DE3434041A1

DE3434041A1 - Plasmidvektoren mit hoher reduplikationsrate und diese enthaltende und replizierende mikroorganismen sowie verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE3434041A1
Application number: DE19843434041
Authority: DE
Inventors: Imre Dr. Boros; György Dr. Szeged Pósfai; Pál Dr. Venetianer
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1983-09-16
Filing date: 1984-09-17
Publication date: 1985-09-12
Also published as: PL249593A1; AT384031B; PL152527B1; FI79552B; GB8423161D0; ATA293584A; FR2552102B1; CA1275631C; IL72952A; SE463266B; HUT35280A; IT8422677A0; ZA847273B; GB2148301B; GB2148301A; SE8404637L; CH667672A5; AU578041B2; SU1443806A3; FR2552102A1

Description

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P 1 952

Patentansprüche und Beschreibung zur Patentanmeldung

RICHTER GEDEON VEGTESZETI G'fAK R.T,

Budapest, Ungarn

betreffend

Plasmidvektoren mit hoher Reduplikationsrate und diese enthaltende und replizierende Mikroorganismen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

343A041

Beschreibung

Die Erfindung betrifft Plasmidvektoren mit hoher Reduplikationsrate und Mikroorganismen, die diese enthalten und replizieren und ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung.

Die sogenannte Genmanipulationstechnik oder in anderen Worten die Gentechnik wird immer wichtiger bei der Herstellung von medizinisch nützlichen Produkten. Gemäß einer bevorzugten Variante dieser Technik wird der Genabschnitt, der für die Herstellung des gewünschten pharmazeutischen Wirkstoffs codiert, in einen Vektor, z.B. ein Plasmid, eingefügt, um ein rekombinantes " Hybrid"-Plasmamolekül zu liefern, das dann zur Transformation eines geeigneten Mikroorganismus verwendet wird. Das Plasmid wird dann zusammen mit dem bakteriellen Wirt repliziert und das eingefügte Gen funktioniert. Die Anzahl der Genprodukte hängt von der Intensität der Translation und Transkription, von der Aufspaltung des Genprodukts innerhalb der Zelle und von der Reduplikationsrate des Gens, d.h. des Plasmids ab, welches das Gen trägt. Folglich kann eine beträchtliche Erhöhung der Anzahl der Genprodukte durch die Erhöhung der Reduplikationsrate des Fremdgens erzielt werden, wenn es gelingt, die Reduplikationsrate eines Plasmids in einer Zelle zu erhöhen. (Zur Genmanipulationstechnik siehe z.B. US-PS 4.237.224).

Deshalb liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Plasmidvektoren, die eine wesentlich höhere Reduplikationsrate pro Zelle haben als die bekannten und viel verwendeten Plasmide und Mikroorganismen, die diese enthalten und replizieren, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zu schaffen.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.

In der wissenschaftlichen Forschung und in der Industrie werden eine Vielzahl an verschiedenen, im allgemeinen künstlich konstruierten Plasmidvektoren verwendet. Eines der am meisten verwendeten Plasmide ist pBR322, das zuerst von Boyer et al. konstruiert wurde (Gene, 2, 95-113 (1977)). Seitdem und bis heute verfügen wir über die erschöpfendsten wissenschaftlichen Informationen über dieses Plasmid und die meisten Genklonierungsverfahren wurden mit diesem Plasmid oder seinen Derivaten durchgeführt, da diese Substanz meistens als Ausgangsmaterial bei den Versuchen der Anmelderin verwendet wurde. Die Struktur des pBR322 wurde von Sutcliffe bestimmt (CSH Symp.Quant.Biol ._43, 77-90 (1979)) und wird in Fig.l veranschaulicht. Dieses Plasmid hat eine Molekularlänge von 4362 bp. Die Replikation des Plasmids beginnt an dem Nukleotid 2536 entgegen dem Uhrzeigersinn und seine Redupiikations rate pro Zelle beträgt im allgemeinen zwischen 20 und 50. Die Reduplikationsrate wirddurch einen komplizierten Reguliermechanismus gesteuert (P-lasmid 9_, 1, (1983)). Das Fragment zwischen den Nukleotiden 2978 und 3081 ist für die Synthese einer RNA mit niedrigem Molekulargewicht verantwortlich, welche nicht für irgendein Protein codiert und die im Uhrzeigersinn mit einer relativ hohen Intensität transkribiert wird. Diese RNA mit niedrigem Molekulargewicht ist der negative Regulator (Repressor) der Plasmidreplikation.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung,· daß die Reduplikationsrate des Plasmids wesentlich erhöht werden kann, wenn in dem Genabschnitt ,der für die. Herstellung des Repressors der Plasmidreplikation verantwortlich ist, eine Mutation vorgesehen wird, die die Funktion dieses Genabschnitts beeinträchtigt.

Daher sind Gegenstand der Erfindung Plasmidvektoren mit hoher Reduplikationsrate, welche dadurch gekennzeichnet sind,

daß sie im Genabschnitt, der für die Erzeugung des Repressors der Plasmidreplikation verantwortlich ist, eine Mutation, welche die Repressorerzeugung modifiziert, enthalten.

