DE3638033C2

DE3638033C2 -

Info

Publication number: DE3638033C2
Application number: DE3638033A
Authority: DE
Inventors: Shigezo Prof. Udaka; Norihiro Tsukagoshi; Hideo Nagoya Aichi Jp Yamagata
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-11-07
Filing date: 1986-11-07
Publication date: 1989-09-28
Also published as: FR2589880A1; CH671032A5; GB2182664A; US4994380A; DK533386A; GB8626680D0; DE3638033A1; SE8604636L; DK533386D0; SE469560B; GB2182664B; SE8604636D0; JPH07108224B2; JPS62201583A; FR2589880B1

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch angegebene Verfahren zum Exprimieren von Genen durch Bacillus brevis.

Wenn ein bestimmtes Gen durch rekombinante DNA-Technik unter Verwendung von Prokaryonten exprimiert werden soll, scheint es, daß die Wahl eines Wirts und auch die Wahl eines für den Wirt geeigneten Sektors sehr wichtig ist. Bacillus brevis scheidet eine große Menge Protein an seine Zellumgebung ab, und ein derart abgesondertes Protein weist eine sehr niedrige Proteaseaktivität auf. Deshalb ist Bacillus brevis als Wirt geeignet. Jedoch wurde Bacillus brevis bisher nicht als Wirt verwendet, da ein geeigneter Plasmidvektor durch rekombinante DNA-Technik nicht hergestellt worden ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Exprimieren von Genen durch Bacillus brevis anzugeben.

Diese Aufgabe löst die Erfindung durch ein Verfahren, wie es im Patentanspruch angegeben ist.

Der hier gebrauchte Ausdruck "im unteren Teil" bedeutet, daß ein Strukturabschnitt weiter unten liegt, wenn eine Strukturformel der DNA fortschreitend entlang einer Linie geschrieben wird, wobei das 5′-Ende der Desoxyribose an der oberen Seite und das 3′-Ende an der unteren Seite angeordnet ist.

Vorzugsweise liegen 17 Basenpaare zwischen den Nucleotidsequenzen (a) und (b).

Um ein Strukturgen, das von verschiedenen Spezies abgeleitet ist, unter der Kontrolle der obengenannten Promotoren zu exprimieren, ist es erforderlich, daß die Verknüpfung so durchgeführt wird, daß die Nucleotidsequenzen (c) und (d) zwischen der Promotornucleotidsequenz (b) und dem Strukturgen angeordnet werden. Dazu ist es bevorzugt, das Strukturgen in einen Plasmidvektor einzusetzen, der ursprünglich sowohl eine Ribosomen-Bindungsstelle als auch ein Transla lationsiniationscodon aufweist. Alternativ ist es möglich, ein Strukturgen, das sowohl die Ribosomen-Bindungsstelle als auch das Translationsinitiationscodon aufweist, in einen Plasmidvektor einzubauen. In dem Fall, in welchem ein Plasmidvektor verwendet wird, der weder eine Ribosomen- Bindungsstelle noch ein Translationsinitiationscodon noch diese beiden aufweist, muß ein Strukturgen, das entweder die Ribosomen-Bindungsstelle oder das Translationsinitiationscodon oder beide aufweist, in den Plasmidvektor eingebaut werden. Andernfalls muß entweder die Ribosomen-Bindungsstelle oder der Translationsinitiationscodon zusätzlich in den Plasmidvektor eingebaut werden. Es kann ein Vektor mit einer DNA-Sequenz, entsprechend einem Signalpeptid, verwendet werden.

Das Strukturgen kann eine weiter native Promotorsequenz aufweisen. Darüber hinaus kann das Strukturgen mit einer DNA-Sequenz, entsprechend einem Signalpeptid, eingesetzt werden.

Es ist nicht erforderlich, daß von einem speziellen Stamm, der aus Bacillus brevis ausgewählt ist, Gebrauch gemacht wird. Bevorzugte Beispiele für Bacillus brevis sind Bacillus brevis 47 FERM-P7224 und 481 FERM-P7531.

Wenn ein Plasmidvektor, in den das Strukturgen eingebaut worden ist, in eine Zelle von Bacillus brevis gemäß der Erfindung eingeführt wird, ist der erhaltene Mikroorganismus derart transformiert worden, daß er in der Lage ist, eine große Menge wertvoller Stoffe, wie Proteine usw., zu bilden.

