシメート［：
　Ｃ，Ｂ、　Ｒｅｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、２７２７（１９
７ｇ）参照〕のジオキサン−水の溶液中で振とぅする。

樹脂をピリジン−水で洗浄し、Ｐ液と洗液を合わせて減
圧濃縮し、残渣に濃アンモニア水を加え、加温する。ア
ンモニアを留去し、Ｄｏｗｅｘ　！ｒ　Ｏなどのピリジ
ニウム型樹脂を加え、樹脂をピリジン−水により洗浄し
、ｆ液と洗液を合わせて濃縮する。濃縮液に少量の水を
加え酢酸エチルでオキシムを抽出除去する。水層を一定
量に希釈し、その１部を用いてジメトキシメチルトリチ
ル基の定ｔ’を行って全体量を推定する。

次いで、水層を減圧乾固し、残渣にｇθ％酢酸を加えた
後、溶媒留去し、残渣を水と酢酸エチルに溶解し、水層
を濃縮した後、ＤＥＡＥ−１ヨパ〜ル（Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ）等を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行う
。

適当な緩衝液中、食塩の濃度勾配で溶出し、Ｕ、Ｖ、　
　吸収によシオリゴヌクレオチドを検出した後、透析脱
塩する。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー：Ｃ１
８シリカゲル担体）及び−次元ホモクロマトグラフィー
で単一であることによシ純度を判定する。

同様の操作を行って、Ｃ部分のＵ、〜Ｕ１□、Ｌ。

〜Ｌ１１のオリゴヌクレオチドを合成する。同様にＢ部
分のＵ　　−Ｕ　　、Ｌ　−Ｌ　　、Ａ部分のＵ。〜１
９０１Ｂ Ｕ　　、Ｌｏ−Ｌ、を合成する。

このようにして得ら孔り各オリゴヌクレオチドを適当な
群、例えば三群に分け（Ｂ部分は四群、Ａ部分は三群が
適当である。）３′−酵素的リン酸化とＤ　Ｎ　Ａ　リ
ガーゼによる結合反応を行う。

すなわち、例えば（７−３２ＰＩＡＴＰをそれぞれのオ
リゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドキナーゼと共に
、キナーゼ緩衝液中、３７°Ｃでインキュベーションす
る。それから、ＡＴＰ及びキナーゼを加え、更にインキ
ュベーション’ｔＪ７ｅける。

次いで加熱してキナーゼを不活性化する。

上記５１−リン酸化した後、ＡＴＰ、メルカプトエタノ
ールの一度を調節し、ＤＮＡリガーゼを加えて、３７ｃ
ｃでインキュベーションする。反応停止徒、生成したＤ
ＮＡ断片を、エタノールで沈殿させ、ダル電気泳動を行
って精製する。必・くして、Ｃ部分の のフラグメント群を得る。同様の操作を行って、Ｂ部分
、Ａ部分の相当するフラグメント群を得る。

これらのフラグメント群を、再びＤＮＡリガーゼを用い
て前記と同様に結合させて、本発明のヒト生長ホルモン
Ｃ部分の遺伝子を得る。次に得らｎた各部分を制限酵素
を加えて処理する。これは必要でない両末端部分の塩基
配列を取シ除き、頭部及び尾部を、目的とする塩基配列
に揃えるためである。例えば、Ａ部分ではＣ１ａ　Ｉ　
−Ａｌｕ　Ｉ系、Ｂ部分では、Ｈｌｎｄ　ｍ　−Ｓａｌ
　Ｉ系、　Ｃ部分ではＣ１ａ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉ系を用
いる。

かくして得られるＡ、Ｂ、Ｃ部分の塩基配列をスキーム
３．’Ｉ、！；にそれぞれ示す。又、以上の反応’ｉＡ
　、　Ｂ　、　Ｃ部分それぞれについてスキーム乙、７
１ｇに示す。

スキー Ａ　　部 １０ スキームク ８部分 スキームＳ １！１０ １（ｉｏ １８（１１９０ ＋５０ ７０ スキーム６ Ａ部分 □←１　　←−−１□　　□□□ □−−−−−−−タ′ スキーム７ Ｂ部分 一一一一μ−−←←−−ト←←←−トー←←Ｍ＋−４Ｍ
−−一−４Ｍ　　−一一一　−一一一−ＬＯＬ５　　　
　’−’１０　　　　Ｌｉ２　　　”１８左′ スキーム、ｇ （Ｉ　）　　　　　　　　　（ＩＩ）　　　　　　　　
（ＩＩυＣ１ａｉ　　　　　　　　　　／７乙””　　
　　　　　　　　　５ａｌＩＳ′□ □　　　　　　　　　　左′ （６）　次に本発明の遺伝子の発現及び各部分の遺伝子
の増量に有用なベクタープラスミドについて説明する。

クローニングに用いるベクターは、プラスミドｐＢＲ３
，２２のＥｃｏＲ１部位に、大腸菌のトリプトファン−
オペロン（ｔｒｐ　−ｏｐｅｒｏｎ）　　のブロモ−タ
ー−オペレーターＬ　−Ｅ　（ｐｒｏｍｏｔｏｒ　−ｏ
ｐｅｒａｔｏｒ　−Ｌ−Ｅ）　　の領域を含んでいる約
３００個の塩基対を通常のｐＢＲ３１２の表現法におい
て時計回り（ｃｌｏｃｋｗｌｓｅ）方向に挿入し、更に
制限酵素ＢＡＬ３／でオ＜　ｏ　７の下流側挿入点より
処理してｔｒｐＥ　のＳ、Ｄ、部位（リポソームが結合
し易い部位）の後部に、制限酵素Ｃ４ａＩリンカ−（ｌ
ｉｎｋｅｒ）　　を結合したものである。この新規なベ
クタープラスミドを’　ｐＣＴ　／　″と呼称する。

このようなプラスミドｐＣＴ　／を有するようになった
菌株の代表例として、ニジエリチア・コリＣＴ／（以下
、“ＣＴ／株″と称する。）を挙げることができる。

上記の宿主菌株はＥ、Ｃｏ１１　Ｋ　／２の誘導体ＫＭ
ｄｅｌ ７．２３　（ｓｔｒ　ｈｉｓ　　ｒｅｃ　Ａ／　ｓｕｐ
　　　ｇａｌ　　　　）　　（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｌｏｌ、　（／９７乙）　ｉｏ、２、’１２７−１Ｉ
３９　　参照）であシ、菌学的性質において大腸菌Ｅ、
　Ｃｏ１ｔ　Ｋ　／　：１株と全く変りがない。上記Ｃ
Ｔ／株は、昭和５７年／２月６日付にて工業技術院微生
物工業技術研究所に究託され、その受託番号は、微工研
菌寄第６ｇ７７号（Ｆ’ＥＲＭ　　Ｐ−ｔｇ／７）であ
る。

得られたｐＣＴ／　　プラスミドを制限酵素Ｃ１ａｌ　
−８ａｌ　Ｉ　で切断し、前記合成したヒト生長ホルモ
ンＣ部分遺伝子フラグメントを挿入すると、ヒト生長ホ
ルモンの前記Ｃ部分遺伝子の発現及び増量に有用な新規
プラスミド−が得られる。この新規なプラスミドを’　
ｐＨＧＨＣ／　’″と略称する。このようなグラスミド
１）ＨＧ）（Ｃ／を有するようになった菌株の代表例と
してニジエリシア・コＩＪ　Ｉ（ＧＨＣ／（以下、”Ｈ
ＧＨＣ／株“と称する。）を挙げることができる。

上記ＨＧＨＣ／　　株の宿主菌株は前記ＫＭ’７コ３で
あり、菌学的性質において前°記Ｅ、ｃｏ目に／ｕ株と
全く変りがなく、昭和５７年／′２月６日付にて、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託され、その受託番号
は、微工研菌第６ｇ７６号（ＦＥＲＭ　Ｐ−Ａｉｄ）で
ある。

