JPS60156389A - 高コピ−数プラスミド及びその製造方法 - Google Patents
高コピ−数プラスミド及びその製造方法Info
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- JPS60156389A JPS60156389A JP59191860A JP19186084A JPS60156389A JP S60156389 A JPS60156389 A JP S60156389A JP 59191860 A JP59191860 A JP 59191860A JP 19186084 A JP19186084 A JP 19186084A JP S60156389 A JPS60156389 A JP S60156389A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
この発明は、プラスミドベクター、並びにその製造及び
使用に関し、さらに詳しくはこの発明は、高コピー数を
有するプラスミドベクター、並びにその製造及び使用に
関する。
使用に関し、さらに詳しくはこの発明は、高コピー数を
有するプラスミドベクター、並びにその製造及び使用に
関する。
（従来の技術）
いわゆる遺伝子操作技法、又は言い換えれば遺伝子工学
は、医療的に有用な生成物の製造において増々重要にな
りつつある。この技法の好ましい方式に従えば、所望の
医薬として活性な生成物の生産をコードする遺伝子断片
がベクター、例えばプラスミドに挿入され、組換「雑種
」プラスミド分子が得られ、次にこの分子が適当な微生
物を形質転換するために使用される。次にプラスミドが
細菌性宿主と共に復製され、そして挿入された遺伝子が
機能する。遺伝子生成物の量は、翻訳及び転写の強度、
細胞内での遺伝子生成物の分解、並びに遺伝子すなわち
遺伝子を担持するプラスミドのコピー数に依存する。従
って、細胞中でプラスミドのコピー数を増加することに
成功すれば、外来性遺伝子のコピー数の増加を介して遺
伝子生成物の量の実質的な増加が得られる。（遺伝子操
作技法に関しては、米国特許出願束４．２５７２２４号
明細書を参照のこと。） （発明が解決しようとする問題点） この発明は、公知のプラスミド及び広く使用されている
プラスミドに比べて、細胞当り実質上高いコピー数を有
するプラスミドベクターを提供することを目的とする。
は、医療的に有用な生成物の製造において増々重要にな
りつつある。この技法の好ましい方式に従えば、所望の
医薬として活性な生成物の生産をコードする遺伝子断片
がベクター、例えばプラスミドに挿入され、組換「雑種
」プラスミド分子が得られ、次にこの分子が適当な微生
物を形質転換するために使用される。次にプラスミドが
細菌性宿主と共に復製され、そして挿入された遺伝子が
機能する。遺伝子生成物の量は、翻訳及び転写の強度、
細胞内での遺伝子生成物の分解、並びに遺伝子すなわち
遺伝子を担持するプラスミドのコピー数に依存する。従
って、細胞中でプラスミドのコピー数を増加することに
成功すれば、外来性遺伝子のコピー数の増加を介して遺
伝子生成物の量の実質的な増加が得られる。（遺伝子操
作技法に関しては、米国特許出願束４．２５７２２４号
明細書を参照のこと。） （発明が解決しようとする問題点） この発明は、公知のプラスミド及び広く使用されている
プラスミドに比べて、細胞当り実質上高いコピー数を有
するプラスミドベクターを提供することを目的とする。
最も広く使用されているプラスミドの１つはｐＢＲ３２
２であり、このプラスミ ドはＢｏｙｅｒ等（Ｇｅｎｅ
、２．９５−１３３ （１９７７））により初めて造成
された。現在まで、発明者等はこのプラスミドについて
最も徹底的な科学的知識を有しており、そして遺伝子ク
ローニング法のほとんどがこのプラスミド又はその誘導
体を用いて行われているので、本発明者等は、この実験
の出発材料としてこの物質を使用した。ｐＢＲ３２２の
ｙｒｒ造は５ｕｔｃｌｉｆｆｅ （’Ｏ８ＨＳｙｍｐ、
Ｑ、ｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ。
２であり、このプラスミ ドはＢｏｙｅｒ等（Ｇｅｎｅ
、２．９５−１３３ （１９７７））により初めて造成
された。現在まで、発明者等はこのプラスミドについて
最も徹底的な科学的知識を有しており、そして遺伝子ク
ローニング法のほとんどがこのプラスミド又はその誘導
体を用いて行われているので、本発明者等は、この実験
の出発材料としてこの物質を使用した。ｐＢＲ３２２の
ｙｒｒ造は５ｕｔｃｌｉｆｆｅ （’Ｏ８ＨＳｙｍｐ、
Ｑ、ｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ。
丑、７７−９０（１９７９））により決定されており、
第１図に示す。このプラスミドは４３６２ｂｐ の分子
長を有する。該プラスミドの複製はヌクレオチド２５３
６において逆時計方向に出発シ、そしてその２１１１胞
当りコピー数は一般に２０〜５゜の間である。コピー数
は複雑な制御機構により制？、ＩＩされる（Ｐｌａｓｍ
ｉｄ９，１．（１９８３））。ヌクレオチド２９７８及
び３０８１の間の断片が、蛋白質をなんらコードせずそ
して比較的高頻度で時計方向に転写される低分子ｆｆｆ
ｌＲＮＡの合成ご担当する。この低分子量Ｒｕｈはプラ
スミド複製の負の制御因子（レプレッサー）である。
第１図に示す。このプラスミドは４３６２ｂｐ の分子
長を有する。該プラスミドの複製はヌクレオチド２５３
６において逆時計方向に出発シ、そしてその２１１１胞
当りコピー数は一般に２０〜５゜の間である。コピー数
は複雑な制御機構により制？、ＩＩされる（Ｐｌａｓｍ
ｉｄ９，１．（１９８３））。ヌクレオチド２９７８及
び３０８１の間の断片が、蛋白質をなんらコードせずそ
して比較的高頻度で時計方向に転写される低分子ｆｆｆ
ｌＲＮＡの合成ご担当する。この低分子量Ｒｕｈはプラ
スミド複製の負の制御因子（レプレッサー）である。
この発明は、プラスミド復製のレプレッサーの生産を担
当する遺伝子区画に該遺伝子のこの機能を害する変異を
与えることによってプラスミドのコピー数を実質上増加
することができると言う認識に基礎を置いている。
当する遺伝子区画に該遺伝子のこの機能を害する変異を
与えることによってプラスミドのコピー数を実質上増加
することができると言う認識に基礎を置いている。
発明者等の研究室において、第１の高コピー数プラスミ
ド（ｐＨ０１）は、プラスミドｐＥＲ３，２２の１１！
ｏｏ Ｒ工及びＢａｍＨ工切断部位間に外来性ＤＮＡを
含有するａｍｐｒ、 ｔｅｔ８表現型プラスミドを用い
る実験において、約５０００の独立のプラスミドから成
る組換体の集団を分析する間に分離された。
ド（ｐＨ０１）は、プラスミドｐＥＲ３，２２の１１！
ｏｏ Ｒ工及びＢａｍＨ工切断部位間に外来性ＤＮＡを
含有するａｍｐｒ、 ｔｅｔ８表現型プラスミドを用い
る実験において、約５０００の独立のプラスミドから成
る組換体の集団を分析する間に分離された。
プラスミドｐｎｏ１を含有する細菌細胞から、他の組換
分子を含有するクローンからよりも約２０〜３０倍多く
のプラスミドＤＮＡが増幅 （ａｍｐｌｉｆｉｏａｔｉｏｎ ）を伴わないで同じ方
法によって分離された。Ｆ、コリ（’に、 ｃｏｌｉ
） ＨＥｌ ０１ （ｐｒｏ−、１ｅｕ−、ｔｈｉ−、
１ａｃ−、ｓｔｒ 、 ｒ−ｍ−ｒｒｕｌｏｌ−、ｒｅ
ｏＡ−） 〔Ｂｏｙｅｒ、 Ｈ，Ｗ、等、：Ｊ、Ｍｏｌ
。
分子を含有するクローンからよりも約２０〜３０倍多く
のプラスミドＤＮＡが増幅 （ａｍｐｌｉｆｉｏａｔｉｏｎ ）を伴わないで同じ方
法によって分離された。Ｆ、コリ（’に、 ｃｏｌｉ
） ＨＥｌ ０１ （ｐｒｏ−、１ｅｕ−、ｔｈｉ−、
１ａｃ−、ｓｔｒ 、 ｒ−ｍ−ｒｒｕｌｏｌ−、ｒｅ
ｏＡ−） 〔Ｂｏｙｅｒ、 Ｈ，Ｗ、等、：Ｊ、Ｍｏｌ
。
Ｂｌｏｌ、旦、４５９−４７２（１９７９））株、０６
００ （ｒｋ−、ｍｋ−、ｔｈｉ−、ｔｈｒ−、１ｅｕ
−、１ａｃ−）（Ｂｏｙｅｒ、 Ｈ，Ｗ、等、前掲３株
、ＩＤ８８００（ｓｕｐ Ｅ！、 ｓｕｐ Ｆ、 ｈａ
ｄ Ｓ″″、 ｍｅｔ−、ｌａａ ＺＭ １５ 。
００ （ｒｋ−、ｍｋ−、ｔｈｉ−、ｔｈｒ−、１ｅｕ
−、１ａｃ−）（Ｂｏｙｅｒ、 Ｈ，Ｗ、等、前掲３株
、ＩＤ８８００（ｓｕｐ Ｅ！、 ｓｕｐ Ｆ、 ｈａ
ｄ Ｓ″″、 ｍｅｔ−、ｌａａ ＺＭ １５ 。
ｒｅｃ Ａ５６）（Ｍｕｒｒａｙ、 Ｎ、Ｅ、等： Ｍ
ｏ１． ｇｅｍ。
ｏ１． ｇｅｍ。
Ｇｏｎｅｔ、 １５［］ 、 ５３−６１ （１９７７
） ） 株を用いてプラスミドを反復して形質転換した
場合、各場合に多量のプラスミドを含有するａｍｐｒ、
ｔｅｔ８クローンが生じた。ｐＢＲプラスミドより２
０〜３０倍多いコピー数の増加の理由として、発明者等
はプラスミドＤＮＡ中の遺伝的変化を予想した。
） ） 株を用いてプラスミドを反復して形質転換した
場合、各場合に多量のプラスミドを含有するａｍｐｒ、
ｔｅｔ８クローンが生じた。ｐＢＲプラスミドより２
０〜３０倍多いコピー数の増加の理由として、発明者等
はプラスミドＤＮＡ中の遺伝的変化を予想した。
高コピー数を生じさせる変異の同定
プラスミドｐＨ０１を制限エンドヌクレアーゼＥａｏＲ
工及びＰｒｕ ＴＩで消化し、そして次に単鎖末端ｉ、
ｄＮＴＰ基質の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ■酵素の
に１０ｎｏｖ亜断片により満たした。こうして得られた
平滑末ｉ７ｉ：有するＤＮＡ分子？、ポリヌクレオチド
リガーゼ酵素により環化し、そしＴＨＥ Ｉ Ｄ １細
胞に形質転換した。アンピシリン含有培地上に増殖した
コロニーからプラスミドＤＮＡ部分４ｐ Ｌ、そして多
量に分解することができるＤＮＡサンプルを、制限エン
