SU1443806A3 - Способ конструировани плазмидного вектора рНС314 или рНС312, или рНС624 - Google Patents

Способ конструировани плазмидного вектора рНС314 или рНС312, или рНС624 Download PDF

Info

Publication number
SU1443806A3
SU1443806A3 SU843792252A SU3792252A SU1443806A3 SU 1443806 A3 SU1443806 A3 SU 1443806A3 SU 843792252 A SU843792252 A SU 843792252A SU 3792252 A SU3792252 A SU 3792252A SU 1443806 A3 SU1443806 A3 SU 1443806A3
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
dna
plasmid
recombinant
copies
fragments
Prior art date
Application number
SU843792252A
Other languages
English (en)
Inventor
Борош Имре
Венетианер Пал
Пошфаи Дьердь
Original Assignee
Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр Рт (Инопредприятие)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр Рт (Инопредприятие) filed Critical Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр Рт (Инопредприятие)
Application granted granted Critical
Publication of SU1443806A3 publication Critical patent/SU1443806A3/ru

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69Increasing the copy number of the vector
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , генной инженерии, а более конкретно к способу получени  плаз- мидных векторов. Целью изобретени   вл етс  конструирование плазмидных векторов на основе pBR322, которые обладают большим числом копий на клетку, чем известные и широко не- . пользуемые векторы. Плазмидные векторы рНС314, рНС312 и рНС624 обладают большим числом копий за. счет того , что в гене, ответственном за продуцирование репрессора плазмидной репликации, получена мутаци  типа замены в положении 3074 участ|):а гена. (У)