Für das Einbauen des Strukturgens in den Plasmidvektor und auch für das Transduzieren des so erhaltenen Plasmids in Bacillus brevis unter Verwendung einer rekombinanten DNA gemäß der vorliegenden Erfindung können die üblichen Methoden angewandt werden. Für das Strukturgen kann nicht nur ein von Eukaryonten, sondern auch ein von Prokaryonten abgeleitetes Gen benutzt werden. Beispielsweise kann ein Humangen (d. h. Interferon, Insulin usw.), ein Enzymproteingen eines Mikroorganismus (Tryptophanase, Ammoniakaspartat-Lyase etc.) usw. verwendet werden.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel 1. Klonieren der Promotorregion des Zellwandproteingens von Bacillus brevis 47

Fig. 1 zeigt eine Restriktionskarte des Zellwandproteingens und seine Nachbarschaft, die durch Analysieren von chromosomaler DNA von Bacillus brevis 47 (FERM-P 7224) gemäß der Southern-Blot-Methode (J. Mol. Biol., Band 98 (1975), Seiten 503 bis 517) hergestellt wird. Dabei verwendet man als Probe ein DNA-Fragment, das für einen Teil des genannten Zellwandproteins (Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 150 00, das nachfolgend als "150 K-Protein" bezeichnet wird) kodiert. Das erwähnt DNA-Fragment wurde durch Tsukagoshi et al. kloniert, da es keine Promotorregion des Gen kodierenden 150 K-Proteins aufweist (J. Bacteriol., Band 158 (1984), Seiten 1054-1060). Weiterhin wurden die Transkriptionsrichtung und die Transkriptionsinitiationsstellen dieses Gens bestimmt, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist, wobei eine gemäß der S1-Karten-Methode (J. Biol. Chem., Band 256 (1981), 11905-11910) aus Bacillus brevis 47 extrahierte RNA verwendet wurde. In Fig. 1 zeigt eine schraffierte Fläche eine DNA-Fragmentregion von 3100 Basenpaaren (nachfolgend werden 1000 Basenpaare mit "Kb" angegeben) an, und die charakteristischen Stellen auf der oberen und der unteren Seite der Mittellinie geben Restriktionsenzyme sowie Schnittstellen, an denen durch die entsprechenden Restriktionsenzyme abgespalten wurde, an.

Die chromosomale DNA von Bacillus brevis 47 wurde mittels des Restriktionsenzyms BclI abgespalten und dann durch Aragose-Gelektrophorese fraktioniert. Aus den entsprechenden Fraktionen wurden 9 Kb-BclI-Fragmente (fast die gesamte Länge der in Fig. 1 gezeigten DNA) elektrophoretisch eluiert. Die eluierten DNA-Fragmente wurden dann mit dem Restriktionsenzym BglII gespalten, und die erhaltenen 3,1-Kb-Fragmente wurden in der gleichen Weise, wie oben erwähnt, gesammelt, die dem in Fig. 1 schraffierten Bereich entsprechen. Andererseits wurde pHW I DNA (J. Bacteriol., Band 150 (1982), Seiten 804-814) mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten und mit DNA-Polymerase behandelt, damit stumpfe Enden vorliegen. Dann wurden BamHI-Linker (5′ CGGATCCG 3′; 3′ GCCTAGGC 5′) zugegeben, und das erhaltene Produkt wurde mit dem genannten DNA-Fragment von 3,1 Kb durch T4-Ligase verbunden, um eine rekombinante DNA zu bilden. Diese wurde zum Transformieren von Bacillus brevis RM 141 (r_M m_M arg 15 leu B8 his AI rec E4) verwendet (Mol. Gen. Genet., Band 168 (1979), Seiten 111-115). Die so erhaltenen Transformanten ließ man in einem Regenerationsagarmedium, das Erythromycin (10 µg/ml) enthielt, wachsen. Zu den Transformanten wurden vorher hergestellte Antikörper für 150 K Protein gegeben. Als Ergebnis wurden Kolonien gefunden, in denen Stämme mit den Antikörpern umgesetzt waren, wenn durch eine Enzym-Immunoassay-Methode (Gene, Band 16 (1981), Seite 149) unter Verwendung eines mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten Proteins A der Nachweis erfolgte. Das Plasmid pCWP I wurde aus den umgesetzten Kolonien extrahiert, und es wurde bestätigt, daß das genannte 3,1-Kb-Fragment eingebaut worden ist, was durch eine dicke Linie in Fig. 2 dargestellt ist, die eine Restriktionskarte des Plasmids pCWP I zeigt. Fig. 2 enthält verschiedene charakteristische Stellen, wie HindIII, die Restriktionsenzyme und durch die Restriktionsenzyme gespaltene Schnittstellen, wie in Fig. 1, anzeigen.

