JPH084507B2 - 新規ｄｎａおよびポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規DNAおよびポリペプチドに関する。

従来の技術および発明が解決しようとする問題点 ヒトＢ型肝炎は、DNAウイルスの１種であるＢ型肝炎
ウイルス（Hepatitis B Virus;以下、HBVと称すること
もある）の感染によって発症する。HBVは、デン粒子と
してその性状が知られており、このウイルス粒子の表面
にはHBV表面抗原（以下、HBsAgと略称する）、粒子内部
に一部分単鎖部分をもつ二重鎖環状DNA、HBVコア抗原
（以下、HBcAgと略称する）、HBVe抗原（HBeAg）が存在
し、また二重鎖DNAの単鎖部分を修復する酵素として内
存性DNA合成酵素の活性が検出されている。HBV DNAは分
子量2.1×10⁶ダルトンで約3,200の塩基対を有する。HBs
Agの抗原性は共通抗原のａを中心にadr,adw,ayr,aywの
４種類が知られている。

HBcAgはHBV感染の早期診断のための診断用試薬として
使用できる。すなわち、HBVに感染すると抗HBs抗体が血
中に現われる前に、抗HBc抗体が出現するので、これを
検出することによりHBV感染の有無を早期に判定でき
る。また、HBcAgは最近、HBVの感染防御に有効であると
の報告もなされている。

一方、HBeAgを含有する血液はデン粒子の含有量も多
く、HBVの感染性のある血液として危険性が高い。それ
故、HBeAgの存在の有無を知ることはHBV感染患者の治療
においても重要であり、HBV感染の診断に必須である。

しかしながら、HBcAgおよびHBeAgを得るには一度デン
粒子を集め、この中のHBcAg,HBeAgを分離しなければな
らないが、デン粒子中に含まれるHBcAgおよびHBeAgは微
量であるため、これらを安全に、しかも大量に得る方法
の確立が望まれていた。

問題点を解決するための手段 本発明はＢ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示す新規なポリ
ペプチドをコードするDNAを含有する組換えDNAおよび該
組換えDNAを含有する形質転換体に関し、更に詳しくは （１）プロモーター、該プロモーターの下流に、翻訳開
始コドン,B型肝炎ウィルスｅ抗原性を示すポリペプチド
をコードするDNAおよびその直後に停止コドンを連結し
てなる組換えDNAであって、Ｂ型肝炎ウィルスｅ抗原性
を示すポリペプチドが次のアミノ酸配列： のいずれかを有するものである、組換えDNA、 （２）プロモーターのSD配列と翻訳開始コドンとの間の
配列がATCGGGCである、（１）記載の組換えDNA、 （３）次のプラスミド： pTB441（FERM BP−1148）、 pTB449、 pTB552（FERM BP−1149）、 pTB（４）441−１（FERM BP−1154）、 pTB（４）441−８（FERM BP−1155）および pTB（４）552−８（FERM BP−1156）から選ばれるもの
である、（１）記載の組換えDNA、および （４）プロモーター、該プロモーターの下流に、翻訳開
始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチ
ドをコードするDNAおよびその直後に停止コドンを連結
してなる組換えDNAであって、Ｂ型肝炎ウィルスｅ抗原
性を示すポリペプチドが次のアミノ酸配列： のいずれかを有するものである組換えDNAを含有する、
大腸菌を宿主とする形質転換体、 を提供するものである。

本発明のＢ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチ
ドを生産する形質転換体の宿主たる微生物としてはＢ型
肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチドを生産する能
力を有するものであればいかなるものであってもよい
が、プロモーターの下流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝炎
ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするDNA
およびその直後に停止コドンを連結してなる組換えDNA
を保持する大腸菌、酵母などがあげられるが、なかでも
上記組換えDNAを保持する大腸菌が好ましい。

プロモーターとしては、RNAポリメラーゼが結合する
ことによってmRNA合成を開始させるのに必要な部位を含
むものであれば、いかなるものであってもよい。たとえ
ば大腸菌を宿主として用いる場合に使用するプロモータ
ーとしてはtrpプロモーター,recAプロモーター,lacプロ
モーター，λＰ_Ｌプロモーター,tufBプロモーターなど
があげられ、とりわけtrpプロモーターが好適である。

