JPS63159397A - 組換えｂ型肝炎ウィルス抗原 - Google Patents

組換えｂ型肝炎ウィルス抗原

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JPS63159397A
JPS63159397A JP62112629A JP11262987A JPS63159397A JP S63159397 A JPS63159397 A JP S63159397A JP 62112629 A JP62112629 A JP 62112629A JP 11262987 A JP11262987 A JP 11262987A JP S63159397 A JPS63159397 A JP S63159397A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 組換えＤＮＡ分子およびそれにより変異されてＨＢＶ抗
原性を示すポリペプチドとそれをコード化する遺伝子と
を生産する宿主、ならびにこれらの分子、宿主、遺伝子
およびポリペプチドの製造および使用方法が開示される
。本発明の組換えＤＮＡ分子は、Ｉ（ＢＶ抗原性を示す
少なくとも１種のポリペプチドをコード化する構造遺伝
子を特徴とする。適当な宿主において、これら組換えＤ
ＮＡ分子は、ＨＢＶ抗原性を特徴とする遺伝子およびポ
リペプチドの生産および同定と、組成物中におけるそれ
らの使用と、人間におけるＨＢＶビールス感染を検出し
てこの感染に対する抗体の生産を刺戟する方法とを可能
にする。
本発明は、組換えＤＮＡ分子およびその製造方法に関す
るものである。さらに詳細には、本発明は、適当な宿主
生物において表現きれる組換えＤＮＡ分子に関するもの
である。本明細害中に開示する組換えＤＮＡ分子は、肝
炎Ｂビールス抗原の特異性を有するポリペプチドをコー
ド化するＤＮＡが特徴である。以下の記載から了解され
るように、組換えＤＮＡ分子は、人間における肝炎Ｂビ
ールスの検出およびこのビールスに対する人間における
抗体の刺戟のために使用することができる。
肝炎Ｂすなわち血清肝炎を引き起こすビールスは、人間
のみに感染すると思われ、人間における肝炎Ｂビールス
（「ＨＢＶ」）感染は蔓延している。英国、米国および
西欧において、全供血者の約０．７　％はＨＢＶの慢性
保菌者である。
ビールス性肝炎による死亡率は高くないが（英国におい
て／り７よ年には１００万六当９３人であった）、英国
における人口のｊ％および米国における人口のｌ！チと
いう多くが感染していると示されている。多くのアフリ
カおよびアジア諸国においては、人口の２０％までがＨ
ＢＶの慢性保菌者であり、これら諸国における全成人の
１０％以上がＨＢＶに感染したかまたは感染している。
肝炎の感染は、３つの一般的機作によって伝染される。
すなわち、（１）輸血におけるような多量でまたは事故
による皮膚刺通を介するような少量で、感染された血液
もしくは体液が非経口的に接種されることによるもの、
（２）近親または性交渉によるもの、および（３）妊娠
中に感染した母親が新生児にビールスを移すことによる
ものである。自然条件下では、Ｉ（ＢＶは大して感染性
の高いものでない。呼吸による伝染は、あったとしても
稀である。
大抵のＨＢＶ感染は準臨床的のものである。
臨床的疾病は通常３〜６週間続き、疾病塵において軟度
乃至急性電撃肝炎次いで肝硬変または死亡までの範囲に
わたる。臨床的および準臨床的なＨＢＶ感染からの回復
は通常完全である。
しかしながら、成る場合には重度の長期結果が生ずる。
（１）急性感染の約！チは肝炎Ｂビールス抗原の慢性保
有者であり、他人に対する感染潜在力を継続して有する
と共に肝臓損傷を進行させており、また（２３　ＨＢ　
Ｖによる過去の感染は慢性型活性肝炎、肝硬変および第
−期肝臓癌というＨＢＶ−血清陰性例の相当な割合を開
始させる完全なまたは部分的な原因となシうる。
分子生物学における最近の進歩は、特異的非細菌性成熟
核蛋白質をコード化するＤＮＡを細菌細胞中に導入する
ことを可能にした。一般に、化学合成により製造したも
の以外のＤＮＡを用いる場合、組換えＤＮＡ分子の構成
は、所望の蛋白質に対する精製メツセンジャー（ｍＲＮ
Ａ）雛型の単一鎖ＤＮＡコピー（ＣＤＮＡ　）を生成さ
せ、とのｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換し、このＤＮＡ
を適当なりローン用ベヒクル（ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｈｉ
ｃｌｅ　）における適当な部位に結合させそしてその組
換えＤＮＡ分子により適当な宿主を変異させる手順から
なっている。このような変異により、宿主は所望の蛋白
質を生産することが可能になる。さらに、少なくともオ
バルブミンＤＮＡの場合、強力な細菌促進子または表現
調節順序に対する特定ＤＮＡの適当な融合は、より大量
の所望オバルブミン蛋白質、すなわち大腸菌（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）細胞の全蛋白質の約Ｏ！〜／％を生成させること
か知られている（オー・メルセローープイジャロン等、
「組換えプラスミドを有するイー・コリに／ｌによるオ
バルプミン状蛋白質の合成」、ネーチャー誌第２７よ巻
第ｓｏｒ〜ｊｌＯ頁（ｌり７♂）ならびにティー・エッ
チ・フレーザーおよびビー・ジエー・ブルース、「雛鳥
オバルプミンはイー・コリにより合成かつ分泌される」
、プロシープインク・ナショナル・アカデミ−・サイエ
ンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、、第７ｊ巻、第ｊり３６〜ｊ２弘Ｏ
頁（ｌり７ｔ））。
数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、組換えＤＮＡ技
術を用いて合成された。これらには、ラッテのプロイン
シュリン抗原決定子を示す蛋白質（エル・ヴイラーコマ
ロフ等、［プロインシュリンを合成する細菌クローンＪ
１プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエ
ンス、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、第７Ｓ巻、第３７２７〜３７
３／頁（／ｙ７Ｊ’））、　　ラッテの成長ホルモン（
ビー・エッチ・シープルク等、「細菌による成長ホルモ
ンの合成」、ネーチャー誌、第２７６巻、第７！Ｐｊ〜
７り１頁（ｌり７１））、ねずみのジヒドロフオレート
レダクターゼ（ニーゆシー・ワイ・チャンク等、「ねず
みのジヒドロフオレートレダクターゼをコード化するＤ
ＮＡ順序のイー・コリにおける表現型式」、ネーチャー
誌、第２７５巻、第６７７〜乙コ弘頁（／り７ｇ））、
ソマトスタチン（ケー・イタクラ等、「ソマトスタチン
ホルモンに対する化学合成された遺伝子のイー・コリに
おける表現」、サイエンス誌、第１９１巻、第１Ｏｊ４
〜１０６３頁（ｌり７７）、ならびに英国特許第２００
ｚＡ７！Ａ号、第２００ｚｌａ７６Ａ号オヨび第ＱＯＯ
Ｉ、７２３Ａ号明細書およびそれらの他国出願）、およ
びひとインシュリンのＡおよびＢポリペプチド鎖（ディ
ー・ヴイー・ゲデル等、「ヒとインシュリンに対する化
学合成された遺伝子のイー・コリにおける表現」、プロ
シープインク・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、
Ｕ、Ｓ、Ａ、、　第７　Ａ巻、第１０６〜／１０頁（ｌ
り７り）および上記英国特許明細書）が包含される。
しかしながら、本発明とは異なり、上記のものはいずれ
もたとえば肝炎Ｂビールス抗原のようなビールス性蛋白
質の組換えＤＮＡ合成に向けられていない。
ＨＢＶ感染は、ビールスの抗原に対して抗体の発生を惹
起することが知られている。これらの抗体は、ＨＢＶ感
染に対する人体の防禦メカニズムである。露呈前におけ
る或いは潜在露呈の場合における急速なこの種の抗体の
発生は、ビールス繁殖を実質的に減少させかつ撲滅する
と共に患者中に広がる。
しかしながら、肝炎Ｂビールスの抗原に対する人工的刺
戟による抗体の発生の問題は、このビールスの限られた
宿主範囲に生ずる。たとえば、人間に対し極めて感染度
が高いが、肝炎Ｂビールスによる実験的感染は、その他
二三の霊長類にしか得られなかった。また、このビール
スは組織培養においては繁殖されなかった。この限られ
た宿主範囲および組織培養細胞の感染不能は、ビールス
とその感染病理学の特性化ならびに迅速検出手段と感染
抑制および予防の効果的手段の開発を著しく妨げている
。
抗体を発生させまた感染を検知するため、ＨＢＶ感染の
犠牲者から単離された真正ＨＢＶビールス抗原を使用す
る試みが幾つかなされたが、これらの処置は活性株の供
給に限度があるため一般的に利用できない。さらに、こ
れら抗原を得るため人間を原材料として使用することは
、人間の単離物を使用する際の周知された汚染問題のた
め好ましくない。
本発明は、ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドをコード化
する構造遺伝子を特徴とする組換えＤＮＡ分子を本発明
により提供して上記の諸問題を解決する。
本発明によれば、ワクチン展進のためならびにビールス
感染の検知およびその病理学と分子生物学の決定に使用
するため、Ｊ（ＢＶ抗原および遺伝子を汚染されていな
いかなりの量で得ることが可能となる。このような供給
物は、このビールスの狭い宿主範囲および組織培養にお
ける繁殖不能のため、従来入手できなかった。
以下の記載から判るように、本発明の組換えＤＮＡ分子
は、適当な宿主において、ＨＢＶ抗原性を示す少なくと
