JPH036797B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子操作技術によつて調製された
新規ベクターに関する。 遺伝子操作技術は、特定の塩基配列を有する複
製可能なDNAフラグメントを、人為的に、特定
の宿主内に移入することにより、特定の塩基配列
に由来する有用物質、特に、酵素等の蛋白質を生
成させる技術である。かかる遺伝子操作の実施に
際して用いられる制限酵素（DNAフラグメント
の特定の塩基配列部位を選択的に切断する機能を
有する酵素）、制限酵素により切断されて生じる
DNA接着末端と、これと相補的な関係にある他
のDNAフラグメント接着末端を結合させる為に
用いる酵素（リガーゼ）、あるいは、互いに相補
的でないDNA末端同志を結合させるためにDNA
末端同志を互いに相補的な接着末端にする酵素あ
るいはこれらを結合させるリガーゼについては、
すでに良く知られ、数多くの酵素が市販され、そ
れらを用いる手段等についても広く開示されてい
る。 微生物、動物及び植物のすべてについて、その
遺伝子DNAは全く同一のヌクレオチドより構成
されており、従つて、これら外来のDNAフラグ
メントを、宿主微生物、例えば、大腸菌（E.
coli）などに組込むことにより、宿主微生物内
で、これらの組込まれたDNAフラグメントを複
製させ、組込まれたDNAフラグメントに起因す
る遺伝情報を発現させることができる。このと
き、外来DNAフラグメントが組込まれ、複製能
を有する、いわゆるベクターが重要なものとな
る。 大腸菌については、従来２種のベクター、すな
わち、プラスミド由来のものとフアージ由来のも
のが用いられているが、ベクターとして実用上重
要なことは、大腸菌におけるベクターのコピー数
と、それに基づく安定した蛋白の産生である。 このコピー数を、人為的に大巾に増大させ、安
定した蛋白の産生を行なわしめるために、現在ま
で種々の技術が公開され、現在、各所に於て盛ん
に研究が行なわれている。 本発明者らは、この目的を達成するために、E.
coli由来DNAフラグメントとCol EI由来DNAフ
ラグメントを接合してできた、第１図に示される
E.coliDNAフラグメント−Col EI系プラスミド
であるpLC−34−44とpBR−322より、第２図に
示されるpPS−3155と呼ばれるプラスミドベクタ
ーを調製した〔ジヤーナル・オブ・バイオケミス
トリー（J.Bio.Chem.）、256巻2219〜2225ページ
（1981）参照〕。かくして調製されたpPS−3155
は、pBR−322に由来するテトラサイクリン耐性
及びアンピシリン耐性を保持している。又、この
pPS−3155はテトラサイクリン耐性を発現する塩
基配列中に、制限酵素BamHIによつて切断され
る部位を１ケ所有しているが、本発明者らは、こ
のBamHIによつて切断された部位に、cIに温度
感受性（tS）変異を有する、λフアージの転写及
び複製を調節する、λフアージDNAをBamHIに
よつて切断して得られる、λNOP域を含むDNA
フラグメントを挿入することによりpPS−3155−
λNOPを調製した〔ジヤーナル・オブ・バイオ−
ケミストリー（J.Bio.Chem.）、256巻、2219〜
2225ページ（1981）〕（第３図参照）。 かくして得られたベクターpPS−3155−λNOP
の特色は、ベクターが移入された宿主微生物の菌
体増殖期と、希望する有用遺伝子に由来する有用
生成物（例えば、酵素等の蛋白質）の生成期を分
離した点にある。菌体増殖期に同調して、有用な
DNAフラグメントが結合したベクターのコピー
数を増大させる方法では、多くの場合、ベクター
を安定的に保持することがきわめて困難となるこ
とが知られている。かかる場合には、安定的な遺
伝子由来産物の生成が著しく困難となる。 pPS−3155−λNOPはかかる問題点を解消する
ために、本発明者らによつて生み出されたもので
ある。このpPS−3155−λNOPについて、さらに
詳しく説明する。 λフアージは、既に知られているように、宿主
中で増殖して最後には宿主を破裂溶菌せしめる、
いわゆる溶菌サイクルと、宿主染色体中に組込ま
れてプロフアージとなり宿主細胞の分裂に伴つて
複製され代を重ねて子孫の細菌に受け継がれてい
く、いわゆる溶原サイクルのいずれかをとる。λ
フアージDNAには、Bam HIによる切断部位が
５ケ所存在するが、NOP領域は、Bam HIによ
つて切断されてできるフラグメントの１つで、そ
の大きさは7.3Kb（キロ・ベース）であり、断片
中にEco RIによつて切断される部位が１ケ所存
在する（第４図参照）。 一方、λフアージDNAのcIが温度感受性に変
