SU1443806A3 - Способ конструировани плазмидного вектора рНС314 или рНС312, или рНС624 - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , генной инженерии, а более конкретно к способу получени  плаз- мидных векторов. Целью изобретени   вл етс  конструирование плазмидных векторов на основе pBR322, которые обладают большим числом копий на клетку, чем известные и широко не- . пользуемые векторы. Плазмидные векторы рНС314, рНС312 и рНС624 обладают большим числом копий за. счет того , что в гене, ответственном за продуцирование репрессора плазмидной репликации, получена мутаци  типа замены в положении 3074 участ|):а гена. (У)

Description

CN

15

20

25

114А3806

Изобретение относитс  к биотехнологии , генной инженерии, а более конкретно к способу получени  плаз- мидных векторов.

Цель изобретени  - конструирование плазмидных векторов на основе pBR322, которые обладают большим числом копий на клетку нежели извес .- ные и широко используемые векторы, Q

Плазмидные векторы рНС314, рНС312 И рНСб24 обладают большим числом копий за счет того, что в гене, ответственном за продуцирование реп- рессора плазмидной репликации, лучена мутаци .

Пример. Плазмйдную рНС1 расщепл ют рестрикционными эндонук™ леазами EcoR1 и Pru 11, а затем од нот жевые концы дополн ют субфрагментом Кленова фермента ДЖ полиме- разы I в присутствии dTP субстратов, У полученных таким образом молекул ДНК с тупьпми концами восстанавливают кольцевую структуру ДНК ли- газой ТА и трансформируют, в НВ101 клетки. Из колоний, растущих на содержащей ампициллин среде, вьщел ют плазмидную ДНК и ДНК-образцы, которые анализируют с помощью агарозного и полиакриламидного гельэлектрофо- реза после переваривани  с рестрикционными эндонуклеазамиЕсоК1 , PVU 1.1 и BspPI. На основании полного молекул рного веса плазмиды (2,3 kb) и размера фрагментов, полученных при расщеплении BspP1 (587; 457,- 434j 267; 240j 80 bp) устанавливают, что плазмида рНС81 содержит участок между нуклеотидами 2069 и 2 плазмиды Q рВЮ22 с мутацией, ответственной за высокое число копий.

Вьщел ют фрагмент ДНК размером 1030 вр, полученный расщеплением . рНС81 рестрикционными эндонуклеазами Pst1 и Tag 1, фрагмент ДНК размером 780 вр, полученный расщеплением pBR322 ферментами Pst и С1а1, и фрагмент ДНК размером 218 вр. полученный расщеплением pBR329 ферментом Tag. 1 . Три полученных .фрагмента ДНК смешивают в эквийол рном соотношении, сшивают ДНК лигазой, а клетки НВ101 трансформируют лигатом. Из отдельных слонов, выращенных на содержащей ампициллин среде, выдел ют плазмидную ДНК. Эти плазмиды обладает фенотипом большого числа копий. Рас- : щепл   плазмидные ДНК рестрикционны30

35

50

55

е

ю л с и э н а

т  п

5

0

5

Q

Q

0

5

0

5

ми эндонуклеазами, устанавливают, что они были получены путем св зывани  трех хорошо различных фрагментов различного происхождени . В этих плазмидах проксимальна  часть. /з - лактамазного гена была получена из pBR322, участок ответственный за репликацию - из плазмиды pBR322, а фрагмент, выделенный из pHCBI, содержал кроме дистальной части - лактамазного гена также мутацию, привод щую к высокому числу копий. Следовательно, мутаци  образовыва- етс  между нуклеотидами-2573 (tagi) и 3612 (Pst1) ДНК плазмиды pBR322. Опередел ют нуклеотидную последовательность этого участка и сравнивают с известной последовательностью pBR322. В результате этого сравнени  устанавливают замену в положении 4074 гена.

Как результат образовавшейс  точечной мутации окончание транскрипции репрессорной РНК нарушаетс  и происходит синтез РНК большего молекул рного веса, котора  уже не может более функционировать как реп- рессор репликации. Окончание репрессорной функхщи приводит к большому числу копий. За счет этой спонтанной точечной мутации число копий плазмиды в клетке можно повысить в 20-30 раз (примерно 1000) по отношению к исходному значению. За счет этой точечной,мутации число копий любой плазмиды с тем же участком репликации, что и pBR322, можно существенно увеличить.