さらに好ましくは、プロモーター中のSD〔シャイン−
ダルガーノ（Shine−Dalgarno）〕配列と、後述の翻訳
開始コドンとの間の配列がATCGGGCであるプロモーター
があげられる。

たとえば酵母を宿主として使用する場合においては酵
母で機能しうるプロモーターであればいかなるものであ
ってもよい。

翻訳開始コドンとしては好ましくはATGがあげられ
る。

Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチドをコー
ドするDNAとしてはいかなるサブタイプのＢ型肝炎ウイ
ルスｃ抗原性を示すポリペプチドをコードするDNAであ
ってもよいが、第２図に示されるポリペプチドをコード
するDNA（adw型）が好ましい。さらに好ましくは、第１
図（adw型HBV DNAの全塩基配列を示す）に示される塩基
配列順序1901〜2455のDNA（adw型）がさらに好ましい。

Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチドをコー
ドするDNAとしてはいかなるサブタイプのＢ型肝炎ウイ
ルスｅ抗原性を示すポリペプチドのコードするDNAであ
ってもよいが、第２図に示されるアミノ酸配列順序１よ
り始まり95ないし184のポリペプチド（adw型）をコード
するDNAが好ましい。さらに好ましくは、第１図に示さ
れる塩基配列順序1901より始まり2263（2263番目の塩基
はＣでもよい）ないし2356のDNA（adw型）がさらに好ま
しい。

Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性またはｅ抗原性を示すポリ
ペプチドをコードするDNAは、生産されるポリペプチド
の抗原性が失なわれない限り、一部のアミノ酸，ペプチ
ドを欠除、他のアミノ酸，ペプチドへの置換、あるいは
他のアミノ酸，ペプチドの付加がなされているポリペプ
チドをコードするDNAであってもよい。

停止コドンとしてはTAA,TAG,TGAがあげられる。

たとえばadw型HBc抗原性を示すポリペプチドをコード
するDNAは、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucle
ic Acids Res.）,11巻,1747頁（1983年）に記載されて
いるpBR322−EcoRI/HBV933（pHBV933と略称）を制限酵
素HhaI消化により断片化し、得られるDNA断片のうちHBc
抗原性を示すポリペプチドをコードするDNAを含有する
約１キロ塩基対のDNAを分離し、EcoRIリンカーを結合し
た後、トリプトファンプロモーターを含むptrp781〔ptr
p701（ヨーロッパ特許公開第0068719号公報参照）を制
限酵素EcoRI消化後、ClaIで部分分解し、生じたのりし
ろ部分をDNAポリメラーゼＩラージフラグメントで修復
し、T4DNAリガーゼを用いて環状化されたプラスミドで
あって、EcoRI部位に近い方のClaI部位がこわれたも
の〕のEcoRI部位に結合されたプラスミドpHE1を得る。
さらに該プラスミドpHE1をEcoRI消化し、さらにヌクレ
アーゼBal 31で消化した後、ClaIリンカーを結合させ、
trpプロモーターを含むptrp771（ヨーロッパ特許公開第
0068719号公報参照）のClaI部位に挿入すれば目的のHBc
抗原性を示すポリペプチドをコードするDNAを含有する
プラスミドpTB368を得ることができる（第４図参照）。
該プラスミドで大腸菌（DH1,χ1776,C600など）を形質
転換することによりHBc抗原性を示すポリペプチドの生
産能を有する大腸菌株が得られる。

adw型HBe抗原性を示すポリペプチドをコードするDNA
は、たとえば適当な制限酵素（例、AvaI,AvaII）でプラ
スミドpTB368を切断し、必要によりさらにヌクレアーゼ
Bal 31で消化した後、停止コドンを含む適当なリンカー
を結合させ、ptrp771に組み込むことにより、目的のHBe
抗原性を示すポリペプチドをコードするDNA含有するプ
ラスミドを得ることができる。得られたプラスミドで大
腸菌（DH1,χ1776,C600など）を形質転換することによ
りHBe抗原性を示すポリペプチドの生産能を有する大腸
菌株が得られる（第５図参照）。

adw型以外のサブタイプのHBc抗原性あるいはHBe抗原
性を示すポリペプチドをコードするDNAも上記と同様に
して得ることができ、また、大腸菌以外の微生物を宿主
として用いる場合においても、該宿主において機能しう
るプロモーターを含有するプラスミドに上記DNAを挿入
することにより目的とするポリペプチドの生産能を有す
る微生物が得られる。