も７種のビールス性ポリペプチドおよびそれをコード化
する構造遺伝子を生成させることができる。これら組換
えＤＮＡ分子と宿主とを用いて、ＨＢＶ抗原性を示すポ
リペプチドとこれらポリペプチドをコード化する構造遺
伝子とを製造することができる。これら生産物はまた同
定かつ特性化されうると共に、宿主中で生成されたまま
の状態で或いは適当に誘導体化もしくは改変した後に、
これら生産物自身の製造を改善する組成物および方法に
使用でき、またＨＢＶ感染を検知し、その病理学を追跡
しかつ人間におけるＨＢＶ抗体の生産を刺戟する組成物
および方法に使用することができる。
さらに本発明によれば、ディン粒子（ＤａｎｅｐａｒＬ
ｉｃｌｅ　）の内生ＤＮＡから調製されたＤＮＡ順序を
ゲイン粒子以外の材料源から調製された他のＤＮＡ順序
に結合させることを特徴とする、組換えＤＮＡ分子の製
造方法が提供される。
本発明の方法は、上記した従来の方法とは次の点で区別
することができる。すなわち、従来法はいずれも組換え
ＤＮＡ分子を構成するための特定蛋白質を得る目的でま
たこの蛋白質もしくは遺伝子を生産する目的で天然遺伝
子またはＤＮＡを使用しない。その代りとして、従来法
は化学合成によシ作られた合成遺伝子またはｃＤＮＡ順
序を作シ出すため供与体細胞から単離されたｍ　ＲＮ　
Ａを酵素的に転写することによシ作られた人工遺伝子の
いずれかを使用する。
蛋白質の組換えＤＮＡ合成において天然ＤＮＡが従来直
接に使用されなかった理由の一つは、大抵の高等生物か
らの天然ＤＮＡおよび少なくとも成る種の動物ビールス
が［イントロン（Ｉｎｔｒｏｎ　）　Ｊすなわち付加的
なヌクレオチット順序を遺伝子の一部として含有するこ
とである。
これらイントロンは、遺伝子の最終的伝達体の一部を形
成しない。寧ろ、それらは高等生物において一次転写生
成物に作用する特殊処理酵素により生体内で除去されて
遺伝子の最終的メツセンジャー（ｍＲＮＡ）を与える。
細菌はこのようなイントロンを処理するのに使用できな
いと思われ、したがって天然ＤＮＡは細菌宿主において
表現することが期待されずまた所望の蛋白質はこれら宿
主により生産することが期待されないであろう。
第１図は、ゲイン粒子の内生ＤＮＡの構造を示す略図で
ある。これは一本の補完的ＤＮＡ鎖すなわちストランド
ａとｂとを示し、さらにストランドａにおける割目とス
トランドｂにおける間隙とを示すと共にこの間隙がＤＮ
Ａポリメラーゼ反応によシ閉鎖されることを示している
。
第２図は、本発明方法の好適具体例の略説明図であり、
ゲイン粒子から単離された内生ＤＮＡの断片は大腸菌（
イー・コリ）ベニシリナーゼ遺伝子に対しプラスミドｐ
ＢＲ３２２上のＰｓＬＪ部位に融合される。イー・コリ
ＨＢ１０／に変異した後、組換えＤＮＡ分子ｐＢＲ３，
２２−Ｐｓｔｌ　ｄＧ　：　ＨＢＶ−Ｋｐｎ　ｌ　ｄＣ
はＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドの合成に向けられる
。
第３〜り図は、本発明により肝炎Ｂビールスゲノムの一
部について決定されたヌクレオチット順序を示している
。順序は、その上部に示された３つの読み枠における停
止コドンにより示される。本発明で決定されたＨＢｃＡ
ｇをコード化する遺伝子については、開始コドンから任
意にナンバーが付される。ヌクレオチット−♂Ｏ〜−７
はこの遺伝子に先行する主順序を示す。
ヌクレオチット／〜ｊ≠りは肝炎Ｂビールス核抗原をコ
ード化する遺伝子につきヌクレオチット順序を示し、こ
の抗原のアミノ酸順序（読み枠ｌ）はその順序の上部に
示される。ヌクレオチット７μ３７〜２／／弘は肝炎Ｂ
ｇ−ルス表面抗原の遺伝子につき決定されたヌクレオチ
ット順序を示し、この抗原のアミノ酸順序（読み枠３）
はその順序の上部に示される。これら遺伝子における各
種の制限エンドヌクレアーゼ識別部位についても第３〜
り図に示される。
第ｉｏ図は、本発明方法の略説明図でちゃ、ここで肝炎
Ｂビールス核ｔ　原性を示すポリペプチドを生産するこ
とのできる組換えＤＮＡ分子は断片化され、この断片は
改善された表現制御順序、すなわち迦系に付加される。
第１１図は、本発明方法の略説明図であシ、ここで本発
明の組換えＤＮＡ分子は断片化されかつファージＤＮＡ
の断片に結合され、これは宿主細胞を溶菌させることに
よシその中に遺伝子コピーの数を増加させる際に使用さ
れる。
第７２図は、本発明方法の別の具体例の略説明図であシ
、ここで肝炎Ｂビールス核則日ト示すポリペプチドを生
産しない本発明の組換えＤＮＡ分子は断片化されてＨＢ
ｓＡｇに対する構造遺伝子が除去され、この構造遺伝子
を使用して組換えＤＮＡ分子を生成、させ、それにより
適当な宿主においてＨＢｓＡｇを生産する。
本発明をさらに充分理解しうるよう、以下詳細に説明す
る。
以下の記載において、下記の用語を使用する。
ヌクレオチット：糖部分（ペントース）と燐酸部分と窒
素系複素環塩基とからなるＤＮＡもしくはＲＮＡの単量
体単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントースのｌ′
炭素）を介して糖部分に結合され、塩基と糖との結合・
物はヌクレオシドである。塩基はヌクレオチットを特性
化する。矢種のＤＮＡ塩基はアデニン（”Ａ”）、クア
ニン（”Ｇ“）、シトシンじＣ”）およびチミン（”Ｔ
”）である。を種のＰ、　Ｎ　Ａ塩基はＡｌＧ、Ｃおよ
びウラシル（”Ｕ”）である。
ＤＮＡ順序：隣接するペントースの３′炭素とｊ′炭素
との間のホスホジエステル結合により互いに結合された
ヌクレオチットの線状系列。
コドン：　　ｍＲＮＡを介してアミノ酸、翻訳開始信号
または翻訳終了信号をコード化する３種のヌクレオチッ
ト（トリプレット）のＤＮＡ順序。
たとえば、ヌクレオチットトリプレットＴＴＡ。
ＴＴＧ％ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣＴＧ　はアミ
ノ酸ａイシン（”Ｌｅｕ”）をコード化し、ＴＡＧ、Ｔ
ＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、ＡＴＧは翻訳
開始信号である。
読み枠：　　ｍＲＮＡをアミノ酸順序に翻訳する際のコ
ドンのグループ化。翻訳の間、適正な読み枠は維持され
ねばならない。たとえば、順序ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡ
Ｇ　　を３つの読み枠もしくは相において翻訳すること
ができ、その各々は異なるアミノ酸順序を与える。すな
わち、旦旦工ＧＧＴ　ＴＧＴΔＡＧ：　Ａｌａ−Ｇｌｙ
　−Ｃｙｓ　−ＬｙｓＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴ　　ＧＴ
Ａ　　ＡＧ：　　Ｌ７！ｕ−Ｍａｌ　−ＶａｌＧＣＴＧ
Ｇ　　ＴＴＧ　　ＴＡＡＡ：　Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（停止
）ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミン基とカ
ルボキシ基との間のペプチド結合により互いに結合され
たアミノ酸の線状系列。
ゲノム：物質の全ＤＮＡ、これは特に物質のポリペプチ
ドをコード化する構造遺伝子、ならびに作動子、促進子
およびたとえばシャインータ゛ルｈ゛ルノ順序のような
順序を含むリポソーム結合および相互作用順序を包含す
る。
構造遺伝子：雛型またはメツセンジャーＲＮＡ（“ｍＲ
ＮＡ”）を介して特定ポリペプチドに特性的なアミノ酸
の順序をコード化するＤＮＡ順序。
転　写：構造遺伝子からｍＲＮＡ　を生成させる過程。
翻　訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成させる過程。
表　現：構造遺伝子によりポリペプチドを生成させるた
めに受ける過程。これは転写と翻訳との組合せである。
プラスミド：完全「レプリコン」からなる非りロモソー
ム二重鎖ＤＮＡ順序であり、これによシブラスミドは宿
主細胞内で再現される。プラスミドを単細胞生物に入れ
ると、その生物の特性がプラスミドのＤＮＡの結果とし
て変化または変異する。たとえば、テトラサイクリン耐
性（Ｔｅａ）についての遺伝子を担持するプラスミドは
従前テトラサイクリンに敏感であった細胞分これに対し
抵抗性の細胞に変異させる。プラスミドにより変異され
たｄ胞を「変異体（トランスホーマント）」と呼ぶ。
ファージまたはバクテリ、オファージ：細胞性ビールス
であシ、その多くは蛋白質エンベロブもしくは被覆（「
カプシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ順序を有する
。単細胞生物において、ファージは「トランスフェクシ
ョン」と呼ばれる工程によシ再現する。
クローン用ベヒクル（ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅ
　）　：宿主細胞中で再現しうるプラスミド、ファージ
Ｄ　Ｎ　Ａまたはその他のＤＮＡ順序でちゃ、これはｌ
＠または少数のエンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とし
、この部位においてこのＤＮＡ順序はＤＮＡの本質的な
生物学的機能（たとえば再現性）、被覆蛋白質の生成の
喪失または促進子もしくは結合部位の喪失を伴わずに決
定可能に切断され、またこの部位は変異細胞の同定（た
とえばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）
に使用するのに適する印しを含有する。クローン用ベヒ
クルはしばしばベクターと呼ばれる。
クローン化（ｃｌｏｎｉｎｇ）：無性繁殖の過程組換え