異したものはよく知られているが、かかるcIを有
するλフアージの複製、転写の制御機構は、次の
とおりである。すなわち、λフアージDNAが、
30℃で溶原化状態にあるときは、プロモータから
の転写は完全に抑制されている。cIリプレツサー
は、その細胞内濃度が上昇すると、自らの転写を
も抑制するオートリプレツサーであり、かかる温
度（30℃）では、リプレツサー濃度は、λフアー
ジDNAが細胞内で溶原化状態を保持するに必要
な一定量に維持される。 一、温度を上げて、42℃にすると、温度感受性
リプレツサーが失活し、PR及びPLの抑制が解除
されるが、cro−リプレツサーが生産され、それ
がPRM及びPLからの転写を抑え、細胞内のcro−
リプレツサー濃度が高くなるとPRからの自己の
転写をも抑制する。このように、系の温度を、一
度42℃以上の、宿主が生育可能な温度に上げて、
cIリプレツサーを失活させると、その後温度を下
げてもcro−遺伝子による産物、すなわち、cro−
リプレツサーはPRMに結合したまゝであるから、
cIリプレツサーは生産されず、転写はある程度は
阻害されずに進行していく（第５図参照）。 従つて、このpPS−3155−λNOPをベクターと
して用いても、かなり効率よく目的とする遺伝子
産物を生成させることが可能であるが、この場合
にはＮ遺伝子産物が生成しないため、tRIで、か
なりの転写が終了してしまうと考えられ、そのた
め、ｏ．ｐ．遺伝子産物の生成量はあるレベルに
とどまつてしまい、さらには、ｏ．ｐ．遺伝子に
続く有用遺伝子の転写もある程度に抑えられてし
まう。 本発明者らは、かかる従来技術の欠点を解消す
べく鋭意研究を行なつた結果、cro−遺伝子に変
異を有するλ−NOP域を用いることによりｏ．
ｐ．遺伝子由来の産物が効率よく生産されること
を見出し本発明を完成するに到つた。 本発明は、cI遺伝子に不可逆の温度感受性変異
を有し、かつcro遺伝子に変異を有するλフアー
ジ由来のλNOP域の遺伝子画分と、有用物質の産
生を発現する遺伝子画分と、ColEI由来の遺伝子
画分を保有することを特徴とする新規なベクタ
ー、を提供するものである。 本発明における、cro遺伝子に変異を有する、
いわゆるcro-変異はcIに温度感受性（tS）変異を
もつ、いわゆるcItSより、42℃ではクリアープラ
ーク（溶菌作用による透明部分）を作り、30℃で
は溶原化するものとして発見されたが、30℃での
溶原化状態は（cItS、cro+）のものと殆んど同一
であるものと思われる。（cItS、cro-）λ−NOP
フラグメントを組込んだベクターにおいては、42
℃ではcItSリプレツサーが失活し、PL及びPRの抑
制は解除される。この場合に、cro遺伝子による
制御作用が働かないため、全てのプロモータから
の転写が進行する。さらに、Ｎ遺伝子産物が生成
されるため、ρ因子によるtRIにおける転写の終
結も起こらず、ｏ．ｐ．遺伝子由来の産物が著量
産生する。さらに、この際に、ｏ．ｐ．遺伝子に
続く有用遺伝子の転写も強力に進行することとな
る（第６図参照）。 本発明に於て“cro遺伝子に変異を有する”と
は、cro遺伝子を欠落しているか、あるいは、cro
遺伝子産物が不活性型となつているかもしくは極
めて低活性型となつている変異を言う。 又、本発明の、λフアージ由来の複製機能を有
するDNAフラグメントは、上記した性質を示す
cItS遺伝子及びcro遺伝子を含み、かつ、複製機能
を有し、何らかの手段で他のもしくは外来の
DNAフラグメントに接合可能なものであればい
かなるものであつてもよいが、例えば、前述した
ベクターpPS−3155−λNOPにおけるcro+遺伝子
の代りにcro-遺伝子を有するλNOP域が挙げられ
る。本発明におけるλフアージ由来のDNAフラ
グメントは、Bam HI等の制限酵素を用いて、一
定のDNAフラグメントをλフアージのDNAから
切り出した後、これを用いてもよく、又、制限酵
素の代りに化学薬剤を用いる手段でDNAフラグ
メントを切り出し、これに酵素で接着末端を付け
るなどして用いてもよい。好ましいDNAフラグ
メントとしては、例えば、Bam HIによつて切り
出されるλNOP領域が挙げられよう。かくして得
られるDNAフラグメントは、これと相補的な接
着末端を有する他の（又は外来の）DNAフラグ
メントと、常法に従つて接合し、本発明のベクタ
ーとすることができる。本発明のベクター中に
は、λフアージ由来のDNAフラグメントが挿入
されたことを判定するための薬剤耐性（例えば、
アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性）又は