プロモーターのSD配列と翻訳開始コドンとの間の配列
がATCGGGCである組換えDNAはたとえば、適当な制限酵素
（例、EcoRI）で処理した後、S1ヌクレアーゼを作用さ
せ、ライゲーション反応を行うことにより得ることもで
きるが、オリゴヌクレチオド・ミュータジェネシス（ol
igonucleotide mutagenesis）などの公知の方法を用い
て作製することもできる。

得られた大腸菌の形質転換体は自体公知の培地で培養
することができる。培地としてはＬブロス，ペナセイ
（Penassay）ブロス，グルコース，カザミノ酸を含むＭ
−９培地などの公知の培地があげられる。必要によりプ
ロモーターを効率よく働かせるために、たとえば、３β
−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることがで
きる。培養は通常15〜43℃、好ましくは28〜40℃で２〜
24時間、好ましくは３〜８時間行い、必要により通気や
攪拌を加えることもできる。

培養後、公知の方法で菌体を集め、緩衝液に懸濁し、
超音波処理、リゾチームおよび（または）凍結融解によ
って菌体を破壊したのち、遠心分離により目的とするポ
リペプチドを含む抽出液を得る方法などの公知の方法を
用いることができる。また抽出液からの目的とするポリ
ペプチドの分離、精製も自体公知の方法により行なわれ
る。

大腸菌以外の微生物の場合も同様にして目的とするポ
リペプチドを得ることができる。

作用 本発明のHBc抗原性あるいはHBe抗原性を示すポリペプ
チドは天然由来のHBc,HBe抗原と同様にＢ型肝炎の診断
剤,B型肝炎ウイルスの感染の防御（予防）剤として使用
することができる。

プロモーターのSD配列と翻訳開始コドンとの間の配列
がATCGGGCである組換えDNAにおいては、HBc抗原性ある
いはHBe抗原性を示すポリペプチドの生産量が増大し、H
Bc抗原あるいはHBe抗原の製造に有利である。

実施例 以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるべきものではない。

実施例１ プラスミドpHBV933を制限酵素EcoRIおよびHhaIで切断
し、１％アガロースゲル電気泳動により、HBc抗原遺伝
子を含むDNA断片（1005bp）を分離した。緩衝液中（10m
M酢酸ナトリウム,150mM NaCl,0.05mM ZnSO₄,pH4.0）で
ヌクレアーゼS1処理した後、EcoRIリンカーｄ（GGAATTC
C）を結合し、さらにEcoRI処理した。このDNA断片をプ
ラスミドptrp781のEcoRI部位に挿入した後、これを用い
て大腸菌DH1を形質転換した。HBcAg遺伝子が組み込まれ
たプラスミド（pHBcHE1）を保持するクローンよりプラ
スミドを抽出し、該プラスミドよりEcoRI DNA断片を切
り出した。５μｇの該DNA断片を緩衝液中（600mM NaC1,
20mMトリス・HC1,pH8.0,12mM CaC1₂,12mM MgC1₂,1.0mM
EDTA）で２ユニットのBal31で24℃,1分間処理した。C1a
Iリンカーｄ（CATCGATG）を結合したのち、C1aIで消化
した。該DNA断片をptrp771のC1aI部位に挿入し、これを
用いて大腸菌DH1を形質転換させ、テトラサイクリン耐
性の形質転換体（Escherichia coli DH1/pTB368）を
得た。

実施例２ 実施例１で得られた形質転換体を８μg/mlのテトラサ
イクリンを含むＭ−９培地（10ml）中、37℃で培養し、
クレット・ユニット（Klett unit）［580nmの吸光度］
が180〜200の時、３β−インドリルアクリル酸を25μg/
mlの濃度に加えて、培養をさらに２〜３時間続けた。