又、前記８部分遺伝子フラグメントを、ｐＢＲ３，：）
、２のＨｉｎｄ　ＩＩＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ切断部位に結
合すると、新規プラスミドが得られる。この新規プラス
ミドを″ｐＨＧＨＢ２　”と呼称する。このようなプラ
スミドｐＨＧＨＢ、２を有するようになった菌株の代表
例としてニジエリシア・コリＨＧＨＢユ　（以下、”　
）（ＧＨＢ：を株″と称する）を挙げることができる。

このプラスミドはヒト生長ホルモ７８部分遺伝子の増量
（（有用である。培養後プラスミドｐＨＧＨＢ、２を単
離し、Ａｌｕ　Ｉ　、Ｂｇｌ　Ｉ＋処理してヒト生長ホ
ルモ７８部分遺伝子を得る。一部をＭａｘａｍ　−Ｇ１
１ｂｅｒｔ法〔Ａ、Ｍ。

Ｍａｘａｍ　＆Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳＣ７４、＆　４０　（／
９７？）　）により塩基配列をしらべ、構造が正しいこ
とを確認する。

以下に、これらのプラスミドを調製する方法について、
更に詳細に説明する。

大腸菌トリシトファンオペロンは、培地中にトリプトフ
ァン除去又はインドールアクリル酸（ＩＡＡ）添加によ
って誘導され、強力にメツセンジャーＲＮＡ　（ｍ　Ｒ
ＮＡ　）合成を開始する。

（１）まず、このプロモーター領域を、既知のプラスミ
ドｐｔｒｐＥ’Ｄ４−／（Ｇｅｎｅ　９　２７　（１９
ｇの参照〕から、制限酵素Ｈｉｎｆ　Ｉ　−Ｈｉｎｆ”
　Ｉで、約３００塩基対をとり出す（第１図参照）。

第１図ニはｐｔｒｐＥ　Ｄ５−／のトリプトファンプロ
モーター領域のみを示す。ｂ、ｐ、は塩基対を示す。

（２）　　切り出した３θθｂ、ｐ、の断片の両末端を
ＴりＤＮＡＩリメラーゼで修復した後ＥｃｏＲＩリンカ
−を介しプラスミドｐＢＲ３２２［：　Ｇｅｎｅ　、２
ワ左（／ｑ７り）］のＥｃｏＲＩ切断部に挿入する（第
２図参照）。

（３）　　次に第２図の■のＥｃｏＲＴ部位のみを切断
し、ＴグＤＮＡポリメラーゼで修復後、Ｔり［）ＮＡり
が一ゼにより接着を行い、Ｅ’ｃｏＲＩで切断できない
ようにする。続いてｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩとＢａｍ
Ｈ部位の間の領域（第２図の斜線部分）をも欠失させる
。このようにして得られるプラスミドを−ｐＯｃＴ、２
−９”と略称する。ｐＯｃＴニー９は、ｔｔ、３Ｋｂ　
（Ｋ　ｂａｓｅ　ｐａｉｒ）　　を有し、細胞当りのコ
ピー数は、λθ〜３０個／ｃｅｌｌ　　である（第３図
参照）。

０部分の１２）から（３）のｐＱＣＴ、２−９　　を得
る工程は次のとおりである。

■のＥｃｏＲ１部位 ・・・・・・ＧＡＡＴＴ　　　Ｃ・・・・・・・・・・
・・ＣＴＴＡＡＧ・・・・・・・・・・・・ＧＡＡＴＴ
　　　　　　　　　ＡＡＴＴＣ・・・・・・・・・・・
・ＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣ・・・・・・・・・・・・ＣＴ
ＴＡＡＴＴＡＡＧ・・・・・・（４）　　ｐ　ＯＣＴ　
２−９　　においてｔｒｐＥ遺伝子はアミノ酸をコード
（ｃｏｃｌｅ　）　する領域の一部しか持たないので不
完全である。

■のｐＢＲ，３，２，２ベクターとの接続部をＥｃｏＲ
Ｉ　テ切断する。

次いで、制限酵素ＢＡＬ３／で３・Ｏｂ、ｐを除去し、
除去した部分に化学合成したＣ１ａｌ　　！Ｊンカーロ
ロＩ可ｑ日をＴグＤＮＡりが−ゼを用いて挿入閉環する
（第グ図参照）。

ｐＣＴ／プラスミドのマツプ（ｍａｐ）　を第６図に示
す。

以上のようにして得られるプラスミドｐＣ’Ｔ／は、マ
キサム及ギルバート法（Ｍａｘａｍ　＆　Ｇ１１ｂｅｒ
ｔ）法［ＰＮＡＳ７叉、界０　（／９クク）〕によって
分析確認する。

得られたプラスミドｐＣＴ／の特長は、次のとおりであ
る。

１）　　’１．ａ　Ｋｂ　　を有し、シピー数は；θ〜
、Ｊ’　Ｏｃｅｌｌである。

ＩＩ）　　Ｃｌａｌ部位に、ＡＴＧで始まるヌクレオチ
ド配列を有するＤＮＡ断片を組み込めば、ＡＴＧ以下の
コドンで指令されるたんばく合成を行う。

生成するたんばくは、単一のたんばくであり、ハイブリ
ツ）　（ｈｙｂｒｉｄ）　　たんばくではない。

Ｉｎ）　　（−の調節は、トリプトファンプロモーター
による支配を受け、培地からトリプト７アンの除去、又
けＩＡＡの添加によって強い形質発現ができる。

ＩＶ）　　ｐＢＲ３２，２７°ラスミド上に元来存在し
た非テトラサイクリン耐性（ＴｃＲ）遺伝子を除去する
ために、ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨ１部位の間〔第２図の
斜線部分〕を欠失させる。従ってトリプトファンプロモ
ーターからの強い転写が時計回りの方向に進入してきて
もテトラサイクリン遺伝子の最大発現による宿主へ悪影
警がない。

■）アンピシリン耐性（ＡｐＲ）遺伝子は、そのままで
ある。

ｖｌ）　　本プラスミドは、１）ＢＲ，３，２２の有し
ていた増殖ドライブにより増殖し、大腸菌体内で安定に
保持される； （５）　　得られたプラスミドｐＣＴ／を、Ｃ１ａｌと
５ａｌｌで切断し、ここで、先に合成した頭部末端がＣ
１ａｒ　　構造、尾部が５ａｌｌ　　構造を有するヒト
生長ホルモンのＣ部分の遺伝子断片を挿入し、ＤＮＡり
が一部で接着すると、ヒト生長ホルモンの前記Ｃ部分遺
伝子の発現及び増量に有用な新規プラスミドＴ）ＨＧＨ
Ｃ／を得ることができる（第６図参照）。

このｐＨＧＨＣ／は、り、１ｌＫｂを有し１．２０〜３
０　／　ｃｅｌｌのコピー数を有する。ｐＨＧＨＣ／を
含む菌（ニジエリチア・コリＨＧＩ（Ｃ／　）を培養後
、常法によりプラスミドを抽出し、次いでＢｇｌ　ｌｌ
−８ａｌ　Ｉで処理することにより、増量したＣ部分の
遺伝子を取り出すことができる。

次にプラスミドｐＢＲ３２，２を、Ｈｌｎｄ　！［１と
５ａｌｌで切断し、ここで、先に合成した頭部末端がＨ
ｌｎｄ　ＩＩＩ　　構造、尾部が５ａｌｌ　　構造を有
するヒト生長ホルモンのＢ部分の遺伝子断片を挿入し、
ＤＮＡりが一部で接着すると、ヒト生長ホルモンの前記
８部分遺伝子の増量に有用な新矧プラスミドｐＨＧＨＢ
Ｊを得ることができる・ｒ第７図参照）。

