DE3332264A1 - Plasmidvektoren zur expression in bacillus subtilis und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Plasmidvektoren/ die Expression von heterologer DNS mit hoher Ausbeute an kodierten Proteinprodukten in Bacillus subtilis ermöglichen.

Bekanntlich können DNS-Fragmente aus eukarybtischen und prokaryo tischen Organismen, .die für bestimmte Proteine kodieren, isoliert und zum Zweck der Replikation, Transkription und Translation in Mikroorganismen eingebracht werden .

In der US-PS 4 237 224 ist ein Verfahren zur Herstellung von biologischen Chimären beschrieben, das die folgenden Stufen umfaßt:
i) Schneiden der heterologen DNS unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms;
ii) Einbau der erhaltenen Fragmente in einen Vektor, der

mit dem gleichen Enzym geschnitten wurde, unter Verwendung eines zweiten, Ligase genannten Enzyms; iii) Transformieren der erhaltenen Hybridmoleküle in Wirtszellen durch einen Transformations-, Konjugations- und Übertragungsmechanismus und schließlich

iv) Auswählen ("Screening") der erhaltenen Klone, wobei diejenigen identifiziert werden, die die für ein bestimmtes interessantes Protein kodierende DNS tragen.

™ Es ist auch bekannt, daß zur Synthese eines bestimmten Proteins die Zellen bestimmte. Sequenzen (Promotor und Shine-Dalgarno) in der DNS benötigen, welche die RNS-Polymerase zur Transkription der DNS in mRNS und die entsprechenden Ribosomen und Enzyme zur Translation der mRNS in Proteine

fähigen. . .

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Da diese Erkennungssequenzen von Organismus zu Organismus verschieden sein können, besteht das beste Verfahren zur Expression eines heterologen Proteins in einer gegebenen Wirtszelle darin, das Strukturgen des Proteins unter die Kontrol- Ie von Erkennungssequenzen zu stellen, die für die Wirtszelle spezifisch sind. -.'·:>- ^: '''■" ·■■'"

Im Hinblick auf die Molekularbiologie von Escherichia coli gibt es zahlreiche Veröffentlichungen, beispielsweise T.M. Robert und"Mitarb., Proc. Natl. Acad., Sei. USA 76 (1979), S. 760 bis 764 und K.Talmatge und W. Gilbert, Gene 12 (1980), S. 235 bis 241, in denen beschrieben wird, daß heterolo'ge Proteine in hoher Ausbeute expremiert werden, wenn die kodierenden Gene unter die Steuerung von Sequenzen gebracht werden, die vom Transkriptions- und Translationssystem der Wirtszelle leicht erkannt werden.

Im Hinblick auf den pathogenen Charakter des genannten Mikroorganismus sind von ihm erhaltene Produkte jedoch auf den Gebieten der Arznei- und Nahrungsstoffe von geringem oder höchstens zweifelhaftem Nutzen.

Aus diesem Grund ist die Expression heterologer Gene in Bacillus subtilis wünschenswert, das einen Organismus darstellt, welcher die vorstehend erwähnten Nachteile von

E. coli nicht aufweist und somit von hoher technischer Bedeutung ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Hybridplasmide bereitzustellen, die sich zur Verwendung als Vektoren für die Transformation in Bacillus subtilis zur Herstellung heterologer Proteine eignen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. . ■

Di_e Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

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Zur Erfindung gehören auch bifunktionelle Plasinide, die sowohl in B. subtilis als auch in E. coli expremiert werden

können, und die sich zur Herstellung der genannten Vektoren eignen.

Erfindungsgemäß wird ein Plasmid verwendet, das ursprünglich aus Staphylococcus aureus gewonnen wurde. Die Modifizierung dieses Plasmids stellt einen wesentlichen Aspekt der Erfindung dar.

Das in Frage stehende Plasmid (pE194) wurde intensiv untersucht und seine Primärstruktur bestimmt; vgl. B. Weisblum und Mitarb., J. Bacteriol. 139 (1979), S. 635 bis 643, A.G. Shivakumar und Mitarb., Plasmid 2 (1979), S. 279 bis 289, A.G. Shivakumar und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980), S 3903 bis 3907, T.J. Gryczah und Mitarb.

Nucl. Ac. Res. 8 (1980) , S. 6081 bis 6097 und S.Horinouchi und Mitarb., J. Bacteriol. 150 (1982), S. 804 bis 814. Es enthält sehr aktive Erkennungssequenzen für das Transcriptions- und Translationssystem (vgl. A.G. Shivakumar in "Plasmid 2", T.J. Gryczan und S. Horinpuchi, a.a.O.) die zur Synthese einer Methylase benutzt werden können, welche Resistenz cregen Erythromycin verleiht. Das Plasmid pE194 wurde wie erwähnt hinsichtlich des aus der Literatur bekannten Plasmids dahingehend modifiziert, daß der Promotor und die Shine-Dalgarno-Sequenz des Methylase-Gens als Erkennungspunkt für die RNS-Polymerase bzw. die Ribosomen zur Synthese von heterologen Proteinen in E. coli und B. subtilis verwendet wurden. Diese Modifizierung stellt einen wesentlichen Aspekt der Erfindung dar.

Durch Erzeugung einer Schnittstelle gerade nach der von den Riboscnien zu erkennenden Sequenz wird der Einbau eines gegebenen Gens ermöglicht, das somit unter der Kontrolle des Promotors und der Shine-Dalgarno-Sequenz des Eryhtromycin- resistenz ergebenden Gens expremiert wird. Außerdem kann das. kodierte heterologe Protein wie im Fall von Methylase (vgl. B. Weißblum und A.G. Shivakumar, a.a.O.) durch das klo-

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nierte Gen synthetisiert werden, wenn die Zellen einer subinhibierenden Erythromycin-Dosis ausgesetzt werden.

