FI79552C - Plasmidvektorer och foerfarande foer framstaellning daerav. - Google Patents

Description

79552

Plasmidiv-ikuorit ja menetelmä niiden valmistamiseksi

Keksintö liittyy plasmidivektoreihin ja niiden valmistukseen. Täsmällisemmin sanottuna keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaisia plasmidivektoreita. Keksinnön kohteena on myös patenttivaatimuksen 4 johdannon mukainen menetelmä plasmidivektoreiden tuottamiseksi plasmideista.

Niinsanottu yhdistelmä-DNA-tekniikka eli geenitekniikka tulee jatkuvasti tärkeämmäksi lääketieteellisesti hyödyllisten tuotteiden tuottamisessa. Tämän tekniikan edullisen toteutustavan mukaan sijoitetaan haluttu, farmaseuttisesti aktiivisen tuotteen tuottamista koodattava geenijakso vektoriin, esim. plasmidiin, niin, että saadaan aikaan yhdistelmäplasmidimolekyyli, jolla sitten transformoidaan sopiva mikro-organismi. Sen jälkeen plas-midi lisääntyy yhdessä bakteeri-isännän kanssa ja mukaan liitetty geeni toimii. Geenituotteiden määrä riippuu luennan ja transkription intensiteetistä, geenituotteiden hajoamisesta solun sisällä ja geenin eli geeniä kantavan plasmidin kopiomäärästä. Näin ollen, jos onnistutaan nostamaan plasmidin kopiomäärää solussa, saadaan geenituotteiden määrä huomattavasti kohoamaan, koska vieraan geenin kopiomäärä kasvaa. (Geenitekniikkaa koskeva selostus löytyy esim. US patenttijulkaisusta no. 4 237 224.)

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota plasmidivektoreita, joilla on oleellisesti suurempi kopiomäärä solua kohti kuin ennestään tunnetuilla ja laajasti käytetyillä plasmideilla.

Tieteellisessä tutkimuksessa ja teollisuudessa käytetään suurta määrää erilaisia tavallisesti keinotekoisesti rakennettuja plasmidivektoreita. Yksi laajimmin käytetyistä plasmideista on pBR322, jonka ensimmäisinä rakensivat Boyer et ai. (Gene, 2, 95-113 (1977)). Nykyään 2 79552 meillä on käytössä mitä täydellisin tieteellinen informaatio tästä plasmidista, ja suurin osa geenien kloonauksista en suoritettu käyttämällä tätä plasmidia tai sen johdannaisia, ja me olemme käyttäneet sitä lähtöaineena omissa kokeissamme. pBR322:n rakenteen on määrittänyt Sutcliffe (CSH Symp. Quant. Biol. 43, 77-90 (1979)) ja se on esitetty kuvassa 1. Tämän plas-midin molekyylin pituus on 4362 emäsparia. Plasmidin rep-likoituminen alkaa nukleotidista 2536 vastapäivään ja sen kopiomäärä solua kohti on yleensä välillä 20 - 50. Kopio-määrää ohjaa monimutkainen säätelymekanismi (Plasmid 9, 1, (1983)). Nukleotidien 2978 ja 3081 välissä oleva osa ohjaa pienimolekyylisen RNA:n synteesiä, joka ei koodita prote-iiniä,ja transkriboituu myötäpäivään suhteellisen suurella intensiteetillä. Tällä RNA:lla on pieni molekyyli-paino ja se on plasmidin replikoitumisen negatiivinen säätelijä (repressori).

Esillä oleva keksintö perustuu siihen havaintoon, että plasmidin kopiomäärää voidaan oleellisesti lisätä, jos plasmidin lisääntymisen repressorin tuotannosta vastuussa olevaan geeniin aiheutetaan mutaatio, joka vahingoittaa mainitun geenijakson tätä toimintakykyä.

Laboratoriossamme eristettiin ensimmäinen suuren kopiomäärän tuottava plasmidi (pHC1) spontaanin mutaa-tion tuloksena kokeessa, joka suoritettiin amp ,tet -fenotyypin plasmideilla, joissa oli plasmidin pBR322 EcoRI- ja BamHI-katkaisukohtien välissä vieras DNA, ja löytö tapahtui analysoitaessa yhdistelmäplasmidijoukkoa, jossa oli noin 5000 itsenäistä plasmidia. Plasmidin pHC1 sisältävistä bakteerisoluista voitiin ilman vahvistusta eristää noin 20 - 30 kertaa enemmän plasmidi-DNA:ta kuin niistä klooneista, jotka sisälsivät muita, rakenteeltaan samanlaisia yhdistelmämolekyylejä. Kun E. coli HB101 (pro , leu , thi , lac , str , r m rndol , recA ) (Boyer, H.W. et ai., J.Mol.Biol. 41., 459-472 (1 979)), C600 (r^, m^ , thi , thr , leu , lac ) (Boyer, H.W. et al·., ibid.) ja ED8800 (supE, supF, hsdS , met ,

II

3 79552 lacZMl5, recA56) (Murray, N.E. et al., Mol.Gen. Genet.