このｐＨＧＨ８，２は、グ、０’Ｋｂ　を有Ｉ７１．２
０〜３０　／　ｃｅｌｌ　　の、コピー数を有する。

ｐ　ＨＧ　Ｈ８，２を含む菌（ニジエリチア・コリＨＧ
ＨＲ，２）を培養後、常法によりプラスミドを抽出し、
次いでＡｌｕｌ　−Ｂｇｌｌｌで処理することにより増
量したＢ部分の遺伝子を取り出すことができる。

（ＴＨ）８部分遺伝子とＣ部分遺伝子の結合前記プラス
ミドｐＨＧＨＢ、２より１月１ｄ　ＪＢｇｌ　Ｅ１次い
でＡｌｕ　＋処理によって得られた：１ｇ！；ｂ−ｐ−
を有する８部分遺伝子ＤＮＡ　（直接前記合成したＢ部
分から取り出す場合はＡｌｕ　Ｔ−Ｒｇｌ　ＩＩ処理で
よい）とプラスミドｐＨｃＨｃ／よりＢｇｌ　ｎ　、Ｓ
ａｌ　Ｉ処理によって得られた／／、３ｂ、ｐ、を有す
るＣ部分遺伝子ＤＮＡをＤＮＡリガーゼによって結合し
、＋ｌＩｘ　ｂ、ｐ、を有するＢ、Ｃ部分結合遺伝子を
得、これをアクリルアミドグ５ル電気泳動により単離す
る。

０Ｖ′）ヒト生長ホルモン遺伝子の合成とプラスミドｐ
ＣＴ／への挿入Ｃｆｆ）　、　（ＴＩＴ）で得られｆｃ
Ａ、Ｂ−Ｃ結合遺伝子ＤＮＡをＤ　Ｎ　Ａ　＋７ガーゼ
により結合すると、５ｇ１ｌｂ、ｐ、を有するヒト生長
ホルモン遺伝子を得る。

更に、これをＣ１ａｌ、５ａｉｌ処理して、頭部、尾部
を目的の塩基配列に揃え、前記グラスミドｐＣＴ／のＣ
１ａｌ、５ａｌｌ切断部位に結合すると、本発明のヒト
生長ホルモンの遺伝子の発現及び増量に有用なベクター
プラスミドを得る。

この新規なベクタープラスミドヲ”’　ｐＨＧ）Ｔ−／
″′と呼称する（第３図参照）。

このようなプラスミドｐＨＧ）Ｔ−／を有するようなっ
た菌株の代表例として、ニジエリチア・コリＨＧＴ（−
／（以下、”　Ｔ（ＧＨ−／株”と称する。）を挙げる
ことができる。

上記ＨＧＨ−／株の宿主菌株はＥ、Ｃｏ１１　Ｋ　／　
２の誘導体ＨＢ／θ／　［ｐｒｏ　　’Ｉｅｕ　ｔｈｉ
”−１ａｃ　Ｙ−ｈｓｄ　Ｒ−ｅｎｄ　Ａ−ｒｅｃＡ−
ｒｐｓ　Ｌ＋２０　ａｒａ−／４１　　ｇａｌ　ＫＡｘ
ｙｌ−３ｍｔｌ−／　８１１ｐＥ　４１１Ｉ；　Ｒ，Ｍ
ｅｙｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ菌学的性質
において大腸菌Ｅ、Ｃｏ１１　Ｋ　／コ株と全く変シが
ない。上記ＨＧＨ−／株は、委託のため昭和ｓｇ年７月
７Ｕ付にて工業技術院微生物工業技術研究所に郵送され
た（昭和！ｇ年／月７日付和光郵便局書留郵便物引受番
号３！ｒλ）。

次に、これらのプラスミドｐＣＴ／あるいはｐＨＧＨＣ
／、ｐＨＧＨＢ、２及びｐＨＧＨ／を含む大腸菌を培養
し、その培養物よりプラスミドＤＮＡを請判する方法に
ついて具体的に説明する。

／）調製性全般について プラスミドＤＮＡを得るためにはできるだけそのＤＮＡ
含量の高い菌体から出発する。菌体をおだやかに壊して
宿主染色体ＤＮＡを残し、細胞質内の物質をヌクレアー
ゼ活性を抑えた条件下で選択的に抽出し°Ｃから混入す
る蛋白質、Ｒ，Ｎ　Ａを除去し、次に宿主染色体ＤＮＡ
断片を主Ｋ　Ｅ　Ｂ　−ＣｓＣ１遠心で除き、最後にオ
リゴヌクレオチドなどを除くと分子生物学的実験に使用
できる標品が得られる。

コ）培養 プラスミドを保持する大腸菌を例えばＦＲＢ（ポリ４デ
トン１０１１肉エキス／θｇ１ＮａＣＩ　　、２．左ｐ
１必要ならイーストエキス、２ｇを加える；水／　／　
Ｓｐｎり、θ）培畑グθ０プに３７史で通気培養する菌
がユ〜り×／θ　／　ｍ１才で生えたところでクロラム
フェニコールを最終濃度で約／左０μｆｌ／ｍノになる
ように加え、その寸ま３７ヤでｇ〜７６時間培養する。

集菌後、数日内に処理するならば菌体をθ〜１ｌＣＣで
保存し、そうでない場合には一７０実で凍結保存する。

３）選択柚−出 培伴液１７００　ｍｌから集めた菌体（ＯＡ；　−／、
５ｇ）を約３０−のＴｒｉｓ　−ＮａＣ１に懸濁し、容
器ｌＩＱ　ｍｌの冷却遠心機用遠心管に移し、’７、．
０００ｒｐｍ、’７分間遠心して沈殿させる。ＩＯ鑓の
ＴＥ−蔗糖を加えて゛懸濁し、０．０！；ｍｌ　ＲＮａ
ｓｅ　、　／ｆｉ／　ＩＪゾチームを混ぜ、０ａｃ５分
間放置する。その後：１ｍｌの０．！；Ｍ　　ＥＤＴＡ
を加、＜−、サラＶＣｏｃ′Ｃ。

７０分間置く。この処理で懸濁液″は・、やや粘性をも
つ、これに／乙ｍｌのＬｙｔｉｃ　Ｍｉｘｊｕｒｅを一
気に加え、ただちに遠心管の口を閉じて容器を数回反転
して全体を均一にする。懸濁液は透明で粘性をもった溶
菌液となる。このま−！Ｏｃｃで７ｓ分間程度あるいは
それ以上放置後、０旬で７３．０００〜７ｇ、０θ０ｒ
ｐｒｎ、、３０分間遠心する。

これでプラスミドＤＮＡが含１れる上清とゲル状になっ
た宿主染色体ＤＮＡや細胞表面物質が含まれる沈殿に分
かれる。上清を静かに同じ大きさの遠心管に移す。液の
重さを計り、比重／として体積に概算する。約３０４の
ｃｌｅａｒｅｄｌｙｓａｔｅ　　が得られる。