培養液を5000rpm,10分間遠心分離して菌体を集め、1m
lの緩衝液（20mMトリス・HCl,pH7.6,20％ショ糖）に懸
濁し、リゾチーム（3mg/ml）,EDTA（最終濃度5mM）およ
びPMSF（最終濃度1mM）を添加して、よく攪拌したの
ち、４℃で１時間静置した。超音波破砕により菌体をさ
らに破壊し、15000rpmで20分間遠心を行い（２回）、得
られた上清（抽出液）をアボット社のHBeリアキットを
使用してHBc抗原価の測定に使用した。その結果、該形
質転換体はHBc抗原発現クローンであることがわかっ
た。

該形質転換体の菌体抽出液を生理食塩水で希釈し、そ
の抗原価を測定した結果、少なくとも2500倍希釈の濃度
でもHBc抗原の検出は可能であった。

実施例３ 上記形質転換体（Escherichia coli DH1/pTB368）よ
りプラスミド（pTB368）を抽出し、該プラスミドを制限
酵素AvaIで切断し、ヌクレアーゼBal 31で30〜90秒間処
理した。停止コドンを有するEcoRIリンカーを結合し、p
trp771のClaI・EcoRI部位に挿入したのち、大腸菌DH1を
形質転換した。得られた形質転換体をＭ−９培地で培養
し、実施例２に記載の方法でHBe抗原価を測定した。HBe
抗原を産生する形質転換体（Escherichia coli DH1/pTB
441,Escherichia coli DH1/pTB449,Escherichia coli D
H1/pTB552）を得た。

実施例４ 形質転換体の菌体抽出液を生理食塩水で５倍に希釈
し、アボット社のHBeリアキットで抗原価を測定した。
結果を以下に示す。

実施例５ ｉ）大腸菌DH1/pTB368の菌体抽出液をベックマン超遠心
機（SW55ローター）で40,000rpm,4℃で６時間遠心し、
沈殿物を緩衝液（20mMトリス・HC1,1mM EDTA,0.15M NaC
1,pH7.6）に溶解した。

試料50μｌに２倍濃度のSDSポリアクリルアミド用緩
衝液（0.15Mトリス・HC1,pH6.8,4％SDS,20％グリセロー
ル,10％２−メルカプトエタノール,0.002％ブロモフェ
ノールブルー）50μｌを加え、100℃,5〜10分間加熱し
た後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ニト
ロセルロースフィルターに上記の分離された蛋白を電気
的に吸着させ、¹²⁵I−抗−HBe抗血清を反応させ、洗浄
後オートラジオグラフを取った。その結果、該形質転換
体が産生する蛋白は分子量が21,500〜22,000ダルトンと
推定された（第６図参照）。

ii）大腸菌DH1/pTB368の菌体抽出液に固形のセシウムク
ロリドを加え、平均ρ＝1.20となるようにした後、38,0
00rpmで72時間遠心し、分画した後、HBc抗原の抗原性の
存在する分画を検討した結果、HBc抗原はρ＝1.34付近
にピークとして分画された（第７図参照）。

以上、i,iiの結果から、該形質転換体の産物はHBcAg
の粒子を形成していると推定される。

iii）大腸菌DH1/pTB368,大腸菌pTB441の菌体抽出液0.5m
lを５〜25％のショ糖濃度勾配液（20mMトリス,pH7.6,0.
15MNaCl,0.001M EDTA）35ml上に重層し、24,000rpm,4℃
で４時間遠心した後、30本に分画した。それぞれの分画
の200μｌずつをHBcAgのEIA（Enzyme Immunoassayキッ
ト，アボット社）法によりHBcAg,HBeAgの検出を行っ
た。

大腸菌DH1/pTB368の産物は主に分画9,10に、大腸菌DH
1/pTB441の産物は分画20,21,22,23に分画され（第８図
参照）、前者は粒子状、後者は粒子の形態をとらないペ
プチドと推定された。

iv）大腸菌DH1/pTB368の菌体抽出液にHBV感染チンパン
ジーの肝臓から抽出したHBcAg粒子で免疫して得た抗HBc
抗血清を加えた後、抗体価の減少を抗HBc測定用キット
（アボット社）で測定した結果、抽出物は抗HBc抗体と
反応し、抗HBc抗体を中和することが明らかとなった。