150, 53-61 (1977) transformoitiin toistuvasti uudestaan plasmidilla pHC1, saatiin joka kerta ampr,tets-klooneja, jotka sisälsivät suuren määrän plasmideja. Syyksi kasvaneelle kopiomäärälle, joka oli noin 20 - 30 kertaa suurempi kuin pBR-plasmidien vastaava määrä, arveltiin, että plasmidi-DNA:ssa oli tapahtunut perinnöllinen muutos.

Suuren kopiomäärän aiheuttavan mutaation tunnistaminen

Plasmidi pHC1 pilkottiin restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja PruII ja yksittäiset päät täytettiin DNA-poly-meraasi I:n Klenow-palasen avulla dNTP-substraattien läsnäollessa. Tylppäpäiset DNA-molekyylit muutettiin rengasmaisiksi polynukleotidiligaasin avulla ja niillä transformoitiin HB101-solut. Ampisilliiniä sisältävällä alustalla kasvatetuista pesäkkeistä eristettiin plasmidi-DNA ja DNA-näytteet, joita kyettiin eristämään suuri määrä, analysoitiin agaroosi- ja polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla, kun oli ensin suoritettu pilkkominen restriktioendonukleaaseilla EcoRI, PvuII ja BspRI. Plasmi-dia pHC81 (kuva 2), joka valittiin jatkotutkimuksiin, ei voitu pilkkoa PvuII:11a ja se linearisoitiin Ecol: llä. Plasmidin kokonaismolekyylipainon (2,3 bp) ja BspRI-katkaisun avulla saatujen palasten koon (587,457, 434, 267, 240, 80... emäsparia) perusteella voitiin todeta, että plasmidi pHC81 sisälsi plasmidin pBR322 nukleotidien 2069 ja 2 välissä mutaation, joka aiheutti suuren kopiomäärän. Tätä mutaatiota ei voitu havaita minkään käytetyillä entsyymeillä tuotettujen jaksojen koon perusteella. Mutaation paikantamiseksi eristettiin 1030 emäsparin jakso, joka oli saatu pilkkomalla pHC81 restriktioendonukleaaseilla PstI ja Taql, 780 emäsparin jakso, joka oli saatu pilkkomalla pBR322 entsyymeillä PstI ja Clal, ja 218 emäsparin DNA-jakso, joka oli saatu pilkkomalla pBR329 entsyymillä Taql. Nämä kolme 4 79552 DNA-jaksoa sekoitettiin keskenään ekvimolaarisessa suhteessa, ne liitettiin yhteen polynukleotidiligaasin avulla ja sen jälkeen HB101-solut transformoitiin yhteen-liitäntätuotteella. Ampisilliiniä sisältävällä alustalla kasvatetuista yksittäisistä klooneista eristettiin plasmidi-DNA. Nämä plasmidit osoittivat suuren kopio-määrän tuottavaa fenotyyppiä. Kun plasmidi-DNA:t hajotettiin restriktioendonukleaaseilla, voitiin todeta, että ne olivat syntyneet kolmen eri alkuperää olevan ja hyvin toisistaan erotettavissa olevan jakson yhteenliittymisen tuloksena; saaduissa plasmideissa oli β-laktamaasi-geenin lähiosa peräisin pBR322:sta, replikoitumisen alkukohta oli plasmidista pBR329 ja pHC81:stä eristetty jakso sisälsi β-laktamaasigeenin etäisosan lisäksi mutaation, joka aikaansai suuren kopiomäärän. Näin ollen pääteltiin, että mutaatio oli plasmidin pBR322 DNA:n nukleotidien 2573 (Taql) ja 3612 (PstI) välissä. Tämän alueen emäs-järjestys määritettiin ja sitä verrattiin ennestään tunnettuun pBR322:n sekvenssiin. Tämä vertailu osoitti, että oli tapahtunut muuttuminen G:stä T:ksi (G = desoksi-guanyyli, T = tymidyyli) nukleotidissa 3074, mikä vastaa muutosta C:stä A:ksi komplementaarisessa DNA-säikeessä (C = desoksisytosyyli, A = desoksiadenyyli).

Tämän pistemutaation johdosta repressori-RNA:n transkription päättyminen on vaurioitunut ja syntetisoituu suu-rempimolekyylista RNA:ta, joka ei enää kykene toimimaan replikoitumisen repressorina. Repressorin toiminnan puuttuminen johtaa suurempaan kopiomäärään. Tämän spontaanin pistemutaation seurauksena, joka voidaan saada aikaan myös tarkoituksella, voitiin plasmidin kopiomäärä solua kohti nostaa noin 20— 30-kertaiseksi (n. 1000) verrattuna alkuperäiseen arvoon. Tällä pistemutaatiolla voidaan oleellisesti lisätä minkä tahansa sellaisen plasmidin kopiomää-rää, jolla on sama replikoitumisalue kuin pBR322:lla.