ｔｌ）＆ｌＪエチレングリコール（ＰＥＧ）による濃縮
およびＥＢ−ＣｓＣ１平衡密度勾配遠心ｃｌｅａｒｅｄ
　”、＋ｙｓａｔｅ　　にその７７１０重骨のＰＥＧ粉
末および／／１０容量のｋＭ　ＮａＣ１を加え、マグネ
チツクスターラーで完全に溶解させる。マグネットを取
り除きＯｃｃで３時間以上／晩程度放置した後、１０．
θＯθｒｐｍ、１０分間遠心するとうす茶色の粘稠な沈
殿が得ら力る。上溝には蛋白質とＲＮＡ断片の大半が含
まれているのでこれを傾けて捨てる。沈殿にはシラスミ
ドＤＮＡが回収される。遠心管の口を下にして斜めにね
かして置き上清をできるだけ除く、ダθ０１培養の標準
スケールから調製した場合、この沈殿ｆ　、７　ｔｎｉ
のＴＥによく溶かしスビンコのりθ凍りは５０番の遠心
管に移す。さらに少量のＴＥを加えて全体を正確にダ、
７Ｕ（比重／としてＬ７４ＩＩ！／）にする。これに５
−００ｇ５−０Ｏ，０，３ｍｌ　Ｆ　Ｂ溶液を加えよく
混合する。多量、たとえばｇｌの培養液から出発した場
合、前記処決に従って３００ｄのｃｌｅａｒｅｄ　Ｉｙ
ｓａｔｅ　　を調製し、ＰＥＧでＤＮＡを沈殿させた段
階でいったんフェノール処理を施した方がよい。どのた
めに沈殿を／３；ｍｌのＴＥに溶かし、／θｍｌの水飽
和フェノールを加えて乳化後、低速遠心して、２層に分
ける。上にくる水層を回収し、コ容のエタノールを加え
る。Ｑｃｃ、、２０分後１０．θθθｒｐｍで１０分間
遠心し、上清をよく除き（沈殿が流出しなジケータ−内
で脱気によりアルコール分を除けばよい）、沈殿を９　
ｍｌ　（７ｊ　Ｔ　Ｅ　−５ａｒｋ　−ｏｓｙｌによく
溶かし、さらに少量のＴ　Ｅ　−５ａｒｋ　−ｏｓｙｌ
でｑ、ｓｘｙに調製する。これに／　０１！　ＣｓＣ１
、／　ｍ１ＥＢ溶液を混ぜて１本の遠心管で遠心する。

遠心は約２０ｃｃ、３乙、Ｃ００ｒｐｍで／ｇ〜３６時
間行なう。遠心後ブレーキを使わずに停止させ、遠心管
を静かに取り出す。ＥＢの色が遠心管の上部から底にか
けて薄くなっており密度勾配ができていることがわかる
う暗室でグラツクランデ（，３Ａ　Ｏｎｍ　）　　で照
らすと試料の下から／の位置にプラスミドｃｃＤＮＡの
バンド、上からＡの位置にｏｃおよび染色体断片のＤＮ
Ａのバンドが黄緑体に光って見える（／μｙ　のＤＮＡ
があれば十分検出できる）。下のｃｃＤＮＡバンドを注
意してなるべく幅狭く回収する。

３）ゲル濾過法による除ＲＮＡ　操作 Ｔ　Ｅ　Ｎ　（／　ＯｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、／ｍ
ＭＥＤＴＡ、θ、／　Ｍ　ＮａＣｌ　、　ｐＨ７，り）
で平衡化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−ＩＩ　Ｂカ
ラム＜　０．ｇｘ、：）、０ｒｙｒｔ＞を用意する。こ
れにＥ　Ｂ　−ＣｓＣｌ　　遠心で得たｃｃＤＮＡ両分
（０，５〜０．ｇ　ｍｌ　）をそのまま加え、ＴＥＮで
自然流出法によ！ｌｌｒル濾過を行なう。

波長−左り皿における吸光度でモニターすると約３ｍ／
のｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｒｎｅが流出したところでＤＮＡ
画分が出、遅れてＲ，Ｎ　Ａ画分、さらに続いて、ＦＢ
やＣｓＣ１が出てくる。ＤＮＡ両分に相当する最初のピ
ークを集めてＴＥＫ透析するかエタノール沈殿で燃線す
るとともにエチジウムブロマイドを除く。こねてプラス
ミドＤＮＡはほぼ純粋りものとして扱うことができる。

以上の全工程を第ｇ図に示→−０ 以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明は何
らこれらに限定されるものではない。

実施例／（Ｃ部分のオリゴヌクレオチドＵ［ｌ”ＵＬ’
、Ｌｏ〜Ｌ１．の合成） オリゴヌクレオチドの合成例 ｄ配９に画もりＪす■ユＣ（Ｕ８）の合成デオキシシチ
ジン担体（１層ユμｍｏｌ／ｇ前記ポリスチレン樹脂、
３３ｒｒＱ）をぎリジソ゛φ−夜室温で放置し次のよう
な操作により縮合反応を行う。

用いるジヌクレオチドは各２０ｍｇである。最初に用い
るのはこの場合チミジンジヌクレオチド（スキームコ、
■、Ｂ＝チミン−／−イル）である。

ｓ′方向に順次鎖を延長する。

操作／）ジクロロメタン−メタノール（り；３、Ｖ／Ｖ
　）ニーにより３回洗滌。

２）コチベンゼンスルホン酸（ジクロロメタン−メチル
アルコール、７：３）溶液２ｍｉと２分間処理した後、
同じ混合溶媒で３回洗滌する操作を繰返して発色のなく
なることを確める。

３）ビリシン、２ｍ／により３回洗滌。

り）ジヌクレオチドのぎりシン溶液（Ｏ２／〜０・コゴ
）を加え溶媒を減圧留去する。

、ｔ＞ｍ合剤、メシチレンスルホニル−３−ニトロトリ
アゾリド（コＯｍｇ）のピリ・シン溶液（０，，２〜θ
、３ｍ１）を加えＳＯ分放置する。

乙）ビリジンユｍｌにより２回洗滌。

７）０：１Ｍジメチルアミノピリジンのピリジン溶液Ｃ
１，ｇｍｔ）および無水酢酸（θ、、２’ｄ　）を加え
７０分間放置する。

ｇ）ビリノン、２−により３回洗滌。

以」二の操作を各ジヌクレオチドについて計７回行った
後、樹脂をθ、＆Ｍ）リメチルグアニジウムーピリジン
ーコーアルドオキシメート（Ｃ，Ｂ。

Ｒｅｅｒｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｎ
　　Ｌｅｔｔ、、　　、２７．２７（７９７ｇ）〕の〕
ジオキサンー水１／）の溶液（／ｄ）中３ｇ時間振とう
する。樹脂を左θチビリジン水により洗滌しｆ液と洗液
を合せて減圧濃縮し、残渣に濃アンモニア水（１３ｍ１
）を加え密栓して夕Ｓ％でＳ時間加温する。アンモニア
を留去し、Ｄｏｗｅｘ　Ａ；　０ピリジニウム型樹脂（
ユｍｅ　）を加え、樹脂をＳＯチビリジン水により洗滌
し、Ｐ液と洗液を合せて濃縮する。濃縮液に少量の水を
加え酢酸エチルでオキシムを抽出して除く。水層を一定
量に希釈し、その一部を用いてジメトキシトリチル基の
定量を行い全体め量を推定する。ジメトキシトリチル基
の分子吸光係数を７７、り０θとすると７７、’ｌＡユ
ニットから／、Ｏｇμｍｏｌの阻オリゴヌクレオチドが
合成されたことがわかる。

水層を減圧乾固し残渣にｇＯチ酢酸／Ｑｙｎｌを加え：
１５％、３０分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢
酸エチ／ヒに溶解し、水層を濃縮した後、イオン交換ク
ロマトグラフィーにかける。イオン交換体はＤＥＡＥ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　　Ａ！；Ｏ８を用いる。カラム（
θ、７　ｘ　、２／（：ｍ）につめ７Ｍ尿素、２０ｍＭ
ｈリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，ｙ）中、θ、／〜０．３
　Ｍの食塩濃度勾配で溶出する。紫外線吸収によりオリ
ゴヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース膜を
用いて透析によシ脱塩し、Ａ２．．９　Ａ　２６ｏユニ
ツトを得る。ＨＰＬＣ（Ｃ１８シＯ力ｒル担体）および
−次元ホモクロマトグラフィーで単一であることにより
純度を判定する。ＨＰＬＣにおけるリテンションタイム
はｄＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＴＴＣ（Ｕ８の場合は／
／、７　分である。ホモクロマトグラフィーのＲｆ値（
Ｒｍ；色素マーカー、ブロムフェノールブルーの動きに
対する相対値）は０．左／　　である。