薬剤感受性を発現する遺伝子フラグメントが組込
まれているのが好ましい。 さらに、又、本発明のベクター中には、ColEI
由来の複製機能を有する遺伝子画分が組み込まれ
ている。 かくして得られる本発明のベクター中に、さら
に、有用物質（例えば酵素等の蛋白質）の産生を
発現する遺伝子画分を組込み、それを例えば、大
腸菌等の宿主微生物中に入れ、宿主を増殖し、組
み換えDNAをコピーせしめることにより、宿主
体内に目的とする有用物質を産生せしめることが
できる。 本発明のベクターを用いて有用物質を効率よく
生産するには、上記した本発明のベクターが42℃
以上で温度感受性であることから、組み換え
DNAを含有する宿主微生物を培養途中にて培養
温度を42℃以上の、該微生物が生育可能な温度に
維持した後、培養温度を目的とする有用物質が安
定的に存在しうる温度に設定して培養を続行し、
かくして得られた培養混合物より目的とする有用
物質を採取する。 本願発明のベクターの宿主微生物としては、例
えば、大腸菌などの細菌、放線菌、酵母等が挙げ
られるが、中でも、大腸菌が好ましいものとして
挙げられる。目的とする有用物質が安定的に存在
する温度とは、目的物質によつて異なるが、例え
ば、ホスフアチジルセリン合成酵素を目的物質と
する場合は、37℃以下であり、熱に不安定なホル
モン系物質等を目的物質とする場合には、それら
の物質が安定に存在する比較的低温である。 本発明のベクターを用い、特定の遺伝子によつ
て発現される有用物質を効率的に製造することが
可能である。この有用な特定な遺伝子とは、細
菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物ある
いは各種フアージ等に由来するDNAがあり、具
体的な有用物質としては、例えば、各種ホルモ
ン、酵素、さらには、抗生物質やアミノ酸などの
合成系酵素等が挙げられる。 以下、調製例、比較例及び実施例を示して本発
明をさらに詳しく説明する。 なお、以下において示すλcI857cro27は、cro遺
伝子に変異を有するものを取得する際に、27番目
に得られたλフアージを表わし、“cro-”即ち不
活性型cro−リプレツサーと同様のものであり、
41℃でcro遺伝子産物の合成が止まり、40℃で
clear plaque（溶菌斑）を形成するが30℃では
plaqueを形成しない、即ち、染色体中に組み込
まれるという特徴を有する（proceedings of the
National Academy of Sciences、66、855−862
（1970））。 実施例 １ (1) λフアージDNAの調製 E.coli Ｋ−12−C600を、ポリペプトン１％、
NaCl0.25％からなる培地にて、菌体数が約２
×108ケ／mlになるまで、培養温度40℃で培養
した。次に、MgCl2を10ｍＭ加え、さらに、
0.2％濃度相当のグルコースを加えλcI857cro27
をm.o.i1で感染させ、40℃で３〜４時間培養し
た後、CHCl3を、２ml／を加えて40℃で55分
間ゆるやかに振り溶菌させた。溶菌液を
DNaseIで処理後、遠心し上澄を分取、次に塩
化セシウム−超遠心法およびフエノール抽出法
にてフアージDNAを得た。 (2) プラスミドDNAの調製 培地組成（KH2PO40.45％、Na2HPO41.05
％、NH4Cl0.1％、Casamino acids（Difco）
1.5％、Geratin0.01％、MgSO40.4％、CaCl20.3
ｍＭ、Glucose0.5％）からなる培地にて、pPS
−3155のプラスミド（ベクター）を含む大腸菌
を30℃にて振盪培養し、菌数５×108ケ／mlで
培養を終了し、集菌後、リゾチーム処理し溶菌
させた。次に４×104G、40分の遠心後、上澄
を塩化セシウム−エチジウムブロマイド法にて
平衡密度勾配遠心し、cccDNAフラグメントを
分画し、エチジウムブロマイドと塩化セシウム
を除去した。次にエタノールを加えて６×
104Gで30分間遠心し、DNAを得た。 (3) pPS−3155−λNOPcro-の調製 上記手法にて調製したpPS−3155とλcI857
cro27のDNAをBam HIを用いて切断し、混合
後、T4−DNAリガーゼを用いて再結合させ
た。再結合後のアガロースゲル電気泳動図を第
７図に示す。Bam HIは熱に不安定であり、ま
た、T4−DNAリガーゼはBam HI切断部位を
基質とし難くDNA濃度が高くなるにつれ、再
結合の速度が大きくなつた。従つて切塚反応は
30℃にて行ない所要時間も30分程度と長くした
方が良好であつた。 (4) pPS−3155−λNOPcro-の確認 上記再結合後のDNA画分をE.coli−JA−200