Kuitenkin on havaittu, että G~t* T-pistemutaation sisältävä alkuperäinen plasmidi pBR322 ei ole enää elinky-

II

5 79552 nen. Nimittäin suuresta kopiomäärästä johtuen lisääntyy niissä plasmidin geeneissä, jotka määrittävät antibiootin- 1Γ 2Γ vastustuskyvyn, Ap = β-laktamaasi, Te —> = kalvoproteiini(t), kummankin proteiinin tuotanto, ja viimeksimainittu (tetra-sykliininvastustuskyvynantava kalvoproteiini) on kasvaneena määränä letaalinen solulle. Sama ongelma on havaittavissa minkä tahansa plasmidin pBR322 suuren kopiomäärän omaavan johdannaisen kohdalla, joka sisältää alkuperäisen tetrasykliininvastustuskykygeenin muuttumattomassa muodossa.

Aikaisemmissa kokeissa emme joutuneet kohtaamaan tätä ongelmaa, koska käytimme plasmideja, joissa vieras DNA-jakso oli kloonattu plasmidin pBR322 BamHI- ja EcoRI-kohtien väliin, ja tällä tavalla tetrasykliininvastustus-kykygeeni oli inaktivoitunut. Näin ollen, jotta saataisiin elinkykyinen, suuren kopiomäärän tuottava plasmidi pBR322 tai sen johdannainen, pitää replikoitumisaluetta muuttaa siten, että tetrasykliininvastustuskykygeenin toiminta inaktivoidaan tai tukahdutetaan.

Näin ollen tämän keksinnön edullisen toteutustavan mukaan tarjotaan uusia plasmideja, jotka on johdettu pBR322:sta tai sen johdannaisista, jotka sisältävät saman replikoitumisalueen, siten, että ne eivät sisällä tet-rasykliininvastustuskykygeeniä tai sisältävät sen inak-tivoituneessa tai muunnetussa muodossa, jolloin geenin toiminta on alentunut, ja lisäksi ne sisältävät pistemutaation, joka muuntaa repressorin tuotantoa sillä geenialueella, joka koodittaa repressori-RNAtta.

Tämän keksinnön vielä edullisemman toteutustavan mukaan plasmidin pBR322 DNArssa tai sen johdannaisessa, jossa on sama replikoitumisalue, korvataan asemassa 3074 (noudatetaan pBR322:n numerointia) emäspari GC emäspa-rilla TA suorittamalla ohjattu pistemutaatio tai korvaamalla tämän mutaation sisältävä osa pHC-plasmidissa, jota selostetaan myöhemmin, halutun plasmidin osalla, joka tätä mutaatiota lukuunottamatta on identtinen.

Kuten edellä on selostettu, pitää GC^TA-pistemu-taatio saada aikaan lähtöplasmidin johdannaiseen, josta 6 79552 tetrasykliininvastustuskykygeeni puuttuu kokonaan tai sen toiminta on inaktivoitunut tai alentunut, jos pBR322:ta tai sen johdannaista käytetään malliaineena. Tässä yhteydessä tukahduttamisella eli repressiolla tarkoitetaan sitä, että geeniä, joka koodittaa tetrasykliininvastus-tuskyvyn aikaansaavan kalvoproteiinin tuotantoa, on muunnettu niin, että sen ohjaama proteiinituotanto on laskenut. Edullisen toteutustavan mukaan poistetaan se DNA, joka koodittaa tetrasykliininvastustuskykyä, tai koko jakso aina pBR322:n replikoitumisen alkukohtaan asti, ja haluttaessa se korvataan synteettistä alkuperää olevalla sidoksenmuodostajalla, jolloin näin lisää saatujen restrik-tioendonukleaasien tunnistuskohtien ansiosta plasmidien sovellutusmahdollisuudet lisääntyvät huomattavasti.