Im eigenen Laboratorium wurde das erste Plasmid mit hoher Reduplikationsrate (pHCl) als das Produkt einer spontanen Mutation in einem Versuch isoliert, der mit Plasmiden des amp^r, tet⁵ Phänotypus durchgeführt wurde, die eine Fremd-DNA zwischen den EcoRI und BamHI Spaltungssteilen des Plasmids pBR322 enthielten, und zwar während der Untersuchung eines Pools von Rekombinanten, die aus etwa 5000 unabhängigen Plasmiden bestanden. Aus den das Plasmid pHcl enthaltenden-Baktierenzellen konnte etwa 20 bis 30 Mal mehr Plasmid-DNA ohne Verstärkung isoliert werden, als aus den Clonen, die andere rekombinante Moleküle mit ähnlicher Struktur enthielten. Diese wiederholte Retransformation des Plasmids pHCl unter Verwendung von E.coli HBlOl (pro", leu", thi", Iac", str", r~m~rndol~, recA~) (Boyer, H.W. et al.: J.Mol. Bio!. 41_, 459-472 (1979)), C600 (r_k", m_k~, thi", thr", leu", Iac") (Boyer, H.W. et a.T ., ' ibid.)) , ED8800 (supE, supF, hsdS", met", lacZM15, recA56) (Murray N.E. et al.: Mol, gen. Genet. 150, 53-61 (1977)) ergaben sich jedes Mal Wirtszellen bei der Erzeugung von amp^r, tet^s Clonen, die eine große Menge an Plasmid enthielten. Als Grund für die erhöhte Reduplikationsrate, die etwa 20 bis 30 mal höher war als die der pBR Plasmide, muß eine vererbliche Änderung in der Plasmid-DNA angenommen werden.

Identifizierung der Mutation, die für die hohe Reduplikationsrate verantwortlich ist

Das Plasmid pHCl wurde mit Restriktionsendonucleasen EcoRI und PruII aufgeschlossen und dann wurden die Einfachstrangenden mit dem Klenow Unterfragment des DNA Polymerase I Enzyms in Anwesenheit von dNTP Substraten gefüllt. Die so hergestellten DNA-Moleküle mit stumpfen Enden wurden mit einem Polynucleotid-Ligase-Enzym zirkularisiert und in HBlOl Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus den auf einem Ampicillin enthaltenden Medium gezüchteten Kolonien isoliert und die DNA-Proben, die in großer Menge isoliert werden konnten, v/urden mittels Agarose und Polyacryl amidgel el ektrophorese nach Aufschließung mit Restriktionsendenucleasen EcoRI, PvuII und BspRI analysiert. Das Plasmid pHC81 (fig.2), das für die

weiteren Untersuchungen ausgewählt wurde, konnte mit dem Enzym PvuII nicht aufgeschlossen werden und wurde mit EcoRI 1inearisiert. Auf der Basis des Gesamtmolekulargewichts des Plasmids (2,3 kb) und der Größe der Fragmente, die durch Aufschließung mit BspRI erzielt wurden (587, 457, 434, 267, 240, 80 ... bp) wurde nachgewiesen, daß das Plasmid ρHC8T den Abschnitt zwischen den Nukleotiden 2069 und 2 des Plasmids pBR322 mit einer Mutation enthielt, die für die hohe Reduplikationsrate verantwortlich war. Diese Mutation kann nicht aufgrund der Größe irgendeines der von den verwendeten Enzymen hergestellte^ Fragmente festgestellt werden. Um die Mutation zu lokalisieren, wurden das 1030 bp DNA-Fragment, das durch Aufschließung von pHC81 mit den Restriktionsendonucleasen Pstl und Taql erzielt wurde, das 780 bp DNA-Fragment, das durch Aufschließung von pBR322 mit den Enzymen Pstl und CIaI erzielt wurde und das 218 bp DNA-Fragment, das durch Aufschiießung'von pBR329 mit dem Enzym Taql erzielt wurde, isoliert. Die drei DNA-Fragmente wur-

den im äquimolaren Verhältnis gemischt, mit einer Polynukleotidiigase gekoppelt, und dann wurden HBlOl Zellen mit dem Ligat transformiert. Aus den einzelnen, auf dem Ampicillin enthaltenden Medium gezüchteten Clonen, wurde Plasmid-DNA isoliert. Diese Plasmide wiesen den Phänotypus mit hoher Reduplikationsrate auf. Durch Aufschließung der Pl asmid-DNA¹s mit Restriktionsendonucleasen wurde nachgewiesen, daß sie durch die Verbindung von drei gut unterscheidbaren Fragmenten verschiedenen Ursprungs erzeugt wurden; in den erhaltenen Plasmiden war der proximale Teil des ß-Lactamase-Gens von pBR322 Ursprung der Bereich, der das Replikationsorigin enthält, wurde von dem Plasmid pBR329 abgeleitet und das Fragment, das aus pHC81 isoliert wurde, enthielt zusätzlich zu dem distalen Teil des ß-Lactamasegens auch die Mutation, die zu der hohen Reduplikationsrate führt. Daraus wurde gefolgert, daß die Mutation zwischen den Nukleotiden 2573 (Taql) und 3612 (Pstl) der DNA des Plasmids pBR322 gebildet worden war. Die Nukleotidsequenz dieses Bereichs wurde bestimmt und mit der bekannten pBR322 Sequenz verglichen. Dieser Vergleich zeigte, daß eine G-M Umwandlung (G= Desoxyguanyl , T = Thymidyl) an dem Nukleotid 3074 stattgefunden hatte, was einer C-#A Umwandlung in dem Komplementär-DNA-Strang entspricht (C = Desoxycytosyl, A = Desoxyadenyl).

Als Ergebnis der resultierenden Punktmutation ist die Beendigung der Transkription der Repressor-RNA beschädigt und eine RNA mit höherem Molekulargewicht wird synthetisiert, die nicht langer als Replikationsrepressor wirken kann. Die Beendigung der Repressorfunktion führt zu einer höheren Reduplikationsrate. Durch diese spontane Punktmutation, die auch absichtlich verursacht werden kann, könnte die Reduplikationsrate des Plasmids pro Zelle um das zwanzig- bis dreißigfache (^ 1000) mit Bezug auf den ursprünglichen Wert erhöht werden. Durch diese Punktmutation kann die Reduplikationsrate irgendeines Plasmids, das den gleichen

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Replikationsbereich wie pBR322 hat, beispielsweise der in der US-Patentschrift 4 371 625 erscheinenden Plasmide pPC 01, pPC 02 und pPC 03, wesentlich erhöht werden.