展開溶媒はホモミックスＩ　（Ｅ、　Ｊａｙｅｔ　ａｌ
、ＩＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　／　、
　３３／　（／ｑ７１１．）　　］を使用した。

同様な反応を行ってＵ　ｏ　＝　Ｕ１２．’（’Ｕ’ｅ
　を除く）、ＬＯ−Ｌｌｌに相当するオリゴ“ヌクレオ
チドを合成した。

ＵＯ””’Ｕ１２、ＬＯ〜Ｌ１１のリテンションタイム
とＲｆ値を第１表に示す・ 実施例、２（Ｂ部分のオリゴ“ヌクレオチドＵＯ〜Ｕ１
９゜Ｌ　　”ＬｌＢの合成） 実施例／と同様に反応を行って、Ｂ部分のＵ。

〜■Ｊ１７．Ｌ−Ｌ１８に相当するオリゴ“ヌクレオチ
ドを合成した。ＵＯ””−Ｕ１９　’　”　　”ＬｌＢ
のりテンションタイムとＲｆ＝を第２表に示す。

実施例３（Ａ部分のオリゴヌクレオチ、′ドＵＯ”””
　Ｕ７　＋Ｌｏ〜Ｌ７の合成） 実施例／と同様に反応を行って、Ａ部分のＵ。

〜Ｕ７　　ｓ　ＬＯ”、”、７　に相当するオリがヌク
レオチドを合成した。ＵＯ”’＝Ｕ７　　＋　ＬＯ〜Ｌ
７のリテンションタイムとＲｆ値を第３表に示す。

実施例り（オリゴヌクレオチドの３′−酵素的リン酸化
とＤＮＡ　りが−ゼによる結合反応） 実施例／で得られたＣ部分のオリゴヌクレオ看ドを ０１　　　　　　　　　ＣＩＯ（ＦＩＴ）の三群に分け
て、それぞれの群につき次の反応を行った。

スθθマイクロキューリーの〔γ−ｐ　　ＩＡＴＰ（：
Ｓ：’７’１００　Ｃ１／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ
　）オリゴヌクレオチド（７０μ！りと３ＵのＴ＋ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株）製）をＡＯμｌの
キナーゼ緩衝液（＆θｍＭ）リス−ＨＣ／、ｐｉざ、０
７’　１０ｍＭＭｇ（Ｊ２　／　１０　ｍＭ　　ジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）／、１．ｍＭス４ルミジン／θ
、／　ＭＫＣｌ　）に溶解したものを混合し、３７°Ｃ
でコ°θ分間インキュベートした。

それからＡＴＰ（／７ナノモル）とＴ４’キナーゼ（／
Ｕ）を加え、更に７時間反応させた。ワθ（、り分間加
熱して、キナーゼを失活させた。

これらの７ラグメントをアニールするため、反応混合物
を、ＤＴＴを除いたｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｔ（
６６ｍＭ　）リス−ＨＣ６、ｐ）！　７．乙／６．乙ｍ
ＭＭｇＣ／２／　／　ＯｍＭ　ＤＴＴ　　／θ−左ｍＭ
　ＡＴＰ　）中で、７０ｏｃで一分間加熱し、それから
ゆっくり室温寸で冷却した。次にＡＴＰとＤＴＴを、そ
れぞれ０．４’　ｍＭと７０ｍＭの濃度で反応混合液に
加えた。反応混合液／３°Ｃに冷却後、ＴｌｌＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造（株）製）（／、、２Ｕ）を加え、７３
時間同じ温度でインキュベートした。乙５’Ｃで左分間
加熱して反応を停止した。ＤＮＡの７ラグメントをエタ
ノールで沈殿させ、／θチアクリルアミドグル電気泳動
に付し、その後、ダルかへ抽出を行って精製した。

それぞれ相当するフラグメントが、７．スμｙ（Ｉ群）
、？、、！、μｇ（■群）、７．２μ＃（Ｔｌ１群）得
られた。ただし、■群のフラグメントについては、沈殿
によ９精製品が得られたので、電気泳動は行わなかった
。

得らねたフラグメント（Ｔ）　、？、／、　ｆｉｌｌ　
、　（ＩＩ）　３．Ａ　ｆｉｇ及び＠）７・、２　ｔｔ
９　　を用い、上記と同様にリン酸化反応、結合反応を
行った後、制限酵素Ｃ１ａ　＋　（ぺ−リンが−・マン
ハイム社ｆ！ｌ！！　）　Ｉｌ、Ｓ−ユニットを加えて
１．？７ＣＣで乙時間インキュベートした。次いで、制
限＃素Ｓａｌ　Ｔ　（宝酒造（株）ｍ）ｉｘｏユ＝ット
、ＮａＣ１／３！；　ｍＭ　ＳＤ　Ｔ　Ｔ　５ｍＭを加
えて３７％で／ｇ時間インキユペートシ、反応停止後、
ＤＮＡをエタノールで沈殿させ１．！ｉ′％ポリアクリ
ルアミドデル電気泳動に付し、その後ダルから抽出を行
って精製した。この結果、第１図に示す本発明のヒト生
長ホルモンのＢ部分の遺伝子０．ｓμｇ　を得た。

実施例り 実施例ユで得られたＢ部分のオリゴヌクレオチドを、 （１）　　　　　　　（Ｕ）　　　　　　　（ＩＩＩ）
　　　　　　（ＴＶ）のダつの群に分けて、実施例グと
同様に反応を行つて、捷ずフラグメント／　Ｏｔｔｊｊ
　（Ｔ群′）、　／／μｇ　（ｙｒ群）、ゲ０．２μｇ
（ＩＩＩ群）、３μｇ（ｒｖ群）を得た。得られたフラ
グメント（■）３μ９１αｆ）３μｙ１（■）３μｇ　
及び（■）３μｇ　を用い、実施例ダと同様にリン酸化
反応、結合反応を行った後、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌ（
宝酒造＠）製）ＳＯユニットを加えて３７ｃｃで１時間
インキュベートした。次いで、制限酵素Ｓａｌ　ｌ　（
宝酒造（株）製）／θ０ユニット、ＮａＣＡ’　／！；
ＯｍＭを加えて３７ｃｃで７９時間インキュベートし、
反応停止後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ１．３−％
ポリアクリルアミドケ゛ルー電気泳動に付１〜、その後
ゲルから抽出を行゛つて精製した。この結果、第１図に
示す本発明のヒト生長ホルモ７８部分の遺伝子３μｇ　
を得た。

実施例乙 実施例３で得られたＡ部分のオリゴヌクレオチ０３つの
群に分けて、実施例ダと同様に（ただしＵＯとＬｏはリ
ン酸化しない）反応を行い、次いで得られたフラグメン
トをそのまま用い、実施例ｙと同様にリン酸化反応、結
合反応を行った後、制限酵素Ａｌｕ　Ｉ　（宝酒造（株
）製）／！；０ユニットを加えて、３７０ｃで／グ時間
インキュベートした。

次いで、制限酵素Ａｌｕ　Ｔ　（宝酒造（株）製）　／
、２０ユニツト、ＮａＣ／　／３！ｒｍＭ　、　Ｄ　Ｔ
　Ｔ　！；ｍＭを加えて３７旬で７１１時間インキュベ
ートし、６３旬でＳ分間処理し、次いでフェノールを加
えて除たん白して反応停止後、ＤＮＡをエタノールで沈
殿させ、／θチポリアクリルアミドｒル電気泳動に付し
、その後ゲルから抽出を行って精製した。この結果、第
１図に示す本発明のヒト生長ホルモンＡ部分の遺伝子０
．３μｇ　を得た。