（λ）にトランスフオームした。該菌をまずア
ンピシリンを50μｇ／ml含む平板培地（トリプ
トン（Difco）１％、NaCl0.5％、酵母エキス
（Difco）0.5％、寒天1.5％）にて30℃で培養
し、耐性コロニーを単離した。次に、同様にし
てテトラサイクリン耐性及びコリシンEI耐性
を併せもつ株（ApR、TcS、ColEIimm：Ap…ア
ンピシリン、Tc…テトラサイクリン、Col EI
…コリシンEI）を選定した。これらの株より
前記の如き手法にてDNAを抽出し、アガロー
スゲル電気泳動法によつて分子量を測定したと
ころpPS−3155−λNOPの分子量とほぼ同一の
新DNA画分が調製されていることがわかつた。
次に、このほぼ同一のDNA画分を含む、菌株
のプラスミドを分離し、Bam HIにて切断、同
様に分析した（第８図）。これによりpPS−
3155−λNOPcro-のDNAの調製を確認した。 (5) pPS−3155−λNOPcro-を含有する大腸菌の
培養によるホスフアチジルセリン合成酵素の製
造 pPS−3155−λNOPcro-を組み込んだ大腸菌
Ｃ−600（λ）を、トリプトン（Difco）1.2％、
酵母エキス（Difco）2.5％、グリセロール0.5
％PH7.6からなる培地にて、30℃で培養し、菌
体数が約４×105cell／mlになつたところで、
短時間の操作で42℃まで昇温させ、そのまま20
分保持した。その後、37℃まで冷却し、３時間
培養を行なつた。集菌後0.1MPH7.6のリン酸緩
衝液にて菌体を洗浄後、超音波処理を行なつて
菌体を破壊し、PS合成酵素活性を測定した。
活性測定には、CDP−ジグリセライド0.675ｍ
Ｍ、Ｌ−３− 3H−セリン0.5ｍＭ、BSA1mg／
ml、0.1Mリン酸緩衝液PH7.4の溶液を用いた。
熱誘導し、活性が増大した一例を第１表に示
す。 第１表プラスミド 相対活性 対 照 １ pPS−3155−λNOPcro-
135±0.5（試験点数の４点の平均値） 比較例 pPS−3155−λNOPcro+を含有する大腸菌の培
養によるホスフアチジルセリン合成酵素の製造 pPS−3155−λNOPcro+を組込んだ大腸菌pPS
−3155−λNOPcro+を用いた他は前記実施例の(5)
と同様に処理し、活性を測定したところ、相対活
性が110±0.5（試験点数の４点の平均値）である
ことが判つた。 試験例 pPS−3155−λNOPcro-及びpPS−3155−
λNOPcro+について、Journal of Bacteriology、
141、213−222（1980）記載の方法に従つてコピー
数を調べたところ、前者では、255コピー、後者
では200コピーであり、本発明のベクターはコピ
ー数を増加させることがわかつた。
新規ベクターに関する。 遺伝子操作技術は、特定の塩基配列を有する複
製可能なDNAフラグメントを、人為的に、特定
の宿主内に移入することにより、特定の塩基配列
に由来する有用物質、特に、酵素等の蛋白質を生
成させる技術である。かかる遺伝子操作の実施に
際して用いられる制限酵素（DNAフラグメント
の特定の塩基配列部位を選択的に切断する機能を
有する酵素）、制限酵素により切断されて生じる
DNA接着末端と、これと相補的な関係にある他
のDNAフラグメント接着末端を結合させる為に
用いる酵素（リガーゼ）、あるいは、互いに相補
的でないDNA末端同志を結合させるためにDNA
末端同志を互いに相補的な接着末端にする酵素あ
るいはこれらを結合させるリガーゼについては、
すでに良く知られ、数多くの酵素が市販され、そ
れらを用いる手段等についても広く開示されてい
る。 微生物、動物及び植物のすべてについて、その
遺伝子DNAは全く同一のヌクレオチドより構成
されており、従つて、これら外来のDNAフラグ
メントを、宿主微生物、例えば、大腸菌（E.
coli）などに組込むことにより、宿主微生物内
で、これらの組込まれたDNAフラグメントを複
製させ、組込まれたDNAフラグメントに起因す
る遺伝情報を発現させることができる。このと
き、外来DNAフラグメントが組込まれ、複製能
を有する、いわゆるベクターが重要なものとな
る。 大腸菌については、従来２種のベクター、すな
わち、プラスミド由来のものとフアージ由来のも
のが用いられているが、ベクターとして実用上重
要なことは、大腸菌におけるベクターのコピー数
と、それに基づく安定した蛋白の産生である。 このコピー数を、人為的に大巾に増大させ、安
定した蛋白の産生を行なわしめるために、現在ま
で種々の技術が公開され、現在、各所に於て盛ん
に研究が行なわれている。 本発明者らは、この目的を達成するために、E.