Es wurde jedoch festgestellt, daß das ursprüngliche Plasmid pBR322, das eine G-*T Punktmutation enthält, nicht länger lebensfähig ist. Durch die hohe Reduplikationsrate wird bei den Genen des Plasmids, die die Antibiotikumresistenz bestimmen - Ap^r = (b -Lactamase, Tc£ = Membranprotei n(e), die Synthese beider Proteine erhöht;· und das letztere tein verantwortlich für die Tetracyclinresistenz) ist in größerer Menge für die Zelle tödlich. Das gleiche Problem wird im Falle irgendeines Derivats von Plasmid pBR322 mit hoher Reduplikationsrate festgestellt, welches das ursprüngliche Tetracyclinresistenzgen in unveränderter Form enthält.

Bei eigenen früheren Versuchen sah sich die AmBlderin nicht mit diesem Problem konfrontiert, da Plasmide verwendet worden waren, in denen Fremd-DNA-Fragmente zwischen die Stellen BamHI und EcoRI des Plasmids pBR322 cloniert worden waren und auf diese Weise das Tetracyclinresistenzgen inaktiviert worden war. Entsprechend muß, um ein lebensfähiges Plasmid mit hoher Reduplikationsrate zu erhalten, pBR322 oder ein Derivat davon mit demselben Replikationsbereich, durch Inaktivierung oder Repression der Funktion des Tetracyclinresistenzgens abgeändert werden.

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Daher sind gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung von pBR322 oder Derivaten desselben abgeleitete und den gleichen Replikationsbereich enthaltende neue Plasmide, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß sie kein Tetracyclinresistenzgen oder eine inaktivierte oder abgeänderte Form desselben mit gemäßigter Funktion sowie eine Punktmutation, welche die Repressorerzeugung auf dem Genabschnitt, der die Repressor-RNA codiert, verändert enthalten, vorgesehen.

Gemäß einer bevorzugteren Ausführungsform der Erfindung wird in der Plasmid-DNA pBR 322 oder einem Derivat desselben, das den gleichen Replikationsbereich hat, in der Position 3074 (gemäß der Numerierung von pBR322) das Basenpaar GC durch TA durch gesteuerte Punktmutation ersetzt oder ein Abschnitt, der diese Mutation in einem weiter unten beschriebenen pHC-Plasmid enthält, durch einen Abschnitt des gewünschten Plasmids, das abgesehen von dieser Mutation identisch ist, ersetzt.

Von den erfindungsgemäßen Plasmiden sind die den gleichen Replikationsbereich wie pBR322 und eine G —>T Punktmutation in dem Gen der kleinen RNA, die als Repressor der Replikation wirkt, haben und

a) ein Ampicillinresistenzgen des Plasmids pBR322 als einen selektiven genetischen Markierer enthalten, wobei in diesen Plasmidvektoren das Tetracyclinresistenzgen inaktiviert wurde oder vollkommen fehlt oder eine reprimierte Wirkung hat, oder

b) die Ampicillin- und Tetracyclinresistenzgene des Plasmids pBR322 als selektive genetische Markierer enthalten, wobei in diesen Plasmidvektoren die Transkription des Tetracyclinresistenzgens durch einen Mutanten, der schwächer als natürlich ist, oder durch einen Fremdpromoter

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erfolgt,
besonders bevorzugt.

Wie vorstehend beschrieben, _muß, falls pBR322 oder ein geeignetes Derivat davon als Model 1 substanz verwendet wird, die GC-+TA Punktmutation auf einem Derivat des Ausgangsplasmids erzeugt werden, bei dem das Tetracyclinresistenzgen vollkommen fehlt oder seine Wirkung inaktiviert oder reprimiert wurde. In diesem Zusammenhang bedeutet Repression, daß das Gen, das für die Erzeugung des Membranproteins codiert, für die Tetracyc1inresistenz verantwortlich ist, geändert wird, um eine verringerte Proteinerzeugung zu steuern. Gemäß einer bevorzugten Variante wird die DNA, die für die TetracycIinresistenz verantwortlich ist, oder der Gesamtabschnitt bis zu dem Repl i kati ons,ori gi η des pBR322 beseitigt und gegebenenfalls .durch einpn Polykoppler synthetischen Ursprungs ersetzt, wodurch auf Grund der in das Plasmid eingefügten zusätzlichen Restriktionsendonuclease-Aufschliessungsstellen, die Anwendungsmöglichkeiten der erzielten Plasmide wesentlich erweitert werden können.

Die in Fig. 3, 4 bzw. 5 gezeigten Pl asmidvektoren pHC 314, pHC 3.12 und pHJC 624 sind besonders bevorzugte Vertreter der erfindungsgemäßen Plasmide mit hoher Reduplikationsrate. Sie haben die folgenden charakteristischen Eigenschaften :

I) Als Ergebnis einer Modifikation in der Struktur des Gens, das für die RNA mit niedrigem Molekulargewicht codiert, die als Replikationsrepressor wirkt, wird ihre Replika-

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tion dereprimiert, damit wird die Reduplikationsrate innerhalb der Zelle wesentlich höher und liegt im allgemeinen bei 1000 (ca. 65% des Gesamt-DNA-Inhalts der Zelle) Diese hohe Reduplikationsrate hat keinen Einfluß auf die als Wirtszellen verwendeten E.coli Zellen.

II. Die Plasmide dieser Serie enthalten die Aufspaltungsstellen für zahlreiche Restriktionsendonucleasen. Aus diesem Grund können DNA-Fragmente, die durch diese Enzyme, durch ihre Kombination oder durch andere Endocunleasen, welche die gleichen Enden erzeugen, aufgeschlossen sind, leicht in diese Plasmide eingefügt werden.