プラスミドの調製 実施例７ （、）培　養 前記ＣＴ／株（微工研菌寄第１．ｇ／７号）をＰＢＢ　
（プリ４デトン１０ｇ、肉エキス／θｇ。

ＮａＣＡ！　：Ａ−左９　、必要ならイーストエキス２
ｇを加える；水／ｌ、ｐ■’７．０）培地ｇｏｏ−に３
７°Ｃで通気培養する。菌がλ〜３Ｘ　／　０８／ｄｔ
で生えたところマクロラムフェニコールを最終濃度約／
ＳＯμｌ／ａｔになるように加え、そのまま３７°Ｃで
ｇ〜７６時間培養する。

（ｂ）　　　抽　　　出 培伴液ｑθθｍｌから集めた菌体（θ、Ｓ〜／、５ｇ）
を約３０ｍｌのＴｒｉｓ　−ＮａＣ６に懸濁し、容ｉ　
４’　Ｏｍｌの冷却遠心機用遠心管に移し、’ｔ、ｏｏ
。

ｒｐｍ、７分間遠心して沈殿させる。７０−のＴＥ−蔗
糖を加えて懸濁し、θ、θｊ　ｍｌ　ＲＮａｓｅ、／−
リゾチームを混ぜ、ｏｃＣｓ分間放置する。

その後、３．　ｍｌのθ、、ｔＭ　ＥＤＴＡ　を加え、
さらにＯ（，７０分間置く。この処理で懸濁液はやや粘
性をもつ。これに／ＡｍｌのＬｙｔｉｃ　Ｍｉｘｔｕｒ
ｅを一気に加え、ただちに遠心管の口を閉じて容器を数
回反転して全体を均一にする。懸濁液は透明で粘性をも
った溶菌液と々る。このままθｃｃで／５分間程度ある
いはそれ以上放置後、θ（で／左、０００〜／ｇ、θ０
０　ｒｐｍ、　３０分間遠心する。

３０分間遠心する。これでプラスミドＤＮＡカニ含まれ
る上清とゲル状に々つだ宿主染色体ＤＮＡや＃ｌ胞売面
物質が含まれる沈殿に分かね、る。上′ｍを静かに同じ
大きさの遠心管に移す。液の重さを計り、比重／として
体積に概算する。約３Ｑｍｌのｃｌｅａｒｅｄ　１ｙｓ
ａｔｅ　　が得られる。

用いた試薬は、それぞれ次のものを示す。

Ｔｒｉｓ　−ＮａＣｒ：　／　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸
緩衝液、０、　／’ｆ’　Ｍ　ＮａＣ＋！、ｐＨｇ　。

ＴＥ−蔗糖：８〕蔗糖（ｗ／ｖ　）、３０　ｒｎＭＴｒ
ｉｓ−塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、　　　ｐＨｇｏ リゾチーム：１０■／　ｍｌリゾチーム、θ、Ｑ３−Ｍ
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、ｐＨｇ　０ θ、りＭＥＤＴＡ：　　ｐＨｇｏ ＲＮａｓｅ　　　：　　０−０１１　Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ
、ｔに１０■／　ｍｌめ濃度に溶かし、／θθ実 でＳ分間加熱処理する。

Ｌｙ　ｔ、ｉ　ｃλ４１ｘｔｕｒｅ　：　０−／　％　
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−／θθ、！；　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ
−塩酸緩衝液、６２、Ａｒ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨざ
。

（Ｃ）　　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による濃
縮およびＥ　Ｒ−ＣｓＣ／　平衡密度勾配遠心ｃｌｅａ
ｒｅｄ　１Ｙｓａｔｅ　　にその４重量のＰＥＧ粉末お
よび４容量の３　Ｍ　ＮａＣ１を加え、マグネチツクス
ターラーで完全に溶解させる。マグネットを刺り除きθ
旬で３時間以上／晩８度放置した後、１０．００Ｏｒｐ
ｍ、　／　０分間遠心するとうす茶色の粘枯々沈殿が得
られる。上清には蛋白質とＲＮＡ断片の大半が含まれて
いるのでこれを傾けて捨てる。沈殿にはプラスミドＤＮ
Ａが回収される。

遠心管の口を下にして斜めにねかして置き上清をできる
だけ除く、４００ｍｌ培養の標準スケールから調製した
場合、この沈殿を３ｄのＴＥによく溶かしスぎンコの１
Ｉｏ−＋たは３０番の遠心管に移す。さらに少量のＴＥ
を加えて全体を正確にグ、７６ｇ　（比重／としてグ、
り乙ｍｌ　）　　にする。

これに！；−００１１Ｃ８Ｃｌ、　０．タブＥＢ溶液を
加えよく混合する。多量、たとえばｇｅの培養液から出
発した場合、前記処決に従って３００ｍ１のＣ１ｅａｒ
ｅｄ　１ｙｓａｔｅ　　を調製し、ＰＥＧでＤＮＡを沈
殿させた段階でいったんフェノール処理を施した方がよ
い。このために沈殿を／ＩＩ／のＴＥに溶かし、／Ｑｍ
ｌの水飽和フェノールを加えて乳化後、イ氏速遠心して
、２層に分ける。上にくる水層を回収し、コ容のエタノ
ールを加える。θ℃１．２０分後１０　、００Ｏｒ　ｐ
ｍで１０分間遠心し、上清をよく除き（沈殿が流出しな
いよう釦注意して倒立しておくか、あるいはデシケータ
−内で脱気によりアルコール分を除けばよい）、沈殿を
ｑｍｔのＴＥ　−５ａｒｋｏｓＹ１によく溶かし、さら
に少量のＴＥ　−５ａｒｋｏｓｙ１で７．忙ｇに調整す
る。こ力、に／　０１　Ｃ５ＣＡ’　、　　／　ｍ１Ｅ
Ｂ溶液を混ぜてｊ本の遠心管で遠心する。

遠心は約コθヤ、３Ａ、Ｃ００ｒｐｍ　　で／ｇ〜３６
時間行々時間連々後ブレーキを使わずに停止させ、遠心
管を静゛かに取シ出す。ＥＢの色が遠心管の上部から底
にかけて薄くなっており密度勾配ができていることがわ
かる。暗室でブラックランデ（３乙Ｏｎｍ　）　　で照
らすと試料の下からλの位置にプラスミドｃｃＤＮＡの
・ぐンド、上から／の位置にＯｅ　および染色体断片の
ＤＮＡのバンドが黄緑１体に光って見える（／μｙ　の
Ｄ　Ｎ　Ａがあれば十分検出できる）。下のｃｃＤＮＡ
バンドを注意してなるべく幅狭く回収する。

用いた試薬は、それぞれ、次のものを示す。

、＋ｑ　ＩＪエチレングリコール（ＰＥＧ）　ＡＯθ０
：７級の粉末でよい。

３　Ｍ　ＮａＣ１、Ｃｓ　Ｃ１固体。

ＥＢ溶液：エチジウムブロマイドを水に対してＬ乙７　
ｍ９　／　ｍｌ　ＶＣなるよう？１ｌＪｌ、光をさえぎ
ったビンに入れｌＩ旬で保存。

Ｔ　Ｅ　；　／　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、／ｍ
ＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　　ｐＨ７，ゲ。

ＴＥ　−５ａｒｋｏｓｙｌ　：　／　ＯｒｎＭ　Ｔｒｉ
ｓ＝塩酸緩衝液、／　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０−．３ｇ　
％５ｏｄｉｕｒｎ　Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌ Ｒａｒｋｏｓｉｎａｔｅ　、　ｐＨ７，ｔＩ。