一方、大腸菌DH1/pTB441,大腸菌DH1/pTB449,大腸菌DH
1/pTB552の菌体抽出物は殆ど抗HBc抗体と反応しなかっ
た。

各形質転換体の抽出物と¹²⁵I−抗−HBc抗体とを反応
させ、¹²⁵I−抗−HBc抗体の残存量を抗HBc測定用キット
（アボット社）で検討した結果を以下に示す。

実施例７ 予め、約20000cpmを示すよう生理食塩水で希釈した菌
体抽出物（大腸菌DH1/pTB368,64倍希釈；大腸菌DH1/pTB
441,4倍希釈）および血清HBeAg（未希釈）100μｌに、
生理食塩水で100倍,500倍,1000倍に希釈したウサギ抗HB
c抗体およびコントロールとして生理食塩水，固相HBe
（HBc）抗体を加え、室温一晩反応後、固相に結合した
抗原を測定した。結果はコントロールとして生理食塩水
を加えた系のカウントを100％として％（パーセント）
で第10図に示した。なお、コントロールのカウントは各
々、大腸菌DH1/pTB368,22340cpm,大腸菌DH1/pTB441,234
71cpm,血清HBeAg,9491cpmであった。

血清HBeAgはカウントで、他の約1/2量の抗原しか加え
ていないのにもかかわらず、第10図から明らかなように
抗HBc抗体を添加してもカウントは最大10％程度しか低
下しなかった。従ってこの抗HBc抗体はHBcAgの検出には
ほとんど影響を及ぼさないものと考えられる。

大腸菌DH1/pTB368の抽出物では抗HBc抗体の添加によ
り明らかにカウントの低下がみられ、産生物がHBc抗原
性を有していることがわかる。大腸菌DH1/pTB441抽出物
では大腸菌DH1/pTB368抽出物のような明らかなカウント
の低下はみられず、産生物は主にHBe抗原性を示してい
ることが示唆される。

実施例８ プラスミドpTB441,pTB449およびpTB552に挿入されて
いるHBeAgをコードするDNAの３′末端側の塩基配列を以
下に示す。

ｉ）pTB441 すなわち、該プラスミドにより生産されるペプチドは
HBcAgのＣ末端側のアミノ酸47個が欠損（天然のHBeAgの
Ｃ末端側のアミノ酸７個が欠損）し、９個の別のアミノ
酸が付加したものである。

ii）pTB449 すなわち、HBcAgのＣ末端側のアミノ酸33個が欠損
し、16個の別のアミノ酸が付加している。

iii）pTB552 すなわち、HBcAgのＣ末端側のアミノ酸64個を欠損し
ている。

実施例９ プラスミドpTB368を制限酵素EcoRIで切断した後、エ
クソヌクレアーゼBal31で処理した。次に、PstIリンカ
ーｄ（GCTGCAGC）を結合し、ClaIおよびPstIで処理して
HBcAg遺伝子を含むClaI・PstIDNA断片を得た。該DNA断
片をptrp771のClaI・PstI部位に組込んだ後、ClaIで切
断し、EcoRIリンカーｄ（GGAATTCC）を結合させ、EcoRI
およびPstI処理で得られたDNA断片をptrp781のEcoRI部
位に組込み、これを用いて大腸菌DH1を形質転換させ、
プラスミドpTB（４）368−１を保持する形質転換体（Es
cherichia coli DH1/pTB（４）368−１）を得た。

該形質転換体をＭ−９培地で培養し、菌体抽出物のHB
cAg産生量を測定した結果、該形質転換体は大腸菌DH1/p
TB368の約10倍のHBcAg生産量が確認された。

プラスミドpTB（４）368−１のプロモーター部位のSD
配列からHBcAg遺伝子の翻訳開始コドンまでの塩基配列
を調べた結果、以下のとおり14bpであった。

SD配列とATGとの間の塩基数を減らすためにpTB（４）
368−１をEcoRIで切断し、S1ヌクレアーゼ処理した後、
ライゲーション（ligation）反応を行い、該反応液を用
いて、大腸菌DH1を形質転換し、プラスミドpTB（４）36
9を保持する大腸菌/pTB（４）369を得た。