Das wie beschrieben modifizierte Plasmid pE194 kann zur Herstellung von Hybridplasmiden benutzt werden, die sich aus der-Verbindung von pE194 mit den Plasmiden pUB110 und pBR322 ableiten. Diese Hybridplasmide sind ein weiterer wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung.

^ Beispiele für diese Hybridplasmide sind die Plasmide mit den Bezeichnungen pSM15, pSM16 und pSM17, die Kloniervektoren in Bacillus subtilis darstellen und die durch einen Kanamycin-Resistenzmarker gekennzeichnet sind, mit dessen Hilfe sie selektioniert werden können, sowie durch eine EcoRI—Schnittstelle, die sich in der Nähe des Endes der Ribosomen-Erkennungssequenz befindet. An dieser Stelle können von heterologer DNS erhaltene DNS-Fragmente nach dem Schneiden mit EcoRI kloniert werden. In ähnlicher Weise ist es nach einer Behandlung der Vektoren mit dem Enzym Sl nach Linearisierung mit EcoRI möglich, Fragmente zu klonieren, die mit irgendeinem Enzym erhalten werden und (i) ein "blunt end" oder (ii) ein "sticky end" aufweisen, und zwar nach Behandlung mit Sl oder Poll von E. coli.

Ein weiteres Merkmal der Plasmide besteht darin, daß die

klonierte DNS durch Verwendung einer subinhibierenden Dosis (0,02 μσ/ml) Erythromycin zur Kyperproduktion der kodierten heterologen Proteine angeregt werden kann.

Das Plasmid pSM15 ist in Figur 1 dargestellt, während Figur sein Herstellungsverfahren erläutert.

Die Sequenzen des modifizierten Bereichs, in den die EcoRI-Schnittstelle eingefügt wurde, sind in Figur 7 dargestellt,

die auch die Unterschiede zwischen den Plasmiden pSMi6 und

pSM17 im Vergleich mit dem Plasmid pSMi5 erläutert. , _copY ' ORIGINAL INSPECTED ^

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Die Plasmide der Erfindung sind Vektoren zur Klonierung von heterologer DNS. Sie erleichtern den Einbau der gewünschten Gene in die Wirtszelle. Folgende klonierte Gene sind dabei von besonderer Bedeutung: ß-Lactamase, iso-Amylase und

° Dehydrofolsäure-Redukfcase.

Die Plasmide der Erfindung werden nach einem Verfahren erhalten, bei dem das Ausgangsmaterial die Plasmide pE194 und pBR322 sind, die aus dem 3tann . Bacillus subtilis BD170 (vgl.

B. Weisblum, a.a.O.) bzw. Escherichia coli HB101 (vgl.

F. Bolivar und Mitarb., Gene 2 (1977) S. 75 bis 93) erhalten werden. Beide sind im molekularbiologischen Laboratorium leicht zugänglich. Zusätzlich wird das Plasmid pBU110 im Verfahren der Erfindung verwendet; vgl. B. Weisblum, a.a.O.

Ein wesentlicher Teil des Verfahrens der Erfindung ist neben der anfänglichen Modifizierung des Plasmids pE194 die Herstellung und Gewinnung der Plasmide pSM4 (Figur 3), pSM5 und pSM6, die zur Expression entweder in B. subtilis oder E. coli

befähigt sind und somit wichtige Zwischenprodukte für die Herstellung der Plasmide pSM15, pSM16 und pSM17 darstellen.

Die vorher erwähnten und die übrigen Figuren zeigen die Stellen, an denen die verschiedenen Restriktionsenzyme die Plasmi-

de schneiden. Die wichtigen Schnittstellen sind neben denjenigen für EcoRI die Schnittstellen für die Enzyme BamHI, Hindlll, Xbal und Sstl, die alle zur Linearisierung von Plasmiden mit einer einzelnen Erkennungsstelle befähigt sind.

In der beiliegenden Zeichnung zeigt:

Figur 1 eine Restriktionskarte des Plasmids pSM15;-Figur 2 schematisch die Herstellung des Plasmids pSMi5; Figur 3 eine Restriktionskarte des Plasmids r-SM4;

Figur 4 die unterschiedliche Orientierung des pE194-Frag-

' ments im Hinblick auf pBR322 in den Plasmiden pSM1 und pSM2 ;

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Figur 5 schematisch die Herstellung des Plasmids pSM3 aus

dem Plasmid pSM2,

Figur 6 schematisch die Verminderung der Länge eines linearen DNS-Fragments durch kombinierte Einwirkung der Enzyme ExoIII und SI und

Figur 7 schematisch das den Promotor und die Shine-Dalgarno-Sequenz enthaltende pE194-Fragment sowie seine Modifizierung zu den Plasmiden pSM15, pSM16 und pSM17.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung. 10

1. Herstellung der Plasmide pE194 und pBR322 1 Liter LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l NaCl) wird mit dem B. subtilis-Stamm BD 170 (pE194) und dem E. coli-Stamm HB101 (pBR322) überimpft. Nach etwa 15 Stunden Wachstum bei 32 bzw. 37°C werden die Zellen durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 5000 U.p.M. geerntet. Die Zellen werden zum Waschen in der Hälfte des ursprünglichen Volumens einer Lösung von 25 % Sucrose, 0,1 M NaCl und 0,05 M Tris-Cl (pH 7,5) suspendiert, danach erneut zentrifugiert und wieder in 1/10 des ursprünglichen Volumens (100 ml) der gleichen Lösung suspendiert. Dann werden die Zellen nach der Zugabe von Lysozym zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Schließlich wird jeder der beiden Behälter, die 100 ml der resuspendierten Zellsuspensionen enthal- · ten, in nachstehender Reihenfolge mit den folgenden Zusätzen versetzt; 24 ml 5 M NaCl, 6 ml 0,5 M EDTA bei pH 8,5 und 130 ml 2 % SDS, gefolgt von 0,7 M NaCl. Das Gemisch wird dann etwa 15 Stunden bei 4⁰C gehalten.