ＤＮＡ分子：少なくともλつのヌクレオチット順序から
なる混成りＮＡ順序であり、第一の順序は天然において
第二の順序と一緒には通常見出されない。
表現制御順序：構造遺伝子に連携結合したときこれらの
遺伝子の表現を制御かつ 調整するヌクレオチットのＤＮＡ順序。
次に、第７図を参照すれば、ディン粒子の内生ＤＮＡの
略図が示されている。ディン粒子は、肝炎Ｂビールス感
染した患者の血漿中に検出される（ディー−ニス・ディ
ンおよびシー・エッチ・カメロン、「オーストラリア−
抗原に関する肝炎を持った患者の血清中におけるビール
ス状粒子」、ランセット誌、第１巻、第６７！〜６りｒ
号（ｌり７Ｑ））。　この粒子は、肝炎Ｂの感染性ビー
ルス単位（ｖｉｒｉｏｎ　）と同一または密接に関連す
ると考えられる。その大きさは知られているが（直径弘
２ナノメータ）、その構造は充分には理解されていない
。一般に、ディン粒子は外層と内核とからなると信じら
れる。粒子の外層は一般に、肝炎８表面抗原（”ＨＢｓ
Ａｇ”）として知られるポリペプチドを含有する。内核
（直径２７ナノメータ）は第二のポリペプチドすなわち
肝炎Ｂ核抗原（”ＨＢｃＡｇ”）ならびにユ／’）Ｌ、
／Ｑ６ダルトンの内生二重鎖の円形ＤＮＡ分子を含有し
、これは種々な長さの単一ストランド間隙を有する。第
三のポリペプチド、すなわち“ｅ”抗原じＨＢｅＡｇ”
）もディン粒子に関係する。さらに、ゲイン粒子は内生
ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼを含むと信じられ、
これはそのＤＮＡをプライマ／雛型として用いるポリメ
ラーゼ反応によシ内生ＤＮＡ中の単一ストランド間隙を
閉鎖する。ディン粒子、さらに詳しくはそのＤＮＡの構
造および性質は幾つかの分析の主題である（たとえばダ
ブリュー・エスーロビンンン、「肝炎Ｂビールスのゲノ
ム」、アニュアル・レビュー・オプーマイクロハイオロ
ジー、第３７巻第３５７〜３７７頁（ｌり７７））。
しかしながら、各種の抗原またはその遺伝子の実際の構
造はまだ決定されていない。
ディン粒子の内生ＤＮＡは、抽出によシブイン粒子から
単離されている。これは、小さな割目すなわちその中の
開口部を有する一定長さの１本のヌクレオチット鎖（第
１図、ストランドａ１〜３０００ヌクレオチット）と成
る程度変化しうる長さの第二のヌクレオチット鎖（第１
図、ストランドｂ１〜２０００ヌクレオチット）とから
なっている。第二のストランドは第一のストランドに対
し補完的であり、その割目を重ね合せて補完的塩基間に
おける水素結合により標準的ワトソンークリック方式で
円状構造を完成する。この重複部が第１図に見られる。
ゲイン粒子のＤＮＡポリメラーゼは、内生ＤＮＡの第二
ストランドをプライマとして使用すると共に第一ストラ
ンドを雛型として使用することによシ種々の間隙を、第
一ストランドのヌクレオチットに対し補完的であるヌク
レオチットで埋めて約３０００ヌクレオチツト対の二重
鎖ＤＮＡを与えると忠われる１゜ 肝炎ＢビールスＤＮＡの調製方法 単−のＨＢｓＡｇ陽性かつＨＢｅＡｇ陽性の供血者（血
清型ａｄｙｍ　）　　からのひと血清を等容量のＰＨ７
弘の緩衝液（０，／　Ｍ　）リス−ＨＣｌ％　０．　／
　Ｍ塩水（ＮａＣ１）、０．７　％の２−メルカプトエ
タノール、０，１％子牛血清アルブミン、ただし％は本
明細書中全てＷ／Ｖ％とする、および０．００／ＭのＥ
ＤＴＡ）で希釈した。これをμ℃にて３５０００　ｒｐ
ｍで２時間遠心分離した。かく得られたベレットを２０
０μ−の同じ緩衝液て再懸濁させ、２０％の蔗糖を含有
する遠沈管の頂部に層化させた。懸濁物を１℃にて≠Ｑ
、０００ｒｐｍで２時間遠心分離した。かく得られたベ
レットを再０：１００ｔｔｌ（ＤＰＩ（７ｊＯ緩衝液（
０，／　Ｍ　トリス−ＭＣＩ、（７，／Ｍ塩水）に再懸
濁させた。
次いで、得られたＤＮＡ含有のベレットを５Ｈまたは３
２ｐでラベルしくビー・エム・カブラン等、「ひと肝炎
Ｂ抗原に関係するＤＮＡポリメラーゼ」、ジャーナル嗜
ヴイロロジー、第１２巻第タデ！〜１００！頁（ｌり７
３））で、後の過程における追跡を容易にした。このラ
ベル化は、濃厚ディン粒子と　Ｈ−もしくは　Ｐ−ラベ
ルされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮ
ＴＰ）との３７℃におけるψ時間の反応により得られる
。このＤＮＡポリメラーゼ反応の後、ＤＮＡ中の単一ス
トランド間隙は部分的に閉鎖され（第１図参照）、ラベ
ル化された材料を蔗糖３０％含有の遠沈管の頂部に層化
させ、弘℃にてｌＡＱＯＯＯｒｐｍでＪ、　ｊ時間遠心
分離した。
次いで、ＤＮＡを得られたベレットからフェノールによ
シ抽出した（エル・アイ・ルトウイックおよびダブリュ
ー・ニス嗜ロビンソン、「肝炎Ｂディン粒子ＤＮＡポリ
メラーゼ反応で合成されるＤＮＡＪ、ジャーナル・グイ
ロロジー、第２１巻第２６〜１０≠頁（／り７７）の手
順を使用）。次いで、抽出されたＤＮＡｔ−０，０／Ｍ
トリスー）（ＣＩ、０，００／ＭのＥＤＴＡの溶液＜Ｐ
Ｉ−１ｒ、ｏ＞で透析してフェノール溶媒を除去した。
かくして単離されたＤＮＡは制限酵素消化に対して準備
できた。これは〜／　０８ｃｐｍ／μりの比放射活性を
示した。上記した方法を概略第２図に示す。
上記のように単離した二重鎖ＤＮＡを無性増殖させるの
に、多種類の宿主−クローン用ベヒクル組合せ物を有効
に使用することができる。
たとえば、有用なりローン用ベヒクルはクロモソーム系
、非りロモンーム系および合成のＤＮＡ順序たとえば各
種の公知細菌性プラスミド（たとえばｐＢＲｊ　２２、
その他イー・コリのプラスミドおよびそれらの誘導体）
、および広宿主範囲のプラスミド（たとえばＲＰ４（）
、ファージＤＮＡたとえば多種のファージλの誘導体（
たとえばＮＭＪ’タタ）、およびプラスミドとファージ
ＤＮＡとの組合せ物から誘導されたベクター、たとえば
７ア一ジＤＮＡ表現制御頴序を使用するよう改変したプ
ラスミドを包含する。有用な宿主は細菌宿主たとえばイ
ー・コ＋）Ｘ／７７乙、イー・コリＸ２２ｒ２、（−＠
コリＨＢ１０／およびイー・コリＭＲＣ／およびシュー
ドモナス、バチルス・ズブチリスおよびその他細菌の菌
株、酵母菌およびその細菌類、動物または植物宿主（た
とえば培養動物もしくは植物細胞）、およびその他宿主
を包含する。勿論、全ての宿主が同等の効果をもつもの
ではない。宿主−クローン用ベヒクル組合せ物の特定の
選択は、本発明の範囲から逸脱することなく上記の原理
を正当に考慮して当業者が行なうことができる。
さらに、各特定ベクター中には、単離された二重鎖ＤＮ
Ａを挿入するため種々な部位を選択することができる。
通常これらの部位は、これらを切断する制限酵素すなわ
ちエンドヌクレアーゼによシ指定される。たとえば、ｐ
ＢＲ３２２においては、Ｐｓｉ／部位はペニシリナーゼ
遺伝子中におけるペニシリナーゼ蛋白のアミノ酸／了ｌ
および／ざ２をコード化する。ヌクレオチソドトリプレ
ットの間に位置する。この部位は、ラッテプロインシュ
リン決定子を示す蛋白質の合成の際上記のピラーコマロ
ン等により用いらレタ。Ｈｉｎｄ　１１工ンドヌクレア
ーゼ識別部位は、アミノ酸１０／および１０２をコード
化するトリプレットの間に存在し、　Ｔａｇ部位はｐＢ
Ｒ３２２におけるその蛋白のアミノ酸≠５をコード化す
るトリプレットに存在する。同様に、このプラスミドに
対するＥｃｏ　ＲＩ工／ドヌクレアーゼ識別部位は、そ
れぞれテトラサイクリンおよびアンピシリンに対する耐
性をコード化する遺伝子の間に位置する。この部位は、
イタクラ等およびゲデル等により、上記した組換えＤＮ
Ａ合成法において使用された。第２図および第１／図は
、例示の目的でプラスミドｐＢＲＪ２２およびファージ
λＮＭ９♂りにおける幾つかの制限部位を示している。
選択ＤＮＡ断片をクローン用ベヒクル中に挿入して組換
えＤＮＡ分子を生成させるため選択される特定部位は種
々の因子によう決定される。
これらは表現すべきポリペプチドの寸法および構造、宿
主細胞成分による内生酵素分解に対する所望ポリペプチ
ドの感受性およびその蛋白による汚染、たとえば聞出お
よび停止コドンの配置のような表現特性、ならびに当業
者に知られたその他因子を包含する。宍現過程は充分に
は理解されていないので、これら因子はいずれも単独で
は特定ポリペプチドに関する挿入部位の選択を絶対に制
御しない。寧ろ、選択された部位はこれら因子をバラン
スさせる効果を有し、成る蛋白に対し必らずしも全ての
部位が同等の効果を示すものではない。
外来ＤＮＡをクローン用ベヒクル中に挿入して組換えＤ
ＮＡ分子を生成させるには幾つかの方法が当分野で知ら
れているが、本発明において好適な方法を第一図に示す
。これは、ディン粒子ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
により開裂させ、開裂ＤＮＡの３′末端（ＤＮＡ糖骨格
のデオキシリボース炭素から便宜上名付けられる）にポ
リープオキシＣ順序を付加させ、そして伸長したＤＮＡ
をクローン用ベヒクルに結合させることを特徴とし、た
だしクローン用ベヒクルは制限エンドヌクレアーゼによ
り特定部位で切断されて、その切断の３′末端に開裂Ｄ
ＮＡのポリーｄＣ順序に対し補完的なポリデオキシＧ順
序を伸長させたものを使用する。ＤＮＡおよびクローン
用ベヒクルの３′末端の補完的性質はこれら末端の結合
を可能にする。
本発明の方法において有用であるためには、ＨＢＶ−Ｄ
ＮＡを開裂させるのに選択される制限酵素は、ＨＢＶ抗
原性を示すポリペプチドをコード化する遺伝子の必須部
分内においてＨＢＶ・ＤＮＡを開裂してはならず、特に
好適には制限された数の部位にてＤＮＡを開裂すべきで
ある。本発明で使用された制限酵素はＫｐｎ＊ｌ。