ドヌクレアーゼ１ｎｃｏ Ｒ工、Ｐｖｕ■、及びＢｓｐ
Ｒ工で消化した後、アガロースゲル電気泳動、及びポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。ざらに
検討するために選択されたプラスミドＩＩＨＯ８１（第
２図）は、酵素Ｐｆｆｕ ＩＴによっては消化されず、
そしてＥｃｏ Ｒ工によりＭ’Ｊｋ化された。このプラ
スミドの全分子ｆｆ１（２，３ｋｂ）、及びＢｓｐ Ｒ
工 を用いる分解により得られた断片の大きさく５８７
，４５７゜４３４．２６７．２４０．８０・・・・・・
ｂｐ ）を基礎にして、プラスミドｐＨ０８１は、ｐＢ
Ｒ５２２のヌクレオチド２０６９と２の間に、高コピー
数のために機能する変異を有する区画を有することが確
立された。この変異は、使用した酵素により生成する断
片のサイズを基礎にして検出することはで。
工及びＰｒｕ ＴＩで消化し、そして次に単鎖末端ｉ、
ｄＮＴＰ基質の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ■酵素の
に１０ｎｏｖ亜断片により満たした。こうして得られた
平滑末ｉ７ｉ：有するＤＮＡ分子？、ポリヌクレオチド
リガーゼ酵素により環化し、そしＴＨＥ Ｉ Ｄ １細
胞に形質転換した。アンピシリン含有培地上に増殖した
コロニーからプラスミドＤＮＡ部分４ｐ Ｌ、そして多
量に分解することができるＤＮＡサンプルを、制限エン
ドヌクレアーゼ１ｎｃｏ Ｒ工、Ｐｖｕ■、及びＢｓｐ
Ｒ工で消化した後、アガロースゲル電気泳動、及びポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。ざらに
検討するために選択されたプラスミドＩＩＨＯ８１（第
２図）は、酵素Ｐｆｆｕ ＩＴによっては消化されず、
そしてＥｃｏ Ｒ工によりＭ’Ｊｋ化された。このプラ
スミドの全分子ｆｆ１（２，３ｋｂ）、及びＢｓｐ Ｒ
工 を用いる分解により得られた断片の大きさく５８７
，４５７゜４３４．２６７．２４０．８０・・・・・・
ｂｐ ）を基礎にして、プラスミドｐＨ０８１は、ｐＢ
Ｒ５２２のヌクレオチド２０６９と２の間に、高コピー
数のために機能する変異を有する区画を有することが確
立された。この変異は、使用した酵素により生成する断
片のサイズを基礎にして検出することはで。
きない。変異の位置を決定するために、ｐＯＨ８１を制
限エンドヌクレアーゼＰｓｔ Ｉ及びＴａｑ ■ で消
化することにより得られた１０３０ｂｌ：ｌＤＮＡ断片
、ｐＢＲ３２２を酵素Ｐｓｔ ■及び０ＩＩＬＩ で消
化することにより得られた７ ８ Ｑ ｂｐ Ｄ Ｎ
Ａ断片、ｐＢＲ３２９を酵素Ｔａｑ ■で消化すること
により得られた２１８ｂｐＤＮＡ断片を分解した。３種
類のＤＮＡ断片を等モル比率で混合し、これらをポリヌ
クレオチドリガーゼにより連結し、そしてこの連結物に
よりＨＥＩＤＩ細胞を形質転換した。アンピシリン含有
培地上に増殖した単一クローンからプラスミドＤ Ｎ
Ａ’を分離した。これらのプラスミドは高コピー数表現
型を示した。プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼで消化することにより、これらのプラスミドが、由来
を異にする３個の全く異る断片により形成され、得られ
たプラスミドにおいてβ−ラクタマーゼ涜伝子の中央部
はｐＢ１３２２由来のものであり、複製開始点ご含有す
る領域はプラスミドｐＢＲ３２９に由来し、そしてｐＨ
０８１から分離された断片はβ−ラクタマーゼ遺伝子の
末端部分のほかに高コピー数をもたらす変異を含有する
ことが確立された。従って、変異は、プラスミドｐＢＲ
３２２のヌクレオチド２５７６（ＴａｑＩ）及び３６１
２（ｐａｔ ■）の間に形成されたものと結論された。
限エンドヌクレアーゼＰｓｔ Ｉ及びＴａｑ ■ で消
化することにより得られた１０３０ｂｌ：ｌＤＮＡ断片
、ｐＢＲ３２２を酵素Ｐｓｔ ■及び０ＩＩＬＩ で消
化することにより得られた７ ８ Ｑ ｂｐ Ｄ Ｎ
Ａ断片、ｐＢＲ３２９を酵素Ｔａｑ ■で消化すること
により得られた２１８ｂｐＤＮＡ断片を分解した。３種
類のＤＮＡ断片を等モル比率で混合し、これらをポリヌ
クレオチドリガーゼにより連結し、そしてこの連結物に
よりＨＥＩＤＩ細胞を形質転換した。アンピシリン含有
培地上に増殖した単一クローンからプラスミドＤ Ｎ
Ａ’を分離した。これらのプラスミドは高コピー数表現
型を示した。プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼで消化することにより、これらのプラスミドが、由来
を異にする３個の全く異る断片により形成され、得られ
たプラスミドにおいてβ−ラクタマーゼ涜伝子の中央部
はｐＢ１３２２由来のものであり、複製開始点ご含有す
る領域はプラスミドｐＢＲ３２９に由来し、そしてｐＨ
０８１から分離された断片はβ−ラクタマーゼ遺伝子の
末端部分のほかに高コピー数をもたらす変異を含有する
ことが確立された。従って、変異は、プラスミドｐＢＲ
３２２のヌクレオチド２５７６（ＴａｑＩ）及び３６１
２（ｐａｔ ■）の間に形成されたものと結論された。
この領域のヌクレオチド配列を決定し、そして公知のｐ
ＥＲ３２２配列と比較した。この比較により、Ｇ−＋Ｔ
）ランジション（Ｇ＝デスオキシグアニル、Ｔ−チミジ
ル）がヌクレオチド３０７４に生じたことが示された〔
これは、相補ＤＮＡ鎖におけるＯ＋Ａ ）ランジション
（０＝デスオキシシトシル、Ａ＝デスオギシアデニル）
に対応する〕。
ＥＲ３２２配列と比較した。この比較により、Ｇ−＋Ｔ
）ランジション（Ｇ＝デスオキシグアニル、Ｔ−チミジ
ル）がヌクレオチド３０７４に生じたことが示された〔
これは、相補ＤＮＡ鎖におけるＯ＋Ａ ）ランジション
（０＝デスオキシシトシル、Ａ＝デスオギシアデニル）
に対応する〕。
結果として生ずる点変異により、レプレッサーＲＮＡの
転写の停止が損傷され、そしてもはや複製のレプレッサ
ーとして機能することができない高分子量のＲＮＡが合
成される。レプレッサー機能の停止が冒いコピー数をも
たらす。この自然釣魚変異（これは意図的に形成するこ
ともできる）により、プラスミドの細胞当りコピー数か
もとの値に対して約２０〜３０倍に増加（約１０００）
することができる。この点変異により、Ｉ）ＢＲ３２２
と同じ複製領域を有する任愈のプラスミドのコピー数を
実質上増加することができる。
転写の停止が損傷され、そしてもはや複製のレプレッサ
ーとして機能することができない高分子量のＲＮＡが合
成される。レプレッサー機能の停止が冒いコピー数をも
たらす。この自然釣魚変異（これは意図的に形成するこ
ともできる）により、プラスミドの細胞当りコピー数か
もとの値に対して約２０〜３０倍に増加（約１０００）
することができる。この点変異により、Ｉ）ＢＲ３２２
と同じ複製領域を有する任愈のプラスミドのコピー数を
実質上増加することができる。
しかしながら、（）−＋’ｌ’点変異全変異するもとの
プラスミドｐＢＲ３２２はもはや生存できないことが見
出された。すなわち、高コピー哲のために、抗生物質耐
性（Ａｐｒ＝β−ラクタマーゼ、Ｔｃｒ＝膜蛋白質）を
決定するプラスミドの遺伝子において膜蛋白質の合成が
増加し、そして後者（テトラサイクリン耐性を担当Ｔる
膜蛋白質）が、増加した量において細胞にとって致命的
である。同じ問題が、もとのテトラサイクリン耐性遺伝
子を変化を受けない形で含有するプラスミド−ｐＢＲ３
２２のすべての高コピー数誘導体の場合に観察される。
プラスミドｐＢＲ３２２はもはや生存できないことが見
出された。すなわち、高コピー哲のために、抗生物質耐
性（Ａｐｒ＝β−ラクタマーゼ、Ｔｃｒ＝膜蛋白質）を
決定するプラスミドの遺伝子において膜蛋白質の合成が
増加し、そして後者（テトラサイクリン耐性を担当Ｔる
膜蛋白質）が、増加した量において細胞にとって致命的
である。同じ問題が、もとのテトラサイクリン耐性遺伝
子を変化を受けない形で含有するプラスミド−ｐＢＲ３
２２のすべての高コピー数誘導体の場合に観察される。
発明者等は、前の実験においてこの問題に直面しなかっ
た。プラスミドｐＢＲ３２２のＢａｎ Ｈ工部位及びＥ
ａｏ Ｒ工部位の間に外来性ＤＮＡ断片がクローニング
され、そしてこの方法によってテトラサイクリン耐性遺
伝子が不活性化されたプラスミドを使用したからである
。従って、生存可能な高コピー数プラスミドを得るため
には、ｐＢＲ３２２又は同じ複製開始点を有するその誘
導体を、テトラサイクリン耐性遺伝子の機能を不活性化
し又は抑制することによって変性しなければならない。
た。プラスミドｐＢＲ３２２のＢａｎ Ｈ工部位及びＥ
ａｏ Ｒ工部位の間に外来性ＤＮＡ断片がクローニング
され、そしてこの方法によってテトラサイクリン耐性遺
伝子が不活性化されたプラスミドを使用したからである
。従って、生存可能な高コピー数プラスミドを得るため
には、ｐＢＲ３２２又は同じ複製開始点を有するその誘
導体を、テトラサイクリン耐性遺伝子の機能を不活性化
し又は抑制することによって変性しなければならない。
従って、この発明の好ましい態様に従えば、ｐＢＲ３２
２又は同じ複製開始点を含有するその誘導体から誘導さ
れた新規なプラスミドが提供され、このプラスミドは、
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有せず、又は該遺伝子
を不活性化された形、もしくは穏和な機能を有する変性
された形で含有し、ぞしてレプレッサーＲＮＡをコード
する遺伝子区画にレプレッサー生産を変性する点変異を
含有することを特徴とする。
２又は同じ複製開始点を含有するその誘導体から誘導さ
れた新規なプラスミドが提供され、このプラスミドは、
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有せず、又は該遺伝子