Stellen, die zur Clonierung der erfindungsgemäß bevorzugten Plasmide geeignet sind, sind wie folgt: pHC 314: ClAI, Hindlll, XBaI, BamHI, BgIII und

fakultative Kombinationen dieser Stellen; pHC 312: CIaI, Hindlll, Xbal, BgIII, EcoRI und

fakultative Kombinationen dieser Stellen; pHC 624: EcoRI, Hindlll, BamHI, Xbal, BgIII, Smal,

(Xmal), sail und ihre Kombinationen mit

einigen Einschränkungen.

III. Die Größe der bevorzugten pHC-'Pl asmide ist wesentlich kleiner, als die des Ausgangs-pBR322. So beträgt die Größe der in Fig. 3, 4 und 5 gezeigten Plasmide 2405 bp, 2010 bp und 2015 bp. Dies ist von Vorteil, da die Reduplikationsrate der meisten Vektorplasmide innerhalb der Zelle umgekehrt proportional zu der Größe des Plasmids ist. Bei Genclonierungsversuchen kann das größere Gen wirksam cloniert werden, die kleineren Vektoren werden eingesetzt.

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[V) Diese Plasmide haben das Ampicillinresistenzgen des ursprünglichen pBR322 als selektiven genetischen Markierer.

V) Sie enthalten das Replikationsorigin des ursprünglichen pBR322.

Gegenstand der Erfindung sich auch Mikroorganismen, die irgendwelche der erfindungsgemäßen Plasmidvektoren enthalten und replizieren.

Konstruktion der Plasmide pHC314, pHC312 und pHC624

Während der weiteren Transformation der, gemäß vorstehend beschriebener Versuche erhaltenen Plasmide, wurden Polykoppler in das pHC81 Plasmid eingefügt, zur Erzeugung von Vektoren, die zur Einfügung der DNA-Fragmente geeignet sind, die mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen gebildet wurden. Die DNA des Piasmids pHC81, die mit der Endonuclease EcoRI linearisiert worden war und mit bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryl i.ert wurde, wurde mit Plasmid-DNA-Fragmenten gekoppelt (.Seed, B.: Nucleic Acid Research 11, 2427-2446 (1983)) und E.coli HBlOl Zellen wurden mit dem Koppler transformiert. Plasmid-DNA wurde aus den Ap-resistenten bakteriellen Kolonien isoliert und mit Hilfe von Gel-Elektrophorese nach Aufschließung von EcoRI und Pstl Restriktionsendonucleasen analysiert. Für weitere Untersuchungen

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wurde das Plasmid, das durch EcoRI auf 2300 und 110 bp Fragmente und durch Pstl auf 1580 und 820 bp Fragemente aufgespalten werden konnte, ausgewählt (pHC 314, Fig,3.). Aus diesem Plasmid wurde PHC312, das nur eine.EcoRI Stelle enthielt, wie folgt konstruiert: Das Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuclease BamHI aufgeschlossen und das erzielte lineare Molekül teilweise mit einem Hinfl Enzym aufgeschlossen. Die DNA-Fragmente wurden in einem 1,2%-igen Agarose-Gel getrennt und das 2010 bp Fragment isoliert. Die Molekülenden, die aufGimd der Aufschließung mit BamHI und Hinfl Enzymen einzelsträngige Abschnitte enthielten, wurden mit dem Klenow-Subfragment der Enzym-DNA-Polymerasel in stumpfe Enden umgewandelt und dann mit T.-induzierter Polynukleotidligase rezirkularisiert. Die verbundene DNA wurde in HBlOl Zellen transformiert und einzelne Clonen isoliert. Für weitere Arbeiten wurde das Plasmid pHC312, das mit Endonuclease BamHI nicht aufgespalten, aber mit EcoRI linearisiert werden konntö und bei Aufschließung mit Hinfl, 1495 bp und 516 bp Fragmente ergab, ausgewählt (fig.4). Um einen Vektor mit hoher Reduplikationsrate herzustellen, der zur Clonierung von DNA-Fragmenten mit stumpfen Enden geeignet ist, wurde das Plasmid pHC312 mit Restriktionsendonucleasen EcoRI und Hi nd III aufgeschlossen und das 1980 bp Fragment aus Agarose-Gel isoliert. Dieses Fragment wurde dann der DNA des Pl asmi ds )tAN7 zugemischt (Seed, B.: Nucleic Acids Research, U_, 2427-2446 (1983)), das mit den Enzymen EcoRI und Hi nd III aufgeschlossen worden war, und die Moleküle wurden mit Polynukleotidligase verbunden. E.coli HBlol Zellen wurden mit dem verbundenen Plasmid transformiert und aus einzelnen Ap-resistenten Bakterienclonen wurde Plasmid-DNA isoliert. Die auf diese Weise erzielte Plasmid-DNA (pHC624, Fig.5) hat keine CIaI Stelle, aber anders als Plasmid pHC312 kann es mit Restriktionsendonucleasen Smal, sail und BamHI linearisiert werden.