該形質転換体のHBcAg生産量を測定した結果、大腸菌D
H1/pTB368の105倍量のHBcAgを生産することがわかっ
た。

プラスミドpTB（４）369のSD配列とATGとの間の塩基
配列は以下のとおり7bpであった。

実施例10 （ｉ）プラスミドpTB（４）369をAvaIで切断し、Klenow
フラグメントで単鎖部分を二重鎖とした後、PstIで処理
し、大断片を分離し、PstI認識部位を有するPstIストッ
プリンカー を結合した。PstIで処理し、大断片を分離し、ライゲー
ション反応を行い、プラスミドpTB（４）369−４を得た
（第11図参照）。

（ii）また、pTB（４）369をStyIで処理し、小断片を
得、該断片をAvaIIで処理した後、Klenowフラグメント
で修復した。前記のPstIストップリンカーを結合した
後、HpaIおよびPstIで処理し、502bp断片を分離し、該
断片をptrp781のHpaI・PstI部位に組込み、pTB（４）36
9−32を得た（第12図参照）。

（iii）また、pTB（４）369のStyI処理で得られた小断
片をHpaIIで処理した後、Klenowフラグメントで修復し
た。前記のPstIストップリンカーを結合した後、HpaIお
よびPstIで処理し、472bp断片を分離し、該断片をptrp7
71のHpaI・PstI部位に組込み、pTB（４）369−41を得た
（第12図参照）。

（iv）pTB441のHBeAg遺伝子中に２つ存在するBglII部位
の５′側のBglII部位とベクター中のPstII部位間のDNA
断片をpTB（４）369のBglII（５′側）・PstI部位に組
込み、pTB（４）441−１を得た（第13図参照）。

（ｖ）pTB441のHBeAg遺伝子中に２つ存在するBglII部位
の３′側のBglII部位とベクター中のPstI部位間のDNA断
片をpTB（４）369のBglII（５′側）・PstI部位に組込
み、pTB（４）441−８を得た（第14図参照）。

（vi）pTB552のHBeAg遺伝子中に２つ存在するBglII部位
の５′側のBglII部位とベクター中のPstI部位間のDNA断
片をpTB（４）369のBglII（５′側）・PstI部位に組込
み、pTB（４）552−８を得た（第15図参照）。

実施例11 実施例９および10で得られたプラスミドを保持する大
腸菌DH1を実施例２と同様に培養した後、菌体を集め、E
DTAおよびリゾチームを加え、超音波破砕により菌体抽
出液を得た。

アボット社のHBe・EIAおよびコアザイム（Corzyme）
を用いてHBcAgおよびHBeAgの測定を行った結果、pTB
（４）369,pTB（４）369−4,pTB（４）369−32またはpT
B（４）369−41を保持する大腸菌DH1はHBcAgおよびHBeA
gを産生していることが、また、pTB（４）441−１また
はpTB（４）552−８を保持する大腸菌DH1はHBeAgを産生
していることがわかった。

pTB（４）441−８を保持する大腸菌DH1の菌体抽出液
を希釈し、アボット社のRIA HBe測定キットで抗原価を
測定した。結果を以下に示す。

実施例12 プラスミドpTB（４）369−4,pTB（４）369−32およびpT
B369−41に挿入されているHBeAgをコードするDNAの３′
末端側の塩基配列を以下に示す。

プラスミドpTB（４）441−８はHBcAg遺伝子中の29〜8
2番目のアミノ酸をコードする部位が欠損し、Ｃ末端側
のアミノ酸47個をコードする部分が欠損し、９個の別の
アミノ酸をコードする塩基配列を有している。

実施例13 pTB（４）441−１またはpTB（４）552−８を保持する
大腸菌DH1のHBeAg抗原性を示す産生物の分子量を¹²⁵I−
抗HBe抗血清を使用したウエスタン・ブロッテング（Wes
tern blotting）法〔Towbin,H,「プロシージング オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.）76巻、９号、4350〜4354頁（197
9）〕およびヒト抗HBe抗血清を使用した免疫沈降法によ
り決定した。

すなわち、ウエスタン・ブロッテング法によりpTB
（４）441−１を保持する大腸菌の産生物の分子量は15,
000〜15,500ダルトンであることがわかった（第16図参
照）。

また、pTB（４）552−８を保持する大腸菌１を¹⁴C−
アミノ酸存在下にＭ−９培地で培養し、菌体抽出物にヒ
ト抗HBe抗血清を加えて37℃で反応させた後、ProteinA
（10％溶液）を加えて抗原抗体反応物を回収し、ポリア
クリルアミドゲル（17％）電気泳動を行い、オートラジ
オグラフィーにより、産生物の分子量を測定した結果1
3,000〜13,500ダルトンであることがわかった（第17
図）。