Anschließend werden die Lösungen bei 8000 U.p.M. in einem Sorvall GSA-Rotcr 45 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird mit 1/10 des Volumens einer 3M Natriumacetatlösung und 2 Volumenteilen 95 % Äthanol versetzt.

Die Lösungen werden 3 Stunden bei -20⁰C belassen und anschließend unter Verwendung eines Sorvall GSA-Rotors 30 Minuten bei 8000 U.p.M. zentrifugiert.

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Die erhaltenen Pellets werden in TES (3OmMTrIs-Cl, pH 7,5, 50 mM NaCl und 5 mM'EDTA) resuspendiert, wobei zur Herstellung von pE194 bzw. pBR322 ein Endvolumen von 24 ml erhalten wird. Beide Zubereitungen werden dann auf 4 Gefäße verteilt, die jeweils die nachstehenden Bestandteile enthalten:

6 ml der Plasmidlösung, 2 ml Athidiumbromid (1 mg/ml) und 7,35 g Caesiumchlorid.

Die Gefäße werden 40 Stunden in einem Beckman 70Ti-Rotor bei 40 000 U.p.M. zentrifugiert. Danach zeigen alle Röhrchen zwei im UV-Licht klar sichtbare getrennte Schichten, von denen eine die chromosomale DNS und die andere (untere) Schicht die Plasmid-DNS darstellt.

Die unteren Schichten werden mit Hilfe einer Injektionsspritze extrahiert und die Lösungen viermal mit Isopropanol gewaschen und gründlich gegen TE-Pufferlösung (10 mM Tris-Cl . und 1 mM EDTA, pH 8,0) dialysiert.

· Sodann werden die beiden Plasmid-DNSen in Äthanol bei -20° ausgefällt, nachdem jede der Lösungen mit 1/10 des Volumens einer 3 M Natriumacetatlösung und mit 2 Volumenteilen 95 % Äthanol versetzt wurde. Nach 30 Minuten Zentrifugieren in einem Sorvall SS 34-Rotor bei 10 000 U.p.M. werden die erhaltenen Pellets mit 70 % Äthanol gewaschen, getrocknet und dann in TE-Pufferlösung resuspendiert, wobei eine Plasraidlösung mit einer. Konzentration von 100 ug/ml erhalten wird.

2. Herstellung des Hybridplasmids pE194-pBR322

1 \ic pE194 und 1,4 \ig pBR322 werden vermischt und mit dem Restriktionsenzym Pstl linearisiert, welches von BRL erhalten und nach den Angaben des Herstellers eingesetzt wurde. Die Umsetzungen werden durch Zugabe eines gleichen Voluiuenia von mit TE-Pufferlösung gesättigtem Phenol gestoppt. Nach den

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Rühren wird das in der wäßrigen Phase vorhandene Phenol dreimal mit Äther extrahiert. Dann wird die DNS nach Zugabe von Ί/10 des Volumens von 3 M Natriumacetat und 2 Volumenteilen 95 % Äthanol während 10 Minuten bei -70⁰C ausgefällt. Die

*> DNS wird in 100 μΐ einer Lösung mit einem Gehalt von 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 1OmM MgCl₃, 10 mM Dithiothreitol und 15 |iM ATP resuspendiert. Danach werden 0,05 U T4-Ligase, hergestellt gemäß B. ^T-7eiss und Mitarb., J. Biol. Chem. 243 (1968), S. 4543 bis 4555, zugesetzt und die Umsetzung 4 Stunden bei 1O⁰C fortgeführt.

5 μΐ des ligierten Gemisches werden zur Transformierung von E. coli HB101-Zellen verwendet, welche in geeigneter Weise mit 0,1 M CaCl--Lösung behandelt wurden; vgl. M. Dagert und S.D. Ehrlich, Gene 6 (1979), S. 23 bis 28.

Zur Selektion wird 0,1 ml der transformierten Zellen auf L-Agar und 15 μg/ml Tetracyclin enthaltende Platten aufgebracht. Danach wird überprüft, ob die Kolonien gegen Ampicillin empfindlich sind (da durch einen Schnitt mit Pstl bei pBR322 das ß-Lactamasegen, das die Ampicillinresistenz ergibt, inaktiviert wird, wird durch Einfügung eines DNS-Moleküls an der Pstl-Schnittstelle von pBR322 die Ampicillinresistenz aufgehoben).
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Die Plasmide aus sechs Tc^, Amp -Kolonien werden wie folgt gereinigt:

1 ml O.N.-Kultur eines jeden Klons wird 1 Minute in einer

Epperdorf-Zentrifuge Typ 5414 zentrifugiert. Die Zellen werden abgetrennt, in 1 ml 25 % Sucrose, 0,1 M NaCl und 0,05 M Tris-Cl, pH 7,5 resuspendiert und erneut zentrifugiert.

Die Zellen werden hierauf in 100 μΐ der gleichen"Lösung re-35

suspendiert, die 0,5 mg/ml Lysozym enthält und 15 Minuten bei 37° C inkubiert. Die nachstehenden Stoffe werden anschlie-

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ßend in folgender Reihenfolge zugegeben: 24 μΐ 5 M NaCl-Losung, 6 μΐ 0,5 M EDTA pH 8,5 und 135 μΐ 2 % SDS,.0,7 M NaCl. Die Lösungen werden 3 Stunden bei 4° C belassen und anschließend 15 Minuten in einer Epperdorf-Zentrifuge Typ 5414a zentrifugiert.

Nach der Zugabe von 2 μΐ einer Lösung von Pankreas-RNSse (10 mg/ml)werden die überstehenden Flüssigkeiten 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann werden 10·μ1 bei 37°C 1/2 Stunde vcrverdaute Pronase (10 mg/ml) zugegeben und die Proben erneut 2 Stunden bei 37⁰C inkubiert.