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Bestimmung der Reduplikationsrate von Plasmiden

a) Relative Redupiikatiohsrate

Zur Bestimmung der relativen Reduplikationsrate von pHC Plasmiden wurden E.coli HBlOl Kulturen, die Plasmide verschiedener Größe enthielten, die vom rekombinanten pBR322 und Derivaten der gleichen Größe mit hoher'Reduplikationsrate abgeleitet worden waren, gezüchtet, bis eine identische Zelldichte erreicht wurde. Aus identischen Mengen der erzielten Suspensionen wurde ohne Verstärkung Plasmid-DNA gemäß der von Birnboim und DoIy beschriebenen Technik isoliert (Nucleic Acids Res. 7_, 1513-1523 (1979)). Den DNA-Präparaten entnommene Proben wurden einer Elektrophorese auf Agarose-Gel in 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 40- bzw. 50-fachen Verdünnungen unterworfen. Die Plasmide mit hoher Reduplikationsrate und ihre Paare mit normaler Reduplikationsrate (die das gleiche Molekulargewicht hatten) wurden gleichzeitig untersucht. Versuchsergebnisse zeigten, daß die Reduplikationsrate von pHC Plasmiden etwa 20 bis 30 mal größer war als die der entsprechenden pBR322 Derivate mit "normaler Reduplikationsrate".

b) Absolute Reduplikationsrate

Die absolute Reduplikationsrate der pHC Plasmide wurde bestimmt, indem die DNA der Zellen, die die Plasmide in vivo enthielten, markiert wurden und das Verhältnis der Radioaktivität in der abgetrennten Plasmid-DNA und in der chromosomalen DNA gemessen wurde. Durch diese Methode wurde festgestellt, daß die Reduplikationsrate der Plasmide mit gleicher Größe wie pH314 (Molekulargewicht = 1,6 · 10⁶d) ungefähr 1000 pro Zelle betrug (Molekulargewicht des Chromosoms =

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' 3534041

2 ■ ΙΟ⁹ d). 60 bis 65% des Gesamt-DNA-Inhalts der Zelle war Plasmid-DNA. Für die in vivo Markierung der DNA wurden die die Plasmide enthaltenden Zellen auf einem M9 Kulturmedium gezüchtet, welches durch eine 20-minütiqe Sterilisierung eines Mediums bei 121⁰C erzielt wurde, bestehend aus

Na₂HPO₄	6	g	g
KH₂PO₄	3	g
NaCl	9»	5	1000 ml,
NH₄Cl	1	9
H₂O	bi	S

und

einen pH Wert von 7 hatte, und mit den folgenden Komponenten ergänzt wurde;.

0,5% Casaminosäure (Difco)

0,5% Glucose

1 pg/ml Vitamin B,

1 Millimol MgSO₄

2 pg/ml Thymidin

250 μg/ml Adenosin und

0,4 mBq/ml [³h1 -Thymidin JmtBq/Millimol, Chemapol,

Prag .J.

Die Plasmid enthaltenden Zellen wurden gemäß Womble et al. CJ. Bacteriol., JL30_ (1977J 148-153) aufgeschlossen. Die chromosomale und die Plasmid-DNA wurden voneinander durch Äthidiumbromid/Cäsiumchlorid-Gleichgewichtsdichtegrad-Zentrifugation

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des Zell-Lysats, das von einer Bakteriensuspension abgeleitet wurde, die auf 2 ml gezüchtet worden war (OD₅₅₀ = 4-5/45000 Upm, Rotor des Beckman Typs 65, 40 Stunden, 20⁰C), getrennt.

Die erhöhte Reduplikationsrate wird in den Figuren 6 und 7 gezeigt.

r 2 In Fig. 6 werden Flecken, die Ap , Tc rekombinanten Plasmid-DNS's des pBR322 Ursprungs entsprechen", nach der Trennung durch Äthidiumbromid/Agarosegelelektrophorese gezeigt. Alle Proben wurden mit derselben Technik, aus der gleichen Menge an Plasmid enthaltenden HBlOl Zellen hergestellt (Birnboim und DoIy, Nucleic Acids Res. _7, 1513-1523 (1979)). Die Proben 1 bis 2 und 4 bis 6 sind rekombinante Plasmide, die ein bis 2,0 kb Fremd-DNA zwischen den Aufspaltungsstellen EcoRI und BamHI des Plasmids pBR322 enthalten. Die Probe 3 ist ein Plasmid der gleichen Größe, das die Mutation enthält, die für die hohe Reduplikationsrate verantwortlich ist (pHCl).

In Fig. 7 werden Flecken der DNA von E.coli HBlOl Zellen gezeigt, die das Plasmid p715 (Probe A) und das Plasmid pHC314 (Probe B) enthalten, nach Trennung durch Äthidiumbromid/Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation. (Das Plasmid ρ715 hat die gleiche Struktur wie pHC314 mit Ausnahme der Mutation, die für die hohe Reduplikationsrate verantwortlich ist.). Die Aufnahme wurde nach der Trennung des Plasmids und der chromosalen DNA durch Zentrifugation mit. ultravioletter Beleuchtung des Zentrifugenglases, das die DNA enthält, gemacht .

Wie deutlich auf dem Photo .zu sehen, fehlt in der DNA, die aus den Zellen mit Plasmid mit normaler Reduplikationsrate erzielt wurden (Probe A), der Plasmid enthaltende untere Streifen fast vollkommen. Andererseits bildet die pHC314 Plasmid-DNA, die aus der gleichen Zahl von Zellen mit derselben Methode erzielt wurde, aufgrund der wesentlich höheren Reduplikationsrate des Plasmids, einen breiten Streifen unterhalb des Streifens, der die chromosomale DNA enthält.

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Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Plasmidvektoren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß im Genabschnitt, der für die Erzeugung des Repressors der Plasmidreplikation verantwortlich ist, eine Mutation, welche die Repressorerzeugung modifiziert, erzeugt wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Derivaten mit hoher Reduplikationsrate von pBR322, ihren Derivaten oder anderen Plasmiden, die den gleichen Replikationsbereich wie pBR322 aufweisen, wird im Derivat von pBR322 oder irgendeinem anderen Plasmid mit demselben Replikationsbereich, welches das Gen für die Tetracyclinresistenz in einer inaktivierten Form oder in einer Form, die eine reprimierte Wirkung aufweist, enthält, im die Repressor- -RNA codierenden Genabschnit eine Punktmutation, welche die Röpressorerzeugung modifiziert, erzeugt und gegebenenfalls der für die Erzeugung des Membranproteins für die Tetracyclinresistenz verantwortliche DNA-Abschnitt in einer oder mehreren Stufen durch eine synthetische PoIykoppler-DNA ersetzt.