Description

CN
15
20
25
114А3806
Изобретение относитс  к биотехнологии , генной инженерии, а более конкретно к способу получени  плаз- мидных векторов.
Цель изобретени  - конструирование плазмидных векторов на основе pBR322, которые обладают большим числом копий на клетку нежели извес .- ные и широко используемые векторы, Q
Плазмидные векторы рНС314, рНС312 И рНСб24 обладают большим числом копий за счет того, что в гене, ответственном за продуцирование реп- рессора плазмидной репликации, лучена мутаци .
Пример. Плазмйдную рНС1 расщепл ют рестрикционными эндонук™ леазами EcoR1 и Pru 11, а затем од нот жевые концы дополн ют субфрагментом Кленова фермента ДЖ полиме- разы I в присутствии dTP субстратов, У полученных таким образом молекул ДНК с тупьпми концами восстанавливают кольцевую структуру ДНК ли- газой ТА и трансформируют, в НВ101 клетки. Из колоний, растущих на содержащей ампициллин среде, вьщел ют плазмидную ДНК и ДНК-образцы, которые анализируют с помощью агарозного и полиакриламидного гельэлектрофо- реза после переваривани  с рестрикционными эндонуклеазамиЕсоК1 , PVU 1.1 и BspPI. На основании полного молекул рного веса плазмиды (2,3 kb) и размера фрагментов, полученных при расщеплении BspP1 (587; 457,- 434j 267; 240j 80 bp) устанавливают, что плазмида рНС81 содержит участок между нуклеотидами 2069 и 2 плазмиды Q рВЮ22 с мутацией, ответственной за высокое число копий.
Вьщел ют фрагмент ДНК размером 1030 вр, полученный расщеплением . рНС81 рестрикционными эндонуклеазами Pst1 и Tag 1, фрагмент ДНК размером 780 вр, полученный расщеплением pBR322 ферментами Pst и С1а1, и фрагмент ДНК размером 218 вр. полученный расщеплением pBR329 ферментом Tag. 1 . Три полученных .фрагмента ДНК смешивают в эквийол рном соотношении, сшивают ДНК лигазой, а клетки НВ101 трансформируют лигатом. Из отдельных слонов, выращенных на содержащей ампициллин среде, выдел ют плазмидную ДНК. Эти плазмиды обладает фенотипом большого числа копий. Рас- : щепл   плазмидные ДНК рестрикционны30
35
50
55
е
ю л с и э н а
т  п
5
0
5
Q
Q
0
5
0
5
ми эндонуклеазами, устанавливают, что они были получены путем св зывани  трех хорошо различных фрагментов различного происхождени . В этих плазмидах проксимальна  часть. /з - лактамазного гена была получена из pBR322, участок ответственный за репликацию - из плазмиды pBR322, а фрагмент, выделенный из pHCBI, содержал кроме дистальной части - лактамазного гена также мутацию, привод щую к высокому числу копий. Следовательно, мутаци  образовыва- етс  между нуклеотидами-2573 (tagi) и 3612 (Pst1) ДНК плазмиды pBR322. Опередел ют нуклеотидную последовательность этого участка и сравнивают с известной последовательностью pBR322. В результате этого сравнени  устанавливают замену в положении 4074 гена.
Как результат образовавшейс  точечной мутации окончание транскрипции репрессорной РНК нарушаетс  и происходит синтез РНК большего молекул рного веса, котора  уже не может более функционировать как реп- рессор репликации. Окончание репрессорной функхщи приводит к большому числу копий. За счет этой спонтанной точечной мутации число копий плазмиды в клетке можно повысить в 20-30 раз (примерно 1000) по отношению к исходному значению. За счет этой точечной,мутации число копий любой плазмиды с тем же участком репликации, что и pBR322, можно существенно увеличить.
E.coli НВ101 клетки трансформируют плазмидой . Выдел ют плазми- ду ДНК и анализируют с помощью гель- электрофореза после расщеплени  EcoRI и Psti рестрикционными эндонуклеазами . Дл  дальнейших исследований отбирают плазмиду, которую можно расщепить на фрагменты 2300 и 110 вр с помощью EcoRl и на фрагменты 1580 и 820 вр с.помощью Psti (рНС314). Плазмиду расщепл ют рестрикционной эндонуклеазой Baralll и полученную линейную молекулу частично расщепл ют ферментом Hinf1, Фрагменты ДНК размером 2010. вр вьщел ют в 1,2%-ном агарозном геле.
Концы молекульц содержащей одно- т жевые участки, полученные при расщеплении ферментами BamHl и Hinfl, превращают в тупые концы субфрагмен31443806
том Клеиова с помощью ДНК полиме- разы 1,а затем рециркул ризируют Т индуцированной полинуклеотидной лигазой. Легированные ДНК трансформируют в клетки ИВ 101 и выдел ют единичные колонии. Получают плазмиду рНС312, которую нельз  расщепить эндонуклеазой ВатН1, но можно линеарадиоактивности в вьщелейных плазмид- ных ДНК и в хромосомных ДНК. Этим способом число копий плазмид одинакового размера с рНС314 (МБ 1,6 к 10 д) составл ло около 1000 на клетку (мол. вес хромосомы 2-10 д) От 60 до 65% полного содержани  ДР1К клетки составл ет плазмвдна  ДНК.
ризировать EcoRI и получить фрагменты д Дл  мечени  ДНК in vivo клетки,
1495 вр и Ь1Ь вр после расщеплени  Hinf1, Дл  получени  вектора с большим числом копий подход щего дл  клонировани  ДНК фрагментов с тупыми концами, плазмиду рНС312 расщепл ют рестрикционными эндонуклеазами EcoR1 и Ilinflll, а затем из агарозно- го гел  выдел ют фрагмент 1980 вр. Этот фрагмент смешивают с ДНК плаз- миды IIAN7, расщепленной ферментами 20 EcoRI и Hinf111, и св зывают молекулы полинуклеотидной лигазой. Клетки E.coli НВ101 трансформируют легированной плазмидой и из единичных бактериальных колоний, устойчивых к Amp, вьщел ют плазмидную ДНК. Плаз- мидна  ДНК, полученна  таким образом (РНС624), не имеет С1а1 сайта, но в отличие от плазмидной рНСЗ12 ее можно разрезать рестрикционными эндонуклеазами Smal, Sail и БатН1.
Пример 2. Дл  определени  относительного числа копий рНС плазмид выращивают E.coli НВ101 культуры, содержащие плазмиды различных разме- ров, полученные из рекомбинантных pBR322 и производных с большим числом копий того ж ё размера до достижени  идентичной плотности клеток. Из
содержащие плазмиды, культивируют на М9 культуральной среде, дополн ной следующими компонентами: 0,5% казаминовой кислоты (Difco); 0,5%
15 ГЛЮКОЗЫ} 1 мкг/мл витамина В,; 2 ммоль MgS04, 2 мкг/мл тимидина 250 мкг/мл аденозина и 0,4 MBg/мл (Н-тимидина) 888 Bg/молъ (Хемапол Прага).
Клетки, содержащие плазмиды, ра щепл ют . Хромосомные и плазмидные ДНК отдел ют друг от друга градие ным центрифугированием с этидиум- бромцц(цезий)хлоридом в равновесно
25 плотности клеточного лизата, полу ченного из бактериальной суспензи выросшей на 2 мл/ОД 5о 4-5 (45000 об/мин, 40 ч, ).
Плазмидные векторы рНС312, рНС3
30 и рНСб24 07.03.84 г. депонированы в Национальной Коллекции Микроорга низмов (OKI, Венгри ) под кодом № 00279, 00280 и 00281 соответстве но.