Schließlich werden die Proben mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetatlösung und 2 Volumenteilen 95 % Äthanol versetzt. Die DNSen werden im Verlauf von 10 Minuten bei -70⁰C ausgefällt.

Nach dem Zentrifugieren werden die Pellets getrocknet und dann in 40 μΐ Pstl-Reaktionspufferlcsung (20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 itiM MgCl„ und 50 mM Ammoniumsulfat) resuspendiert. Nach Zugäbe einer Enzymeinheit und einer Stunde Inkubation bei 37⁰C werden die Proben auf 0,8 % Agarosegel gebracht und die DNSen durch Anlegen einer Potentialdifferenz von 30 V im Verlauf von 15 Stunden getrennt.

Das Gel wird mit einer 0,5 ^Vml-Lösung von A'.thidiumbromid angefärbt, und es zeigt sich, daß alle sechs analysierten Kolonien eine Plasmid-DNS enthalten, die nach der Verdauung - mit Pstl zwei verschiedene Banden ergibt, die mit den linearisierten pE194-und pBR322-Molekülen wandern.

Dies zeigt, daß die Plasmide tatsächlich aus pE194 und pBR322 bestehen, welche an der Pstl-Schnittstelle miteinander verbunden sind.

Zwei willkürlich aus den sechs ausgewählte Klone wurden a.. schließend auf die Orientierung des pE194-Moleküls in Bezug

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auf das pBR322 analysiert. Hierzu wird die aus den Klonen extrahierte Plasmid-DNS mit dem Enzym Hindlll linearisiert, das im pBR322-Bereich in einer Entfernung von 783 Basenpaaren vcn der Pstl-Schnittstelle schneidet. Anschließend wird das linearisierte Plasmid mit Sstl geschnitten, das im pE194-Bereich in einer Entfernung von 1059 Basenpaaren von der Pstl-Schnittstelle schneidet. In Abhängigkeit von der Orientierung des ρΕ194 im Verhältnis zum pBR322 ist als Ergebnis dieser doppelten Verdauung das Auftreten von zwei Banden im Agarosegel zu erwarten, deren Molekulargewichte 3,14 χ 10 und 2,2 χ 10⁶ bzw. 4,1 χ 10⁶ und 1,3 χ 10⁶ betragen.

Die Analyse des Agarosegels zeigt, daß ein Klon ein Plasmid enthält, das nach dem Schneiden ir.it Hindlll und Sstl zwei DNS-Fragmente mit Molekulargewichten vcn 3,20 χ 10 und 2,32 χ 10 ergab, während der andere Klon eine Plasmid-DNS enthält, das nach gleichem Verdau zwei Fragmente mit den Molekulargewichten 4,20 χ 10 und 1,32 χ 10 ergibt. Dies zeigt, daß die beiden Plasmide, die als pSM1 und pSM2 bezeichnet werden, verschiedene Orientierungen aufweisen (Figur 4).

3. Eliminierur.g der EcoRI-Schnittstelle im Plasmid pSM2

Das Plasmid pSM2 enthält eine einzige EcoRI-Schnittstelle im pBR322-Bereich (Figur 4) . Zur Abtrennung dieser Schnittstelle wird 1 μg pSM2 (10 μΐ) mit einer Einheit EcoPI 1 Stunde bei 37°C in 30 μ 1 einer Lesung von 100 mM Tris-Cl pH 7,5, 5 mM MgCl„, 2 mM Mercaptoäthanol und 50 mM NaCl verdaut.

Danach wird das Enzym durch Zugabe von 30 μΐ mit TE-Pufferlösung gesättigtem Phenol inaktiviert. Nach dem Abtrennen des Phenols aus der wäßrigen Phase und der Ausfällung der CNS nach dem verstehend beschriebenen Verfahren wird das linearisierte Plasmid in 40 μΐ einer Lösimq von 10 mM HaOIV: -UOA- pH 4,13, 300 mM NaCl und 12 mM ZnSO. rosuspendiert und dann mit 2 μΐ Enzym Sl (11,7 U/μΙ) versetzt. Das Enzym wird 1 Stunde bei 15⁰C einwirken gelassen und dann durch Zugabe eines Tropfens

Phenol inaktiviert. COPY

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Nach Abtrennung des Phenols durch dreimalige Extraktion mit Äther wird die DNS im Verlauf von 10 Minuten bei -70⁰C durch Zugabe von 4 μΐ 3 M Natriumacetat und 100 μΐ 95 % Äthanol ausgefällt.

·

Das nach 10 Minuten Zentrifugieren in einer Epperdorf 5414-Zentrifuge erhaltene Pellet wird getrocknet und dann in 40 ml einer Lösung resuspendiert, die 50 ir.M Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 50 μΐη ΛΤΡ enthält. Die Lösung wird sodann mit einer Einheit T4-Ligase versetzt: und die Umsetzung weitere 12 Stunden bei 10⁰C durchgeführt. Sodann wird das Enzym 10 Minuten bei 65°C inaktiviert und 5 μΐ des Reaktionsgemisches werden zur Transformierung von 100 μΐ E.coli HB101 Zellen verwendet, die gemäß vorstehender

Beschreibung vorbehandelt worden sind. Die Transformation ergibt 44 Tc^R Klone.

Drei dieser Klone werden sodann analysiert. Nach der Extraktion von 1 ml der Plasmidkultur unter Anwendung des vorstehend beschriebenen raschen Extraktionsverfahrens wird bei zwei Klonen ein Plasmid nachgewiesen, das bei der Verdauung mit EcoRI nicht von der helikalen in die lineare Form übergeht. Dies beweist den Verlust der EcoRI-Schnittstelle.

Eines dieser Plasmide, das aus 1 Liter Kulturlösung gereinigt wird, erhält die Bezeichnung pSM3 (Figur 5).