を不活性化された形、もしくは穏和な機能を有する変性
された形で含有し、ぞしてレプレッサーＲＮＡをコード
する遺伝子区画にレプレッサー生産を変性する点変異を
含有することを特徴とする。
この発明のさらに好ましい態様に従えば、プラスミドＤ
ＮＡｐＢＲ３２２又は同じ複製開始点を有するその誘導
体中の３０７４位（Ｉ）ＢＲ３２２の番号による）の塩
基対ａＯを、制御された点変異により、又は後で記載す
るｐＨＯプラスミド中のこの点変異を含有しない区画の
代りに、この点変異を含有するが他は同一である区画を
導入することにより、ＴＡで置き換える。
ＮＡｐＢＲ３２２又は同じ複製開始点を有するその誘導
体中の３０７４位（Ｉ）ＢＲ３２２の番号による）の塩
基対ａＯを、制御された点変異により、又は後で記載す
るｐＨＯプラスミド中のこの点変異を含有しない区画の
代りに、この点変異を含有するが他は同一である区画を
導入することにより、ＴＡで置き換える。
上記のように、ｐＢＲ３２２又はその誘導体をモデル物
質として使用する場合、テトラサイクリン耐性遺伝子が
完全に欠失しているか、またはその機能が不活性化もし
くは抑制されている出発プラスミドの誘導体上にＧＯ→
ＴＡ点変異を形成しなければならない。ここで「抑制さ
れている」とは、テトラサイクリン耐性を担当する膜蛋
白質の生産をコードする遺伝子が減少した蛋白質生産を
指令するように変性されていることを意味する。好まし
い態様に従えば、テトラサイクリン耐性を枦当するＤＮ
Ａ、又はｐＢＲ３２２の復製開始点までの全領域を除去
し、そして所望により合成的に得たポリリンカーにより
置き換え、こうして、プラスミドに導入された追加の制
限エンドヌクレアーゼ消化部位に基いて、得られたプラ
スミドの利用の可能性を実質的に拡張する。
質として使用する場合、テトラサイクリン耐性遺伝子が
完全に欠失しているか、またはその機能が不活性化もし
くは抑制されている出発プラスミドの誘導体上にＧＯ→
ＴＡ点変異を形成しなければならない。ここで「抑制さ
れている」とは、テトラサイクリン耐性を担当する膜蛋
白質の生産をコードする遺伝子が減少した蛋白質生産を
指令するように変性されていることを意味する。好まし
い態様に従えば、テトラサイクリン耐性を枦当するＤＮ
Ａ、又はｐＢＲ３２２の復製開始点までの全領域を除去
し、そして所望により合成的に得たポリリンカーにより
置き換え、こうして、プラスミドに導入された追加の制
限エンドヌクレアーゼ消化部位に基いて、得られたプラ
スミドの利用の可能性を実質的に拡張する。
６２４の造成
上記の実験において得られたプラスミドをさらに形質転
換する間に、ｐＨ０８１プラスミドにポリリンカーを挿
入し、種々の制限エンドヌクレアーゼによって形成され
たＤＮＡ断片の挿入に適するそして細菌アルカリホスフ
ァターゼにより脱燐酸化し、プラスミドＤＮＡ断片（５
ｅｅｄ、 Ｅ、 ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ：１４ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ １１．２４２７−２４４６（１９８３）
）と連結し、そしてこの連結物を用いてＥ、コリＨＢ１
０１ 細胞を形質転換した。
換する間に、ｐＨ０８１プラスミドにポリリンカーを挿
入し、種々の制限エンドヌクレアーゼによって形成され
たＤＮＡ断片の挿入に適するそして細菌アルカリホスフ
ァターゼにより脱燐酸化し、プラスミドＤＮＡ断片（５
ｅｅｄ、 Ｅ、 ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ：１４ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ １１．２４２７−２４４６（１９８３）
）と連結し、そしてこの連結物を用いてＥ、コリＨＢ１
０１ 細胞を形質転換した。
Ａｐ耐性細菌コロニーから、プラスミドＤＮＡを分離し
、そしてＩｃｏＲ工及びＰｓｔＩ制限エンドヌフレアー
ゼで消化した後にゲル電気泳動により分析した。さらに
検討するため、ＥＱＯＲ工により２３００ ｂｐ断片と
１１０ｂｐ断片とに切断され、そしてＰｓｔ ｉ によ
って１５８０ ｂｐ断片と８２０ｂｐ 断片とに切断さ
れるプラスミド（ｐＨ０１４゜第３図）を選択した。こ
のプラスミドから、Ｅ！ｃ。
、そしてＩｃｏＲ工及びＰｓｔＩ制限エンドヌフレアー
ゼで消化した後にゲル電気泳動により分析した。さらに
検討するため、ＥＱＯＲ工により２３００ ｂｐ断片と
１１０ｂｐ断片とに切断され、そしてＰｓｔ ｉ によ
って１５８０ ｂｐ断片と８２０ｂｐ 断片とに切断さ
れるプラスミド（ｐＨ０１４゜第３図）を選択した。こ
のプラスミドから、Ｅ！ｃ。
Ｒ工部位１個のみを含有するプラスミドｐＨ０３１２を
次のようにして遺勲した。プラスミドを制限エンドヌク
レアーゼＥａｍ Ｈ工で消化し、そして得られた線状分
子をＨｌｎｆ ■酵素により部分的に消化した。ＤＮＡ
断片を１．２％アガロースゲル中で分離し、そして２０
１０ｂｐ断片を分離した。酵素ＢａｍＨ工及びＨｌｎｆ
■による消化に基いて短細部分を含有する分子末端を
、酵素ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ亜断片を用
いて平滑末端に転換し、そしてＴ４誘導ポリヌクレオチ
ドリガーゼにより再環化した。さらに操作するため、エ
ンドヌクレアーゼＥａｍＨＩによっては切断されないが
ＥａｏＲＩにより線状化されそしてＨｌｎｆ ■で消化
した場合、に１４９５ｂｐ断片及び５１６１：ＩＩ）
断片を生成するプラスミドｐＯＨ３１２（第４図）を選
択した。平滑末端を有するＤＮＡ断片をクローニングす
るのに適する多コピー数ベクターを遺勲するために、プ
ラスミドベクターｐＨ０１３２を制限エンドヌクレアー
ゼ１ｃａｏＲ工及びＨｌｎｄ ｌ’ｌ’［で消化し、そ
して１９８０ ｂｐ 断片をアガロースゲルから分離し
た。
次のようにして遺勲した。プラスミドを制限エンドヌク
レアーゼＥａｍ Ｈ工で消化し、そして得られた線状分
子をＨｌｎｆ ■酵素により部分的に消化した。ＤＮＡ
断片を１．２％アガロースゲル中で分離し、そして２０
１０ｂｐ断片を分離した。酵素ＢａｍＨ工及びＨｌｎｆ
■による消化に基いて短細部分を含有する分子末端を
、酵素ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ亜断片を用
いて平滑末端に転換し、そしてＴ４誘導ポリヌクレオチ
ドリガーゼにより再環化した。さらに操作するため、エ
ンドヌクレアーゼＥａｍＨＩによっては切断されないが
ＥａｏＲＩにより線状化されそしてＨｌｎｆ ■で消化
した場合、に１４９５ｂｐ断片及び５１６１：ＩＩ）
断片を生成するプラスミドｐＯＨ３１２（第４図）を選
択した。平滑末端を有するＤＮＡ断片をクローニングす
るのに適する多コピー数ベクターを遺勲するために、プ
ラスミドベクターｐＨ０１３２を制限エンドヌクレアー
ゼ１ｃａｏＲ工及びＨｌｎｄ ｌ’ｌ’［で消化し、そ
して１９８０ ｂｐ 断片をアガロースゲルから分離し
た。
次に、この断片を、酵素Ｂｃｏ Ｒ工及びＨｌｎｂ ■
で消化したプラスミドπＡＮ７（ｓｅｅｄ、Ｂ、：Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａａｉａｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 １１
、２４２７−２４４６＜ １９８３））のＤＮＡと混合
し、そしてこれらの分子をポリヌクレオチドリガーゼに
より連結した。この連結されたプラスミドを用いてＥ、
コＩＪＨＢ１０１細胞を形質転換し、そして１つのＡｌ
ｌ＋耐性細菌クローンからプラスミドＤＮＡを分離した
。こうして調製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＨ０６２４
，第５図）は、Ｏｌａ ■ 部位を有しないが、プラス
ミドｐＨ３１２と異なり、制限エンドヌクレアーゼＳｍ
ａ Ｉ、 Ｓａｌ Ｔ、）ｌびＢａａ Ｈ工により線状
化することができる。
で消化したプラスミドπＡＮ７（ｓｅｅｄ、Ｂ、：Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａａｉａｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 １１
、２４２７−２４４６＜ １９８３））のＤＮＡと混合
し、そしてこれらの分子をポリヌクレオチドリガーゼに
より連結した。この連結されたプラスミドを用いてＥ、
コＩＪＨＢ１０１細胞を形質転換し、そして１つのＡｌ
ｌ＋耐性細菌クローンからプラスミドＤＮＡを分離した
。こうして調製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＨ０６２４
，第５図）は、Ｏｌａ ■ 部位を有しないが、プラス
ミドｐＨ３１２と異なり、制限エンドヌクレアーゼＳｍ
ａ Ｉ、 Ｓａｌ Ｔ、）ｌびＢａａ Ｈ工により線状
化することができる。
（相対的コピー数）
ｐＨＯプラスミドの相対的コピー数を決定するために、
組換ｐＢＲ３２２から誘導された種々のサイズのプラス
ミド、及び同じサイズの高コピー数誘導体を含有する１
、フ１ＪＨＥ１０１を、同一濃度まで増殖せしめた。得
られた懸濁液の同一量から、増幅を伴わないで、Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃｌｅｉａ Ａｏｉｄｓ
Ｒｅｓ。７，１５１ｓ−１５１（１９７９））に記載
されている方法に従ってプラスミドＤＮＡを分離した。
組換ｐＢＲ３２２から誘導された種々のサイズのプラス
ミド、及び同じサイズの高コピー数誘導体を含有する１