Vorzugsweise wird eine G τΓ Punktmutation in der Position 3074 des Genabschnitts, der die Repressor-RNA codiert, gemäß der ursprünglichen Numerierung von pBR322, wie es weiter unten ausführlich beschrieben wird, erzeugt.

Verschiedene alternative Ausführungsformen stehen zur Beseitigung der durch Tetracyclinresistenz verursachten Probleme zur Verfügung. Gemäß einer Ausführungsform wird der DNA-Abschnitt, der für die Erzeugung des Membranproteins für die Tetracyclinresistenz verantwortlich ist, durch eine

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Polykoppler-DNA synthetischen Ursprungs, die durch eines oder mehrere bedeutende Restriktionsenzyme aufspaltbar ist, ersetzt. Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann ein Fremd-DNA-Abschnitt in das Gen für die Tetracyj3linresistenz eingesetzt werden, wodurch seine Wirkung inaktiviert wird.

Gemäß weiterer alternativer Ausführungsformen wird die Transkription des Gens für die Tetracyclinresistenz durch eine Mutation im Promotorbereich oder durch Ersetzendes natürlichen Promotors durch einen "Fremd"-Promotor, welcher eine weniger intensive Transkription sichert, vermindert.

Die erfindungsgemäßen P1 asmidνektοreη mit hoher Reduplikationsrate haben verschiedene Anwendungsbereiche. Daher ist weiterhin Gegenstand der Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Plasmidvektoren oder Mikroorganismen zur Herstellung irgendeines clonierten Abschnitts des gesamten Chimärenplasmids in reiner Form für Kontrol1 versuche, zum Nachweis von Strukturen, zur Modifizierung oder Transclonierung und insbesondere zur Herstellung von Insulin oder Vasopressin, wobei die letztgenannten Beispiele für industrielle Anwendungen sind.

Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Plasmide kann die gleiche Menge an DNA aus beträchtlich weniger Ausgangsmaterial erzielt werden, als in dem Fall der allgemein verwendeten, aus der Literatur bekannten Plasmide. Im Falle der als Beispiel angeführten pHC Plasmide ist ungefähr 20 bis 30 mal weniger Ausgangsmaterial erforderlich als bei pBR322, um die gleiche Menge an DNA herzustellen. Die Plasmid-DNA, die aus einer einzigen Kolonie eines Bacteriums, das pHC Plasmide trägt, isoliert werden kann, reicht für 3 bis 4 Restriktionsanalysen. Aus einem Liter der Bakterienkultur können mehr als 10 mg reines Plasmid isoliert werden.

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Falls die erhöhte Menge des Produkts des clonierten Gens für die Wirtszelle erträglich ist, kann di-e Synthese irgendeines Genprodukts durch die Verwendung von erfindungsgemäßen pHC-Plasmiden erhöht werden. In einem optimalen Fall ist die Ausbeute etwa 20 bis 30 mal größer, da dieses Maß an Gendosiserhöhung erreicht werden kann. In bestimmten Fällen ist die Erhöhung etwas geringer wegen der begrenzenden Rolle anderer Faktoren.

Die Einfügung von Polykopplerbereichen in die pHC Plasmide verleiht ihnen eine große Flexibilität. Wenn die Abspaltungsstellen für das zu clonierende Gen ungeeignet sind, können sie ersetzt oder für die Clonierung mit anderen Fragmenten mittels synthetischer Adaptoren geeignet gemacht werden.

Zusätzlich zu den veranschaulichten technischen Lösungen gibt es zahlreiche weitere Möglichkeiten um mit der Erfindung zu arbeiten. Die entsprechenden DNA-Abschnitte, die 21 bzw. 32 Nukleotide enthalten, können z.B. unter Verwendung der Enzyme Fnu4HI und Tthill von dem ursprünglichen pBR322 abgespalten werden, wobei die entsprechenden Fragmente, die eine G-*-T Punktmutation enthalten, chemisch, synthetisiert und in das Molekül von pBR322 statt der beseitigten Fragmente eingefügt werden können.

In gleicher Weise kann eine V i el za-h 1 von synthetischen Polykoppl er-DNA-Fragmenten in, das Molekül anstelle des teilweise oder gänzlich beseitigten DNA-Abschnitts eingefügt werden, der für die Tetracyclinresistenz verantwortlich war.

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Plasmide pHC 312, pHC 314 beziehungsweise pHC 624 wurden am 7· März 1984 bei der ungarischen Nationalen Stammsammlung von Mikroorganismen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet, Budapest, Ungarn) unter den Nummern MNG 00279, 00280 und 00281 hinterlegt.

Plasmide P 715, pHC 1, pHG 81,TlAN 7 beziehungsweise JIvX wurden am 25· Juli 1984 bei der ungarischen Nationalen Stammsammlung von Mikroorganismen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet, Budapest, Ungarn) unter den Nummern MNG 00293, 00294, 00295, 00296 beziehungsweise 00297 hinterlegt.

Mikroorganismen E.coli HB 101, E.coli ED 8800 beziehungsweise E.coli C 600 wurden am 25· Juli 1984 bei der ungarischen Nationalen Stammsammlung von Mikroorganismen (Orszagos Közegeszs^gügyi Intezet, Budapest, Ungarn) unter den Nummern MNG 00290, 00291 beziehungsweise 00292 hinterlegt. Die Stämme S.coil 46 101 pBR 322 E.coli HB 101 pBR 329 wurden bei der gleichen Hinterlegungsstelle am 12. September 1984 unter den Nummern 00298 beziehungsweise 00299 hinterlegt.

Die Erfindung wird an Hand des folgenden Beispieles näher erläutert.