4. Gewinnung des Hpal-Sstl-Fragments von pSM3

wie aus Figur 5 hervorgeht, weist das pSM3 nur eine einzige Hpal- und eine einzige Sstl-Schnittstelle auf, die beide in dem pE194-Bereich liegen. pSM3-DNS ergibt deshalb bei der Verdauung mit diesen Restriktionsenzymen zwei Fragmente mit Molekulargewichten von 5x10 und 4,83 χ 10 .

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7 μg pSM3 DNS, gereinigt wie vorstehend im Hinblick auf pE194 und pBR322 beschrieben, werden mit 7 U Hpal unter Verwendung des vom Hersteller (BRL) empfohlenen Puffers in einer Lösung mit einem Endvolumen von 100 μΐ 1 Stunde bei 37⁰C verdaut. Danach wird das Enzym im Verlauf von 10 Minuten bei 65⁰C inaktiviert. Anschließend wird die Lösung mit 1,8 μΐ 5 M NaCl, 3 μΐ konzentrierte Mercaptoäthanollösung und 7 Einheiten Sstl versetzt. Die Umsetzung wird 1 Stunde bei 37°C fortgeführt. Hierauf wird das Enzym wieder im Verlauf von 10-Minuten bei 65⁰C inaktiviert.

Die DNS wird mit milt TE-Puffer gesättigtem Phenol behandelt und durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetatlösung und 2 Volumenteilen 95 % Äthanol bei -70⁰C ausgefällt. Der Niederschlag wird getrocknet und dann in 300 μΐ 30 mM Tris-Cl pH 8,1, 1 mM EDTA und 1 M NaCl resuspendiert.

Anschließend wird die Probe auf 5 ml Sucrosegradient 5 bis 20 % gebracht und 7,4 Stunden in einem Beckman Sw 55.1-Rotor bei 40 000 U.o.M.. zentrifugiert.

Sodann werden 23 Fraktionen von jeweils 6 Tropfen aufgefangen und 15 μΐ jeder Fraktion auf 0,8 % Agarosegel analysiert. In den Fraktionen 16 bis 21 findet sich fast das gesamte..·';· große Hpal-Sstl-Fragment. Diese Fraktionen werden zusammen : geerntet, mit einem gleichen Volumen H^O verdünnt und"die DNS nach Zugabe von 2 Volumen S5 % Äthanol im Verlauf von 14 Stunden bei -20⁰C ausgefällt. Nach 30 Minuten Zentrifugieren in einem Sorvall SS34 Rotor bei 10 000 U.p.M. wird das.Pellet mit 70 % Äthanol gewaschen, getrocknet und in TE-Pufferlösung zu einer DNS-Endkonzentration von 100 μg/ml resuspendiert. .-

5. Anbringen eines Linkers an das Sstl - Hpal-Fragment

In dem geschilderten Beispiel wird ein eine EcoRI-Schnittstelle enthaltender Linker verwendet. 1 μg des Sstl - Hpal-Fragments (10 μΐ) wird zum Anbringen des

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EcoBI CCTTAAGG "^{Linkers an sein} "blunt end" verwendet. Der EcoRI-Linker wird in 500-fachem molarem Überschuß im Verhältnis zu dem Fragment zu 50 μΐ Reaktionsgemisch gegeben, das 1 μg des Fragments, 50 μΜ ATP, 50 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl₃ und 10 mM Dithiothreitcl enthält. Danach werden 2 U T4-Ligase zugegeben und die Umsetzung 12 Stunden bei 10⁰C durchgeführt. Anschließend wird das Enzym 10 Minuten bei 65⁰C inaktiviert.

6. Herstellung des-pE194 DNS-Fragments mit den Promotor-' und Shine-Dalgarnc-Sequenzen des Methylase-Gens

Das Fragment wird durch Abspaltung aller überflüssigen Teile aus Teil III der Shine-Dalgarno-Sequenz nach folgendem Verfahren erhalten:

10 μg pE194 werden 1 Stunde bei 37⁰C in 150 μΐ Endvolumen aus 6 mM Tris-Cl pH 7,6, 6 mM MgCl_, 6 mM Mercaptoäthanol und 10 Einheiten Haelll verdaut. Anschließend wird das Enzym durch Zugabe eines gleichen Volumens mit TE-Pufferlösung gesättigten Phenols inaktiviert. Das in der wäßrigen Phase gelöste Phenol wird durch dreimalige Extraktion mit Äther abgetrennt. Danach wird die DNS im Verlauf von 10 Minuten bei -70⁰C durch Zugabe von 20 μΐ 3 M Natriumacetatlösung und 400 μΐ 95 % Äthanol ausgefällt. Nach 10 Minuten Zentrifugieren in einer 5414 Epperdorf-Zentrifuge wird das Pellet mit 100 μΐ 70 % Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.

^ου Die ENS wird dann in 40 μΐ 100 mM Tris-Cl pH 7,6 und 10 mM MgCl₂ resuspendiert. Nach Zugabe von 4 μΐ ExoIII (BRL, 25 Einheiten/μΐ) wird die Umsetzung 16 Minuten bei 20⁰C fort geführt. Unter diesen Bedingungen werden pro Minute etwa 8

bis 10 Basan von 3'-Ende abgespaltet (Figur 6). 35

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Sodann wird die Umsetzung durch Zugabe von 40 μΐ einer Löt sung von 200 mM NaOAc-HOAc pH 4,13, 600 mM NaCl und 24 rr.M ZnSO. abgebrochen.