、フ１ＪＨＥ１０１を、同一濃度まで増殖せしめた。得
られた懸濁液の同一量から、増幅を伴わないで、Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃｌｅｉａ Ａｏｉｄｓ
Ｒｅｓ。７，１５１ｓ−１５１（１９７９））に記載
されている方法に従ってプラスミドＤＮＡを分離した。
ＤＮＡ標品からのサンプルを、５，１０，１５，２０，
２５． ３０゜４０、及び５０倍稀釈において、アガロ
ースゲル上で電気泳動にかけた。高コピー数プラスミド
、及びその正常コピー数対応物（同じ分子風を有する）
を同時に試験した。実験結果は、ｐＨＱ プラスミドの
コピー数が、対応する「正常コピー数」ｐＢＲ３２２誘
導体のそれに比べて約２０〜３０倍多いことを示した。
２５． ３０゜４０、及び５０倍稀釈において、アガロ
ースゲル上で電気泳動にかけた。高コピー数プラスミド
、及びその正常コピー数対応物（同じ分子風を有する）
を同時に試験した。実験結果は、ｐＨＱ プラスミドの
コピー数が、対応する「正常コピー数」ｐＢＲ３２２誘
導体のそれに比べて約２０〜３０倍多いことを示した。
絶対的コピー数
ｐＨ０７’ラスミドの絶対的コピー数を、プラスミド含
有細胞のＤＮＡを生体内においてラベルし、そして分離
されたプラスミドＤＮＡと染色体ＤＮＡ中の放射能の比
率を測定することによって決定した。この方法により、
ｐＨ０５１４と同じサイズ（Ｍｗ＝ １． ／）Ｘ １
０ ドルトン）を有するプラスミドのコピー数が約１０
００／細胞（染色体の分子１ｉ１ ＝２Ｘ １０ ドル
トン）であることが見出された。
有細胞のＤＮＡを生体内においてラベルし、そして分離
されたプラスミドＤＮＡと染色体ＤＮＡ中の放射能の比
率を測定することによって決定した。この方法により、
ｐＨ０５１４と同じサイズ（Ｍｗ＝ １． ／）Ｘ １
０ ドルトン）を有するプラスミドのコピー数が約１０
００／細胞（染色体の分子１ｉ１ ＝２Ｘ １０ ドル
トン）であることが見出された。
細胞の全ＤＮＡ含量の６０〜６５％がプラスミドＤＮＡ
であった。Ｄ Ｎ Ａを生体内ラベルするために、プラ
スミド企、０．５％のカザミノ酸（ディフコ）、０．５
％のグルツース、１μＷ／ｍｌのビタミンＢ１＋ １
ｍＭのＭｇＳＯ４，２ｐ！ｉｒ／ ｍｌのチミジン、２
５０ ｐｆｆ ／ｍｅのアデノシン及び０．４ ｍＢｑ
／ｍｌの〔３Ｈ〕−チミジン（８８８ｔＢｐ／ミリモル
、Ｏｈｅｍａｐｏｌ、 Ｐｒａｇ 〕を補充したＭ９培
地上で培養した。
であった。Ｄ Ｎ Ａを生体内ラベルするために、プラ
スミド企、０．５％のカザミノ酸（ディフコ）、０．５
％のグルツース、１μＷ／ｍｌのビタミンＢ１＋ １
ｍＭのＭｇＳＯ４，２ｐ！ｉｒ／ ｍｌのチミジン、２
５０ ｐｆｆ ／ｍｅのアデノシン及び０．４ ｍＢｑ
／ｍｌの〔３Ｈ〕−チミジン（８８８ｔＢｐ／ミリモル
、Ｏｈｅｍａｐｏｌ、 Ｐｒａｇ 〕を補充したＭ９培
地上で培養した。
プラスミド含有細胞を、Ｗｏｍｂｌｅ等〔Ｊ。
Ｅａｏｔｅｒｉｏｌ、 １５０ （１９７７） ）の方
法に従って消化した。染色体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮ
Ａを、２ｍｌ中に増殖した細菌懸濁液からの細胞溶解物
の臭化エチジウム／塩化セシウム平衡密度勾配遠心（Ｏ
Ｄ５．。＝４〜５，４５０００ｒｐＩ１１１ベックマン
タイプ６５０−ター、４０時間、２０Ｃ）により相互に
分離した。
法に従って消化した。染色体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮ
Ａを、２ｍｌ中に増殖した細菌懸濁液からの細胞溶解物
の臭化エチジウム／塩化セシウム平衡密度勾配遠心（Ｏ
Ｄ５．。＝４〜５，４５０００ｒｐＩ１１１ベックマン
タイプ６５０−ター、４０時間、２０Ｃ）により相互に
分離した。
増加したコピー数を第６図及び第７図に示す。
第６図Ｇこ、臭化エチジウム／アガロースゲル電気泳動
による分離後の、ｐＥＲ３２２由来のＡＮ；ｌ ｒ。
による分離後の、ｐＥＲ３２２由来のＡＮ；ｌ ｒ。
ＴＣｓ組換プラスミドのＤＮＡに対応するスポットを示
す。すべてのサンプルは、プラスミド含有ＨＢ１０１細
胞の同じ量から、同じ方法により調製した（ Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ、 Ｎｕｃｌｓｉｃ Ａｃｉ＋１
ｓＲｅｓ、７．１５１３−１５２３（１９７９））。
す。すべてのサンプルは、プラスミド含有ＨＢ１０１細
胞の同じ量から、同じ方法により調製した（ Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ、 Ｎｕｃｌｓｉｃ Ａｃｉ＋１
ｓＲｅｓ、７．１５１３−１５２３（１９７９））。
サンプル１〜２、及び４〜６は、ｐ、ＢＲ３２２の１１
ｎａｏＲ工及びＥａｍＨ工切断部位に、１．５〜２．Ｏ
ｋｂの外来性ＤＮＡを含有する組換プラスミドである。
ｎａｏＲ工及びＥａｍＨ工切断部位に、１．５〜２．Ｏ
ｋｂの外来性ＤＮＡを含有する組換プラスミドである。
サンプル３は、高コピー数のために機能する変異を含有
する同じサイズのプラスミド（ｐＨ０１）である。
する同じサイズのプラスミド（ｐＨ０１）である。
第７図に、臭化エチジウム／塩化セシウム勾配遠心によ
り分離した後の、プラスミドｐ７１５含有Ｅ８コリＨＢ
１０１細胞のＤＮＡ（サンプルＡ）、及びプラスミドｐ
Ｈ０３１４のそれ（サンプルＢ）のスポットを示す。（
プラスミドｐ７１５はｐＨ０３１４と同じ構造を有する
が高コピー数のために機能する変異を有しない。）第７
図の写真は、遠心外ＩＩＩによりプラスミドＤ’ＮＡ及
び染色体ＤＮＡを分離した後に、ＤＮＡを収容した遠心
チューブのＵ、Ｖ照射の下で撮彰した。写真に明らかに
示されているように、正常コピー数プラスミドを含有す
る細胞から得られたＤＮＡ（サンプルＡ）においては、
プラスミド含有低ストライブが完全に欠落している。他
方、同一の方法により同量の細胞から得られたｐＨ０３
１４プラスミドＤＮＡは、該プラスミドの実質的に増加
したコピー数のために、染色体ＤＮＡ含有ストライブの
下方に広いストライブを形成する。
り分離した後の、プラスミドｐ７１５含有Ｅ８コリＨＢ
１０１細胞のＤＮＡ（サンプルＡ）、及びプラスミドｐ
Ｈ０３１４のそれ（サンプルＢ）のスポットを示す。（
プラスミドｐ７１５はｐＨ０３１４と同じ構造を有する
が高コピー数のために機能する変異を有しない。）第７
図の写真は、遠心外ＩＩＩによりプラスミドＤ’ＮＡ及
び染色体ＤＮＡを分離した後に、ＤＮＡを収容した遠心
チューブのＵ、Ｖ照射の下で撮彰した。写真に明らかに
示されているように、正常コピー数プラスミドを含有す
る細胞から得られたＤＮＡ（サンプルＡ）においては、
プラスミド含有低ストライブが完全に欠落している。他
方、同一の方法により同量の細胞から得られたｐＨ０３
１４プラスミドＤＮＡは、該プラスミドの実質的に増加
したコピー数のために、染色体ＤＮＡ含有ストライブの
下方に広いストライブを形成する。
実験において使用した材料及び技法
細菌株及びプラスミド＝ ｐ Ｂ Ｒ３２２ａ ｍ Ｉ
’ ”＋ｔｅｔｒ（Ｂｏｌｉｖａｒ、 ？、等： Ｇｏ
ｎｏ ２．９５−１１３（１９７７） ） ；１；＋Ｅ
Ｒ３２９ａｍｐｒ、ａｈｌｒ、ｔｅｔｒ（０ｏｖａｒｕ
ｂｂｉａｓ、 Ｉ＋、、 Ｂｏｌｉｖａｒ、 ？、：
Ｇｅｍ５．１７゜７９−８９（１９８２））。
’ ”＋ｔｅｔｒ（Ｂｏｌｉｖａｒ、 ？、等： Ｇｏ
ｎｏ ２．９５−１１３（１９７７） ） ；１；＋Ｅ
Ｒ３２９ａｍｐｒ、ａｈｌｒ、ｔｅｔｒ（０ｏｖａｒｕ
ｂｂｉａｓ、 Ｉ＋、、 Ｂｏｌｉｖａｒ、 ？、：
Ｇｅｍ５．１７゜７９−８９（１９８２））。
πｖＸ及びＡＮ７プラスミドＤＮＡ標品は、工ｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ ｏｆ Ｂ、ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ ０ｅｎｔｒｅ ｏｆ
ｔｈｅ Ｈｕｎｇａｒｉａ：ｎＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ
ＳｃｉθｍＱｅＦ３．スチェゲド、ハンガリー （５
ｅｅｄ、 Ｂ、 ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ。
ｔｕｔｅ ｏｆ Ｂ、ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ ０ｅｎｔｒｅ ｏｆ
ｔｈｅ Ｈｕｎｇａｒｉａ：ｎＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ
ＳｃｉθｍＱｅＦ３．スチェゲド、ハンガリー （５
ｅｅｄ、 Ｂ、 ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ。
１１．２４２７−２４４６（１９８３））において調製
された。
された。
使用した制限エンドヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４誘導ポ
リヌクレオチドキナーゼ、及びポリヌクレオチドリガー
ゼ標品は、工ｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｏｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ａ
ｃａｂｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ ；スチェゲド、
ハンガリー、において、公表されている精製法（Ｒｏｂ