coli由来DNAフラグメントとCol EI由来DNAフ
ラグメントを接合してできた、第１図に示される
E.coliDNAフラグメント−Col EI系プラスミド
であるpLC−34−44とpBR−322より、第２図に
示されるpPS−3155と呼ばれるプラスミドベクタ
ーを調製した〔ジヤーナル・オブ・バイオケミス
トリー（J.Bio.Chem.）、256巻2219〜2225ページ
（1981）参照〕。かくして調製されたpPS−3155
は、pBR−322に由来するテトラサイクリン耐性
及びアンピシリン耐性を保持している。又、この
pPS−3155はテトラサイクリン耐性を発現する塩
基配列中に、制限酵素BamHIによつて切断され
る部位を１ケ所有しているが、本発明者らは、こ
のBamHIによつて切断された部位に、cIに温度
感受性（tS）変異を有する、λフアージの転写及
び複製を調節する、λフアージDNAをBamHIに
よつて切断して得られる、λNOP域を含むDNA
フラグメントを挿入することによりpPS−3155−
λNOPを調製した〔ジヤーナル・オブ・バイオ−
ケミストリー（J.Bio.Chem.）、256巻、2219〜
2225ページ（1981）〕（第３図参照）。 かくして得られたベクターpPS−3155−λNOP
の特色は、ベクターが移入された宿主微生物の菌
体増殖期と、希望する有用遺伝子に由来する有用
生成物（例えば、酵素等の蛋白質）の生成期を分
離した点にある。菌体増殖期に同調して、有用な
DNAフラグメントが結合したベクターのコピー
数を増大させる方法では、多くの場合、ベクター
を安定的に保持することがきわめて困難となるこ
とが知られている。かかる場合には、安定的な遺
伝子由来産物の生成が著しく困難となる。 pPS−3155−λNOPはかかる問題点を解消する
ために、本発明者らによつて生み出されたもので
ある。このpPS−3155−λNOPについて、さらに
詳しく説明する。 λフアージは、既に知られているように、宿主
中で増殖して最後には宿主を破裂溶菌せしめる、
いわゆる溶菌サイクルと、宿主染色体中に組込ま
れてプロフアージとなり宿主細胞の分裂に伴つて
複製され代を重ねて子孫の細菌に受け継がれてい
く、いわゆる溶原サイクルのいずれかをとる。λ
フアージDNAには、Bam HIによる切断部位が
５ケ所存在するが、NOP領域は、Bam HIによ
つて切断されてできるフラグメントの１つで、そ
の大きさは7.3Kb（キロ・ベース）であり、断片
中にEco RIによつて切断される部位が１ケ所存
在する（第４図参照）。 一方、λフアージDNAのcIが温度感受性に変
異したものはよく知られているが、かかるcIを有
するλフアージの複製、転写の制御機構は、次の
とおりである。すなわち、λフアージDNAが、
30℃で溶原化状態にあるときは、プロモータから
の転写は完全に抑制されている。cIリプレツサー
は、その細胞内濃度が上昇すると、自らの転写を
も抑制するオートリプレツサーであり、かかる温
度（30℃）では、リプレツサー濃度は、λフアー
ジDNAが細胞内で溶原化状態を保持するに必要
な一定量に維持される。 一、温度を上げて、42℃にすると、温度感受性
リプレツサーが失活し、PR及びPLの抑制が解除
されるが、cro−リプレツサーが生産され、それ
がPRM及びPLからの転写を抑え、細胞内のcro−
リプレツサー濃度が高くなるとPRからの自己の
転写をも抑制する。このように、系の温度を、一
度42℃以上の、宿主が生育可能な温度に上げて、
cIリプレツサーを失活させると、その後温度を下
げてもcro−遺伝子による産物、すなわち、cro−
リプレツサーはPRMに結合したまゝであるから、
cIリプレツサーは生産されず、転写はある程度は
阻害されずに進行していく（第５図参照）。 従つて、このpPS−3155−λNOPをベクターと
して用いても、かなり効率よく目的とする遺伝子
産物を生成させることが可能であるが、この場合
にはＮ遺伝子産物が生成しないため、tRIで、か
なりの転写が終了してしまうと考えられ、そのた
め、ｏ．ｐ．遺伝子産物の生成量はあるレベルに
とどまつてしまい、さらには、ｏ．ｐ．遺伝子に
続く有用遺伝子の転写もある程度に抑えられてし
まう。 本発明者らは、かかる従来技術の欠点を解消す
べく鋭意研究を行なつた結果、cro−遺伝子に変
異を有するλ−NOP域を用いることによりｏ．
ｐ．遺伝子由来の産物が効率よく生産されること
を見出し本発明を完成するに到つた。 本発明は、cI遺伝子に不可逆の温度感受性変異
を有し、かつcro遺伝子に変異を有するλフアー
ジ由来のλNOP域の遺伝子画分と、有用物質の産
生を発現する遺伝子画分と、ColEI由来の遺伝子
画分を保有することを特徴とする新規なベクタ
ー、を提供するものである。 本発明における、cro遺伝子に変異を有する、
いわゆるcro-変異はcIに温度感受性（tS）変異を
もつ、いわゆるcItSより、42℃ではクリアープラ
ーク（溶菌作用による透明部分）を作り、30℃で
は溶原化するものとして発見されたが、30℃での
溶原化状態は（cItS、cro+）のものと殆んど同一
であるものと思われる。（cItS、cro-）λ−NOP
フラグメントを組込んだベクターにおいては、42
℃ではcItSリプレツサーが失活し、PL及びPRの抑
制は解除される。この場合に、cro遺伝子による
制御作用が働かないため、全てのプロモータから