Ｂｇｌ、［、Ｂａｍ−ＨＩ、ＡｖａｉｌおよびＥｃｏ＠
ＲＩを包含する。その他の制限エンドヌクレアーゼも同
様に本発明において使用することができる。
これらの選択は、本発明の範囲を逸脱することなく、上
記した諸因子を考慮して当業者が行なうことができる。
第３〜り図は、ＨＢＶゲノムの一部における制限エンド
ヌクレアーゼ識別部位の幾つかを示している。
勿論、ＤＮＡ順序をクローン用ベヒクル中に挿入して組
換えＤＮＡ分子を生成させるその他公知の方法も同等に
本発明において使用される。
これらには、たとえば同一の制限エンドヌクレアーゼを
使用してＨＢＶ−ＤＮＡとクローン用ベヒクルとを開裂
させるような直接結紮１云が包含される。この方法は本
質的に補完的端部を結合に供する。
勿論、クローン用ベヒクルの選択制限部位に挿入された
ヌクレオチット順序または遺伝子断片は所望蛋白質に対
する実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチットを包
含し或いはその構造遺伝子の断片のみを包含することも
できると了解すべきである。と’＊ｐＮＡ西己ダｌＩを
Ｊ中入（／でも変異された宿主はＨＢＶ抗原性を示すポ
リペプチドを生産することの；？か゛地学である。。
混成遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を使用して宿主
を変異させ、この宿主（夏異体）が構造遺伝子フたばそ
の断片を表現しかつ昆成ＤＮＡのコード化するポリペプ
チドまたはその一部を生産するようにさせることもでき
る。また組換えＤＮＡ分子を使用して宿主を変異させ、
この宿主が再現性をもって付加的な組換えＤＮＡ分子を
ＨＢＶ構造遺伝子およびその断片の源泉として生産する
ようにさせることもできる。これらいずれかの使用て対
する適当な宿主の選択は、当分野で知られた多くの因子
によシ管理される。これらの因子には、たとえば選択ベ
クターとの適合性、共生産物の毒性、所望ポリペプチド
の回収容易性、表現特性、生物学的安全性および価格が
包含される。また、表現のメカニズムは充分には理解さ
れていないので、宿主の絶対的選択をこれら因子のいず
れか単独により特定の組換えＤＮＡ分子またはポリペプ
チドについて行なうことはできないであろう。寧ろ、特
定の組換えＤＮＡ分子の表現に対・し全ての宿主が同等
の効果を示しえないという現実に鑑みてこれら因子をバ
ランスさせねばならない。
本発明の合成において、好適なりローン用ベヒクルは細
菌性プラスミドｐＢＲＪ２ｊであり、そこの好適な制限
エンドヌクレアーゼ部位はＬ吐／部位である（第２図）
。このプラスミドは、抗生物質アンピアリン（Ａｍｐ）
およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）に対する耐性遺伝子
を担持する小さい（分子量約２．６メガダルトン）プラ
スミドである。プラスミドは充分に特性化されている（
二）・ポリヴアール等、「新規なりローン用ベヒクルＵ
の構成および特性化。多目的クローン系」、ジーン、第
り５〜１１３頁（／り７７））。本発明による好適な宿
主はイー・コリＨＢ１０／である。
本発明の好適具体例の実際的実施において、ディン粒子
から上記のように単離したＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼＫｐｎ　ｌ　（／　ＯｍＭのトリス−ＨＣＩ　（ｐ
Ｈ７６）　、／　０−ｍＭのＭｇＣ＋２．１０ｍＭの２
−メルカプトエタノール、≠ＯｍＭのＮａＣｌ、０．　
ｊ　ａｌ　ノＮ？素ｉ４Ｍ裂物／　０　μｐ中ｔＪ：）
　Ｄ　Ｎ　Ａ約２０ｎｌ）により３７　”Ｃにてり０分
間消化させ、制限酵素を７０″Ｃ，ｊ分間の加熱により
不活性化させた。ポリーデオキンＣ順序（例示の目的で
第２図にはＣＣＣとして示す）を、フェノールおよびク
ロロホルム（各２０μｅ）での抽出により残留蛋白質を
除去した後、ポリヌクレオチド末端トランスフェラーゼ
との標準的反応により消化生成物の３′末端に付加させ
た。エーテルでの抽出によりフェノールを水相から除去
し、ＪＭの酢酸ナトリウム、ｐＨＡ、　ｊ　（ｊ　ｔｔ
ｌ　）と冷エタノール０．７　ｒｕｌとの添加によりＤ
ＮＡを沈殿させた。−７０℃に１時間保った後、沈殿Ｄ
ＮＡを／　Ｑ、０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離して
回収し、このペレットを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７ｊ（１０μｌり中に溶解させた。
これに３μｌの’ＡＯＯｍＭカコジル酸カリウム（ＰＨ
７，ｏ　）と４４ｍＭの塩化コバル・トと≠ｍＭのデオ
キシントノントリホスフエート （ｄＣＴＰ）と−００μソ／ｍｅの子牛血清アルブミン
とを加え、混合物をＱｊμｌのポリヌクレオチット末端
トランスフェラーゼ（＋０００ｕ　／ｍｌ　）　　と共
に２７℃にて１０分間培養しそしてｒＯｍＭのＥＤＴＡ
　（／　ｔｔｌ　）を添加シテ反応を停止させた。
３２２の調製 プラスミドｐＢＲＪ２２を制限エンドヌクレアーゼＰｓ
ｔ　ｌ　（これに対しプラスミドは７つの目標を有する
）により消化し、この生成物をＨＢＶ−ＤＮＡについて
上記したようにフェノール抽出およびエタノール沈殿に
より精製した。ポＩＪ　−ｄ　Ｇ順序（例示の目的で第
２図にＧＧＧとして示す）を、ＨＢＶに対するボＩＪ−
ｄＣ順序の付加について上記したように、末端トランス
フェラーゼにより線状ｐＢＲＪ、！λの３′末端に付加
させ、ただしこの場合反応は３７℃にて行なった。
次いで、等モル量のｐＢＲＪ＋２２−ポリ−ｄＧとＨＢ
Ｖ、ＤＮＡ−ポリ−ｄＣとを混合し、補完的順序ｆ１０
０ｍＭのＮａＣ１，６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ
７ｊ　）、ｊｍＭのＥＤＴＡ（ＴＮＥ）（ｊＯμｌり　
　中にてＡｊ”（、で１時間、次いで≠７′Ｃで１時間
、３ＴＣで１時間および２０℃で７時間培養することに
より結合させ、そして等容量のＴＮＥと２０μｌの１０
０ｍＭのＭｇＣｌ２．１００ｍＭのＣａＣｌ２．１００
ｍＭのトリｙ、−ＨＣ１！（ｐＨ７５）とを加えた。
４、　イー−コリＨＢ／θ／の変異 変異に適したイー・コＩＪＨＢ１０／の培養物ヲ、イー
・エム・レーターヘルクおヨヒエス・エッチ・コーヘン
により「プラスミドデオキシリボ核酸によるサルモネラ
・チフイムリウムの変異」、ジャーナル・バクテリオロ
ジー、第１１り巻、第１０７２〜１０７’１頁（ｌり７
≠）に記載されているよつに調製した。
細胞の０、ｊｍＭ部をアニールされたＤＮＡ調製物２！
μｌと混合し、０℃で一２０５＋間培養し、次いで２０
℃にて７０分間培養した後、テトラサイクリン（１０μ
９／ｍｅ’）ｋ含有するＬ−寒天板上に塗床して３７℃
で一晩培養した。
プラスミドｐＢＲＪ２λはテトラサイクリン耐はについ
ての遺伝子を有するので、このプラスミドにより変異さ
れたイー・コリ集落は、このよって変異されなかったイ
ー・コリ集落を除いて、この抗生物質を含有する培養物
中で増殖するであろう。したがって、テトラサイクリン
含有の培養物における増殖は適切に変異された宿主の選
択を可能にする。
ング 培養されたテトラサイクリン含有り一寒天板上に増殖し
た細菌集落をアンピシリンに対する感度について試験し
た。プラスミドｐＢＲｊ２λはアンピシリン耐性につい
ての遺伝子を有する。この遺伝子は混成遺伝子挿入の提
案部位である。したがって、選定識別部位に挿入された
Ｄ　Ｎ　Ａを有するプラスミドにより変異された集落は
アンピンリンに灯し感受性であるが、テトラサイクリン
に対する耐性を保持するであろう。アンピシリンに対し
感受性であるがテトラサイクリンに対し耐性であったイ
ー・コリ集落を、テトラサイクリンを含有するＬ−Ｑ天
板上に支持されたミリボア硝酸セルロースフィルターの
円板の上ニ装置した。３７℃で一晩増殖させた後、この
ミリポアフィルタ−をテトラサイクリンとクロラムフェ
ニコール（／！０μｇ／ｍｉ　とに含有する新たなＬ−
寒天板に移し、３７℃にてさらに数時間培養して細胞内
のプラスミドのコピー数を増加させた（第２図）。次い
で、エム・グルンスタインおよヒティーーエス・ホグネ
スにより「集落交雑化：特異遺伝子を含有するクローン
化ＤＮＡの単離方法」、プロシーテイング・ナショナル
晦アカデミー拳サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、第７２巻第、
３り６１〜３り６よ頁（／り７ｊ）に記載されているよ
うに、集落交雑化のため、前記で調製した５２ｐ＝ラベ
ルされたＨＢＶ−ＤＮＡ％−試料とじてミリポアフィル
タ−を使用した。フィルターのラジオオートグラフは、
標準ＨＢＶ＠ＤＮＡに対し補完的なりＮＡ順序を含有す
る集落の存在を示した。
テトラサイクリンに耐性であり、アンピシリンに感受性
でありかつ標準ＨＢＶ、ＤＮＡで交雑化した集落を、Ｈ
ＢＶ抗原特異性すなわち抗原性を示す少なくとも７種の
ポリペプチドを生産する能力について試験した。ここで
も集落を、テトラサイクリン含有のＬ−寒天板上に支持
されたミリポアフィルタ−の上に載置し、３７°Ｃで一
晩培養した。バクテリオファーシュλヴイルの発病法を
感染させた（感染度約ｌの倍率）イー・コ＋）ｃｔｏｏ
の培養物（軟質寒天２ｍｉ中０．／ｍｔ）、を有する第
二のＬ−寒天板で覆い、３７°Ｃで一晩培養し、その際
細菌叢は総合的にファージ（λグイル）により自画され
た（すなわち、実質的に全ての宿主細胞壁が破裂した）
。本発明により変異された細胞を含有するミリポアフィ
ルタ−を板から釣り上げ、集落を下面としてλラベルで
溶菌されたイー・コ＋７　ｃ　６ｏ　ｏのＬ−寒天板の
表面に接触させた。この接触全約１０分間続けて、ミリ