ｅｒｔｓ、 Ｒ９Ｊ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｏ、ｌｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ １１ 、ｒ１３５−ｒ１３７（１９８３
）；Ｍｕｒｒａｙ、 Ｎ、 Ｅ、等： 、ＴｏＭｏｌ、
Ｂｉｏｌ、 １３２ 、 ４９３−５０５ （１９７
９） ； Ｐａｎｅｔ、 Ａ、等：Ｂｉｏｏｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、 １２ 、５０４５−５０５０（１９７３））
に従って調製された。酵素ＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌ
ｅｎｏｗ断片はニューイングランドビオラズス（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）製品であり、細
菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）はウォーシントン
（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ）により製造された。
リヌクレオチドキナーゼ、及びポリヌクレオチドリガー
ゼ標品は、工ｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｏｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ａ
ｃａｂｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ ；スチェゲド、
ハンガリー、において、公表されている精製法（Ｒｏｂ
ｅｒｔｓ、 Ｒ９Ｊ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｏ、ｌｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ １１ 、ｒ１３５−ｒ１３７（１９８３
）；Ｍｕｒｒａｙ、 Ｎ、 Ｅ、等： 、ＴｏＭｏｌ、
Ｂｉｏｌ、 １３２ 、 ４９３−５０５ （１９７
９） ； Ｐａｎｅｔ、 Ａ、等：Ｂｉｏｏｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、 １２ 、５０４５−５０５０（１９７３））
に従って調製された。酵素ＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌ
ｅｎｏｗ断片はニューイングランドビオラズス（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）製品であり、細
菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）はウォーシントン
（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ）により製造された。
〔γ−３２Ｐ ） Ａ Ｔ Ｐ （Ｈｕｎｇａｒｉａｎ
工５ｏｔｏｐ工ｍ５ｔｉｔｕｔｅ、ブタペスト）は２２
ＴＢｑ／ｍＭの比活性を有していた。
工５ｏｔｏｐ工ｍ５ｔｉｔｕｔｅ、ブタペスト）は２２
ＴＢｑ／ｍＭの比活性を有していた。
ＹＴＢ培地（Ｍｉ １ｌｅｒ、 、Ｔ、 Ｈ，ＩＩ；ｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ土ｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、０ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９７２））は１
０Ｐ／−１ａのバタトトリプトン（ディフコ）、５１／
２のパクト酵母エキス（ディフコ）、及び５グのＮａＯ
］−を含有する。ＹＴＡプレートを調製するためには、
ＹＴＢ培地に１５！？＃？のバクトアガー（ディフコ）
を補充した。
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ土ｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、０ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９７２））は１
０Ｐ／−１ａのバタトトリプトン（ディフコ）、５１／
２のパクト酵母エキス（ディフコ）、及び５グのＮａＯ
］−を含有する。ＹＴＡプレートを調製するためには、
ＹＴＢ培地に１５！？＃？のバクトアガー（ディフコ）
を補充した。
プラスミドＤＮＡを分離するために、適当なプラスミド
を含有する細菌株ＨＢ１０１．０６００、及びＥ工１８
８００を、１００μｙ／ｒａｌのアンビシリン（ファル
マキム、ソフィア）を含有するＹ’ＴＢ培地に増殖せし
めた。各非−ｐＨｏ プラスミドを分離する前に、ＯＤ
６ｏ ｏ ｎｍ ０．７〜０，８において１７０μｙ
／ｍｌ のり四ラムフェニコールを添加し、そしてさら
に１０〜１２時間振とうした。高コピー数（ｐＨｏ ）
プラスミドは、増幅を伴わないで定常期まで増殖した培
養細胞から分離した。調製的量においてプラスミドＤＮ
Ａを分離する場合、（ｐＨＧプラスミドの場合は５０〜
１００ｍＡ！の細菌培養物から、そして他の誘導体の場
合は１〜３沼の培養物から）、Ｏｌｅｗｅｌｌ及びＨｅ
１１ｎｓｋｉ ［Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１１０
．１１３５（１９７２））の技法に従って透明な溶解物
を調製し、そしてプラスミドＤＮＡをセファクリル５１
０００（ファルマシア）のカラムにより精製した。分析
目的でプラスミドＤＮＡを分離する（１．０〜１．５
ｍｌの細菌培養物から）ためには、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及
びＤｏ ｌｙにより開発されそしてり、工ｓｈ−Ｈｏｒ
ｏｗｉｃｈにより改良された酢酸カリウム法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、 Ｔ、等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｏｌｏｎｉｎ
ｇ 、 ００１４ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｉ＋
ａｂｏｒａｔｏｒｙ。
を含有する細菌株ＨＢ１０１．０６００、及びＥ工１８
８００を、１００μｙ／ｒａｌのアンビシリン（ファル
マキム、ソフィア）を含有するＹ’ＴＢ培地に増殖せし
めた。各非−ｐＨｏ プラスミドを分離する前に、ＯＤ
６ｏ ｏ ｎｍ ０．７〜０，８において１７０μｙ
／ｍｌ のり四ラムフェニコールを添加し、そしてさら
に１０〜１２時間振とうした。高コピー数（ｐＨｏ ）
プラスミドは、増幅を伴わないで定常期まで増殖した培
養細胞から分離した。調製的量においてプラスミドＤＮ
Ａを分離する場合、（ｐＨＧプラスミドの場合は５０〜
１００ｍＡ！の細菌培養物から、そして他の誘導体の場
合は１〜３沼の培養物から）、Ｏｌｅｗｅｌｌ及びＨｅ
１１ｎｓｋｉ ［Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１１０
．１１３５（１９７２））の技法に従って透明な溶解物
を調製し、そしてプラスミドＤＮＡをセファクリル５１
０００（ファルマシア）のカラムにより精製した。分析
目的でプラスミドＤＮＡを分離する（１．０〜１．５
ｍｌの細菌培養物から）ためには、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及
びＤｏ ｌｙにより開発されそしてり、工ｓｈ−Ｈｏｒ
ｏｗｉｃｈにより改良された酢酸カリウム法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、 Ｔ、等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｏｌｏｎｉｎ
ｇ 、 ００１４ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｉ＋
ａｂｏｒａｔｏｒｙ。
ニューヨーク（１９８２））を使用した。
制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡサンプルの分解は
、ニューイングランドビオラプスにより推奨された反応
条件下で行った。
、ニューイングランドビオラプスにより推奨された反応
条件下で行った。
単鎖末端を有するＤＮＡ断片を平滑末端を有する断片に
変形するためには、制限酵素で分解した後のＤＮＡをア
ルコールにより沈澱せしめ、そして次に、５０ ｍＭの
Ｔｒｙｓ−Ｈｏｔ、 ｐＨ７４，７ｍＭのＭｇ、Ｏ１２
，１ｍＭのジチオスレイトール、０．１ｍＭのｄＡＴＰ
、 ０．ｉｍＭのｄＯＴＰ、 ０．１ｍＭのｃｌ（）Ｔ
Ｐ、 ０．１ｍＭのＴＴＰを含有する緩衝液（最終体積
１０〜２０μ）、ＤＮＡ濃度濃度２御０〜２５０溶解し
た。次に、溶液を、１〜２ＵのＤＮＳポリメラーゼ■Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片と共に３７ｔ）’にて１５分間インキュ
ベートした（ Ｍａｎｉａｔｉａ， Ｔ．等：Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ， ０ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク
（１９８２））。
変形するためには、制限酵素で分解した後のＤＮＡをア
ルコールにより沈澱せしめ、そして次に、５０ ｍＭの