Plasmidien pHC314, pHC312 ja pHC624 rakentaminen

Edelläkuvatuissa kokeissa saatuja plasmideja muokattiin edelleen siten, että plasmidiin pHC81 sijoitettiin sidoksenmuodostajät, jotta saatiin aikaan sopivia vektoreita eri restriktioendonukleaaseilla muodostettujen DNA-jaksojen liittämistä varten. Plasmidin pHC81 DNA lineari-soitiin endonukleaasilla EcoRI ja defosforyloitiin bakteeriperäisellä emäsfosfataasilla ja sen jälkeen siihen liitettiin plasmidi-DNA-jaksoja (Seed, B.; Nucleic Acid Research 1J_, 2427-2446 (1983)) ja E. coli HB101-solut transformoitiin liitäntätuotteella. Apille vastustuskykyisistä bak-teeriklooneista eristettiin plasmidi-DNA ja se analysoitiin geelielektroforeesin avulla, kun ensin oli suoritettu pilkkominen restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Pstl. Jatkotutkimuksiin valittiin plasmidi, joka voitiin katkaista 2300 ja 110 bp:n palasiin EcoRI:llä ja 1580 ja 820 bp:n palasiin Pstl:llä (pHC314, kuva 3).Tästä rakennettiin seuraavalla tavalla plasmidi pHC312, jossa oli vain yksi EcoRI-kohta. Plasmidi katkaistiin rest-riktioendonukleaasi11a BamHI ja saatu lineaarinen molekyyli hajotettiin osittain HinfI-entsyymillä. DNA-jak- i 7 79552 sot erotettiin toisistaan 1,2% agaroosigeelillä ja 2010 bp:n jakso eristettiin. Molekyylin, päät, jotka sisälsivät yksisäikeisiä osia johtuen entsyymeillä BamHI ja Hinfl-tapahtuneesta pilkkomisesta, muunnettiin tylpiksi käyttämällä DNA-polymeraasi I:n Klenow-jaetta ja sen jälkeen suoritettiin renkaanmuodostus käyttämällä T^rllä indusoitua polynukleotidiligaasia. HBl01-solut transformoitiin yhteenliitetyllä DNA:11a ja yksittäiset kloonit eristettiin. Jatkotutkimuksiin valittiin plasmidi pHC312, jota ei voitu katkaista endonukleaasilla BamHI, mutta joka voitiin linearisoida EcoRIrllä, ja joka tuotti 1495 bp:n ja 516 bp:n palat Hinflrllä pilkottaessa (kuva 4). Jotta saataisiin aikaan suuren kopiomäärän tuottava vektori, joka soveltuu tylppäpäisten DNA-jaksojen kloonaamiseen, plasmidi pHC312 pilkottiin restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Hindlll ja 1980 bp:n pala eristettiin agaroosi-geelistä. Sitten tämä pala sekoitettiin plasmidin ttAN7 DNA:n kanssa (Seed, B.; Nucleic Acids Research, _Π, 2427 -2446 (1983)), pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja Hindlll ja molekyylit liitettiin yhteen polvnukleotidiligaasin avulla. E. coli HB101-solut transformoitiin yhteenliitetyllä plasmidilla ja yhdestä ampisilliinille vastustuskykyisestä bakteerikloonista eristettiin plasmidi-DNA. Tällä tavalla valmistetussa plasmidi-DNA:ssa (pHC624, kuva 5) ei ole lainkaan Clal-kohtaa, mutta toisin kuin plasmidi pHC312 se voidaan linearisoida restriktioendonukleaaseilla Smal, Sali ja BamHI.

Plasmidien kopiomäärän määrittäminen

Suhteellinen kopiomäärä

Jotta saataisiin määritetyksi pHC-plasmidien suhteellinen kopiomäärä, kasvatettiin E. coli-viljelmiä, joissa oli yhdistelmäplasmidista pBR322 johdettuja erikokoisia plasmideja ja samankokoisia suuren kopiomäärän tuottavia johdannaisia, samaan solutiheyteen asti.' Yhtä suurista määristä saatuja vahvistamattomia suspensioita eristettiin plasmidi-DNA noudattamalla Birnboimin ja Dolyn ku- 8 79552 vaarnaa menetelmää (Nucleic Acids Res. T_, 1513-1523 (1979)). DNA-valmisteista otetuille näytteille suoritettiin elektroforeesi agaroosigeelillä 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ja 50 kertaa laimennettuina vastaavasti. Suuren kopiomäärän tuottavat plasmidit ja niiden normaalin kopiomäärän tuottavat parit (molekyylipainot olivat samat) tutkittiin samanaikaisesti. Koetulokset osoittivat, että pHC-plas-midien kopiomäärä oli noin 20 - 30 kertaa suurempi kuin vastaavien "normaalin kopiomäärän tuottavien" pBR322-johdannaisten.

Absoluuttinen kopiomäärä pHC-plasmidien absoluuttinen kopiomäärä määritettiin merkkaamalla plasmidit sisältävien solujen DNA in vivo ja mittaamalla erotetun plasmidi-DNA:n ja kromosomaali-sen DNA:n radioaktiivisuuden suhde. Tällä menetelmällä havaittiin sellaisten plasmidien kopiomäärän, joiden koko oli sama kuin pHC314:n (molekyylipaino 1,6 x 10° d), olevan 9 noin 1000 solua kohti (kromosomin molekyylipaino 2 x 10 d) . 60 - 65 % solun kokonais-DNA-pitoisuudesta oli plas- midi-DNA:ta. DNA:n in vivo-merkkausta varten kasvatettiin plasmidit sisältäviä soluja M9-kasvualustassa, jota oli täydennetty seuraavilla aineosilla: 0,5 % kasamino- happoa (Difco) , 0,5 % glukoosia, 1 ug/ml B^-vitamiinia, 1 mmol MgSO., 2 yg/ml tymidiiniä, 250 ng/ml adenosii-4 3 nia ja 0,4 mBq/ml H-tymidiiniä (888tBq/mmol, Chemapol, Praha).

Plasmidin sisältävät solut hajotettiin menetelmällä Wombe et ai. (J. Bacteriol, 130 (1977) 148-153). Kro-mosomaalinen DNA ja plasmidi-DNA erotettiin toisistaan etidiumbromidi/keesiumkloridi-tasapainotiheysgradientti-sentrifugoimalla solulysaatti bakteerisuspensiosta, joka oli kasvatettu 2 ml:ksi. (OD^^^=4-5/45000 1/min, Beckman Type 65-roottori, 40 tuntia, 20°C).

Kasvanut kopiomäärä on esitetty kuvissa 6 .ja 7.