E.coli НВ101 клетки трансформируют плазмидой . Выдел ют плазми- ду ДНК и анализируют с помощью гель- электрофореза после расщеплени  EcoRI и Psti рестрикционными эндонуклеазами . Дл  дальнейших исследований отбирают плазмиду, которую можно расщепить на фрагменты 2300 и 110 вр с помощью EcoRl и на фрагменты 1580 и 820 вр с.помощью Psti (рНС314). Плазмиду расщепл ют рестрикционной эндонуклеазой Baralll и полученную линейную молекулу частично расщепл ют ферментом Hinf1, Фрагменты ДНК размером 2010. вр вьщел ют в 1,2%-ном агарозном геле.

Концы молекульц содержащей одно- т жевые участки, полученные при расщеплении ферментами BamHl и Hinfl, превращают в тупые концы субфрагмен31443806

том Клеиова с помощью ДНК полиме- разы 1,а затем рециркул ризируют Т индуцированной полинуклеотидной лигазой. Легированные ДНК трансформируют в клетки ИВ 101 и выдел ют единичные колонии. Получают плазмиду рНС312, которую нельз  расщепить эндонуклеазой ВатН1, но можно линеарадиоактивности в вьщелейных плазмид- ных ДНК и в хромосомных ДНК. Этим способом число копий плазмид одинакового размера с рНС314 (МБ 1,6 к 10 д) составл ло около 1000 на клетку (мол. вес хромосомы 2-10 д) От 60 до 65% полного содержани  ДР1К клетки составл ет плазмвдна  ДНК.

ризировать EcoRI и получить фрагменты д Дл  мечени  ДНК in vivo клетки,

1495 вр и Ь1Ь вр после расщеплени  Hinf1, Дл  получени  вектора с большим числом копий подход щего дл  клонировани  ДНК фрагментов с тупыми концами, плазмиду рНС312 расщепл ют рестрикционными эндонуклеазами EcoR1 и Ilinflll, а затем из агарозно- го гел  выдел ют фрагмент 1980 вр. Этот фрагмент смешивают с ДНК плаз- миды IIAN7, расщепленной ферментами 20 EcoRI и Hinf111, и св зывают молекулы полинуклеотидной лигазой. Клетки E.coli НВ101 трансформируют легированной плазмидой и из единичных бактериальных колоний, устойчивых к Amp, вьщел ют плазмидную ДНК. Плаз- мидна  ДНК, полученна  таким образом (РНС624), не имеет С1а1 сайта, но в отличие от плазмидной рНСЗ12 ее можно разрезать рестрикционными эндонуклеазами Smal, Sail и БатН1.

Пример 2. Дл  определени  относительного числа копий рНС плазмид выращивают E.coli НВ101 культуры, содержащие плазмиды различных разме- ров, полученные из рекомбинантных pBR322 и производных с большим числом копий того ж ё размера до достижени  идентичной плотности клеток. Из

содержащие плазмиды, культивируют на М9 культуральной среде, дополн ной следующими компонентами: 0,5% казаминовой кислоты (Difco); 0,5%

15 ГЛЮКОЗЫ} 1 мкг/мл витамина В,; 2 ммоль MgS04, 2 мкг/мл тимидина 250 мкг/мл аденозина и 0,4 MBg/мл (Н-тимидина) 888 Bg/молъ (Хемапол Прага).

Клетки, содержащие плазмиды, ра щепл ют . Хромосомные и плазмидные ДНК отдел ют друг от друга градие ным центрифугированием с этидиум- бромцц(цезий)хлоридом в равновесно

25 плотности клеточного лизата, полу ченного из бактериальной суспензи выросшей на 2 мл/ОД 5о 4-5 (45000 об/мин, 40 ч, ).

Плазмидные векторы рНС312, рНС3

30 и рНСб24 07.03.84 г. депонированы в Национальной Коллекции Микроорга низмов (OKI, Венгри ) под кодом № 00279, 00280 и 00281 соответстве но.