ポアフィルタ−上に存在する細胞のλラベルによる感染
を行なわせた。
次いで、ミリポアフィルタ−をＬ−寒天の新たな板に移
し、３７℃でさらに５時間培養した。その間、ニスｅプ
ルームおよびダブリュー・ギルバートによシ「特異的翻
訳生成物を検出する免疫学的スクリーニング方法」、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス
、Ｕ、Ｓ、Ａ、第７ｊ巻第２７弘６〜２７μり頁（ｌり
７Ｆ）に記載されているように、ＨＢＶ抗体でポリビニ
ル円板を被覆した。
変異した細菌集落が明白に溶菌し・たミリポアフィルタ
−をその集落につき被覆ポリビニル円板と接触させ、弘
°Ｃに３時間保った。この接触の結果、ミリポアフィル
タ−上の細胞から溶出したＨＢＶ抗原は全て円板のＨＢ
Ｖ抗体と結合する。被覆円板をミリポアフィルタ−から
分離し、次いで洗浄して１２５ニーラベルされたＨＢＶ
抗体と共に培養した。この培養の結果、ミリポアフィル
タ−からのＨＢＶ抗原が円板のＨＢＶ抗体により事前に
結合されてしまった円板上の個所が放射活性となる。
洗浄後、上記ブルームおよびギルバートによシ記載され
ているようにラジオオートグラフィーにかけると、ＨＢ
Ｖ抗原特異性を有するポリペプチドを生成した集落はラ
ジオオートグラフによシ位置確認された。
ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドとそれをコード化する
構造遺伝子および断片と・を、人間におけるＨＢＶ抗体
の存在を検知ししたがってこのビールスにより感染され
た人間および血液試料を識別するよう設計した方、去お
よび装置に使用することができる。
たとえば、本発明の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子により変異さ
れた宿主により生産されるＨＢｃＡｇを、肝炎Ｂビール
ス検知のため現在利用しうる免疫学的診ｉ祈試５験、す
なわち放射性免疫分析法またはエリザ（ＥＬＩＳＡ、酵
素結合免疫吸着分析法）、に使用することができる。放
射性免疫分析法の一型式においては、実験動物中に成育
させた抗−核抗原抗体を固体相、たとえば試験管の内側
に付着させる。次いで、この試験管にＨＢｃＡｇを加え
て抗体と結合させる。抗原−抗体複合物により被覆され
たこの試験管に、患者血清の試料と共にたとえば放射性
沃素のような放射性同位元素でラベルしたＨＢＶ抗−核
抗体の既知量を添加する。患者血清中のＨＢＶ抗体は、
抗原−抗体複合物の遊離結合部位に対しラベル化抗体と
競合するであろう。血清を作用させた後、過剰の液体を
除去し、試験管を洗浄しそして放射活性の量を測定する
。陽性の結果、すなわち患者血ｈ〒がＨＢＶ抗体を含有
するという結果は、低放射計数によって示される。エリ
ザ試験法の一型式においては、マイクロ滴定板をＨＢｃ
Ａｇ“で被覆し、これに患者血清の試料を加える。抗体
と抗原とを反応させる培養期間の後、板体を洗浄しそし
て実験動物で成育させかつ酵素ラベルに結合させた抗−
ひと抗体の調製物を加え、培養して反応を生ぜしめ、次
いで板体を再洗浄する。その後、酵素基質をマイクロ滴
定板に加え、酵素を基質に作用させる期間培養しぞして
最終調製物の吸着率を測定する。吸着率における大きな
変化は陽性結果を示す。
本発明のイー・コリにおける組換えＤＮＡ分子から翻訳
された抗原性ポリペプチドの生物学的活性を試験するた
め、ＨＢｃＡｇを表現するために示した細菌細胞の無菌
抽出物を・、等容量のフインド補助液と混合した後、兎
に注射した。
２匹の動物Ｑては粗製の細菌抽出物を与え、寸だ２匹の
動物には同じ抽出物の試ｆ−＋全で７アデンクスｔｊＯ
カラムでの分画の後（で加えた。さらに、凍結および貯
蔵した（充分な抗原活性を保持する）同じ試料の注射を
、最初の注射から２週間後およびｊ週間後に与えた。こ
れら動物を、最初の注射から数週間後、時間間隔を置い
て出血させた。
オー・オウチタ口二一により「免疫拡散および免疫電気
泳動」、ハンドブック・オブ・エキスベリメンタル・イ
ミュノロジー（ディー・ダブリュー・ウェア編、ブラッ
クウェル・サイエンティフィック出版社、オツクスフオ
ート・およびニシンバラ）、第１り章（／り６７）に記
載された方法を用いて免疫拡散実験を行ない、兎血清（
抗体）をひと肝臓から得られたＨＢｃＡｇを使用してひ
と肝炎Ｂビールス核抗体じＨＢｃＡｂ”）と比較した（
ビー・リュー・コーヘンおよびワイ・イー・コサルト、
「肝炎Ｂ核抗原に対する抗体のスクリーニング試験の応
用」、ジャーナル・クリ二カ°ル・パノロジー、第３０
巻第７０７〜７／ＪＥ（（／り７７））。ψ匹の兎の血
清全ては、人間から得られたＨＢｃＡｇとＨＢｃＡｂ　
との間に形成されたものと同一の、ＨＢｃＡｇを有する
沈降素ラインを与えた。したがって、本発明の組換えＤ
ＮＡ分子を用いてイー・コリ中で合成した核抗原は生体
内において血清学的に活性である。この活性は、微生物
細胞中で合成されたビールス抗原を用いる組成物および
方法を人間における抗体形成の刺戟のために使用しうる
ことを確立した。この種の組成物および方法は、本発明
で製造された組換えＤＮＡ分子により変異された宿主が
生産するポリペプチドを特徴とする。これらのポリペプ
チドは、単独に或いは人間におけるビールス感染の処置
および予防のだめの組成物および方法に使用される当分
野で認められているたとえば食塩溶液または他の添加剤
の如き周知の医薬上許容しうる担体と共に、使用される
であろう。
前記したように、本発明の組換えＤＮＡ分子を製造する
には、上記Ｋｐｎ　ｌ／Ｐｓｔ　ｌ　　組合せ物取外の
制ＶＭ酵素も有効に使用することができる。プラスミド
ｐＢＲＪ２２およびＨＢＶゲノムの一部における他のホ
１ｊ限部［をそれぞれ第２図および第３図に示す。これ
らの代案となるが余り好適でない具体例を説明するため
、以下に実施レリを示す。
Ｈａｍ　・ＨＩ、　Ｅｃｏ　−ＲＩ、Ｂｇｌ　−１１−
Ｐｓｔ　１組合せＫｐｎｌにより生成されたものとは異
なり、ｌ巴・Ｈｌ、Ｂｃｏ−Ｒ１およびシ己・口の使用
により生成されたＨＢＶ−ＤＮＡ断片は、短かい！′−
単−グーストランド突出部在するため、直接に末端結合
させることが便利にできなかった。したがって、これら
は、３′末端にポＩＪ−ｄＣ順序を付加させる前に、λ
エキソヌクレアーゼで処理して上記突出部を除去した。
これは、制限されたＤＮＡ　（前記したように１０μｌ
の溶液）を／ｊμｌの／　００　ｍＭグリシン酸ナトリ
ウム（ｐＨりよ）、／　ｏｍＭのＭｇＣ１゜；”／　ｏ
、０　μり／ｍｅの子牛血清アルブミン、５μｌのλエ
キソヌクレアーゼと共に０　’Ｃにて７５時間培養する
ことにより行なった。次いで、混合物をフェノールとク
ロロホルムとで抽出し、工程を続けた。二二・Ｈｌを使
用した調製物の場合、後の放射免疫分析法によりＨＢＶ
抗原特異性を有するポリペプチドの生成を確認した。
上記したようにＤＮＡｌｉ片を末端結合でせる代りに、
本発明の方法において遺伝子断片の直接的結紮を用いる
ことができる。たとえば、別の２種の調製物ニオイテハ
、ＨＢＶ−ＤＮＡ（２０ｎ＆）を１０ｍＭのトリス−Ｈ
ＣＩ（ｐｉ−１ｚｔ）、１０ｍＭのＭｇ　ＣＩ　２．１
０ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｊ　ＯｍＭのＮａ
Ｃ１（ｉ　０　μｌ　）中において制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏ−ＲＩまたはＢａｍ−ＨＩによシ３７℃にて
ｌよ時間制限化処理し、同一条件下で同一酵素と共に培
・養された過剰のｐＢＲｊ２ノと混合した。濃厚緩衝溶
成〔島ＯｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７ｊ　）、／　
００　ｍＭのＭｇＣ＋２、／　ＯｍＭのＥＤＴＡｌｌｏ
ｏｍＭの２＝メルカプトエタノール、４ｔ００ｍＭの：
’ｈｃｌ、／ｍＭのＡＴＰ］　（２μｌりを加え、この
混合物をＴｔａ　−ＤＮＡ　ＩＪ　ｉ−セ（ｏ、ｚμｌ
　）　ト共に１０℃で３時間、次いで０゛Ｃで少なくと
も２弘時間培養した。この浴液を１０ｍＭのトリス−Ｈ
ＣＩ（ｐ）１７ｊ）により０．　／　ｍｅに希釈し、前
記したようにイー・コＩ）ＨＢｌｏｌの適当な培養物を
変異させるのに使用した。ｂ二・ＨＩ調製した組換えＤ
ＮＡ分子の場合、交雑化に対するスクリーニングの前（
て、集落をアンピシリンに対してでなくテトラサイクリ
ンに対する感度について試験した。
何故なら、ｐＢＲ３２２中の−Ｂａｍ・ＨＩの目標はテ
トラサイクリン耐性をコード化する遺伝子内にあり、し
たがってこの識別部位において上手に挿入すれば旦已」
部位における挿入の場合と同様（Ｃアンピシリン耐性で
なくテトラサイクリ／耐性の喪失が生ずるからである。
Ｅｃｏ−ＲＩ部位を介して調製された組換えＤＮＡ分子
の場合には、交雑化についてのス”クリーニングの前（
テ、集落をアンピシリンとテトラサイクリンとの両者に
対する耐性につき試、験した。
何故なら、ｐＢＲｊＪ２中のＥｃｏ・ＲＩの目標はテト
ラサイクリンとアンピシリンとの耐性をコード化する遺
伝子間に存在し、したがってアンピシリンまたはテトラ
サイクリンの耐性に関する遺伝子の不活性化はこの部位
における混成りＮＡ挿入の際生じないからである。
本明細書中に記載した方法で調製された微生物は、７９
７１年／２月ｌｊ日にボートンダウン在のカルチャー・
コレクション・オプ番ザ・マイクロバイオロジカル・リ
サーチ・エスタプリツシュメントに寄託されかつｐＢＲ
Ｊｊλ−ＨＢＶ−Ａ　、　Ｆとして同定された培養物に
より例示される。
詳細には、これら培養物の特徴は次の通りである。
これらと同一の培養物の一部を、／り７り年／２月ｌり