Ｔｒｙｓ−Ｈｏｔ、 ｐＨ７４，７ｍＭのＭｇ、Ｏ１２
，１ｍＭのジチオスレイトール、０．１ｍＭのｄＡＴＰ
、 ０．ｉｍＭのｄＯＴＰ、 ０．１ｍＭのｃｌ（）Ｔ
Ｐ、 ０．１ｍＭのＴＴＰを含有する緩衝液（最終体積
１０〜２０μ）、ＤＮＡ濃度濃度２御０〜２５０溶解し
た。次に、溶液を、１〜２ＵのＤＮＳポリメラーゼ■Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片と共に３７ｔ）’にて１５分間インキュ
ベートした（ Ｍａｎｉａｔｉａ， Ｔ．等：Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ， ０ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク
（１９８２））。
接着末端を有するＤＮＡ断片を連結するために使用する
反応混合物（３０〜４０μ．、ｅ）には、０、 ５ 〜
１． ０μｍのＤＮＡ，６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＱｔ（
ｐＨ７．６）、５ｍＭのＭｇＯ１２ 、 ５ ｍＭのジ
チオスレイトール、１ｍＭのＡＴＰ，及び１ＵのＴ４誘
導ポリヌクレオチドリガーゼを含有せしめた。連結は、
１４ｔＺ’にて２〜３時間行った〔λ（ａｎｉａｔｉｓ
、 Ｔ 、等＝ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎ
ｇ， Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（１９８２））Ｏ 平滑末
端を有する断片は、３ ０ 〜４ ０ ｐｙ／ｍｌ （
７） ＤＮＡ。
反応混合物（３０〜４０μ．、ｅ）には、０、 ５ 〜
１． ０μｍのＤＮＡ，６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＱｔ（
ｐＨ７．６）、５ｍＭのＭｇＯ１２ 、 ５ ｍＭのジ
チオスレイトール、１ｍＭのＡＴＰ，及び１ＵのＴ４誘
導ポリヌクレオチドリガーゼを含有せしめた。連結は、
１４ｔＺ’にて２〜３時間行った〔λ（ａｎｉａｔｉｓ
、 Ｔ 、等＝ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎ
ｇ， Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（１９８２））Ｏ 平滑末
端を有する断片は、３ ０ 〜４ ０ ｐｙ／ｍｌ （
７） ＤＮＡ。
２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｅ４（ ｐＨ７．４ ）、５ｍ
ＭのＭｇ０１２。
ＭのＭｇ０１２。
５ｍＭのス６ルミジン、１ｍＭのＡＴＰ，１０μｍ／Ｍ
のＢＳＡ（シグマ、タイプ■）を含有する緩衝液中で連
結した。反応混合物に４〜６■のＴ４誘導ポリヌクレオ
チドキナーゼを加え、そして１４ｔＺ’にて８〜１２時
間インキュベートした（ Ｍａｎｉａｔｉｓ等， Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ， Ｏ’ｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， 二．
−ヨーク（１９８２））。
のＢＳＡ（シグマ、タイプ■）を含有する緩衝液中で連
結した。反応混合物に４〜６■のＴ４誘導ポリヌクレオ
チドキナーゼを加え、そして１４ｔＺ’にて８〜１２時
間インキュベートした（ Ｍａｎｉａｔｉｓ等， Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ， Ｏ’ｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， 二．
−ヨーク（１９８２））。
ＤＮＡ断片のゲル電気泳動は、Ｈｅｌｌｉｎｇ 等によ
り記載された方法（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．１４． １２３
５（１９７４））に従って、水平電気泳動装置中で０、
８〜２．０％アガロースゲル（シグマ、タイプ■）にお
いて行った。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１％及
び８％の１鮎の厚さの垂直ゲルを使用）はＭａｎｉａｔ
ｉｓ等の方法（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １４
。
り記載された方法（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．１４． １２３
５（１９７４））に従って、水平電気泳動装置中で０、
８〜２．０％アガロースゲル（シグマ、タイプ■）にお
いて行った。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１％及
び８％の１鮎の厚さの垂直ゲルを使用）はＭａｎｉａｔ
ｉｓ等の方法（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １４
。
３７８７−３７９４（１９７５））に従って行った０
アガロースゲル及びポリアクリルアミドゲルがらＤＮＡ
断片を分離するために、Ｗｉｎｂｅｒｇ 等により開発
された技法（ ＤＩｎＡＥ紙を用いる）〔Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ．旦，２５３−２６４（１９８
０））を使用した。
断片を分離するために、Ｗｉｎｂｅｒｇ 等により開発
された技法（ ＤＩｎＡＥ紙を用いる）〔Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ．旦，２５３−２６４（１９８
０））を使用した。
細菌株ＨＢ１０１，０６ｏＤ，及ヒｌ！！Ｄ８８００ｆ
７）形質転換のためのコンピテント細胞は、Ｍａｎｄｅ
ｌ及びＨｌｇａ （ 、Ｔ， Ｍｏｌ， Ｂｉｏｌ，
５３， １５４（ １９７０ ）により報告されたいわ
ゆるＯ ａ Ｏ ｔ２法により調製した。
７）形質転換のためのコンピテント細胞は、Ｍａｎｄｅ
ｌ及びＨｌｇａ （ 、Ｔ， Ｍｏｌ， Ｂｉｏｌ，
５３， １５４（ １９７０ ）により報告されたいわ
ゆるＯ ａ Ｏ ｔ２法により調製した。
Ｄ’ＮＡ断片の５′末端の脱燐酸、ポリヌクレオチドキ
ナーゼ及び〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰを用いる末端のラベル
、及びヌクレオチド配列の決定はＭａｘａｍ及びＧ１１
ｂｅｒｔ （ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ：ｎｚｙｍｏｌ．
６５。
ナーゼ及び〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰを用いる末端のラベル
、及びヌクレオチド配列の決定はＭａｘａｍ及びＧ１１
ｂｅｒｔ （ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ：ｎｚｙｍｏｌ．
６５。
４９９（１９７７））により記載された方法により行っ
た。
た。
この発明のプラスミドの内、ｐＢＲ３２２と同じ複製領
域を有し、複製のレプレッサーとして機能する小ＲＮＡ
の遺伝子中に（）−＋ Ｔ点変呉を有し、そして （α）遺伝的選択マーカーとしてｐＢＲ３２２のアンピ
シリン耐性遺伝子を含有し、そしてテトラサイクリン耐
性のための遺伝子が欠失又は不活性化されており、ある
いは （ｈ） １１伝的選択マーカーとしてプラスミドのアン
ピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子を
含有し、そしてテトラサイクリン耐性遺伝子の転写が天
然のプロモーターより弱い変異プロモーターから、又は
外来性プロモーターから行われる高コピー数プラスミド
ベクターが特に好ましい。
域を有し、複製のレプレッサーとして機能する小ＲＮＡ
の遺伝子中に（）−＋ Ｔ点変呉を有し、そして （α）遺伝的選択マーカーとしてｐＢＲ３２２のアンピ
シリン耐性遺伝子を含有し、そしてテトラサイクリン耐
性のための遺伝子が欠失又は不活性化されており、ある
いは （ｈ） １１伝的選択マーカーとしてプラスミドのアン
ピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子を
含有し、そしてテトラサイクリン耐性遺伝子の転写が天
然のプロモーターより弱い変異プロモーターから、又は
外来性プロモーターから行われる高コピー数プラスミド
ベクターが特に好ましい。
第３，４．及び５図に示すプラスミドは、この発明の高
コピー数プラスミドの好ましい代表例であって、次のよ
うな特徴を有する。
コピー数プラスミドの好ましい代表例であって、次のよ
うな特徴を有する。
１６複製のレプレッサーとして機能する低分子量ＲＮＡ
′？ｉ：コードする遺伝子の構造変化の結果として、複
製が抑制解除され、従って細胞内でのコピー数が実質的
に増加し、そして約１０００（細胞の全ＤＮＡ含量の約
６５％）となる。この高コピー数は、宿主細胞として使
用された亘、コリ細胞に影響を与えない。
′？ｉ：コードする遺伝子の構造変化の結果として、複
製が抑制解除され、従って細胞内でのコピー数が実質的
に増加し、そして約１０００（細胞の全ＤＮＡ含量の約
６５％）となる。この高コピー数は、宿主細胞として使
用された亘、コリ細胞に影響を与えない。
２、 この一連のプラスミドは多数の制限エンドヌクレ
アーゼの切断部位を含有し、従ってこれらの個々の酵素
により、これらの組合わせにより、又は同じ末端を生成
する他のエンドヌクレアーゼにより消化されたＤＮＡ断