の転写が進行する。さらに、Ｎ遺伝子産物が生成
されるため、ρ因子によるtRIにおける転写の終
結も起こらず、ｏ．ｐ．遺伝子由来の産物が著量
産生する。さらに、この際に、ｏ．ｐ．遺伝子に
続く有用遺伝子の転写も強力に進行することとな
る（第６図参照）。 本発明に於て“cro遺伝子に変異を有する”と
は、cro遺伝子を欠落しているか、あるいは、cro
遺伝子産物が不活性型となつているかもしくは極
めて低活性型となつている変異を言う。 又、本発明の、λフアージ由来の複製機能を有
するDNAフラグメントは、上記した性質を示す
cItS遺伝子及びcro遺伝子を含み、かつ、複製機能
を有し、何らかの手段で他のもしくは外来の
DNAフラグメントに接合可能なものであればい
かなるものであつてもよいが、例えば、前述した
ベクターpPS−3155−λNOPにおけるcro+遺伝子
の代りにcro-遺伝子を有するλNOP域が挙げられ
る。本発明におけるλフアージ由来のDNAフラ
グメントは、Bam HI等の制限酵素を用いて、一
定のDNAフラグメントをλフアージのDNAから
切り出した後、これを用いてもよく、又、制限酵
素の代りに化学薬剤を用いる手段でDNAフラグ
メントを切り出し、これに酵素で接着末端を付け
るなどして用いてもよい。好ましいDNAフラグ
メントとしては、例えば、Bam HIによつて切り
出されるλNOP領域が挙げられよう。かくして得
られるDNAフラグメントは、これと相補的な接
着末端を有する他の（又は外来の）DNAフラグ
メントと、常法に従つて接合し、本発明のベクタ
ーとすることができる。本発明のベクター中に
は、λフアージ由来のDNAフラグメントが挿入
されたことを判定するための薬剤耐性（例えば、
アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性）又は
薬剤感受性を発現する遺伝子フラグメントが組込
まれているのが好ましい。 さらに、又、本発明のベクター中には、ColEI
由来の複製機能を有する遺伝子画分が組み込まれ
ている。 かくして得られる本発明のベクター中に、さら
に、有用物質（例えば酵素等の蛋白質）の産生を
発現する遺伝子画分を組込み、それを例えば、大
腸菌等の宿主微生物中に入れ、宿主を増殖し、組
み換えDNAをコピーせしめることにより、宿主
体内に目的とする有用物質を産生せしめることが
できる。 本発明のベクターを用いて有用物質を効率よく
生産するには、上記した本発明のベクターが42℃
以上で温度感受性であることから、組み換え
DNAを含有する宿主微生物を培養途中にて培養
温度を42℃以上の、該微生物が生育可能な温度に
維持した後、培養温度を目的とする有用物質が安
定的に存在しうる温度に設定して培養を続行し、
かくして得られた培養混合物より目的とする有用
物質を採取する。 本願発明のベクターの宿主微生物としては、例
えば、大腸菌などの細菌、放線菌、酵母等が挙げ
られるが、中でも、大腸菌が好ましいものとして
挙げられる。目的とする有用物質が安定的に存在
する温度とは、目的物質によつて異なるが、例え
ば、ホスフアチジルセリン合成酵素を目的物質と
する場合は、37℃以下であり、熱に不安定なホル
モン系物質等を目的物質とする場合には、それら
の物質が安定に存在する比較的低温である。 本発明のベクターを用い、特定の遺伝子によつ
て発現される有用物質を効率的に製造することが
可能である。この有用な特定な遺伝子とは、細
菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物ある
いは各種フアージ等に由来するDNAがあり、具
体的な有用物質としては、例えば、各種ホルモ
ン、酵素、さらには、抗生物質やアミノ酸などの
合成系酵素等が挙げられる。 以下、調製例、比較例及び実施例を示して本発
明をさらに詳しく説明する。 なお、以下において示すλcI857cro27は、cro遺
伝子に変異を有するものを取得する際に、27番目
に得られたλフアージを表わし、“cro-”即ち不
活性型cro−リプレツサーと同様のものであり、
41℃でcro遺伝子産物の合成が止まり、40℃で
clear plaque（溶菌斑）を形成するが30℃では
plaqueを形成しない、即ち、染色体中に組み込
まれるという特徴を有する（proceedings of the
National Academy of Sciences、66、855−862
（1970））。 実施例 １ (1) λフアージDNAの調製 E.coli Ｋ−12−C600を、ポリペプトン１％、
NaCl0.25％からなる培地にて、菌体数が約２
×108ケ／mlになるまで、培養温度40℃で培養
した。次に、MgCl2を10ｍＭ加え、さらに、
0.2％濃度相当のグルコースを加えλcI857cro27
をm.o.i1で感染させ、40℃で３〜４時間培養し
た後、CHCl3を、２ml／を加えて40℃で55分
間ゆるやかに振り溶菌させた。溶菌液を
DNaseIで処理後、遠心し上澄を分取、次に塩
化セシウム−超遠心法およびフエノール抽出法
にてフアージDNAを得た。 (2) プラスミドDNAの調製 培地組成（KH2PO40.45％、Na2HPO41.05
％、NH4Cl0.1％、Casamino acids（Difco）
1.5％、Geratin0.01％、MgSO40.4％、CaCl20.3
ｍＭ、Glucose0.5％）からなる培地にて、pPS