Kuva 6 esittää täpliä, jotka vastaavat pBR322-alku-

II

9 79552 perää olevia Apr,Tcs-yhdistelmäplasmidi-DNA-laatuja, kun erottaminen on suoritettu etidiumbromidi/agaroosigee-lielektroforeesilla. Kaikki näytteet valmistettiin samalla tavalla ja yhtä suurista määristä plasmidipitoisia HB101-soluja (Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res.

T_, 1513-1523 (1979)). Näytteet 1-2 ja 4-6 olivat yh-distelmäplasmideja, joissa oli 1,5 - 2,0 kb vierasta DNA:ta plasmidin pBR322 EcoRI- ja BamHI-katkaisukohtien välissä. Näyte 3 on samankokoinen plasmidi, joka sisältää suuren kopiomäärän tuottavan mutaation (pHC1).

Kuva 7 esittää E. coli HB101-solujen DNA:n täpliä, jotka sisältävät plasmidia p715 (näyte A) ja plasmidia pHC314 (näyte B), kun erottaminen on suoritettu etidium-bromidi/keesiumkloridigradienttisentrifugaatiolla. (Plas- midilla p715 on sama rakenne kuin pHC314:llä, mutta siitä puuttuu suuren kopiomäärän aiheuttava mutaatio.) Kuva otettiin sen jälkeen, kun plasmidin DNA ja kromosomin DNA oli erotettu toisistaan sentrifugoimalla, ja DNA:n sisältävä sentrifugiputki valaistiin UV-valolla. Kuvasta voidaan nähdä selvästi, että normaalin plasmidikopiomäärän tuottavista soluista (näyte A) saadusta DNAista puuttuu lähes kokonaan plasmidin sisältävä alempi kaista. Sen sijaan pHC314-plasmidi-DNA, joka on saatu samasta solu-määrästä samalla menetelmällä, muodostaa korosomi-DNA:n sisältävän kaistan alapuolelle leveän kaistan, joka aiheutuu oleellisesti lisääntyneestä plasmidikcpionäärästä.

Kokeissa käytettiin seuraavia materiaaleja ja menetelmiä

Bakteerikannat ja plasmidit: pBR322 ampr, tetr (Bolivar, F., et ai., Gene 2_, 95-113 (1 977) ) ; pBR329 ampr, chlr, tetr (Covarubbias, L., Bolivar, F., Gene, V7, 79-89 (1982)).

πνΧ- ja AN7-plasmidi-DNA-preparaatit valmistettiin seu-raavassa laitoksessa: Institute of Biochemistry, Biolo- 10 79552 gical .Research Centre of the Hungarian Academy of Sciences/ Szaged, Hungary (Seed, B., Nucleic Acids Research, 11, 2427-2446 (1983)).

Käytetyt restriktioendonukleaasipreparaatit, Teillä indusoidut polynukleotidikinaasipreparaatit ja polynuk-leotidiligaasipreparaatit valmistettiin laitoksessa the Institute of Biochemistry, Biological Research Centre of the Hungarian Academy of Sciences,Szeged, Hungary, käyttämällä julkaistuja puhdistusmenetelmiä (Roberts, R.J., Nucleic Acids Research JM_, r135-r1 37 ( 1 983); Murray, N.E. et ai., J. Mol. Biol. V32, 493-505 (1979); Panet, A. et al. , Biochemistry 1_2 , 5045-5050 (1 973)). DNA-polymeraasi I:n Klenow-palanen oli New England BioLabs'n tuote, kun taas bakteeriperäinen emäsfosfataasi (BAP) oli

Worthingtonin tuottama.

32 γ- P ATP:n (Hungarian Isotope Institute, Budapest) ominaisaktiivisuus oli 22 TBq/mM.

YTB-kasvualusta (Miller, J.H., ed., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)) sisälsi 10 g/1 Bacto Tryptonea (Difco) , 5 g/1 Bacto-hiivauutetta (Difco) ja 5 g /1 NaCl. YTA-levyjen valmistamiseksi YTB-kasvualustaan lisättiin 15 g/1 Bacto-agaria (Difco).

Plasmidi-DNA:n eristämistä varten kasvatettiin sopivan plasmidin sisältäviä bakteerikantoja HB101, C600 ja ED8800 YTB-kasvualustassa, joka sisälsi 100 yg/ml ampi-silliiniä (Pharmachim, Sofia). Ennen kunkin ei-pHC-plasmidin eristämistä lisättiin bakteeriviljelmiin OD600nm:n °H-essa O'7 " 170 yg/ml kloramfenikolia ja sen jälkeen viljelmiä ravisteltiin vielä 10-12 tuntia. Suuren kopiomäärän tuottavat plasmidit (pHC) eristettiin soluviljelmästä, joka oli kasvatettu stationäärivaihee-seen ilman vahvistusta. Eristettäessä plasmidi-DNA pre-paratiivisina määrinä (50 - 100 ml:sta bakteeriviljelmää, kun pHC-plasmidit olivat kyseessä, ja 1-3 litrasta viljelmää, kun muut johdannaiset olivat kyseessä) valmistettiin kirkas lysaatti menetelmällä Clewell ja Helinksi, li 11 79552 J. Bacteriol., 110/ 1135 (1972)) ja plasmidi-DNA puhdistettiin Sephacryl S1ΟΟ-pylväässä (Pharmacia). Plasmi-di-DNA:n eristämiseksi analyyttisiä tarkoituksia varten (1/0 - 1/5 ml:sta bakteeriviljelmää) käytettiin ka-liumasetaattimenetelmää, jonka Birnboim ja Doly ovat kehittäneet/ ja jota D. Ish-Horowich on muunnellut (Mani-atis, T. et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)).