Claims (1)

  1. Формула изобретени
    Способ конструировани  плазмид ного вектора рНС314 или рНС312,
    идентичных количеств полученных сус- -jo или рНС624, заключающийс  в том, что
    пензий без амплификации выдел ют плазмрщную ДНК. Образцы, вз тые из препаратов ДНК, подвергают электро- форетической обработке на агарозном геле в 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 40- и 50-кратном разбавлении соответственно . Плазмиды с большим количеством копий и их пары с нормальным числом копий (того же молекул рного веса) исследуют одновременно. Ре- gQ МИДУ pHCBI, котора  содержит точечную мутацию G Т в положении 3074 участка гена, кодирующего репрессор- ную ДНК, далее ДНК плазмиды рН081 обрабатывают эндонуклеазой EcoRI, gg дефосфорилируют щелочной фосфатазой и сшивают с EcoRI фрагментом плазмн- ды nVX, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют щтамм E.coli НВ101, отбирают amp колонии, из них
    зультаты экспериментов показьтают, что число копий рНС плазмид в 20 - 30 раз больше, чем число соответствующих pHBR322 производных с нор« мальным числом копий.
    Пример 3. Абсолютное число копий рНС плазмид определ ют путем мечени  ДНК клеток, содержащих плазмиды in vivo и измерени  отношени 
    содержащие плазмиды, культивируют на М9 культуральной среде, дополненной следующими компонентами: 0,5% казаминовой кислоты (Difco); 0,5%
    ГЛЮКОЗЫ} 1 мкг/мл витамина В,; 2 ммоль MgS04, 2 мкг/мл тимидина 250 мкг/мл аденозина и 0,4 MBg/мл (Н-тимидина) 888 Bg/молъ (Хемапол, Прага).
    Клетки, содержащие плазмиды, расщепл ют . Хромосомные и плазмидные ДНК отдел ют друг от друга градиентным центрифугированием с этидиум- бромцц(цезий)хлоридом в равновесной
    плотности клеточного лизата, полученного из бактериальной суспензии, выросшей на 2 мл/ОД 5о 4-5 (45000 об/мин, 40 ч, ).
    Плазмидные векторы рНС312, рНС314
    и рНСб24 07.03.84 г. депонированы в Национальной Коллекции Микроорганизмов (OKI, Венгри ) под кодом № 00279, 00280 и 00281 соответственно .
    Формула изобретени 
    Способ конструировани  плазмид- ного вектора рНС314 или рНС312,
    плазмидную ДНК рНС1 расщепл ют рет- рикционными эндонуклеазами EcoRI и PruII, затупл ют концы с помощью субфрагмента Кленова ДНК полимера- 45 зы I в присутствии dNTP, восстанавливают кольцевую структуру ДНК с помощью ДНК лигазы Т и трансформи- руют штамм бактерий Escherichia coli° НВ101, из amp клонов выдел ют плазвыдел ют плазмидную ДНК, расщепл ют E.coRI и PstI эндонуклеазами и отбирают рНС314, котора  может быть расщеплена на фрагменты размерам 2300 и 100 kb к на PstI фрагменты ра.змером 1580 и 820 kb, далее рекомбинантную пйазмвдную ДНК рСН314 в случае конструировани  рНС312 расщепл ют Ват HI эндонуклеазой, полученную линейную ДНК частично гидролизуют Hinfl эндонуклеазой, выдел ют фрагмент размером 2010 kb, восстанавливают кольцевую структуру ДНК, трансформируют штамм E.coli НВ101 данной ре комбинантной ДНК и отбирак)Т рекомбинантную плазмидную ДНК рНС312, со
    держащую E.coRI и Hinfl сайты рестрикции и образующую фрагменты размером 1495 и 516 kb после расщеплени  эндонуклеазами E.coRI и Hinfl плазмиду рНС312,, в случае конструировани  рНС624 расщепл ют E.coRI и Hind111 эндонуклеазами и выдел ют фрагмент 1980 kb, смешивают с расщепленной ферментами E.coRI и Hindlll ДНК плазмиды ПАЫ, фрагменты сшивают ДНК лигазой Тф, трансформируют штамм бактерий E.coli НВ101, полученной плазмидой и из агар клонов отбирают рекомбинантную плазмидную ДНК рНСб24, содержащую Sraal, Sail и BamHI сайты.
SU843792252A 1983-09-16 1984-09-14 Способ конструировани плазмидного вектора рНС314 или рНС312, или рНС624 SU1443806A3 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU833212A HU194307B (en) 1983-09-16 1983-09-16 Process for producing plasmidvectors of high copy number