（（１）　　ｒル濾過法による除ＲＮ　Ａ　４１ｖ！作
ＴＥＮ（／θｒ１Ｍ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、／　ｍＭ
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　０．／　ＭＮａＣｌ、　ｐＨ７，
１りで平衡化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−ｌＩＢ
カラム（ｏ、ｇｘｘｏｃ−ｍ＞を用意する。これにＥＢ
−ＣｓＣｌ遠心で得たｃ　ｃ　ＤＮＡ画分（θ、ｓ〜θ
、ｇｍｌ）をそのま捷加え、ＴＥＮで自然流出法により
ｒル濾過を行なう。波長、２　ｇ　’Ｉ　ｎｍにおける
吸光度でモニターすると約３　ｍｌのｖｏｉｄ　ｖｏｌ
ｕｍｅが流出したところでＤＮＡ両分が出、遅れてＲＮ
Ａ画分、さらに続いてＥＢやＣ８Ｃｌが出てくる。ＤＮ
Ａ画分に和尚する吊初のピークを集めてＴＥに透析する
かエタノール沈殿で濃縮するとともにエチジウムブロマ
イドを除くと約７００μｇ　のプラスミドｐｃＴ／が得
られた。

実施例ｇ 前記Ｔ（ＧＨＣ／株（微工研菌寄ｘ＜ｂｇｉｂ号）を、
実施例７と同様に培養□及び後処理を行って、プラスミ
ドｐＴ（ＧＨＣ／を約ｌθ０）ｔｇ　　得た。

実施例ヲ 前記ＨＧＨＢＪ株を、実施例７と同様に培養及び後処理
を行って、プラスミドｐＨＧＴ（：ｌを約／、ＩＯμ２
　得た。

実施例／θ Ｂ部分遺伝子（／μｇ）・とＣ部分遺伝子（／μｇ）を
前記１ｉｇａｔｉｏｎ　　パシファー中ＴｑＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造（株）製）（＆Ｕ）を加え７０時間、コθ
％でインキュベートし、６！ｒｃｃで３分間加熱して反
応を停止した。得られたＢ、Ｃ部分結合遺伝子フラグメ
ントをエタノールで沈殿させ、制限酵素５ａｉｌ（宝酒
造（株）製）（５０’Ｕ）を加え、５７７（で９時間イ
ンキュベートした。次いで制限酵素Ａｌｕ　１　（宝酒
造（株）製）（／、Ｍ７Ｕ）を加えて、３７旬で３時間
インキュベートし、Ａ＆’Ｃｆ＆分間処理して反応を停
止した。得られたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、１０
％＃リアクリルアミドｒル電気泳動に付し、その後、ゲ
ルから抽出を行って精製し、Ｂ、Ｃ部分結合遺伝子θ、
７５μｇを得た。

実施例／／ Ｂ部分とＣ部分遺伝子の結合遺伝子０．７μｇとＡ部分
の遺伝子θ、／μＩ　をＴｌｌＤＮＡりが一部（全酒造
＠）製）ｊＵを加え、前記１１ｇａｔｉｏｎバッファ中
、７０時間、２０ｃｃでインキュベートしたｔ３旬で３
分間加熱して反応を停止点せた後、得られたＤＮＡフラ
グメントをエタノールで沈殿させ、制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ
　（ペーリンガーマンハイム社製）／３Ｕを加え、３７
ｃｃ、、３時間インキュベートした。次いで制限酵素Ｓ
ａｔ　Ｔ　（全酒造（株）製）左θＵ　、　ＮａＣ１／
　７　ｊ　ｍＭ、　　β−ＥｔＳＨ７ｍＭを加えて、更
に３７ｏｃで３時間インキュベートシ、上記と同様に反
応停止後ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、本発明のヒト
生長ホルモン遺伝子を得た。これは、そのまま次のプラ
スミドの挿入に用いた。

実施例７．２ 前記プラスミドｐＣＴ／　／θμ１１緩衝液（３□ｍＭ
　　）リス−ＨＣ／　　ｏ　ｐＨ７，、ｔ）、（，７ｍ
Ｍβ−Ｅ　ｔ　ＳＨ）／θμｉ　、水３０．７３μｌ　
、制限酵素Ｃ１ａ　Ｅ　（ヘーリンガーマンハイム社與
）９Ｕ（総量３０μ））を加え、３７（で左〜Ａ時間時
間インキュトート。その後、θ１．２Ｍβ−ＥｔＳＨ３
ｔｉｌＳ！ｒＭ−Ｎａｃｌ　２ｔｔｌ制限酵素Ｓａｌ　
ｇ　２θＵ、水／　ｍｌ　（総量／　Ｏａｌｊ　　を加
工、更に３７°Ｃで、／夜インキュベーションした。

次いでフェノールを加えて逆抽出した後ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に付した。その後、低融点アガロースゲルに、上記電気
泳動のバンドを移し２、バンド・トランスファー抽出を
行い、はぼ定量的に、開環したプラスミド（第６同左か
ら二番目参照）を得た。次いで実施例／／で得られたヒ
ト生長ホルモン遺伝子と、上記開環したプラスミド及び
ＴｌｌＤＮＡりが一部３Ｕを、前記１１ｇａｔｉｏｎ　
　バッファー中に加え、２０Ｏｃ、１時間反応させて、
ヒト生長ホルモン遺伝子を挿入した（プラスミドｐＨＧ
Ｈ／）次いで、前記ニジエリチア・コリＨＢ１０／　（
宿主菌株）を、実施例りと同様に、Ｏ，Ｄ　　　Ｏ，θ
６〜０．θｇ°６５０ （〜３　Ｘ　／　０８　ｃｅｌｌ／　ｍｌ　）ｔで培養
し、集菌した。

これに前記得られたプラスミド及びＳθｎＩＭ　ＣａＣ
ｌ２を加え、０°Ｃで３０分間処理してトランス７オー
ムした。アン２シリン（Ａｐ）　Ｊ　Ｏμ、ｉ７　／　
ｍｌを含む寒天培地上に、）ランスフオームした菌を植
え、ＡｐＲの細胞を選定し、集めた。かくして、本発明
のヒト生長ホルモン遺伝子を含むプラスミドｐＨＧＨ／
　　を含む菌、ニジエリテア・コリＦＴ　Ｇ　）Ｊ　／
を得た。

実施例／３ 前記ＨＧＨ／株（昭和ｓｇ年７月７日付和光郵便局書留
郵便物引受番号３左２）を実施例７と同様に培養及び後
処理を行って、プラスミドｐＨＧＨ／を約／り０μｇ得
た・