片を、これらのプラスミドに容易に挿入することができ
る。
アーゼの切断部位を含有し、従ってこれらの個々の酵素
により、これらの組合わせにより、又は同じ末端を生成
する他のエンドヌクレアーゼにより消化されたＤＮＡ断
片を、これらのプラスミドに容易に挿入することができ
る。
この発明の好ましいプラスミドにおけるクロー及びこれ
らの部位の任意の組合わせ； ｐＨ０３１２： ｏ１ａ■、 Ｈ１ｎｄ／［、Ｘｂａ
Ｉ、 Ｂｇｌ■。
らの部位の任意の組合わせ； ｐＨ０３１２： ｏ１ａ■、 Ｈ１ｎｄ／［、Ｘｂａ
Ｉ、 Ｂｇｌ■。
ＩＣａ ｏＲ工、及びこれらの部位の任意の組合わせ；
ｐＨ０６２４：ＥａｏＲ工、 Ｈｌｎｄｍ、 ＢａｍＨ
工、 Ｘｂａ■、 Ｂ１１Ｔｌ。
工、 Ｘｂａ■、 Ｂ１１Ｔｌ。
Ｓｍａ Ｉ、 （ＸｍａＩ） 、Ｓａｌ Ｌ 及びこれ
らの組合わせ。
らの組合わせ。
３、 好ましいｐＨＯプラスミドのサイズは、出発ＴＩ
ＢＲ３２２のそれよりも相当に小さく、第３゜４、及び
５図に示したプラスミドは、それぞれ２４０５ｂｐ、２
０１０ｂｐ、及び２０’１５ ｂｐである。細胞内おほ
とんどのベクタープラスミドのコピー数は該プラスミド
のサイズに反比例するから、上記のことは有利である。
ＢＲ３２２のそれよりも相当に小さく、第３゜４、及び
５図に示したプラスミドは、それぞれ２４０５ｂｐ、２
０１０ｂｐ、及び２０’１５ ｂｐである。細胞内おほ
とんどのベクタープラスミドのコピー数は該プラスミド
のサイズに反比例するから、上記のことは有利である。
遺伝子クローニング実験において、より小さいベクター
を使用することにより、より大きな遺伝子をクローニン
グすることができる。
を使用することにより、より大きな遺伝子をクローニン
グすることができる。
４、 これらのブラスミｌ゛は、遺伝曲選“択マーカー
としてもとのｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子を
有する。
としてもとのｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子を
有する。
５、 これらは、もとのＩＩＢＲ３２２の複製開始点を
含有する。
含有する。
この発明の他の観点に従えば、高コピー数ベクターの製
造方法が提供され、この方法は、プラスミド複製のレプ
レッサーの生産を担当する遺伝子区画に、レプレッサー
の生産を変える変異を形成することを含んで成る。
造方法が提供され、この方法は、プラスミド複製のレプ
レッサーの生産を担当する遺伝子区画に、レプレッサー
の生産を変える変異を形成することを含んで成る。
この発明によって提供される方法の好ましい態様に従え
ば、レプレッサーの生産を変える点変異を、テトラサイ
クリン耐性が不活性化されており又は抑制された機能を
示すｐＢＲ３２２の誘導体又は同じ複製領域を有する他
の任意のプラスミドのレプレッサーＲＮＡコード遺伝子
区画に形成し、そして所望によりテトラサイクリン耐性
のための膜蛋白質の生産を担当するＤＮＡ区画Ｐ、１又
は複数の段階において合成ポリリンカーＤＮＡにより置
き換える。
ば、レプレッサーの生産を変える点変異を、テトラサイ
クリン耐性が不活性化されており又は抑制された機能を
示すｐＢＲ３２２の誘導体又は同じ複製領域を有する他
の任意のプラスミドのレプレッサーＲＮＡコード遺伝子
区画に形成し、そして所望によりテトラサイクリン耐性
のための膜蛋白質の生産を担当するＤＮＡ区画Ｐ、１又
は複数の段階において合成ポリリンカーＤＮＡにより置
き換える。
前記のように、麦類は好ましくは′５０７４位（ｐＢＲ
３２２のもとの番号に従う）における（） −＋ Ｔ点
変異である。
３２２のもとの番号に従う）における（） −＋ Ｔ点
変異である。
テトラサイクリン耐性により惹起される問題を除去する
ために使用することができる幾つかの代替法が存在する
。可能性に従えば、テトラサイクリン耐性のための膜蛋
白質の生産を担当するＤＮＡ区画を、１又は複数の重要
な制限酵素により切断され得る合成ポリリンカーにより
置き換える。この方法に変えて、外来性ＤＮＡ断片をテ
トラサイクリン耐性遺伝子に挿入し、その機能を不活性
化する。他の可能性に従えば、テトラサイクリン耐性遺
伝子の転写を、ブロモーター領域における変異により、
又は天然ブロモーターを強くない転写を保証する「外来
性」ブロモーターで置き換えることにより低下せしめる
。これらすべての技法、及びその自明の変法はこの発明
の範囲に属する。
ために使用することができる幾つかの代替法が存在する
。可能性に従えば、テトラサイクリン耐性のための膜蛋
白質の生産を担当するＤＮＡ区画を、１又は複数の重要
な制限酵素により切断され得る合成ポリリンカーにより
置き換える。この方法に変えて、外来性ＤＮＡ断片をテ
トラサイクリン耐性遺伝子に挿入し、その機能を不活性
化する。他の可能性に従えば、テトラサイクリン耐性遺
伝子の転写を、ブロモーター領域における変異により、
又は天然ブロモーターを強くない転写を保証する「外来
性」ブロモーターで置き換えることにより低下せしめる
。これらすべての技法、及びその自明の変法はこの発明
の範囲に属する。
この発明の高コピー数プラスミドベクターは種々の利用
可能性を有し、例えば、対照試験、構造の確認、変彩、
トランスクローニング （ｔｒａｎｓｃｌｏｎｉｎｇ）のために、任意のクロー
ン化区画の又は全キメラプラスミドを純粋な形で調製の
使用することができる。この発明のプラスミドを使用す
る場合、文献から知られる一般に使用されるプラスミド
の場合よりも相当少ない出発材料から同量のＤＮＡを得
ることかできる。例示されたｐＨＣプラスミドの場合に
は、ｐＢＲ３２２から得られるのと同じ量のＤＮＡを得
るために約２０〜３０分の１の出発材料が必要なのみで
ある。ｐＨＣプラスミドを担持する細菌の単一コロニー
から分離することができるプラスミドＤＮＡは、３〜４
の制限分析のために十分である。１ｌの細菌培養物から
１０ｍｇ以上の純粋なプラスミドが得られる。
可能性を有し、例えば、対照試験、構造の確認、変彩、
トランスクローニング （ｔｒａｎｓｃｌｏｎｉｎｇ）のために、任意のクロー
ン化区画の又は全キメラプラスミドを純粋な形で調製の
使用することができる。この発明のプラスミドを使用す
る場合、文献から知られる一般に使用されるプラスミド
の場合よりも相当少ない出発材料から同量のＤＮＡを得
ることかできる。例示されたｐＨＣプラスミドの場合に
は、ｐＢＲ３２２から得られるのと同じ量のＤＮＡを得
るために約２０〜３０分の１の出発材料が必要なのみで
ある。ｐＨＣプラスミドを担持する細菌の単一コロニー
から分離することができるプラスミドＤＮＡは、３〜４
の制限分析のために十分である。１ｌの細菌培養物から
１０ｍｇ以上の純粋なプラスミドが得られる。
宿主細胞がクローニングされた遺伝子の生成物の増加し
た量に耐えるならば、この発明のｐＨＣプラスミドを使
用することによって任意の遺伝子生成物の合成を強化す
ることができる。最適な場合においては約２０〜３０倍
である。なぜならこの程度の遺伝子の増加が達成できる
からである。
た量に耐えるならば、この発明のｐＨＣプラスミドを使
用することによって任意の遺伝子生成物の合成を強化す
ることができる。最適な場合においては約２０〜３０倍
である。なぜならこの程度の遺伝子の増加が達成できる
からである。
ある場合には、他の因子の限定作用のために、この増加
の程度は幾分少ないであろう。
の程度は幾分少ないであろう。
ｐＨＣプラスミドへのポリリンカー区画の挿入は、これ
らのプラスミドに高い柔軟性を付与する。
らのプラスミドに高い柔軟性を付与する。
用いることができる切断部位が、遺伝子をクローニング
するのに適当でなければ、これらを合成アダプターによ
り置き換え又は他の断片によりクローニングに適当なも
のとすることができる。
するのに適当でなければ、これらを合成アダプターによ
り置き換え又は他の断片によりクローニングに適当なも
のとすることができる。
工業的用途として、インシュリン、バソプレッシン等の
製造を挙げることができる。
製造を挙げることができる。
この発明の説明に使用した実験は単に例示的なものであ
って、この発明の範囲を限定するものではない。例示し
た解決方法のほかに、この発明を実施するための多数の
その他の可能性が存在する。
って、この発明の範囲を限定するものではない。例示し
た解決方法のほかに、この発明を実施するための多数の
その他の可能性が存在する。
例えば、酵素Ｆｎｕ４ＨＩ及びＴｔｈｉＩＩを使用する
ことによって、それぞれ２１及び３２ヌクレオチドを含
有する対応するＤＮＡ区画をもとのｐＢＲ３２２から切
り出し、Ｇ→Ｔ点変異を含有する対応する断片を化学的
に合成し、そして除去された断片の代りにｐＢＲ３２２
の分子に挿入することができる。
ことによって、それぞれ２１及び３２ヌクレオチドを含
有する対応するＤＮＡ区画をもとのｐＢＲ３２２から切
り出し、Ｇ→Ｔ点変異を含有する対応する断片を化学的
に合成し、そして除去された断片の代りにｐＢＲ３２２
の分子に挿入することができる。
同様に、種々の合成ポリリンカーＤＮＡ断片を、テトラ
サイクリン耐性を担当する、部分的に又は完全に除去さ
れたＤＮＡ区画の代りに挿入することができる。
サイクリン耐性を担当する、部分的に又は完全に除去さ
れたＤＮＡ区画の代りに挿入することができる。
これらの、及び同様の解決方法、並びにこれらの方法に
よって得られるプラスミドはこの発明の範囲に属する。
よって得られるプラスミドはこの発明の範囲に属する。
プラスミドｐＨＣ３１２、ｐＨＣ３１４及びｐＨＣ６２
４は、１９８４年３月７日付で、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｇａｎｉｓｍｓ
（ＯＫＩ、ハンガリー）に、それぞれＮｏ．００２７９