DNA-näytteiden pilkkominen restriktioendonukleaaseil-la suoritettiin New England Biolabs'n suosittelemissa reaktio-olosuhteissa.

Jotta saataisiin DNA-jaksojen yksisäikeiset päät muutetuiksi tylppäpäisiksi, DNA pilkottiin restriktio-entsyymillä ja saostettiin alkoholilla ja liuotettiin sen jälkeen puskuriin, jossa oli 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 7 mM MgC^, 1 mM ditiotreitolia, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM TTP (lopputilavuus 10-20 mikrolitraa; DNA-väkevyys 200-250 yg/ml). Sitten liuosta inkuboitiin 15 minuuttia 37°C:ssa 1-2 yksikön kanssa DNA-polymeraasi I:n Klenow-palasta (Maniatis, T. et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)).

Reaktioseos (30-40 yl), jota käytettiin yksisäikeiset päät omaavien DNA-palasten yhteenliittämiseen, sisälsi 0,5 -1,0 g DNA:ta, 66 mM Tris-HCl (pH7,6), 5 mM MgC^, 5 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP ja 1 yksikön T^:llä indusoitua polynukleotidiligaasia. Yhteenliittäminen suoritettiin 14°C:ssa 2-3 tunnin aikana (Maniatis, T. et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)). Tylppäpäiset palaset liitettiin yhteen puskurissa, jossa oli 30-40 yg/ml DNA:ta, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgC^, 5 mM spermidiiniä, 1 mM ATP, 10 yg/ml BSA (Sigma, Type V). Reaktioseokseen lisättiin 4-6 yksikköä Teillä indusoitua polynukleotidiligaasia ja sitä inkuboitiin 8-12 tuntia 14°C:ssa (Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1982)).

12 79552 DNA-näytteiden geelielektroforeesi suoritettiin 0,8 - 2,O-prosenttisessa agaroosigeelissä (Sigma, Type I) horisontaalisessa elektroforeesi laitteessa noudattamalla menetelmää Helling et ai., J. Virol. _1_4, 1235 (1974). Polyakryyliamidigeelielektroforeesi (käyttämällä 1-prosenttista ja 8-prosenttisia, 1 mm paksuja pystysuoria geelejä) suoritettiin menetelmällä Maniatis et ai., Biochemistry 1_4' 3787-3794 (1975).

DNA-palasten erottamiseksi agaroosi- ja polyakryy-liamidigeeleistä käytettiin menetelmää Winberg et ai., Nucleic Acids Res. 8, 253-264 (1980)) ja DEAE-paperia.

Bakteerikannat HB101, C600 ja ED8800 tehtiin trans-formointikypsiksi ns. CaC^-menetelmällä, jota ovat selostaneet Mandel ja Higa, J. Mol. Biol., 5_3, 1 54 (1 970).

DNA-palasten 5'-päiden defosforylointi ja merkkaa- 32

minen polynukleotidikinaasilla ja γ- P ATP:llä ja emäsjärjestyksen määrittäminen suoritettiin menetelmällä Maxam and Gilbert, Methods Enzymol. 6_5, 499 (1977) J

Erityisen edullisia keksinnönmukaisia plasmideja ovat sellaiset suuren kopiomäärän tuottavat plasmidi-vektorit, joissa on sama replikoitumisalue kuin pBR322: ssa, G-^*T-pistemutaatio siinä geenissä , joka koodittaa replikoitumisen tukahduttajana toimivaa pientä RNA:ta, ja a) jossa valintamerkkirä on pBR322:n ampisilliinivastustuskyky-geeni, ja joista tetrasykliininvastustuskykygeeni puuttuu tai on inaktivoitunut, tai b) jotka sisältävät plasmidin pBR322 ampisilliinivastus-tuskykygeenin ja tetrasykliininvastustuskykygeenin geneettisinä valintamerkkeinä, mutta tetrasykliininvas-tustuskykygeenin transkriptio tapahtuu mutantista, joka on heikompi kuin alkuperäinen, tai vieraasta pro-mootterista lähtien.

Kuvien 3, 4 ja 5 esittämät plasmidit ovat edullisia keksinnönmukaisia suuren kopiomäärän tuottavia plasmideja ja niillä on seuraavat luonteenomaiset ominaisuudet: li 13 79552 1. Koska siinä geenissä, joka koodittaa repli-koitumisen repressorina toimivaa pienimolekyylistä RNA:ta, on tapahtunut muutos, ei plasmidien replikoituminen enää tukahdu ja näin ollen kopiomäärä solun sisällä kasvaa huomattavasti ollen noin 1000 kpl (noin 65 % solun koko-nais-DNA-määrästä). Tällä kopiomäärällä ei ole mitään vaikutusta isäntäsoluina käytettyihin E. coli-soluihin.