Beispiel

Bei den Versuchen wurden die folgenden Materialien und Techniken verwendet:

Bacterium-Stämme und Plasmide:
amp^r, te

(1977)];

pBR322 amp^r, tet^r [Bolivar, F. et al.: Gene 2, 95-113

pBR329 amp , chl^r, tet^r (Covarubbias, L., Bolivar, F.: Gene, 17, 79-89 (1982)].

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(pBR 322 und pBR 329 ist uneingeschränkt von H.W. Boyer, Abt. Biochem. Biophys., Univ. Calif., San Francisco, Kalifornien 94 14-3» USA erhältlich oder kann frei von Boehringer Mannheim GmbH Biochemica, Postfach 3ΊΟ12Ο, D-6800 Mannheim 31 gekauft werden und ferner wurde pBR322 in der US-Patentschrift 4 371 625 [C. N. C. M. No. 1-065] beschrieben. J

Die ICvX und ftAN7 Plasmid-DNA-Präparate wurden im Institute of Biochemistry, Biological Research Centre, der Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungarn [Seed, B.: Nucleic Acids Research, 11., 2427-2446 (1983) ] hergestellt.

Die verwendeten Restriktionsendonuclease-, T^-induzierte Polynukleotidkinase- und Polynukleotidligase-Präparate wurden im Institute of Biochemistry, Biological Research Centre der Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungarn, unter Verwendung veröffentlichter Reinigungsmethoden hergestellt [Roberts, R.J.: Nucleic Acids Research 11, Π35-Π37 (1983); Murray, N.E. et al.: J. Mol. Biol. 132, 493-505 (1979); Panet, A. et al.: Biochemistry, 12, 5045-5050 (1973)]. Das Klenow-Fragment der Enzym-DNA-Polymerasel war das Produkt.der New England Bio Labs, während die bakterielle alkalische Phosphatase (BAP) von Worthington hergestellt worden war.

Das [Y-3 P]ATP (Hungarian Isotope Institute, Budapest) hatte eine spezifische Aktivität von 22 TBq/mM.

Das YTB-Kulturmedium [Miller, J.H., ed. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] enthielt lOg/l Bacto Trypton (Difco), 5g/l Bacto-Hefeexfcrakt (Difco) und 5g NaCl. Um YTA-Platten herzustellen, wurde das YTB-Kulturmedium mit 15g/l Bacto-Agar (Difco). ergänzt.

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Zur Isolierung von Plasmid-DNA wurden die Bacterium- Stämme E.coil HBlOl, C600 und ED8800, die die geeigneten Plasmide enthielten, auf dem YTB-KuIturmedium gezüchtet, das 100 ng/ml Ampicillin (Pharmachim, Sofia) enthielt. Vor der Isolierung jedes nicht-pHC Plasmids wurden 170 Mg/ml Chloramphenicol den Bakteriumkultüren bei ^OD6oonm°'⁷~⁰'^{8 hi}nzugefügt, die dann weitere 10 bis 12 Stunden geschüttelt wurden. Die Plasmide mit hoher Reduplikationsrate (pHC) wurden aus den Zellen einer Kultur, die bis zur stationären Phase gezüchtet worden war, ohne Verstärkung isoliert. Bei der Isolierung von Plasmid-DNA in präparativen Mengen fron 50bis 100 ml der Bacterium-Kultur im Falle von pHC Plasmiden und 1 bis 3 Liter der Kultur im Falle anderer Derivate), wurde ein klares Lysat mit der Methode von Clewell und Helinski [j. Bacterial«, 110, 1135 (1972)] hergestellt, und die Plasmid-DNA wurde auf einer Sephacryl SlOOO (Pharmacia) Kolonne gereinigt. Um Plasmid DNA für analytische Zwecke (aus 1,0 bis 1,5 ml der Bacterium-Kultür) zu isolieren, wurde die von Birnboim und DoIy entwickelte, von D. Ish-Horowich modifizierte Kaliumazetat-Methode verwendet [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] .

Die Aufschließung der DNA-Proben durch Restriktionsendonucleasen wurde unter den von New England BioLabs empfohlenen Reaktionsbedingungen durchgeführt.

Um DNA-Fragmente mit einzelsträngigen Enden in Fragmente mit stumpfen Enden zu transformieren, wurde DNA mit Alkohol nach Aufschließung mit dem Restriktionsenzym ausgefällt und dann in einem Puffer, der 50 Millimol TMs-HCl., pH" 7.4, 7 Millimol MgCl₂, 1 MIHimol Di th'iothreito!, 0,1 Millimol dATP, 0,1 Millimol dCTP, 0,1 Millimol dGTP, 0,1 Millimol TTP (Endvolumen:

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10 bis 20 μΐ, DNA-Konzentration: 200-250 pg/nil ) aufgelöst. Die Lösung wurde dann mit 1-2 U des DNS-Polymerasel Klenow- - Fragments bei 37°C 15 Minuten lang inkubiert [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)]·

Die Reaktionsmischung (30-40 μΐ ) die verwendet wurde, um DNA-Fragmente mit überstehenden Enden zu verknüpfen, enthielt 0,5 bis 1,0 μ<] DNA, 66 Millimol Tri s- (hydroxymethyl )-antinoraethan (Tris-HCI) (pH 7,6), 5 Millimol MgCl^, 5 Millimol Dithiothreitol 1 Millimol ATP und 1 U T₄ ¹ induzierter PoIynukleotidligase. Die Verknüpfung wurde bei 14°C 2 bis 3 Stunden lang durchgeführt [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)1. Fragmente mit stumpfen Enden wurden in einem Puffer verknüpft, der 30-40 μg/m^ DNA, 25 Millimol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-Hcl.) (pH 7,4), 5 Millimol MgCl₂, 5 Millimol Spermidin, 1 Millimol ATP, ^g/ml BSA (Sigma, Typ V) enthielt. Der Reaktionsmischung wurden 4 bis 6 Einheiten (U) der T--indizierten Polynukleotidligase hinzugefügt und das Ganze dann bei 14°C während 8 bis 12 Stunden inkubiert [Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] .