Claims (1)

1. Формула изобретени

   Способ конструировани  плазмид ного вектора рНС314 или рНС312,

   идентичных количеств полученных сус- -jo или рНС624, заключающийс  в том, что

   пензий без амплификации выдел ют плазмрщную ДНК. Образцы, вз тые из препаратов ДНК, подвергают электро- форетической обработке на агарозном геле в 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 40- и 50-кратном разбавлении соответственно . Плазмиды с большим количеством копий и их пары с нормальным числом копий (того же молекул рного веса) исследуют одновременно. Ре- gQ МИДУ pHCBI, котора  содержит точечную мутацию G Т в положении 3074 участка гена, кодирующего репрессор- ную ДНК, далее ДНК плазмиды рН081 обрабатывают эндонуклеазой EcoRI, gg дефосфорилируют щелочной фосфатазой и сшивают с EcoRI фрагментом плазмн- ды nVX, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют щтамм E.coli НВ101, отбирают amp колонии, из них

   зультаты экспериментов показьтают, что число копий рНС плазмид в 20 - 30 раз больше, чем число соответствующих pHBR322 производных с нор« мальным числом копий.

   Пример 3. Абсолютное число копий рНС плазмид определ ют путем мечени  ДНК клеток, содержащих плазмиды in vivo и измерени  отношени 

   содержащие плазмиды, культивируют на М9 культуральной среде, дополненной следующими компонентами: 0,5% казаминовой кислоты (Difco); 0,5%

   ГЛЮКОЗЫ} 1 мкг/мл витамина В,; 2 ммоль MgS04, 2 мкг/мл тимидина 250 мкг/мл аденозина и 0,4 MBg/мл (Н-тимидина) 888 Bg/молъ (Хемапол, Прага).

   Клетки, содержащие плазмиды, расщепл ют . Хромосомные и плазмидные ДНК отдел ют друг от друга градиентным центрифугированием с этидиум- бромцц(цезий)хлоридом в равновесной

   плотности клеточного лизата, полученного из бактериальной суспензии, выросшей на 2 мл/ОД 5о 4-5 (45000 об/мин, 40 ч, ).

   Плазмидные векторы рНС312, рНС314

   и рНСб24 07.03.84 г. депонированы в Национальной Коллекции Микроорганизмов (OKI, Венгри ) под кодом № 00279, 00280 и 00281 соответственно .

   Формула изобретени 

   Способ конструировани  плазмид- ного вектора рНС314 или рНС312,

   плазмидную ДНК рНС1 расщепл ют рет- рикционными эндонуклеазами EcoRI и PruII, затупл ют концы с помощью субфрагмента Кленова ДНК полимера- 45 зы I в присутствии dNTP, восстанавливают кольцевую структуру ДНК с помощью ДНК лигазы Т и трансформи- руют штамм бактерий Escherichia coli° НВ101, из amp клонов выдел ют плазвыдел ют плазмидную ДНК, расщепл ют E.coRI и PstI эндонуклеазами и отбирают рНС314, котора  может быть расщеплена на фрагменты размерам 2300 и 100 kb к на PstI фрагменты ра.змером 1580 и 820 kb, далее рекомбинантную пйазмвдную ДНК рСН314 в случае конструировани  рНС312 расщепл ют Ват HI эндонуклеазой, полученную линейную ДНК частично гидролизуют Hinfl эндонуклеазой, выдел ют фрагмент размером 2010 kb, восстанавливают кольцевую структуру ДНК, трансформируют штамм E.coli НВ101 данной ре комбинантной ДНК и отбирак)Т рекомбинантную плазмидную ДНК рНС312, со

   держащую E.coRI и Hinfl сайты рестрикции и образующую фрагменты размером 1495 и 516 kb после расщеплени  эндонуклеазами E.coRI и Hinfl плазмиду рНС312,, в случае конструировани  рНС624 расщепл ют E.coRI и Hind111 эндонуклеазами и выдел ют фрагмент 1980 kb, смешивают с расщепленной ферментами E.coRI и Hindlll ДНК плазмиды ПАЫ, фрагменты сшивают ДНК лигазой Тф, трансформируют штамм бактерий E.coli НВ101, полученной плазмидой и из агар клонов отбирают рекомбинантную плазмидную ДНК рНСб24, содержащую Sraal, Sail и BamHI сайты.