2. Tämän sarjan plasmidit sisältävät tunnistuskoh-tia useille restriktioendonukleaaseille, ja näin ollen näillä entsyymeillä tai niiden, yhdistelmillä tai muilla samoja päitä tuottavilla endonukleaaseilla pilkottuja DNA-palasia voidaan helposti liittää näihin plasmidei-hin.

Keksinnönmukaisten edullisten plasmidien sopivat kloonauskohdat ovat seuraavat: pHC314: Clal, Hindlll, Xbal, BamHI, Bglll ja näiden kohtien mahdolliset yhdistelmät; pHC312: Clal, Hindlll, Xbal, Bglll, EcoRI ja näiden koh tien mahdolliset yhdistelmät; pHC624: EcoRI, Hindlll, BamHI, Xbal, Bglll, Smal (Xmal),

Sali ja näiden yhdistelmät eräin rajoituksin.

3. Edullisten pHC-plasmidien koko on huomattavasti pienempi kuin lähtöplasmidin pBR322 koko; kuviin 3, 4 ja 5 merkittyjen plasmidien koot ovat 2405 bp, 2010 bp ja 2015 bp. Tämä on edullista, koska useimpien solujen sisällä olevien vektoriplasmidien kopiomäärä on kääntäen verrannollinen plasmidin kokoon. Geenien kloonauskokeis-sa voidaan tehokkaasti kloonata sitä suurempi geeni, mitä pienempää vektoria käytetään.

4. Näissä plasmideissa on valintamerkkinä alkuperäisen pBR322:n ampisilliininvastustuskykygeeni.

5. Ne sisältävät alkuperäisen pBR322:n replikoi-tumisen alkukohdan.

Edelleen keksintö tarjoaa menetelmän suuren kopio-määrän tuottavien plasmidivektorien valmistamiseksi siten, että geenialueeseen, joka aiheuttaa plasmidin 14 79552 replikoitumisen repressorin tuotannon, saadaan aikaan mutaatio, joka muuntaa repressorituotantoa.

Keksinnönmukaisen menetelmän edullisessa toteutustavassa aiheutetaan pistemutaatio, joka muuntaa repressorin tuotantoa geenialueessa, joka koodittaa repressori-RNAzta pBR322:n johdannaisessa tai missä tahansa plasmi-dissa, jolla on sama replikoitumisalue, ja plasmidissa on tetrasykliininvastustuskykygeeni inaktivoitunut tai toiminnaltaan heikentynyt, ja haluttaessa tetrasykliinin-vastustuskyvyn antavan kalvoproteiinin tuotannosta vastuussa oleva DNA-jakso korvataan synteettisellä sidoksen-muodostaja-DNA:11a yhdessä tai useammassa vaiheessa.

Kuten edellä mainittiin, on mutaatio mielellään G->T-pistemutaatio asemassa 3074, kun noudatetaan alkuperäistä pBR322:n numerointia.

Tarjolla on useita vaihtoehtoisia tapoja, joilla voidaan poistaa tetrasykliininvastustuskyvyn aiheuttama ongelma. Erään vaihtoehdon mukaan tetrasykliininvastustuskyvyn aikaansaavan kalvoproteiinin tuotannosta vastaava DNA-jakso korvataan synteettistä alkuperää olevalla sidoksenmuodostaja-DNA:11a, joka voidaan katkaista yhdellä tai useammalla tärkeällä restriktioentsyymillä. Eräs mahdollisuus on liittää tetrasykliininvastustuskyky-geeniin vieras DNA-jakso, joka inaktivoi geenin toiminnan. Vielä eräs mahdollisuus on heikentää tetrasyklii-nigeenin transkriptiota aiheuttamalla mutaatio promoottorialueeseen tai korvaamalla luontainen promoottori "vieraalla" promoottorilla, joka heikentää transkription intensiteettiä .

Keksinnönmukaisilla suuren kopiomäärän tuottavilla vektoriplasmideilla on erilaisia käyttömahdollisuuksia, kuten minkä tahansa kloonatun jakson tai koko yhdistelmä-plasmidin tuottaminen puhtaassa muodossa, vertailukokeet, rakenteen toteaminen, muuntaminen, transkloonaus jne. Keksinnönmukaisia plasmideja käytettäessä voidaan sama DNA-määrä saada huomattavasti pienemmästä lähtöai-nemäärästä kuin käytettäessä tavallisia, kirjallisuu-

II

15 79552 desta tunnettuja plasmideja. Esimerkiksi pHC-plasmidien kohdalla tarvitaan noin 20 - 30 kertaa vähemmän lähtöainetta saman DNA-määrän tuottamiseen kuin pBR322-plas-midia. Plasmidi-DNA, joka voidaan eristää yhdestä pHC-plasmideja kantavasta bakteeripesäkkeestä, riittää 3-4 restriktioanalyysin suorittamiseen. Yhdestä litrasta bakteeriviljelmää voidaan ersitaä yli 10 mg puhdasta plasmidia.