Die Gelelektrophorese der DNA-Proben wurde in 0,8 bis 2,0%* -igen Agarose-Gels (Siqma, Typ I) tin waagrechten Elektrophoresegeräten gemäß der von Helling et al. beschriebenen Methode durchgeführt [J. Virol. 1_4, 1235 (1974)] . Die Polyacryl amid-Gelel ektrophorese (unter Verwendung von 1% und 8% 1 jam dickem, verti kai em Gel) wurde gemäß Maniatis et al. durchgeführt [Biochemistry, 14, 3787-3794 (1975)].

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Zur Isolierung der DNA-Fragmente aus Agarose- und Polyacrylamid-Gel wurde die von Winberg et el. entwickelte Methode [Nucleic Acids, Res. IB, 253-264 (1980)] unter Verwendung von DEAE-Papier verwendet.

Kompetente Zellen für die Transformation der Bacterium-Stämme HBlOl, C600 und ED8800 wurden mit der sogenannten CaC!-- Methode hergestellt, über die Mandel und Higa berichten. [J. Mol. Biol., 55. 154 (1970)].

Die Dephosphorylierung der 5^f-Enden der DNA-Fragmente, die Markierung der Enden mit Polynukleotidkinase und [^- P] ATP und Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde entsprechend dem von Maxam und Gilbert beschriebenen Protokoll durchgeführt [Methods Enzymol. 65, 499 (1977)].

Zusammenfassung

Claims

Patentansprüche

1.) Plasmidvektoren mit hoher Reduplikationsrate, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Genabschnitt, der für die Erzeugung des Repressers der Plasmidreplikation verantwortlich ist, eine Mutation, welche die Repressorerzeugung modifiziert, enthalten.

2.) Plasmidvektoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie den gleichen Replikationsbereich wie pBR322 und eine G--»T Punktmutation in dem Gen der kleinen RNA, die als Repressor der Replikation wirkt, haben und

a) ein Ampicillinresistenzgen des Plasmids pBR322 als einen selektiven genetischen Markierer enthalten, wobei in diesen Plasmidvektoren das Tetracyclxnresistenzgen inaktiviert wurde oder vollkommen fehlt oder eine reprimierte Wirkung hat, oder

b) die Ampicillin- und Tetracyclinresistenzgene des Plasmids pBR322 als selektive genetische Markierer enthalten, wobei in diesen Plasmidvektoren die Transkription des Tetracyclinresistenzgens durch einen Mutanten, der schwächer als natürlich ist, oder durch einen Fremdpromoter erfolgt.

3.) Plasmidvektoren pHC 312, pHC 314 und pHC 624, hinterlegt am 7· März 1984 bei der ungarischen Nationalen Stammsammlung von Mikroorganismen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet, Budapest, Ungarn) unter den Nummern MNG 00279, 00280 beziehungsweise 00281.

4-.) Mikroorganismen, die irgendwelche der Plasmidvektoren nach Anspruch 1 bis 3 enthalten und replizieren.

5.) Verfahren zur Herstellung von Plasmidvektoren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man im Genabschnitt, der für die Erzeugung des Repressors der Plasmidreplikation verantwortlich ist, eine Muation, welche die Repressorerzeugung modifiziert, erzeugt.

6.) Verfahren nach Anspruch 5 zur Herstellung von Derivaten mit hoher Reduplikationsrate von pBR322, ihren Derivaten oder anderen Plasmiden, die den gleichen Replikationsbereich wie pBR322 aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß man im Derivat von pBR322 oder irgendeinem anderen Plasmid mit demselben Replikationsbereich, welches das Gen für die Tetracyclinresistenz in einer inaktivierten Form oder in einer Form, die eine reprimierte Wirkung aufweist, enthält, im die Repressor-RNA codierenden Genabschnitt eine Punktmutation, welche die Repressorerzeigung modifiziert, erzeugt und gegebenenfalls den für die Erzeugung des Membranproteins für die Tetracyclinresistenz verantwortlichen DNA-Abschnitt in einer oder mehreren Stufen durch eine synthetische Polykoppler- -DNA ersetzt.

7.) Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine G—>T Punktmutation in der Position 3074- des Genabschnittes, der die Repressor- -RNA codiert, gemäß der ursprünglichen Numerierung von pB322,, erzeugt.

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8.) Verfahren nach. Anspruch 5 his 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Plasmid, das eine G-^-T Punktmutation enthält, den DNA-Abschnitt, der für die Erzeugung des Membranproteins, welches die Tetracyclinresistenz verursacht, verantwortlich ist, durch einen synthetischen Polykoppler-DNA-Abschnitt, der durch ein oder mehrere Restriktionsenzyme abspaltbar ist, ersetzt oder in einen Tetracyclinresistenzgen einen Fremd-DNA-Abschnitt, der seine Wirkung inaktiviert, einsetzt oder die Transkription des Tetracyclinresistenzgens durch eine Mutation im Promotorbereich oder durch Ersetzen des natürlichen Promotors durch einen Fremd-Promotor, der für eine weniger intensive Transkription sorgt, reprimiert.

9.) Verwendung der Plasmidvektoren nach Anspruch 1 bis 3 oder der Mikroorganismen nach Anspruch 4- zur Herstellung irgendeines clonierten Abschnitts des gesamten Chimärenplasmids in reiner Form für Kontrollversuche, zum Nachweis der Struktur, zur Modifizierung oder Transclonierung, insbesondere zur Herstellung von Insulin oder Vasopressin.

Beschreibung