−3155のプラスミド（ベクター）を含む大腸菌
を30℃にて振盪培養し、菌数５×108ケ／mlで
培養を終了し、集菌後、リゾチーム処理し溶菌
させた。次に４×104G、40分の遠心後、上澄
を塩化セシウム−エチジウムブロマイド法にて
平衡密度勾配遠心し、cccDNAフラグメントを
分画し、エチジウムブロマイドと塩化セシウム
を除去した。次にエタノールを加えて６×
104Gで30分間遠心し、DNAを得た。 (3) pPS−3155−λNOPcro-の調製 上記手法にて調製したpPS−3155とλcI857
cro27のDNAをBam HIを用いて切断し、混合
後、T4−DNAリガーゼを用いて再結合させ
た。再結合後のアガロースゲル電気泳動図を第
７図に示す。Bam HIは熱に不安定であり、ま
た、T4−DNAリガーゼはBam HI切断部位を
基質とし難くDNA濃度が高くなるにつれ、再
結合の速度が大きくなつた。従つて切塚反応は
30℃にて行ない所要時間も30分程度と長くした
方が良好であつた。 (4) pPS−3155−λNOPcro-の確認 上記再結合後のDNA画分をE.coli−JA−200
（λ）にトランスフオームした。該菌をまずア
ンピシリンを50μｇ／ml含む平板培地（トリプ
トン（Difco）１％、NaCl0.5％、酵母エキス
（Difco）0.5％、寒天1.5％）にて30℃で培養
し、耐性コロニーを単離した。次に、同様にし
てテトラサイクリン耐性及びコリシンEI耐性
を併せもつ株（ApR、TcS、ColEIimm：Ap…ア
ンピシリン、Tc…テトラサイクリン、Col EI
…コリシンEI）を選定した。これらの株より
前記の如き手法にてDNAを抽出し、アガロー
スゲル電気泳動法によつて分子量を測定したと
ころpPS−3155−λNOPの分子量とほぼ同一の
新DNA画分が調製されていることがわかつた。
次に、このほぼ同一のDNA画分を含む、菌株
のプラスミドを分離し、Bam HIにて切断、同
様に分析した（第８図）。これによりpPS−
3155−λNOPcro-のDNAの調製を確認した。 (5) pPS−3155−λNOPcro-を含有する大腸菌の
培養によるホスフアチジルセリン合成酵素の製
造 pPS−3155−λNOPcro-を組み込んだ大腸菌
Ｃ−600（λ）を、トリプトン（Difco）1.2％、
酵母エキス（Difco）2.5％、グリセロール0.5
％PH7.6からなる培地にて、30℃で培養し、菌
体数が約４×105cell／mlになつたところで、
短時間の操作で42℃まで昇温させ、そのまま20
分保持した。その後、37℃まで冷却し、３時間
培養を行なつた。集菌後0.1MPH7.6のリン酸緩
衝液にて菌体を洗浄後、超音波処理を行なつて
菌体を破壊し、PS合成酵素活性を測定した。
活性測定には、CDP−ジグリセライド0.675ｍ
Ｍ、Ｌ−３− 3H−セリン0.5ｍＭ、BSA1mg／
ml、0.1Mリン酸緩衝液PH7.4の溶液を用いた。
熱誘導し、活性が増大した一例を第１表に示
す。 第１表プラスミド 相対活性 対 照 １ pPS−3155−λNOPcro-
135±0.5（試験点数の４点の平均値） 比較例 pPS−3155−λNOPcro+を含有する大腸菌の培
養によるホスフアチジルセリン合成酵素の製造 pPS−3155−λNOPcro+を組込んだ大腸菌pPS
−3155−λNOPcro+を用いた他は前記実施例の(5)
と同様に処理し、活性を測定したところ、相対活
性が110±0.5（試験点数の４点の平均値）である
ことが判つた。 試験例 pPS−3155−λNOPcro-及びpPS−3155−
λNOPcro+について、Journal of Bacteriology、
141、213−222（1980）記載の方法に従つてコピー
数を調べたところ、前者では、255コピー、後者
では200コピーであり、本発明のベクターはコピ
ー数を増加させることがわかつた。
第１図はE.coliDNAフラグメント−ColEI系プ
ラスミド（pLC−34−44）を示す。（〓 E.coli
由来DNA画分、− ColEI由来DNA画分、PSS
ホスフアチジルセリン合成酵素産生を発現する領
域）、第２図は、プラスミドpPS−3155を示す。
（〓 E.coli由来DNA画分、− ColEI由来DNA
画分、＝ pBR−322由来DNA画分、Ap アンピ
シリン耐性を発現する領域、Tc テトラサイク
リン耐性を発現する領域）、第３図は、ベクター
pPS−3155−λNOPを示す。（〓 E.coli由来
DNA画分（有用遺伝子挿入部分）、− ColEI由
来DNA画分、＝ pBR−322由来DNA画分、〓
λフアージDNAのNOP域（λNOP）、Ap アン
ピシリン耐性を発現する領域、Tc テトラサイ
クリン耐性を発現する領域。）、第４図は、λフア
ージの遺伝子地図を示す。RI：制限酵素EcoRI
の作用部位、（ ）内は、Kb単位、第５図及び第
６図は、λ−NOP（C1857S7）の機能の機構を示
す模式図である。第７図は、実施例１における
DNAフラグメントのアガロースゲル電気泳動図
を示す。（ λcI857cro27のBam HIによる切断
パターン、 pPS−3155のBam HIによる切断
パターン、 リガーゼによる再結合後のパター
ン）、第８図は、実施例１において調製されたプ
ラスミド切断片のアガロースゲル電気泳動図を示
す。（ 抽出プラスミドのBam HIによる切断