Sodann wird das Reaktionsgemisch mit 3,5 μΐ Enzym Sl (11,7 U/ul) versetzt und 2,5 Stunden bei 15°C inkubiert. Hierauf wird das Enzym durch Zugabe eines Tropfens Phenols inaktiviert, das anschließend mit Äther extrahiert wird. Die DNS wird nach Zugabe von 9 μΐ 3 M Natriumacetat und 250 μΐ 95 % Äthanol im Verlauf von 10 Minuten bei -70⁰C ausgefällt und dann durch Zentrifugieren in einer 5414 Epperdorf-Zentrifuge abgetrennt. Das erhaltene Pellet wird getrocknet und in 45 μΐ TE-Pufferlcsung resuspendiert. Zur Abtrennung der Salzverunreinigungen wird die Lösung auf eine Säule mit 1 ml Sephadex G-50 gebracht, das vorher durch Zentrifugieren bei 2000 Cp.M. getrocknet wurde. Die DNS wird durch 2 Minuten erneutes Zentrifugieren der Säule bei 2000 U.p.M. gewonnen. Es werden 40 μΐ Lösung erhalten und sofort mit 5 μΐ Salze für das Enzym Sstl, 10 mal konzentriert (Salz 1X, 14 mM Trds-Cl pH 7,4, 6 mM MgCl-, 90 mM NaCl, 2 mM Mercaptoäthanol) und 6 Einheiten Sstl (BRL) versetzt. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wird das Enzym im Verlauf von 10 Minuten bei 65⁰C inaktiviert.

Die so behandelte DNS wird neben mit Hpall verdautem pBR322 als Molekulargewichtsstandard auf 7,5 % Acrylamidgel gebracht und durch Anlegen einer Pctentialdifferenz von 100 V im Verlauf von 3 Stunden getrennt. Nach dem Bedecken des Gels mit einer Lösung von 0,2 ng/ml Xthidiumbromid zeigt die DNS-Probe wie erwartet eine Reihe von Banden im UV-Licht, die sehr schwierig aufzulösen sind und von etwa 130 bis etwa 180 Basenpaaren variieren, sowie eine Reihe von Banden mit viel höherem Molekulargewicht.

Da der Abstand der Sstl-Schnittstclle vom Ende der Ribosomen-Erkennungssequenz (—GTT) 157 Basenpaare + 4 einzelne Basen

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j beträgt ("sticky end" des Schnitts mit Ssti) wird der Gelbereich zwischen der 13. und der 14. durch Verdauung von pBR322 mit Hpall erzeugten Bande (160 bzw. 147 Basenpaare) mit einem Rasiermesser herausgeschnitten.

Die DNS in der herausgeschnittener. Gelfraktion wird mit 0,8 ml einer Lösung aus 10 mM Magnesiumacetat, 0,5 M Ammoniumacetat, 0,1 SDS und 0,1 mM EDTA 14 Stunden bei 65⁰C gemäß dem von A.Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), S. 560 - 564 beschriebenen Verfahren eluiert; vgl. auch S. Kuhn und Mitarb., Molec. Gen. Genet. 167 (1979) , S. 235 - 241.

Die erhaltenen 0,8 ml Lösung werden mit 2 ml 95 % Äthanol versetzt und die DNS im Verlauf von 24 Stunden bei -20⁰C ausgefällt. Nach 30 Minuten Zentrifugieren in einem Sorvall SS34-Rotor bei 10.000 U.p.M. wird das Pellet mit 0,5 ml 70 % Äthanol gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und in 0,5 ml TE resuspendiert. Das in der DNS-Doppelhelix verbliebene Äthidiumbromid wird durch viermalige Extraktion mit 1-Butanol entfernt. Nach Beendigung der Alkoholextraktion beträgt das Endvolumen der wäßrigen Lösung 160 μΐ.

Diese Lösung wird mit 18 μΐ 3 M Natriumacetatlösung, 2 μΐ 1 M MgCl₂ und 400 μΐ 95 % Äthanol versetzt. Die DNS wird im Verlauf von 10 Minuten bei -70⁰C ausgefällt und durch 10 Minuten Zentrifugieren in einer 5414 Epperdorff-Zentrifuge abgetrennt. Das erhaltene Pellet wird mit 100 μΐ 70 % Äthanol gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und dann in TE zu einer Konzentration von 100 μg/ml resuspendiert .

7. Verbindung des pHi94-Fragments mit dem Hpal - Sstl-

Fragment von pSH3 und Transformation 35

0,1 ng pE194-Fragment, gereinigt gemäß der Beschreibung in vorstehendem Absatz 6) wird in 50 μΐ Ligase-Gemisch, das

L -ÖRIGINAUINSPECTED t J

COPY '

_] 50 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 roM MgCl₃, 10 mM Dithiothreitol' und 50. |aM ATP mit 4 Einheiten T4 Ligase enthält, an 1 μg Hpal Sstl-Fragment von pSH3 (Abschnitt 5) gebunden. Nach 4 Stunden Inkubation bei 10⁰C werden 10 |il des Ligasegemisch.es in der gleichen Pufferlösung 10-fach verdünnt und nach der Zugabe

von weiteren 4 Einheiten T4 Ligase weitere 20 Stunden bei 4⁰C umgesetzt. Sodann wird das Enzym im Verlauf von 10 Minuten . bei 65⁰C inaktiviert.

10 μΐ des verdünnten Ligasegemisches werden zur Transfornation von 100 μΐ HB101 Zellen verwendet, die gemäß vorstehender Beschreibung vorbereitet sind. Es wird auf einer L-Agar-Platte mit 15 ικτ/ml Tc auf Tetracyclinresistenz (Tc^R) selektioniert.

Von den erhaltenen 486 Klonen werden 30 zur Herstellung des Plasmids nach dem vorstehend im Abschnitt 2) beschriebenen raschen Verfahren verwendet. Nach der Ausfällung mit Äthanol wird jedes Pellet in 40 μΐ EcoRI-Puffer 1 χ (100 mM Tris-Cl pH 7,5, 5 mM MgCl-, 50 mM NaCl und 2'mM Mercaptoäthanol) resuspendiert. Die DNSen werden nach Zugabe von 1 Einheit EcoRI in jedem Fall 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach 1 Minute Inaktivierung des Enzyms bei 65⁰C werden die Proben auf 0,8 % Agarosegel gebracht und im Verlauf von 14 Stunden bei einer Spannung von 30 Volt getrennt. Das Gel wird dann 15 Minuten in einer Lösung von 0,5 ug/ml Λthidiumbromid angefärbt und . im UV-Licht geprüft.