なお、形質転換体の寄託機関および受託番号は以下の
とおりである。

なお、大腸菌DH1は公知の微生物である〔Selson,M.E.
ら，ネイチャー，第217巻,1110頁（1968年）〕。

IFOは財団法人発酵研究所の受託番号を、FERMは通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受託番号を表
す。

発明の効果 HBc抗原,HBe抗原は天然にはHBV感染後のヒトあるいは
チンパンジーのみから得ることしかできず、量的にも制
約されてきた。また、これらの疾患動物の取扱いはHBV
感染の危険を伴い、不都合であった。本発明はこれらの
問題を解決し、本発明によれば抗原性が天然のものに近
く、安価で、安全で、しかも大量にHBc抗原性あるいはH
Be抗原性を示すポリペプチドが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図はadw型HBV DNAの全塩基配列を示し、第２図はad
w型HBcAgのアミノ酸配列を示し、第３図はadw型HBcAgを
コードするDNAの塩基配列を示す。 第４図はpTB368の構築図を示し、第５図はHBeAg発現用
プラスミドの構築図を示す。 第６図はレーン1,2とも大腸菌DH1/pTB368の産生物のウ
エスタン・ブロッティング（Western blotting）の結果
を示す。 第７図は大腸菌DH1/pTB368の産生物のセシウムクロリド
平衡密度勾配遠心による解析結果を示す。 第８図は大腸菌DH1/pTB368の産生物のショ糖濃度勾配遠
心による解析結果を、第９図は大腸菌DH1/pTB441の産生
物のショ糖濃度勾配遠心による解析結果を示す。 第10図はウサギ抗HBc抗体によるHBe（HBc）RIAの中和試
験結果を示す。 第11図はpTB（４）369−４の構築図を、第12図はpTB
（４）369−32及びpTB（４）369−41の構築図を、第13
図はpTB（４）441−１の構築図を、第14図はpTB（４）4
41−８の構築図を、そして第15図はpTB（４）552−８の
構築図をそれぞれ示す。 第16図は本発明産生物の分子量のウェスタン・ブロッテ
ィング法による解析図であり、第17図は本発明産生物の
分子量の免疫沈降法による解析図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭55−104887（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−52228（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．291Ｎｏ．5815 （1981）Ｐ．503−506 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖ ｏｌ．４Ｎｏ．５（1985）Ｐ．1287−1292 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８（1981) Ｐ．237−243 Ｇｅｎｅ Ｖｏｌ．36（1985）Ｐ．375 −379 日本農芸化学会編「ＡＢＣシリーズ物質 生産のための遺伝子工学」朝倉書店発行 （1983．11．20）第160−161頁

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】プロモーター、該プロモーターの下流に、
   翻訳開始コドン,B型肝炎ウィルスｅ抗原性を示すポリペ
   プチドをコードするDNAおよびその直後に停止コドンを
   連結してなる組換えDNAであって、 Ｂ型肝炎ウィルスｅ抗原性を示すポリペプチドが次のア
   ミノ酸配列 のいずれかを有するものである、組換えDNA。
2. 【請求項２】プロモーターのSD配列と翻訳開始コドンと
   の間の配列がATCGGGCである、特許請求の範囲第１項記
   載の組換えDNA。
3. 【請求項３】次のプラスミド： pTB441（FERM BP−1148）、 pTB449、 pTB552（FERM BP−1149）、 pTB（４）441−１（FERM BP−1154）、 pTB（４）441−８（FERM BP−1155）および pTB（４）552−８（FERM BP−1156）から選ばれるもの
   である、特許請求の範囲第１項記載の組換えDNA。
4. 【請求項４】プロモーター、該プロモーターの下流に、
   翻訳開始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリ
   ペプチドをコードするDNAおよびその直後に停止コドン
   を連結してなる組換えDNAであって、Ｂ型肝炎ウィルス
   ｅ抗原性を示すポリペプチドが次のアミノ酸配列： のいずれかを有するものである組換えDNAを含有する、
   大腸菌を宿主とする形質転換体。