日にスコツトランド、アバディーン在のカルチャー・コ
レクション・オブ・ザ・ナショナル・コレクション・オ
ブ拳インダストリアル・バクテリアにも薔託した。
培養物に対する上記命名は、次のような培養物の記載で
ある。宿主／クローン用ベヒクル−クローン用ベヒクル
中の制限部位であって、伸長ヌクレオチット（もし存在
すれば）を示す：肝炎Ｂビールス中の肝炎Ｂビールス制
限部位であって、伸長（もしあれば）を示すニーテトラ
サイクリン（Ｔｅｔ）およびアンピシリン（Ａｍｐ）に
対する耐性（Ｒ）−ｊたは感受性（Ｓ）：上記の集落交
雑化試験におけるＨＢｖ−ＤＮＡに対する＋ 陽性交雑化（ＨＢＶ）および上記のＨＢＶ抗原汀十 を示すポリペプチドの生産（ＶＡ　　）。この命名を用
イれば、培養物ｐＢ　Ｒ３２２−ＨＢＶ　−Ａ　Ｉｒｉ
、プラスミドとして組換えＤＮＡ分子を含有するイー・
コＩ）ＨＢ１０ｉ培養物を示し、この岨換えＤＮＡ分子
は坦１部位で開裂されかつ３′末端にポ１７−　ｄＧ端
部が伸長化されたｐＢＲ３２２からなり、さらにＨＢＶ
・ＤＮＡはＫｐｎｌにより開裂されかつ３′末端にボＩ
Ｊ　−ｄＣ端部が伸長化されており、また培養物はテト
ラサイクリン耐性とアンピシリン感受性と陽性のＨＢＶ
、ＤＮＡ交雑化試験とを示すと共にＨＢＶ抗原性を示す
ポリペプチドを生産する。
勿論、混成微生物、組換えＤＮＡ分子およびポリペプチ
ドならびにこれらに応用しうる本発明の方法は、上記の
好適具体例のみに限定されるものでないことを了解すべ
きである。寧ろ、混成生物、組換えＤＮＡ分子および″
ポリペプチドは生産の途上でまたはその後に公知方法に
より有利シて改変することができる。たとえは、より効
果的な表現制御順序を利用してＨＢＶ遺伝子または混成
遺伝子の転写を得ることができ、また望ましくない遺伝
子生成物の合成を減少させるよう突然変異を導入するこ
とができ、また宿主細胞中のプロテアーゼレベルヲ減少
させることもでき、さらにＨＢＶ遺伝子を含有する熱誘
導性リゾゲンを宿主クロモソーム中に一体化させること
ができ、或いはその他の改変および手順を行なって細胞
中の遺伝子コピーの数を増加させたり所望ポリペプチド
を生産する細胞の生産性を増大させたりすることもでき
る。
ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを生産させるためのそ
れらの使用の他、本発明の混成微生物は、肝炎Ｂビール
スに対するゲノムの全部または一部を含有する大量のＤ
ＮＡを生産するのにも有用である。たとえば、細胞濃度
が適当なレベルに達した時成育培地にクロラムフェニコ
ールを添加することによる増殖、或・いは突然変異を用
いてＨＢ　Ｖ　ＩＩＩ序を含むバクテリオファージヒブ
リドにおける溶菌を防止することは、従来得られなかっ
た量のＨＢＶ−ＤＮＡの製造を可能にする。
このように製造されたＨＢＶ、ＤＮＡを使用して、ゲノ
ムのヌクレオチド順序を決定することができ１　これか
ら遺伝子ならびに）ｆＢＶ抗原および構造遺伝子自体の
アミノ酸順序を決定することができる。これら順序の知
見は、肝炎Ｂビールスの生物学を理解する上で役立ち、
また上記した改変を最も有利に用いることを可能くする
。
上記の方法によ°り製造された、固相放射免疫分析法に
より検出されるよりなＨＢｃＡｇの合成能力を宿主細胞
に付与する一連の組換えＤＮＡ分子を順序分析のために
使用した。断片を適当な制限酵素での消化によ・りこれ
ら組換えＤｆＪＡ分子から調製し、この断片をそのｊ′
　末端に〔α−”Ｐ）ＡＴＰとＴ４ｔポリヌクレオチド
キナーゼとでラベルした。次いで各断片のヌクレオチッ
ト順序を周知の化学的分解法により決定した（ニー・エ
ム・マキサムおよびダブりニー・ギルバート、「ＤＮＡ
の新規な順序決定方法」、ブロアーディング・ナノヨナ
ル・アカデミ−・サイエンス、　Ｕ、Ｓ、Ａ。
第７弘巻第！ＡＯ〜！６’Ａ頁ｃ／り７７））。
得られたヌクレオチット順序を第３〜り図に示す。参考
のため、順序には核遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンのＡ
からナンバーを付する。
ＨＢｃＡｇに関する遺伝子のヌクレオチント順序および
この遺伝子から引出されるポリペプチドのアミノ酸順序
（読み枠ｌ）を第３〜り図においてヌクレオチット／〜
よ≠２の間に示す。この遺伝子によりコード化されるポ
リペプチドの寸法は、ゲイン粒子からの核抗原について
観察された分子量ｌり０００に近いものである。しかし
ながら、この・構造決定は、若干のアミノ酸が標準抗原
の生成の際生体内でこのポリペプチドのアミン末端から
切除されうる可能性を排除しない。さらに、この構造は
、他のひと酵素たとえば蛋白質をグリコンル化（ｇｌｙ
ｃｏｓｏｌａＬｅ　）するような酵素との相互作用によ
りもたらされるポリペプチドへのその他または追加的改
変をも考〜：に入れない。
したがって、ここで決定されたポリペプチド構造は生体
内に見出されるＨＢｃＡｇとは同一でないが、免疫反応
については同一でないにしろ極めて類似するであろう。
検査した組換えＤＮＡ分子の全ては挿入されたＨＢＶ−
ＤＮＡを有したので、核抗原遺伝子はｐＢＲｊ２２のペ
ニシリン耐性に関する遺伝子と同じ翻訳相に維持された
。さらに、各種の組換え物において、ＨＢＶ、ＤＮＡ挿
入物はＨＢＶ順序における同じ位置の７個もしくは２個
のヌクレオチット内で始まった。これら組換えＤＮＡ分
子は各種の制限酵素（たとえばと−ＨＩおよびＫｐｎ−
Ｉ）で消化されたＨＢＶ、ＤＮＡから生じたので、この
独特な付加は驚異的でありかつティン粒子の内生ＤＮＡ
における開目でのＨＢＶ−ＤＮＡυ偶発的破所またはポ
リヌクレオチド末端請合から生じたのであろう（第１図
）。異なる馳訳相中にＨＢＶ−ＤＮＡ挿入物を有する組
換えＤＮＡ分子はＨＢ　ｃ　Ａ　ｇ遺伝子を表現せず、
またこの種の組換えＤＮＡ分子により変異された宿主に
はＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドが検出されなかった
。勿論、この種の非遺伝子表埃宿主および組換えＤＮＡ
分子も本発明によりＨＢＶ、ＤＮＡを生産するのに有用
である。
ＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物の表現を介して生成されたＨＢｃ
Ａｇまたはその断片は少数のグリシン残基を介してベニ
シリナーゼ耐性に関する遺伝子の生成物（β−ラクタマ
ーゼ）に融合するであろうことが予測されたが、実際に
はそうでなかった。寧ろ、各場合にβ−ラクタマーゼは
３〜２個のグリシンを介して同一のペプチド順序に融合
されたが、この順序は２５個のアミノ酸の後に終端した
。この読み忰（枠／、第３図）において１停正コドン（
ＴＡＧ）に次いで３個のヌクレオチットが続き、その後
に開始コドンが続き、そこから翻訳が妨げられずに続い
てペプチドに／ざ３個のアミノ酸の長さを与える（第３
〜ｒ図）。
したがって、核抗原活性は、組換えＤＮＡ分子から転写
されたｍ　ＲＮ　Ａ内のＨＢＶ順序により初めから翻訳
された約λ／、０００ダルトンのポリペプチド中に存在
する。このポリペプチドは宿主細胞内に残存しない。何
故なら、これはＨＢＶ・ＤＮＡ挿入物の停止コドンおよ
び開始コドンの配置により分泌ベニ７リナーゼ担体蛋白
質に結合されないからである。
２、肝炎８表面抗原 ＨＢｓＡｇに対する遺伝子のヌクレオチット順序および
この遺伝子から生ずるポリペプチドに対するアミノ酸順
序（読み枠３）も、第６〜ｇ図においてヌクレオチット
／１Ａ３７〜２／／≠間に示される。このポリペプチド
のアミノ酸順序ばＮ末端から始まって順序ｍｅｔ−ｇｌ
ｕ　−ａｓｈ　−ｉ　ｌｅ　−Ｌｈｒ　−ｓｅｒを有す
る。この最初のアミンｒ￥！１．順序は、ティー・エル
・ビーターソン等、「肝炎８表面抗原のλつの主成分ポ
リペプチドの部分的アミノ酸順序」、プロン−ディング
・ナショナル・アカテミー・サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、
、第７弘巻第１！３０〜ｌタ３１Ｉ頁（／り７７）によ
り、標準ひとＨＢｓＡｇから決定された。この蛋白質の
アミノ酸順序は第６〜ｇ図において停止コドンまで２２
６個のアミノ酸を続ける。この２２６ポリペプチド順序
は２３．’１００ダルトンの蛋白質に相当する。
ＨＢｓＡｇのアミノ酸および長さは、ビー・バレンツエ
ラ等、「肝炎Ｂビールス表面抗原の主要蛋白質をコード
化する遺伝子のヌクレオチット順序」、ネーチャー誌、
第２ざ０巻、第ｘｉｊ−♂ｌり頁（ｌり７り）により、
適当な組換えＤＮＡ分子を順序決定することにより単独
に確認された。
本発明の組換えＤＮＡ分子について決定されたヌクレオ
チット順序は、Ｈ［３ｅＡｇに対する遺伝子を表現した
検査されたもの全てが適当な宿主細胞内に表現されるこ
とを期待する位置にＨＢ　Ｓ　Ａ　ｇに対する遺伝子を
持ち得ないことを示す。事実、ＨＢｃＡｇに対する遺伝
子を表現することが見出されたフラスミドにより変異さ
せた細胞の抽出物には、ＨＢｓＡｇは検出されなかった
。しかしながら、上記したように、これら遺伝子のヌク
レオテッド順序の知見は、表決過程の改変が収率と効果
とを向上きせかつ遺伝子の表現と従来表現もしくは検出
されなかったポリペプチドの生産とを容易化するのを可
能にする。
これら抗原の遺伝子およびアミノ酸順序は、細菌細胞当
りの抗原または遺伝子の生産レベルを高める方法を設計
する際有用である。
蛋白質の生産レベルは２つの主要因子により支配される
。すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とこれら遺伝子
コピーを転写かつ翻訳する効率とである３、転写も・よ
ひ翻訳（これは表現をも含む）の効率は、通常所望のコ