21 der entstandenen 30 Plasmide waren nach der Behandlung .'mit EcoRI linearisiert, was auf die Anwesenheit einer EcoRI-Schnittstelle in ihrer Sequenz hinweist.

Gemäß vorstehender Beschreibung werden aus 1 Liter Kulturlösung aus 10 der Klone, die die EcoRI-Schnittstelle aufweisen, Plasmide gewonnen. Alle Plasmide werden mit einem Satz Restriktionsendonucleasen analysiert (Pstl, Sstl, EcoRI und Hpal) und mit den Plasmiden pSM2, pBR322 und pE194 verglichen.

ORIGINAL INSPECTED COPY

Beim Schneiden mit Pstl ergeben alle Plasmide zwei Fragmente, von denen das größere auf dem Agarosegel mit dem linearisierten pBR322 wandert, während das kleinere etwas langsamer . als pE194 wandert. Dies entspricht der Erwartung. 5

Zusätzlich werden die 10 Plasmide mit Sstl und HcoRI geschnitten, wobei zwei Fragmente erhalten werden. Das, größere davon wandert etwas rascher als das linearisierte pSM2, während das kleinere etwa 160 Basenpaare aufweist. Auch dies entspricht der Erwartung.

Die 10 Plasmide erhalten die Bezeichnung pSM(4-13).

8. Sequenz des kleinen EcoRI-Pstl-Fragments der Plasmide pSM4, pSM5 und pSM6

Die DNS der erhaltenen Hybridplasmide (z.B. pSM4, pSM5 usw.) wird einer Doppelverdauung mit EcoRI und Pstl unterzogen, wobei drei auf Agarosegel leicht trennbare Fragmente erhalten werden. Das kleinste Fragment mit etwa 1220 Basenpaaren trägt die Promotor- und Shine-Dalgarno-Bereiche des pE194-Methylasegens.

Zur Bestimmung des Abstands zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und der EcoRI-Schnittstelle, die durch den eingefügten Linker erzeugt wurde, wird das Fragment nach der Reinigmu mit Acrylamidgel gemäß vorstehender Beschreibung (Abschnitt ί in Phage M13 (eine replikative Doppelhelix-Form) kloniert und nach dem "Dideoxynucleotid-Verfahren" zu Sequenzen ausge-

bildet. Das Verfahren ist im einzelnen von F. Sanger und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), S. 5463 5467 und J. Messing und Mitarb., Nucl. Ac. Res. 9, (1981), S. 303 - 321 beschrieben worden.

Nach dem Schneiden des Phagen M 13 mit EcoRI und P^tI wi folgendes Reaktionsgemisch bereitet: 4 μΐ M13mp9 (0,01 pMol

DNS) 4 μΐ EcoRI-Pstl-Fragment von pSM4 (oder pSM5,pSM6) ^: ■ (0,03 pMol DNS), 2 μΐ Lösung von 500 mM Tris-Cl pH 7,5, 100 mil MgCl₉, 10 mM Dithiothreitol, 2 μΐ 1 mM ATP, 7 μΐ H₀O und 1 μΐ T4 Ligase (50 Einheiten/ml). Die Umsetzung wird 18 Stunden bei 12,5⁰C durchgeführt. 2 bis 5 ng DNS aus dem Ligasegemisch werden zur Transformation von E.coli 71.18 Zellen (BRL) verwendet, die gemäß vorstehender Beschreibung" in geeigneter Weise mit CaCl₀ vorbehandelt worden sind. *

· Die weißen, den Phagen, in den das gewünschte Fragment eingebaut wurde, enthaltenden Plaques werden auf einer YT-Agarplatte (8 g Bacto-Trypton, 8 g Bacto-Hefeextrakt und 5 g NaCl/1) selektioniert, nachdem zu 0,3 ml transformierten Zellen 0,2 ml E.coli 71.18 Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase, 0,01 ml IPTG (100 mM), 0,05 ml Xgal (2 % in Dimethylformamid)und 3 ml Weichagar zugesetzt wurden. Die Sequenz des der EcoRI-Schnittstelle benachbarten Bereiches der drei Plasmide pSM4, pSM5 und pSM6 ist in Figur dargestellt.

Die Daten zeigen, daß der EcoRI-Linker in pSM4, pSM5 und pSM6 in einer Entfernung von 0, 3 bzw. 4 Basen vom letzten G der Sequenz GAGGG eingebaut worden ist, das vermutlich dasjenige ist, das von der 16 S ribosomalen RNS erkannt wird und die Bindung der Ribosomen an die RNS erleichtert.

9. Eliminierung der pBR322-Sequenz aus den Plasmiden pSM4, pSM5 und pSM6 und Einfügung von pUB110 in die Xbal- Schnittstelle

2 μg DNS von pSM4, pSM5 und pSM6 werden in 50 μΐ einer Lösung von 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl₂ und 50 mM Ammoniumsulfat mit einem Gehalt an 2 Einheiten Psti verdaut. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37⁰C wird das Enzym im Vorlauf von 10 Minuten bei 65°C inaktiviert.

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Alle Reaktionsgemische werden auf niedrig schmelzendes Agarosegel gebracht und die DNSen durch Anlegen einer Potentialdifferenz von 30 V im Verlauf von 14 Stunden getrennt. Nach dom Anfärben mit Ί\thidiumbromid gemäß vorstehender Be-Schreibung wird das Gel mit UV-Licht bestrahlt. Es wird festgestellt, daß alle drei DNSen aus zwei Fragmenten bestehen, von denen das größere mit dem linearisierten pBR322 wandert, während das kleinere eine etwas größere elektrophoretische Mobilität als pE194 aufweist.