Jos isäntäsolu sietää kloonatun geenin tuotteen kasvaneen määrän, voidaan minkä tahansa geneettisen tuotteen synteesiä lisätä käyttämällä keksinnönmukaisia pHC-plasmideja. Optimaalisessa tapauksessa saanto kasvaa noin 20- - 30-kertaiseksi, koska tämä geenikopioiden kasvu voidaan saavuttaa. Tietyissä tapauksissa voi määrä muista rajoittavista tekijöistä johtuen olla hieman pienempi.

Sidoksenmuodostajien liittäminen plasmideihin Iisaa niiden soveltuvuutta eri tarkoituksiin. Jos tarjolla olevat katkaisukohdat eivät ole sopivia kloonattavalle geenille, ne voidaan korvata tai tehdä kloonaukseen sopiviksi synteettisten sidoksenmuodostajajaksojen avulla .

Mitä teollisiin sovellutuksiin tulee, on mainitta va esim. insuliini ja vasopressiini.

Mainittujen teknisten ratkaisujen lisäksi voidaan keksintö toteuttaa lukuisilla muilla tavoilla. Esimerkiksi käyttämällä entsyymejä Fnu 4HI ja Tthill voidaan alkuperäisestä pBR322:sta poistaa vastaavat 21 ja 32 nukleotidia sisältävät DNA-jaksot ja vastaavat G->T-pistemutaation sisältävät jaksot voidaan syntetisoida kemiallisesti ja liittää pBR322-molekyyliin eliminoitujen jaksojen tilalle.

Vastaavasti voidaan mitä erilaisimpia synteettisiä sidoksenmuodostaja-DNA-jaksoja liittää molekyyliin tetra-sykliininvastustuskykygeenin paikalle, joka on poistettu ie 79552 kokonaan tai osittain.

Nämä ja samanlaiset ratkaisut ja näillä menetelmillä saadut plasmidit kuuluvat keksinnön kattamaan alaan.

Plasmidit pHC 312, pHC 314 ja pHC624 on taltioitu kokoelmaan National Collection of Microorganisms (OKI, Hungary) numeroilla 00279, 00280 ja 00281 vastaavasti, 7. maaliskuuta 1984.

Seuraavassa luetellut mikrobikannat ja plasmidit taltioitiin kokoelmaan National Collection of Microorganisms (OKI, Hungary) 25. heinäkuuta 1984 seuraavilla numeroilla: E. coli H3 101 00290 E. coli ED 8800 00291 E. coli C 600 00292 p 715 00293 pHC 1 00294 pHC 81 00295 π AN7 00296 ti VX 00297

Claims (6)

1. Suuren kopiomäärän tuottavat plasmidivektorit, tunnetut siitä, että niissä on sama replikoitumis-alue kuin pBR322:ssa ja niissä on siinä geenialueessa, joka aikaansaa plasmidin replikoitumisen tukahduttavan represso-rin tuotannon, repressorin tuotantoa muuntava mutaatio transkriptoriterminaalissa, ja a) valintamerkkinä on plasmidin pBR322 ampisilliinin-vastustuskykygeeni, ja mainituissa plasmidivektoreissa on tetrasykliininvastustuskykygeeni inaktivoitunut tai puuttuu kokonaan tai sen toiminta on alentunut, tai b) ne sisältävät geneettisinä valintamerkkeinä plasmidin pBR322 ampisilliinvastustuskykygeenin ja tetrasykliinin-vastustuskykygeenin, mutta mainituissa plasmidivektoreissa tapahtuu tetrasykliininvastustuskykygeenin transkriptio luontaista heikommasta mutantista tai vieraasta promootte-rista lähtien.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset plasmidivektorit, tunnetut siitä, että niissä on G->T pistemutaatio siinä geenissä, joka koodittaa replikoitumisen tukahduttajana toimivaa pientä RNA:ta.

3. Plasmidivektorit, tunnetut siitä, että ne ovat pHC 314 (00280, OKI, Unkari), pHC 312 (00279, OKI, Unkari) ja pHC 624 (00281, OKI, Unkari).

4. Menetelmä suuren kopiomäärän tuottavien plasmidivekto-rien tuottamiseksi plasmideista, joissa on sama replikoitu-misalue kuin pBR322:ssa, tunnettu siitä, että siinä geenialueessa, joka aikaansaa plasmidin replikoitumisen tukahduttavan repressorin tuotannon, aiheutetaan repressorin tuotantoa muuntava mutaatio transkriptoriterminaalissa.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että pBR322:ssa, jossa tetrasykliininvastustus-kykygeeni on inaktivoituneessa muodossa tai toimintakyvyl- ib 79552 tään alentuneessa muodossa, repressori-RNA:ta koodittavassa geenialueessa aiheutetaan pistemutaatio, joka muuntaa rep-ressorituotantoa ja haluttaessa tetrasykliininvastustuskyvyn antavan kalvoproteiinin tuotannosta vastuussa oleva DNA-jakso korvataan synteettisellä sidoksenmuodostaja- DNA:11a yhdessä tai useammassa vaiheessa.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aiheutetaan G->T pistemutaatio asemaan 3074 repressori-RNA:ta koodittavassa geenialueessa, kun noudatetaan pBR322:n alkuperäistä numerointia. li 19 79552