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1443806A3 true SU1443806A3 (ru) 1988-12-07

Family

ID=10963133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU843792252A SU1443806A3 (ru) 1983-09-16 1984-09-14 Способ конструировани плазмидного вектора рНС314 или рНС312, или рНС624

Country Status (20)

Country Link
US (1) US4703012A (ru)
JP (1) JPS60156389A (ru)
AT (1) AT384031B (ru)
AU (1) AU578041B2 (ru)
BE (1) BE900570A (ru)
CA (1) CA1275631C (ru)
CH (1) CH667672A5 (ru)
DE (1) DE3434041A1 (ru)
DK (1) DK439784A (ru)
FI (1) FI79552C (ru)
FR (1) FR2552102B1 (ru)
GB (1) GB2148301B (ru)
HU (1) HU194307B (ru)
IL (1) IL72952A (ru)
IT (1) IT1178510B (ru)
NL (1) NL8402846A (ru)
PL (1) PL152527B1 (ru)
SE (1) SE463266B (ru)
SU (1) SU1443806A3 (ru)
ZA (1) ZA847273B (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0219814B1 (en) * 1985-10-21 1991-09-11 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Process for production of isulin-like growth factor i and plasmid for production thereof
DE4136389A1 (de) * 1991-03-18 1992-10-08 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von glutarylacylase in grossen mengen
JPH06327480A (ja) * 1993-05-20 1994-11-29 Mitsubishi Petrochem Co Ltd プラスミドの自律複製を司る機能に関与する遺伝子を含むdna断片
US20040259252A1 (en) * 2001-07-18 2004-12-23 Sanders Mitchell C. Vector containing an enhanced p15a origin of replication
WO2006081529A2 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Nature Technology Corp. Compositions and processes for improved plasmid dna production
CA2622710C (en) * 2005-09-16 2016-10-18 Monsanto Technology Llc Hybrid portable origin of replication plasmids
UA100692C2 (ru) 2007-05-02 2013-01-25 Мериал Лимитед Днк-плазмиды, имеющие повышенную экспрессию и стабильность

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2759053A1 (de) * 1977-12-30 1979-07-12 Uhlin Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns
FI793884A (fi) * 1978-12-26 1980-06-27 Cetus Corp Stabila plasmider med stort kopieantal
CA1198067A (en) * 1981-02-27 1985-12-17 David H. Gelfand Stable high copy number plasmids
CA1209501A (en) * 1982-09-16 1986-08-12 Nikos Panayotatos Expression vector
GB8308236D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Dna vectors
EP0126166B1 (en) * 1983-05-11 1990-01-31 Fina Research S.A. Cloning vectors comprising a restriction site bank and the construction thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nesvera S., Hochannova S. Jsola- tion and characterization of, hingber copy number mutant of plastnid PGK. - Folia microbiol. 1983, v. 28, № 5, p. 345-352. *