Die kleineren Fragmente werden nach der Entfernung der sie enthaltenden Gelfraktion durch Schmelzen der Agarose bei 65⁰C und zweimalige Extraktion mit Phenol aus dem Gel eluiert. Die DNS in der wäßrigen Phase wird gemäß vorstehender Beschreibung zweimal mit Äthanol gefällt. Nach dem Trocknen der Pellets wird die DNS in TE zu einer Endkonzentration von 20 μg/ml resuspendiert.

0,1 μg dieser DNS wird mit 0,05 Einheiten T4 Ligase in 20 μ.1 einer Lösung von 50 mM Tris-Cl pH 7,5, 1OmM MgCl₃, 10 mM Dithiothreitol und 100 μΜ ATP verbunden. Nach 18 Stunden Inkubation bei 12°C wird das Enzym im Verlauf von 10 Minuten bei 65°C inaktiviert.

Die Plasmide die zirkulär gemacht wurden, werden dann durch Schneiden mit 0,1 Einheiten Xbal (das an einer einzigen Stelle in pE194 schneidet) in 50 μΐ einer Lösung von 6 mM Tris-Cl pH 7,'6, 0,1 M NaCl und 6 mM MgCl₃ im Verlauf von 1 Stunde bei 37°C relinearisiert.

■ . ·

Schließlich werden die Plasmid-DNSen nach der Inaktivierung des Enzyms mit Phenol und der Ausfällung mit Alkohol gemäß vorstehender Beschreibung mit dem Plasmid pUB110 (T.J. Gryczan und Mitarb., J. Bacteriol. 134 (1978), S. 313 bis 329), das mit Xbal in einer Konzentration von 100 μg/ml DNS iinearisiert worden ist im Gemisch mit Liaase verbunden.

^L ORIGINAL INSPECTED

Die drei Ligasegemische werden zur Transformierung von

B. subtilis BD 170 Zellen verwendet, die in geeigneter Weise gemäß Anagnostopoulus und Spizizen, J. Bacteriol. 81 (1961·)/ S. 741 bis 746, vorbehandelt worden sind. Die Selektion wird auf L-Agarplatten mit 5 ug/ml Kanamycin durchgeführt.

Die Plasmide werden nach dem vorstehend beschriebenen raschen Verfahren (Abschnitt 2) aus 10 der von jeder Transformation erhaltenen Kolonien extrahiert. Die Plasmide werden dann mit Xbal geschnitten und mit der von pUB110 erhaltenen" und mit Xbal geschnittenen DNS sowie mit den DNSen der Plasmide pSM4, pSM5 und pSM6, die mit Pstl geschnitten wurden, verglichen.

Diejenigen Kolonien, bei denen ein Plasmid gefunden wurde, das nach dem Schneiden mit Xbal zwei Fragmente ergibt, von denen das Größere mit der mit Xbal linearisierten DNS von PÜB110 und das kleinere mit dem kleinen Fragment der mit Pstl geschnittenen Plasmide pSil4, pSM5 und pSM6 wandert, "

^ wurden zur Herstellung von Plasmiden aus 1 Liter Kulturlösung verwendet.

Die dabei erhaltenen Plasmide, denen die Bezeichnung pSMI5, pSM16 und pSMI7 gegeben wurde, wurden mit verschiedenen Re-

striktionsenzymen analysiert. Dabei wurde ihr Aufbau wie folgt bestimmt: :

pSMi5: pUBi10 + das kleine Pstl-Fragment von pSM4 pSMi6: pUB110 + das kleine Pstl-Fragment von pSM5 pSM17: püB110 + das kleine Pstl-Fragment von pSM6.

ORIGiMALiNSPECTED

Leerseite

Claims (4)

VOSSlUS -VOSSlUS -TAUCH WEKrH^1JNEMANN -RAUH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE 4--8OOO MÜNCHEN 86 · 'jf (O89) 4.7 4O 75 u.Z.: S 611 (Ra/kä) «J£^eP· JS83 Case: CR/mz/1101 ENI - ENTE NAZIONALE IDROCARBURI ! Rom, Italien " Plasmidvektoren zur Expression in Bacillus subtilis und Verfahren zu ihrer Herstellung " Patentansprüche

1. Hybridplasmide, erhalten durch aufeinanderfolgende Verbindung des Plasmids pE194 mit den Plasmiden pBR322 und pUB110, wobei das Plasmid pE194 dadurch modifiziert worden ist, daß eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzyin hinter der Shine-Dalgarno-

Sequenz des Methylasegens in einer Position eingefügt wurde, die für die Klonierung und Expression eines heterolo-

gen Gens geeignet ist.
25

2. Hybridplasmide, erhalten durch Verbindung des Plasmids pUB110 mit dem gemäß Anspruch 1 modifizierten Plasmid pE194, gekennzeichnet durch ein Kanamycin-Resistenzgen als Marker, eine am Ende der Ribosomen-Erkennungssequenz befindliche EcoRI-Schnittstelle und durch die Möglichkeit, die Expression des heterologen Proteins, für das die klonierte DNS kodiert, durch Anwendung einer subinhibierenden Erythromycxndosis zu induzieren.

3. Plasmid pSMi5, erhalten durch Verbindung des Plasmids pUB110 mit dem kleinen Pstl-Fragment des Plasmids pSM4.

^- ί7~Λ*—^ΐηι\,·ητ ;

1

4. Plasmid pSMi6, erhalten durch Verbindung des Plasmids pUB110 mit dem kleinen Pstl-Fracrnient des Plasmids pSM5.

5. Plasmid pSMi7, erhalten durch Verbindung des Plasmids

5 pUB110 mit dem kleinen Pstl-Fragment des Plasmids pSM6.

6. Plasmide pSM4, pSM5 und pSM6, erhalten durch Modifizierung des Plasmids pE194 und befähigt zur Expression entweder in B.subtilis oder in E. coli.

7. Verwendung der Hybridplasmide gemäß Anspruch 1 bis 5 als Klonierungsvektoren in B. subtilis.

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