ード化用順序の前方に位置するヌクレオチット順序に依
存する。これらのヌクレオチット１１１序または表現制
御、：偵序は、特にＲＮＡポリメラーゼが相互反応して
転写（促進子順Ｆ：ｆ−）を開始しかつリポソームがｍ
ＲＮＡ（転写の生成物）と結合かつ相互反応して翻訳を
開始する位置を規定する。この種の表現制御順序全てが
同等の効率をもって機能するものではない。したがって
、隣接するヌクレオチット順序から所望蛋白質に対する
特異的コード化順序を分離し、これらを公知の表現制御
順序に融合させてよシ高度の表現レベルを得ることが有
利である。これは達成されており、新たに処理されたＤ
ＮＡ断片を多コピープラスミドまたはバクテリオファー
ジ誘導体中に導入して、細胞内の遺伝子コピーの数を増
加させそれにより表現蛋白質の収率をさらに・改善する
ことができる。
例示の目的で、ＨＢｃＡｇの遺伝子について決定した１
部序をこのようにして用いて、イー・コリにおけるＨＢ
ｃＡｇの生産を改善した。その一つの過程を第１Ｏ図に
示す。
第３図におけるＨＢｃＡｇについてのＤＮＡ順序を点検
すると、この遺伝子はヌクレオチッドー−２乙にΔ廊・
Ｉに対する目標（ＡＧＣＴ）を有し、ヌクレオチット２
−２および／！り０にユニ・ＲＩ　　に対する目標を有
し、２０りにユニ・Ｒ１１に対する目標（ＣＣＴＧＧ）
、−２♂Ｑに旦■・■に対する目標（ＧＧＣＣ）またコ
≠６および≠６１ｉｃＡｖａ−１１ｉｃ対する目標（Ｃ
ＧＡＣＣ，、ＧＧＴＣＣ）を有することが判る。この複
雑性が与えられると、核抗原コード化順序をよ゛り効果
的な表現制御順序に２段階で移行させるのが便利である
。
たとえば、本発明により製造されて約２３６０塩基対（
ヌクレオチット）、すなわち第３図のスクレオチツドー
♂θ〜約２２７０のＨＢＶ・ＤＮＡ挿入物を有する組換
えＤＮＡ分子をＡ　Ｉ　ｕ　−２およびＥｃｏ−ＲＪ　
で消化すると、特にヌクレオチット−２６と２２との間
に断片（断片Ａ）を与える一方、Ｅｃ＋＋、Ｒ１の単独
消化はヌクレオチット２３〜ｉｒｒりに断片（断片Ｂ）
を与えかつヌクレオチット２３〜６７６における断片（
断片Ｂｙ）の収率を低くする。これらの断片は第３〜≠
図を参照して容易をで確認することができ、第１Ｏ図に
図示する。断片ＡおよびＢはゲル電気泳動によシ分別精
製され、それらのＥｃｏ−Ｒ１”を介して端部結合し、
合体断片（断片Ｃ）を与える。次いで、必要に応じ断片
Ｃを直接結紮により新たな表現制御順序に付加させ、前
記したようなＢ′端部結合法を介しまたは合成的オリゴ
−ヌクレオチット結合を介して正しい翻訳相を維持する
。この付加はより良好な表現制御順序を使用して蛋白質
生産を改善させるだけでなく、ＨＢｃＡｇをコード化す
る遺伝子断片を表現制御順序自身によυ近接して付加さ
せそれによりその遺伝子断片の表現の制御を向上させる
ことも可能にする。同様にして、断片ＡおよびＢ′を合
体させ、または多くの他の調製断片を合体させ、得られ
た断片を上記のように使用することができる。この方法
は、特定ポリペプチドをコード化する構造遺伝子の７部
のみを本発明の組換えＤＮＡ分子（ｐＨＢＶ／ハ・に使
用する需要があることを示している。
選択された遺伝子断片の特定表現制御１貝序と開始コド
ンとの間の距離をさら（（短線するため、特定断片をそ
の末端でまたは末端近くで特異的に作用するヌクレアー
ゼの組合せ物により軽く処理するかまたはエキソヌクレ
アーゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に使用して、断
片の開始コドンに先行する断片のヌクレオチットの全て
または幾つかを除去することができる。或いは、ヌクレ
オチット−２６および３０で開裂して生ずるたとえばΔ
弧・Ｉ断片のような断片を同様にエキソヌクレアーゼ処
理またはポリメラーゼ結合修復反応によシ短縮させ、次
いでシー・ＲＩ＊で開裂させてヌクレオチット−２乙お
よび／とヌクレオチット−２２との間から断片をもたら
し、断片Ｂに融合させた後に表現制御順序に付加させる
ことができる。３別の経路は断片Ｂまたは同等の断片の
交雑化を包含し、これはＤＮＡポリメラーゼおよび限ら
れた数のヌクレオシドトリホスフェートとの一連の反応
において伸長のため元の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子から適当
な単一ストランド雛型に対して行なわれ、したがって断
片ストランドはコード化順序の初めに再構成することが
できるであろう。次いで雛型ストランドを伸長断片スト
ランドに関連する位置に２いてエンドヌクレアーゼＳ／
により開裂させ、そして得られた断片を表現制御順序に
付加きせる。
幾つかの表現制御順序は、上記したように使用すること
ができる。これらは、イー・コリの乳糖オペロン（「１
蘇系」）の作動子、促進子およびリポソーム結合および
作用順序（たとえばシャインータ゛ルガＩＶ／順序のよ
うな順序を含む）、イー・コリのトリプトファン合成酵
素系Ｃｒｔｒｐ系」）の対応する順序、ファージλの主
要作動子および促進千載（０ＬＰＬおよびｏＦＬＰｒＬ
Ｉ）ならびにファージ「ｄ破瓜蛋白質の制御域を包含す
る１、こｎら順ＦＦ？含有するＤＮＡ＠片は、１二もし
くはｔｒｐオペロンを担持する変換用ファージから単離
されたＤＮＡからまたはファージλもしくは「ｄのＤＮ
Ａから制限酵素での開裂により一１１出される。次いで
、これら断片をＨＢＶ抗原順序；（ついて記載したよう
に処理して限られた数の分子を得、重要な制御順序を断
片Ｃについて上記したように所望抗原に対するコード化
順序の開始コドンに極めて近接してまたはこれに並列さ
せて結合させることができる。
次いで、融合生成物を上記のよう（Ｃクローン用ベヒク
ル中に挿入して適当な宿主を変異させ、抗原生産レベル
を細胞の溶解の後に放射免疫分析により測定する。遺も
効果的な表現を与える細胞はこのように選択することが
できる。或いは、開始コドンに付加されたｌａｃ、　　
ｔｒｐもしくはλＰＬ制御系を担持するクローン用ベヒ
クルを使用して、これ＝ｉＨＢＶ抗ＨＢＶ示すポリペプ
チドをコード化する順序を持った断片に融合させ、構造
遺伝子断片をクローン用ベヒクルの開始コドンから正確
に翻訳する。
これらの実験を特にＨＢＶ核抗原の生産に関連させたが
、これらはたとえばＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ遺伝子
ならびにその断片のような他の遺伝子の表現を改良する
のにも使用することができる。
これら特定抗原の細胞収率における増加は、細胞中に使
用しつる遺伝子の数の増加に依存する。これは、例示の
目的であるが、上記したように得られた組換えＤＮＡ分
子を雛型バクテリオファージλ（ＮＭ９１り）中に挿入
することにより達成され、最も簡単にはプラスミドを制
限酵素、たとえばユニ・Ｒ１または一匹２止・■で消化
１−で線状分子を与え、次いでこれを制限ファージスク
ローン用ベヒクル〔たとえばエヌ・イー・ムレ−等、「
組換え体の試験管内における回収を簡易化するラムダ型
ファージ」、モレキュラー・ジーン・ゲネテイツク、第
１ｊＯ巻第ｊ３〜乙／頁（ｌり７７）およびエヌ命イー
・ムレ−等、「バクテリオファージＴ≠からのＤＮＡリ
ガーゼ遺伝子の分子無性増殖」、ンヤーナノいモレキュ
ラー・バイオロジー、第７３２巻第ψり３〜ｓｏｊ頁（
／９７９）に記載された種類〕と混合し、そして組換え
ＤＮＡ分子をＤＮＡＩ、１ガーゼとの培養により生成さ
せる。このような手順を第１／図に示す。次いで、所望
の組換えファージを、特定抗原に対する放射免疫分析に
よりまたは放射ラベルしたＨＢＶ、ＤＮＡ順序との交雑
化によシ選択して、イー・コリの宿主株を溶菌化するの
に使用した。
特ニ有用なλクローン用ベヒクルは抑圧遺伝子ｃｌにお
ける感温性突然変異株および遺伝子互における抑圧側突
然変異株を含み、その生成物は宿主細胞の溶解に必要で
あり、さらに遺伝子Ｅに関するものも含みその生成物は
ビールスの主要なカプシド蛋白質である。この方式によ
れば、笥解性細胞を３２°Ｃにて成育せしめ、次いで≠
ｊ℃に加熱してグロファージの制量を誘発させる。３７
℃にて長期成育させると高レベルの抗原生産分もたらし
、これが、細胞内に保持される。何故なら、こハらはフ
ァージ遺伝子牛酸物により通常のようＫは溶解されない
からであり、またファージ遺伝子挿入物はカプセル化さ
れないので、それは転写用として使用可能に留まるから
である。次いで、細胞の人工的ｍｍは抗原を高収率で遊
離させる（第１／図）。
これら実施例が原理的に関係するイー・コリ系シτ加え
、同じ型の処理を行なって、たとえば、バチルス・ズブ
チリス、すなわち耐熱性細菌または酵母およびカビのよ
うな他の微生物細胞或いは培養動物または植物細胞にお
いて抗原生産レベルを増大させることができる。バチル
ス・ズブチリスの場合、バチルス・リヒエニホルミスか
ら単離されたベニシリナーゼの決定子を担持するプラス
ミドはこれら目的に有用な表現制御項序を提供する。
ＨＢｓＡｇについて決定した遺伝子およびアミノ酸順序
は、本発明の方法によりＨＢｓＡｇに対する遺伝子の表
現を可能にする方法を設計する際に有用である。このよ
うな表現は、ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを生成し
た組換えＤＮＡ分子により変異させた宿主において従来
観察されなかった。
第６〜ｒ図のヌクレオチット順序は、ヌクレオチット／
≠３７と２／／弘との間のＨＢｓＡｇをコード化する遺
伝子を示す。この遺伝子は、第３〜り図のＨＢＶゲノム
におけるＨＢｃＡｇをコード化する遺伝子（読み枠／）
とは異なる翻訳相（読み枠３）にある。したがって、適
当な宿主を変異させるために使用された時ＨＢｃＡｇを
生成しなかったが、約２３よ０個のヌクレオチット（第