、００２８０、及び００２８１として寄託された。
４は、１９８４年３月７日付で、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｇａｎｉｓｍｓ
（ＯＫＩ、ハンガリー）に、それぞれＮｏ．００２７９
、００２８０、及び００２８１として寄託された。
下記の微生物株及びプラスミドは、１９８４年７月２５
日に、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＭ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＯＫＩ、ハンガリー）に
寄託された。
日に、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＭ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＯＫＩ、ハンガリー）に
寄託された。
Ｅ．コリ ＨＢ１０１ ００２９０
Ｅ．コリ ＥＤ８８００ ００２９１
Ｅ．コリ Ｃ６００ ００２９２
ｐ．７１５ ００２９３
ｐＨＣ１ ００２９４
ｐＨＣ８１ ００２９５
πＡＮ７ ００２９６
πＶＸ ００２９７
第１図はプラスミドｐＢＲ３２２の地図であり；第２図
はプラスミドｐＨＣ８１の地図であり；第３図はプラス
ミドｐＨＣ３１４の地図であり；第４図はプラスミドｐ
ＨＣ３１２の地図であり；第５図はプラスミドｐＨ０６
２４の地図であり；第６図は各種のプラスミドの電気泳
動図であって図面に代る写真であり；そして第７図は、
プラスミドｐ７１５（Ａ）及びｐＨ０６１４ＣＢ）含有
Ｅ、コリＨＢ１０１からのＤＮＡの密度勾配遠心図であ
って、図面に代る写真である。 特許ＩＢＭ人 リヒター ゲデオン ベジェセティ ジャール アール、チー。 特許出願代理人 弁理士 青 木 朗 弁理士西舘和之 弁理士 福 本 積 弁理士山口昭之 弁理士西山雅也 図面のｒｐ書 ”、、’： １． ７ ’ り、、；２．Ｈｌ （内容に変更なし） 第３．１ざ１ 第４回 第５゛１）″ｊＩ 第６図 第７図 手続補正書（方式） ％式％ ）（１ Ｎｊ、ｌ−ノビ−叔ゾ°）−（ミ ド及びイー１７）製
、・２−ノア法３ 、 ；ｉｔｉ、’、ｉレン・−する
−右手イ′ｌどの関（，１々 １、′ｌ’Ｎ’ｌ出１ｖ
〔を入名称 リ）−ター ゲラ−４シ ベ、パ−丁十“
Ｊイ ンヤール了−１Ｌ−。チー。 ・１ 、 （！、７１己（１，！（ ６、補止の対象 （１）願書の［出願人の代表者−１の欄１（２） 勿任
状 （３） ｌ＝ンｌ ｉｆ＋ｉ ７、補庄の自答 （１”）（２） 別紙の通り （３）１ツ自ｔｒｉの浄ψＦ（自答に愛用なＩ、２）８
、添附前ね“Ｊの１−１峰 （ｉ） １ｉｑ１１〜１舶書 １ ｌｉす（２）俗仔状
及び訳文 各Ｉｉｉす （３）洋書ｔ！＜： ！ｊｉ’！ １ ｌ（＋ｌｉ（“
Ｄ −Ｌ 中 書 １、ｊｌ。
はプラスミドｐＨＣ８１の地図であり；第３図はプラス
ミドｐＨＣ３１４の地図であり；第４図はプラスミドｐ
ＨＣ３１２の地図であり；第５図はプラスミドｐＨ０６
２４の地図であり；第６図は各種のプラスミドの電気泳
動図であって図面に代る写真であり；そして第７図は、
プラスミドｐ７１５（Ａ）及びｐＨ０６１４ＣＢ）含有
Ｅ、コリＨＢ１０１からのＤＮＡの密度勾配遠心図であ
って、図面に代る写真である。 特許ＩＢＭ人 リヒター ゲデオン ベジェセティ ジャール アール、チー。 特許出願代理人 弁理士 青 木 朗 弁理士西舘和之 弁理士 福 本 積 弁理士山口昭之 弁理士西山雅也 図面のｒｐ書 ”、、’： １． ７ ’ り、、；２．Ｈｌ （内容に変更なし） 第３．１ざ１ 第４回 第５゛１）″ｊＩ 第６図 第７図 手続補正書（方式） ％式％ ）（１ Ｎｊ、ｌ−ノビ−叔ゾ°）−（ミ ド及びイー１７）製
、・２−ノア法３ 、 ；ｉｔｉ、’、ｉレン・−する
−右手イ′ｌどの関（，１々 １、′ｌ’Ｎ’ｌ出１ｖ
〔を入名称 リ）−ター ゲラ−４シ ベ、パ−丁十“
Ｊイ ンヤール了−１Ｌ−。チー。 ・１ 、 （！、７１己（１，！（ ６、補止の対象 （１）願書の［出願人の代表者−１の欄１（２） 勿任
状 （３） ｌ＝ンｌ ｉｆ＋ｉ ７、補庄の自答 （１”）（２） 別紙の通り （３）１ツ自ｔｒｉの浄ψＦ（自答に愛用なＩ、２）８
、添附前ね“Ｊの１−１峰 （ｉ） １ｉｑ１１〜１舶書 １ ｌｉす（２）俗仔状
及び訳文 各Ｉｉｉす （３）洋書ｔ！＜： ！ｊｉ’！ １ ｌ（＋ｌｉ（“
Ｄ −Ｌ 中 書 １、ｊｌ。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 プラスミド複製のレプレッサーの生産を担当する
遺伝子区画中に該レプレッサーの生産を変える変異を含
有する高コピー数プラスミドベクタ０ ２、 １）ＢＲ６２２と同じ複製領域を有し、そして複
製のレプレッサーとして機能する小ＲＮＡの遺伝子中に
Ｇ−＞Ｔ点変異を有し、そして（α）遺伝的選択マーカ
ーとしてプラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺
伝子を含有し、そしてテ（ラサイクリン耐性遺伝子は不
活性化されており、もしくは完全に欠失しており、又は
抑制された機能を有し、あるいは （ｈ）遺伝的選択マーカーとしてプラスミドｐＢＲ３２
２のアンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性
遺伝子を含有し、そしてテトラサイクリン耐性遺伝子の
転写が天然プロモーターより弱い変異プロモーターから
、又は外来性プロモーターから行われる特許請求の範囲
第１項記載の高コピー数プラスミドベクター。 ３、ｐＨ０５１４、ｐＨ０３１２、及びｐＨ０６２４で
ある特許請求の範囲第１項記載のプラスミドベクター。 ４、 プラスミド複製のレプレッサーの生産を担当する
遺伝子区画中に該レプレッサーの生産を変える変異を含
有する高コピー数プラスミドベクターを含有し、そして
複製する微生物。 ５、 プラスミド複製のレプレッサーの生産を担当する
遺伝子区画中にレプレッサー生産を変える変異を形成す
ることを含んで成る高コピー数プラスミドベクターの製
造方法。 ６、ｐＢＲ３２２、その誘導体又はＩ）ＢＲ３２２と同
じ複製領域を有する他のプラスミドの高コピー数誘導体
の製造のために、テトラサイクリン耐性のための遺伝子
を不活性化された形又は抑制された機能を示す形で含有
するｐＢＲ３２２の誘導体又はこれと同じ複製領域を有
する他の仕走、のプラスミドにおいて、レプレッサーＲ
ＮＡをコードする遺伝子区画中にレプレッサー生産を変
える点変異を形成し、所望によりテトラサイクリン耐性
のための膜蛋白質の生産を担当ＴるＤＮＡ区画を１又は
複数段階において合成ポリリンカーＤＮＡにより置き換
えることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法
。 Ｚ レプレッサーＲＮＡをコードする遺伝子区画の３０
７４位（ｐＢＲ３２２のもとの番号に従う）にＧ −）
Ｔ点変異を形成する特許請求の範囲第５項又は第６項
記載の方法。 ８、ｅ−＋’ｒ点変異を含有するプラスミドにおいて、
テトラサイクリン耐性を生じさせる膜蛋白質の生産全担
当するＤＮＡ区画を、１又は複数の制限酵素により切断
され得るリンカ−ＤＮＡにより置き換え、あるいはテト
ラサイクリン耐性機能を不活性化する外来性ＤＮＡ区画
をテトラサイクリン耐性遺伝子中に挿入し、あるいはテ
トラサイクリン耐性遺伝子の転写を、プロモーター領域
における変異により、又は天然プロモーターを、強力で
ない転写をもたらす外来性プロモーターで置き換えるこ
とにより抑制することを特徴とする特許請求の範囲第５
項又は第６項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU2251/3212/83 | 1983-09-16 | ||
| HU833212A HU194307B (en) | 1983-09-16 | 1983-09-16 | Process for producing plasmidvectors of high copy number |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60156389A true JPS60156389A (ja) | 1985-08-16 |
Family
ID=10963133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59191860A Pending JPS60156389A (ja) | 1983-09-16 | 1984-09-14 | 高コピ−数プラスミド及びその製造方法 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4703012A (ja) |
| JP (1) | JPS60156389A (ja) |
| AT (1) | AT384031B (ja) |
| AU (1) | AU578041B2 (ja) |
| BE (1) | BE900570A (ja) |
| CA (1) | CA1275631C (ja) |
| CH (1) | CH667672A5 (ja) |
| DE (1) | DE3434041A1 (ja) |
| DK (1) | DK439784A (ja) |
| FI (1) | FI79552C (ja) |
| FR (1) | FR2552102B1 (ja) |
| GB (1) | GB2148301B (ja) |
| HU (1) | HU194307B (ja) |
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