パターン、 pPS−3155−λNOPのBam HIに
よる切断パターン）。
ラスミド（pLC−34−44）を示す。（〓 E.coli
由来DNA画分、− ColEI由来DNA画分、PSS
ホスフアチジルセリン合成酵素産生を発現する領
域）、第２図は、プラスミドpPS−3155を示す。
（〓 E.coli由来DNA画分、− ColEI由来DNA
画分、＝ pBR−322由来DNA画分、Ap アンピ
シリン耐性を発現する領域、Tc テトラサイク
リン耐性を発現する領域）、第３図は、ベクター
pPS−3155−λNOPを示す。（〓 E.coli由来
DNA画分（有用遺伝子挿入部分）、− ColEI由
来DNA画分、＝ pBR−322由来DNA画分、〓
λフアージDNAのNOP域（λNOP）、Ap アン
ピシリン耐性を発現する領域、Tc テトラサイ
クリン耐性を発現する領域。）、第４図は、λフア
ージの遺伝子地図を示す。RI：制限酵素EcoRI
の作用部位、（ ）内は、Kb単位、第５図及び第
６図は、λ−NOP（C1857S7）の機能の機構を示
す模式図である。第７図は、実施例１における
DNAフラグメントのアガロースゲル電気泳動図
を示す。（ λcI857cro27のBam HIによる切断
パターン、 pPS−3155のBam HIによる切断
パターン、 リガーゼによる再結合後のパター
ン）、第８図は、実施例１において調製されたプ
ラスミド切断片のアガロースゲル電気泳動図を示
す。（ 抽出プラスミドのBam HIによる切断
パターン、 pPS−3155−λNOPのBam HIに
よる切断パターン）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ cI遺伝子に不可逆の温度感受性変異を有し、
かつcro遺伝子に変異を有するλフアージ由来の
λNOP域の遺伝子画分と、有用物質の産生を発現
する遺伝子画分と、ColEI由来の遺伝子画分を保
有することを特徴とするベクター。 ２ 前記λフアージ由来のλNOP域が、
λcI857cro27-フアージ由来のNOP域を含む遺伝
子画分である特許請求範囲第１項記載のベクタ
ー。 ３ 前記有用物質の産生を発現する遺伝子画分
が、大腸菌由来のホスフアチジルセリン合成酵素
の産生を発現する遺伝子画分である特許請求の範
囲第１項又は第２項記載のベクター。 ４ 薬剤耐性又は薬剤感受性を発現する遺伝子画
分を含む特許請求の範囲第１項ないし第３項記載
のベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56134213A JPS5835198A (ja) | 1981-08-28 | 1981-08-28 | 新規ベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56134213A JPS5835198A (ja) | 1981-08-28 | 1981-08-28 | 新規ベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5835198A JPS5835198A (ja) | 1983-03-01 |
| JPH036797B2 true JPH036797B2 (ja) | 1991-01-30 |
Family
ID=15123064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56134213A Granted JPS5835198A (ja) | 1981-08-28 | 1981-08-28 | 新規ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5835198A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58212781A (ja) * | 1982-06-02 | 1983-12-10 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 新種バクテリオフア−ジ及びその育種法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5714599A (en) * | 1980-06-06 | 1982-01-25 | Biogen Nv | Improved vector,manufacture of vector of this kind and expression of cloning gene |
-
1981
- 1981-08-28 JP JP56134213A patent/JPS5835198A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5714599A (en) * | 1980-06-06 | 1982-01-25 | Biogen Nv | Improved vector,manufacture of vector of this kind and expression of cloning gene |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5835198A (ja) | 1983-03-01 |
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