Also Published As

Publication number Publication date
FI79552C (fi) 1990-01-10
IT1178510B (it) 1987-09-09
PL249593A1 (en) 1985-07-16
CA1275631C (en) 1990-10-30
AU3307784A (en) 1985-03-21
IL72952A (en) 1990-11-05
GB2148301B (en) 1988-05-11
HUT35280A (en) 1985-06-28
ZA847273B (en) 1986-01-29
JPS60156389A (ja) 1985-08-16
FR2552102A1 (fr) 1985-03-22
IT8422677A0 (it) 1984-09-14
GB8423161D0 (en) 1984-10-17
FI843600L (fi) 1985-03-17
DK439784D0 (da) 1984-09-14
US4703012A (en) 1987-10-27
SE8404637L (sv) 1985-03-17
IL72952A0 (en) 1984-12-31
FR2552102B1 (fr) 1987-09-18
SE463266B (sv) 1990-10-29
AT384031B (de) 1987-09-25
HU194307B (en) 1988-01-28
ATA293584A (de) 1987-02-15
AU578041B2 (en) 1988-10-13
FI843600A0 (fi) 1984-09-14
GB2148301A (en) 1985-05-30
DE3434041A1 (de) 1985-09-12
FI79552B (fi) 1989-09-29
DK439784A (da) 1985-03-17
BE900570A (fr) 1985-03-13
NL8402846A (nl) 1985-04-16
CH667672A5 (de) 1988-10-31
PL152527B1 (en) 1991-01-31
SE8404637D0 (sv) 1984-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kodaira et al. The dnaX gene encodes the DNA polymerase III holoenzyme τ subunit, precursor of the γ subunit, the dnaZ gene product
Collis et al. Gene cassettes from the insert region of integrons are excised as covalently closed circles
Nurse et al. Inactivation of the Escherichia coli priA DNA replication protein induces the SOS response
Khosla et al. The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotide sequence and genetic expression in Escherichia coli
Kollek et al. Isolation and characterization of the minimal fragment required for autonomous replication (“Basic replicon”) of a copy mutant (pKN 102) of the antibiotic resistance factor R1
Iida et al. DNA restriction—modification genes of phage P1 and plasmid p15B: Structure and in vitro transcription
Horinouchi et al. Construction and application of a promoter-probe plasmid that allows chromogenic identification in Streptomyces lividans
Young et al. Amplification of the respiratory NADH dehydrogenase of Escherichia coli by gene cloning
Smith Characterization of Bacteroides ovatus plasmid pBI136 and structure of its clindamycin resistance region
Chow et al. The overproduction of DNA terminase of coliphage lambda
Berman et al. Selection of lac gene fusions in vivo: ompR-lacZ fusions that define a functional domain of the ompR gene product
Linder et al. An essential replication gene, repA, of plasmid pSC101 is autoregulated
US5726039A (en) Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures
Jones et al. In vivo 5'terminus and length of the mRNA for the proton-translocating ATPase (unc) operon of Escherichia coli
SU1443806A3 (ru) Способ конструировани плазмидного вектора рНС314 или рНС312, или рНС624
EP0195303B1 (en) Plasmid vectors for expression in escherichia coli and/or bacillus subtilis
Müller et al. Characterization of the Salmonella typhimurium mgl operon and its gene products
EP0040963A2 (en) Plasmid
JP3696247B2 (ja) 組換えタンパク質、プラスミド及び修飾細胞を生産するためのプロセス
Byström et al. The structural gene (trmD) for the tRNA (m1G) methyltransferase is part of a four polypeptide operon in Escherichia coli K-12
Sako et al. Coordinate expression of Escherichia coli dnaA and dnaN genes
Asada et al. Structure of replication origin of the Escherichia coli K-12 chromosome: the presence of spacer sequences in the orl region carrying information for autonomous replication
GB2253852A (en) Vectors incorporating inducible selection genes
EP0187630B1 (en) Cloned streptomyces beta-galactosidase promoter fragment
Ritzenthaler et al. Use of in vitro gene fusions to study the uxuR regulatory gene in Escherichia coli K-12: direction of transcription and regulation of its expression