【図面の簡単な説明】

第７図は、プラスミドｐｔｒｐＥＤ　３−　／のトリプ
トファンプロモーター領域から切り出される約３０θの
塩基対を示す模式図であり、第２図は切り出された３θ
Ｏの塩基対を、リンカ−を介してシラスミドｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ　　切断部に挿入した状態を示す模式図
であり、汝３図は、プラスミドｐｏｃ’ｒｘ　−９の模
式図であり、第グ図■はプラスミドｐＯｃＴ２−９から
プラスミドｐＣＴ／　　を合成する経路を示す模式図、
■はの部分の拡大詳′踊図、■は０部分の拡大詳細図で
あり、第夕図ＩはプラスミドｐＣＴ／のマツプを示し、
■は０部分の拡大詳細図であり、第６図はプラスミドｐ
ＣＴ／からプラスミドｐ）（ＧＨＣ／を合成する経路を
示す模式図であり、第７図は、プラスミドｐＢＲ３，２
−からプラスミドｐＨＧＨＢｕを合成する経路を示す模
式図であり、第ｇ図は、本発明方法によりヒト生長ホル
モン遺伝子を合成する全経路を示す模式図である。 手続補正書（方式） １　事イ′１の表示　　昭和　５ｇ　年　特４′「願　
　第　７６　グ　　　号２　発明の名称　　　ヒト生長
ホルモン遺伝子の合成法ｊ３　　補正をする省゛ 事件との関係　　出願人 名称　（６７９）理化学研究所 ４、代理人 ５、補正命令の日付　　昭泪１１’年ｌＡ月！乙日６、
補正の対象　　明細１甫　　全図面■、小事件表示　昭
和ｊ♂年特許願第　タ乙７　　号２、発明の名称　　ヒ
ト生長ホルモン遺伝子の合成法３　補正をする者 事件との関係　　出屡１人 名称（６７９）理化学研究所 ４代理人 ７　補正の対象　　明細書の発明の詳細な説明の欄８　
補正の内容　　　　　　　　　　、て１て］キ＼、（１
）昭和ｊｇ年ｊ月７２日付提出の全文訂正明細書の記載
を下表のとおシ訂正する。 （２）同書第３７貞乙行の１引受番号３３．２）。′の
次に下記の文を加入する・ 「上記ＨＧＨ−／株の受託番号は機工′研菌寄第乙と６
を号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−乙ど６乙）（受託日昭和よざ年
り月／θ日）である。」 （３）同書第乙０頁／行の１３０分間遠心する。、′を
削除する。 添付書類 （１）　　微生物受託証 （２）微生物寄託証明願及び証明書 昭和　　年　　月　　　日 ４．７．７１　　”１“１官　　若　　杉　　和　　夫
　　ヶ３、補正ヤする者 事件との関係　　出願人 名称　（６７９）理化学研究酒 ４、代理人 ７　補正の対象　　明矧１書の発明の詳ａ１なＩｖ５２
ＢＡの欄８、補ｊ「の内容　　　　　　　　　　　−１
−′″黴゛。 ・°＄３庁“〜 書第３２頁第６行とｍｌ−行の間に次の文章を挿入する
。 「本発明のヒト生長ホルモンの遺伝子の発現は、通常の
方法によシ行うことができる。すなわち、カザアミノ酸
、グルコース等を含む培地で、３０〜３７℃でインキュ
ベートシ、菌体濃度が一定の値（例えば０Ｄ６６ｏ〜０
．θ）：　、５’　Ｘ　／　０７ｃｅｌｌｌ　／　ｍｌ
　）　ＶＣなった時、ｔｒｐプロモーターのインデユー
ザーであるβ−インドールアクリル酸等′ｆｔ加工、更
にインキュベートシ続ける。その後、菌体濃度が一定値
に乏った時（例えば、３．３　Ｘ　／　Ｏｃｅｌｌ　／
ｖｔ　）、集菌、リゾチーム等による溶菌処理後、ラジ
オイムノアッセイ法によって）ＩＧＨ抗体への結合活性
でタンパク量を求めることができる。」（２）同明細書
第６ｒ頁第１Ｉ行と第１．ｌ！行の間に次の文章を挿入
する。 「実施例／≠ 実施例／、２で得られた・８０８７株（微工研菌寄第６
に乙６号）をｊψターｏ、ｊ％カザアミノ酸−〇、、２
９（、グルコース培地で、３７℃でインキュベートシ、
ＯＤ　　　〜０．０：２ＣＪＸ１０’６０ ｃｅｌｌ　／ｌｎｉ　）になった時、β−インドールア
クリル酸（ＩＡＡ　：　ｔｒｐプロモーターのインデュ
ーザー〕を添加しく　）Ｊｕえない場合は、等量のエタ
ノールｆｒ刀１１える〕、更に、インキュベートを続け
、ＯＤ　　　−０，／〜０．／　／　（３，６Ｘ６０ ／　Ｏｃｅｌｌ／ｌｄ　）にｌった時に集菌した。 集菌した細胞をリゾチームで溶菌し、得られた溶菌物を
ＰＨＡＤＥＢＡＳ　：ヒト生長ホルモン（ＨＧ　Ｈ）φ
アッセイ・キットを用いて調べた。 Ｈａ　ＨＭ、体の結合しているペーパｍ−ディスクに、
この゛溶菌物の希釈液を加え、反応後、更に［ＩＩＨＧ
Ｈ抗体を加え反応した。標準曲線から、ＨＧＨ抗体への
結合活性で、タンパク■を求めると第４Ｌ表のような結
果を得た。なお、ＣＴ／株も同様な条件にて反応を行い
、比較した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）デオキシグアノシン、デオキシシチジン、デオキ
   シアデノシン及びチミジンのそれぞれの３７−エステル
   から選ばｎる７種と、一般式：（ただし、式中、Ｂ及び
   Ｂ′は、４−Ｎ−ベンゾイルアデニン−デーイル、　　
   ４−Ｎ−ベンゾイルシトシン−／−イル、　　２−Ｎ−
   イ；ツブチリルグアニンーデーイル、　チミン−／−イ
   ル基を示し、同−又は異っていてもよい。）で表わさｎ
   るジヌクレオシドを固相法により順次縮合させ−で得ら
   れるフラグメント群を　ｊ／　−酵素的リン酸化とＤ　
   Ｎ　Ａ　リガーゼによる結合反応を行って、塩基配列： １　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   １０Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ
   　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＡｓｐＣ
   ｌａ　Ｉ　　　　　　　ＵｏＨｉｎｆ　　　　Ｕ１０ Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇ
   ｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒ。 ５Ｕ６ ＣＴＧ　ＴＧＡ　ＡＴＧ　ＧＴＣＣＴＣＡＡＧ　ＣＴＴ
   　ＣＴＴ　ＣＧＴ　ＡＴＧ　ＴＡＧ　ＧＧＣ△　　　　
   　　　　　　　　　　　△ Ｌ４　　　　　　　　　　　　　　Ｌ５Ａｓｎ　Ａｌａ
   　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　
   Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ２Ｕ
   ３Ｕ４ ０ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ７ ハ Ｌ６　　　　　　　　　　　Ｌ７ を有するヒト生長ホルモン遺伝子Ａ部分（以下“Ａ部分
   ”と称する）、塩基配列： ３０ １２０ ”＋４　　　　　　　　ハ　　　　　　　Ｉ、１５　　
   　　　　　　△を有するヒト生長ホルモン遺伝子３部分
   （以下、”Ｂ部分”と称する・）及び塩基配列：１４０ １６す １８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　１９０５０ ７０ を有するヒト生長ホルモン遺伝子Ｃ部分（以下”Ｃ部分
   ”と称する）をそれぞれ合成し、Ａ部分、Ｂ部分、Ｃ部
   分を順次ＤＮＡ！Ｊガーゼで結合せしめることを特徴と
   する、塩基配列：ａ　　ＨＱ　＜ 、　ｇＢ　　ｇ、＝　ｇｉ　　　；　ｇ：）　　峰ｊｊ
   ｊ　　　：　Ｈ”＝Σ　　＜ト ：・ｈ　　　号ミＥ　　８名８Ｕ　　　　七　８８２；
   　に１＋５′）ＣＪ　Ｑ　　　　　←　ト＜　　　　←
   　く←　　　　ｌ　←クー〉　　じＯｉ轢Ｊ　く３妊　
   　：七ご　弓片禅　　二８）３ω　　−＜　　　　　　
   　　　　　　　　　　　く　　。Ｑ層重 む同　　２り戸 Ｐ　Ｑ　ｇｃ、　　　５−３ト ａ　哩　　　＝　　目 〉　　　００ 會：、　３Ｅ　　　　、　　・・　　・・・・Ｃｕ８定
   　　　＝６８８ よ　渋ゴ　　　３　荘　　　ｒ　しご ＜ｏ（６ 魯、２計　　；騎鍔　　時ｋｇ ００　３ｔ　　　　　　　石・−ａ、　　　　　二δ目
   く５ピ「：（ご ＜　叩　　　　々　８８ を有するヒト生長ホルモン遺伝子の合成法。