３〜を図の順序のヌクレオチット−１０，２２７０にほ
ぼ相当する）のＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物を含有する組換え
ＤＮＡ分子をＨＢｓＡｇ生産に使用するため選択した。
選択された組換えＤＮＡ分子は、特ｉ／（ＨＢ　ｓ　Ａ
ｇをコード化する全遺伝子を含有した。この組換えＤＮ
Ａ分子のＨＢＶ−ＤＮＡ挿入物のヌクレオテッド順序を
検査すると、ＨＢｓＡｇをコード化する遺伝子を含有す
る断片の割出を可能にする幾つかの制限エンドヌクレア
ーゼ目標が示される。たとえば、ヌクレオチット／≠Ｏ
り（Ｘｈｏ）、ヌクレオチット／　ｔａｌｏ　（Ｔ＋１
ｇ　Ｌ　ヌクレオテッド／’＋０り（ＡｖａｌＬ　およ
びヌクレオチット／≠２♂（Ｈｈａ　ｌ　）　（第６図
）。これらのうち最後のもの（Ｈｈａ　ｌ　）は特に有
用である。何故なら、ＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物の開裂はヌ
クレオチット順序３０と／弘３７との間で起こり、ＨＢ
ｓＡｇ自身に対する遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）
の前方に僅か６個のヌクレオチットが存在するからであ
る。≠種の場合全てにおいて、割出された断片は、選択
されたＨＢＶ−ＤＮＡ挿入物を越えて、組換えＤＮＡ分
子のｐＢＲ７２２部分のヌクレオチット順序内に位置す
る特定制限エンドヌクレアーゼに対する目標まで延在す
る。したがって、これら制限エンドヌクにアーゼおよび
その地回様に有用なものを単独または組合せて使用する
と、開始コドンの近辺であるかその前方と翻訳終末コド
ンの後とにおいてｆ（ＢｓＡｇをコード化する遺伝子の
割出が可能となる。勿論、ＨＢｃＡｇに対する遺伝子の
場合に示したように、全遺伝子の断片のみを組換えＤＮ
Ａ分子中に実際使用し、適当な宿主においてＨＢｓＡｇ
抗原性を示すポリヌクレオチットを生成させうろことが
了解されよう。
このような消化物から生ずるＨＢＶ、ＤＮＡの断片を、
核抗原をコード化する遺伝子および遺伝子断片について
記載したものに類似した一連の反応で処理した。たとえ
ば、遺伝子断片をｐＢＲｊ２２のペニシリン耐性をコー
ド化する遺伝子（たとえばＰｓｔ　ｌ識別部位、第２図
）中に挿入してＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリペプチドを
β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ遺伝子の生成物）と
融合させて生成させることができ、遺伝子断片をｐＢＲ
３２２におけるペニシリン耐性をコード化する遺伝子と
テトラサチクリン耐性をコード化する遺伝子との間（ユ
ニ・Ｒ１またばＨｉｎｄ　［１１Ｒ別部位、第２図）に
挿入して、これをそこでまたは挿入前に二系表現ｆｆ１
ｌｌ　ｉｍｌ傾序：で結合することＫよりＨＢ　ｓ　Ａ
ｇ抗原性を示すポリペプチドを生成させてｌａｃ系のβ
−ガラクトシダーゼ蛋白質に融合させることかでき、遺
伝子断片を、ＨＢｅＡｇをコード化する遺伝子Ｏてつい
て前記したと同様ＩＣ１選択された表現削−順序自身に
できるだけ近接してクローン用ベヒクル中に挿入するこ
とができ、或いは遺伝子断片を本発明により記載したと
同様に無性増殖させることができる。
例示の目的で、一つのこの種の方法を第７２図に示す。
ここで、はぼヌクレオチット−１０と２２７０（第３〜
ｒ図）との間に延在したＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物を有する
選択組換えＤＮＡ分子をＨｈａ　−（での消化により断
片化させた。
得られた断片を、前記した３′末端結合法によりｐＢＲ
３２２のｐｓＬ　１部位に挿入した。この組換えＤＮＡ
分子によシ変異させた宿主は、ＨＢｓＡｇ抗原性を示す
ポリペプチドを生成した。
他の断片（たとえばΔｖａ　ｌ　、　Ｔａｇ　、Ｘｈｏ
またばＰｓｔｌ（部分消化））をもｐＢＲ３２２におけ
るＰｓｔ　ｌ識別部位または他の部位て挿入して、ＨＢ
ｓＡｇ抗原避を示すポリペプチドまたはＨＢｓＡｇをコ
ード化する遺伝子断片の生産に有用な組換えＤＮＡ分子
を生成させた。
さらに、この種の遺伝子断片をＰｓＬ　ｌにより開裂さ
れたｐＢＲ３２２に挿入し、次いで得られたベニシリナ
ーゼをコード化する遺伝子の断片を、ベニ／リナーゼま
たはβ−ラクタマーゼのアミノ酸／♂２をコード化する
コドンから成る場合にはアミノ酸３２をコード化するコ
ドンへとまた他の場合にはそのポリペプチドのアミノ酸
１３をコード化するコドンへと切シ離す。またｐＢＲｊ
　２２−Ｐｓｔ　ａｌ’のこれら誘導化プラスミドをヌ
クレオチット／μ弘７から１７り６まで延在するＨＢｓ
Ａｇ遺伝子断片（第６〜７図）と共に使用してＨＢ　ｓ
　Ａ　ｇ抗原性を示すポリペプチドを生成させた。
ＨＢｓＡｇをコード化する構造遺伝子の直前におけるヌ
クレオチツドタ４Ｌ♂〜／弘ｊ７間／’）ヌクレオチッ
ト順序を使用断片中に含まぎて、ＨＢｓＡｇ抗原性を示
すポリペプチドおよびＨＢｓＡｇに対する構造遺伝子の
遺伝子断片を生産するのに有用な組換えＤＮＡ分子を生
成させることもできる。このヌクレオチット順序は、遺
伝子の先駆体順序と呼ばれる。この先駆体順序とＨＢｓ
Ａ、ｇに対する構造遺伝子との両者を含む遺伝子断片を
Δ坦・Ｉ（ヌクレオチツドタ３り）、Ｈｈａ・Ｉ（ヌク
レオチツドタＯＯ）または旦肥・ＩＩ（ヌクレオチット
ざタタ）により創出することができる。Ａｌｕ−１およ
びＨｈａ　−１の場合、部分消化と得られた断片のたと
えばゲル電気原動による分離とが必要である。例数なら
、これら酵素に対する識別部位は、先、駆体順庄内にお
いて、Ａ組・１についてはヌクレオチット１０り／にま
たＨｈａ　−１１についてはヌクレオチット／１Ａ２１
にも生ずるからである。
以上、本発明の多くの具体例について記載したが、この
基本構成を変化させて、本発明方法を使用する他の具体
例を与えることもできることが明白である。したがって
、本発明７）範囲は例示した特定実施例によシ規定さる
べきでなく、特許請求の範囲の記載によシ規定さるべき
であることが了解されよう。
本明細書中に記載した方法（（より調製した微生物は、
ｌり７り年／２月ｌり８江スコツトランド、アバディー
ン在のザ・カルチャー・＝レクション・オプ・ザ・ナシ
ョナルｅコレクション・１プ・インダストリアル・バク
テリア　（ＴｈｅＣｕＨｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　ｏｒ　Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎｏ「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃ’ｔｅｒｉａ　
）　　に寄託されかつｐＢＲｊ　２　ｊ　−ＨＢＶ−Ｇ
−Ｌと同定サレｆｃ培養物ニよシ例示され、次のような
特性を有する。
Ｇ：イー・コリＨＢＩＯＩ　／ｐＢＲ３２２−二匹１ｄ
Ｇ：ＨＢＶ−Ｋｐｎ　Ｉ　ｄＣ（以下、’　ｐＨＢＶ１
１４　”　）：　Ｔｅｔ’Ａｍｐ’ＨＢＶ” Ｈ：イー・コリＨＢＩＯＩ　／　ｐＢＲ３２２一旦１．
ビｄＧ：ｐＨＢＶ１１４−Ｐｓｔ　Ｉ　：’Ｔｅｔ”Ａ
ｍｐ’ＨＢＶ”ＶＡ”■：イー・コリＨＢＩＯＩ　／　
（（ｐＢＲ３２２−Ｅｃ土Ｒｒ。
１姪旧二一り匹−プロモータ配列） −）Ｉｉｎｄ　ＩＩ！　’）　７カー：　ＩＴＢＶ１１
４−）１ｈａ　ＩＲａｍ　）ＩＩ　：　Ｔｅｔ’Ａｍｐ
？ＨＢＶ”ＶＡ”Ｊ：イー・コリＨＢＩＯＩ　／　ｐＬ
ＩＲ２Ｅｃｏ　Ｒ１：　ＨＢＶ１１４−二ｒ　Ｅｃｏ　
Ｒ１リンカー：　ＴｅＬ’Ａａ＋ｐ”ＨＢＶ“ＶＡ十 に：イー・コリＨＢＩＯＩ　／ｐＢＲ３２２−ＰｓＬ　
ｒ　ｄＧ　：ｐＨＢＶ１１４−Ａｖａ　ｆ　ｄＣＴｅｔ
”ＡｍｐＳＨＢＶ”ＶＡ”Ｌ：イー・コリ）１８１０１
　／　ｐＢＲ３２２−Ｐｓｔ　ｒ　ｄＧ　：ｐＨＢＶ１
１４−Ｔａｑ　ｄＣＴｅｔ”Ａｍｐ’Ｈ８Ｖ”ＶＡ”※
　：テトラブイクリン尉性についてのポリペプチドをコ
ード化する遺伝子を含む ＤＮＡ順序を持ったｐＢＲＪ２２の誘導体を、イー・コ
リｌａｃ系を含むより小さいＤＮＡＪ＠序で置き換えた
。
【図面の簡単な説明】
第１図はディン粒子の内生Ｄ　Ｎ　Ａの構造を示す略図
であり、第２図は本発明方法の好適具体例の略説明図で
あり、第３〜り図は本発明によシ肝炎Ｂビールスゲノム
の一部について決定したヌクレオチット頭圧の説明図で
あシ、第１０図は肝炎Ｂビールス核抗原を示すポリペプ
チドを生産することのできる組換えＤＮＡ分子を断片化
し、その断片を改善表現制御順序（（結合させる本発明
方法の略説明図であシ、第１／図は本発明方法の略説明
図であり、第１−図は本発明方法の他の具体９りの略説
明図である。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）Ｂ型肝炎ウィルス源の他の蛋白を実質的に含まな
    いことを特徴とする組換えＢ型肝炎ウィルス抗原。
  2. （２）組換えＢ型肝炎ウィルス抗原をコードするＤＮＡ
    配列を含む組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主
    を培養することにより産生された特許請求の範囲第１項
    記載の組換えＢ型肝炎ウィルス抗原。
  3. （３）式： 【遺伝子配列があります】 のポリペプチドおよびＨＢＶ抗原性を示すその断片より
    なる群から選択される特許請求の範囲第１項記載の組換
    えＢ型肝炎ウィルス抗原。
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