2. Analyse des klonierten DNA-Fragments und Stärke der Promoteraktivität

Die Basensequenz des klonierten DNA-Fragments wurde nach der Maxam-Gilbert-Methode (Methods Enzymol., Band 65 (1980), Seiten 449-560) bestimmt, und unter Verwendung einer aus Bacillus brevis 47 extrahierten RNA wurde nach der SI-Karten-Methode (J. Biol. Chem., Band 256 (1981), 11905-11910) eine Transkriptions initiationsstelle bestimmt. Als Ergebnis wurden ein offenes Leseraster, das sich von der Stelle bei einer Entfernung von etwa 2 Kb von der Stelle BclI nach der Stelle BglII erstreckt, und vier Transkriptionsinitiationsstellen P 1, P 2, P 3, P 4, die in dem oberen Teil des offenen Leserasters angeordnet sind, wie in Fig. 3 gezeigt ist, gefunden. Nebenbei zeigt Fig. 3 eine Nucleotidsequenz der 5′-Region des Zellwandproteingens von Bacillus brevis 47, Transkriptionsinititiationsstellen, die durch einen Pfeil angegeben sind, sowie eine Aminosäuresequenz, die dem offenen Leseraster, das entsprechend der Erfindung aufgefunden worden ist, entspricht. In Fig. 3 bedeutet das Zeichen eine Promotorregion und das Zeichen ein Translationsinitiationscodon, die beide im Rahmen der Erfindung aufgefunden wurden. Die Tabelle 1 zeigt Nucleotidsequenzen, die an der Stelle gefunden wurden, die sich im oberen Teil einer jeden der genannten vier Transkriptionsinitiationsstellen vom Bereich -10 bis -35 erstreckt. Als Ergebnis der Analyse nach der S1-Karten-Methode wurde bestätigt, daß die Transkription an jeder der Stellen P 2, P 3 und P 4 mit einer größeren Häufigkeit als an der Stelle P 1 initiiert wurde, die eine der Consensus-Sequenz ähnliche Sequenz aufweist, und verglichen mit dem Promotor des α-Amylase-Gens (Pam1) aus Bacillus lichenformis. Die Tabelle II zeigt die gemäß der S1- Karten-Methode bestimmte Stärke der Promotoraktivität, und daraus wird klar, daß die Promotoren P 2, P 3 und P 4 eine höhere Aktivität als der Promotor P 1 und Pam1 aufweisen.

Tabelle I

Tabelle II Stärke der Promotoraktivität nach der S1-Karten-Methode

Art des Promotors
Promotoraktivität
P 1
±
P 2	++
P 3	+++
P 4	++
Pam1	±

3. Herstellung des Vektors zur Verwendung bei der Bestimmung der Promotoraktivität in Bacillus brevis 47 Ein α-Amylase-Gen aus dem Stamm Bacillus licheniformis 584 wurde kloniert (Arch. Biochem. Biophys., Band 155 (1973), Seiten 290-298) und in den Plasmidvektor pHY 481 eingesetzt, der in Bacillus brevis stabil gehalten werden konnte (Appl. Env. Microbiol., Band 49 (1985), Seiten 1076-1079), um das in der Fig. 4 gezeigte Plasmid pHY 483 zu bilden. Es wurde bestätigt, daß alle Nucleotidsequenzen in diesem Amylase-Gen im allgemeinen die gleichen waren wie jene der 5′-Region des α-Amylase-Gen in dem Stamm Bacillus licheniformis FD02 (J. Bacteriol., Band 158 (1984), Seiten 369-372), und das Amylase-Gen war vollständig gleich dem genannten α-Amylase-Gen bezüglich der Sequenz in der Region -10 und der Region -35, der Sequenz an der Ribosomen-Bindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz), des Vorliegens einer umgekehrten Wiederholungssequenz, von der angenommen wird, daß sie die Wirkung hat, die Transkription von dem im oberen Teil angeordneten Gen zu stoppen, usw. Unter Verwendung dieses Gens wurde ein Vektor für den Einsatz bei der Bestimmung der Promotoraktivität in der unten genannten Weise hergestellt.

Zuerst wurde das Plasmid pHY 483 mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten, dann wurde ein Bereich, der sich von der Schnittstelle zu der gerade vor der Shine-Dalgarno-Sequenz in dem α-Amylase-Gen befindlichen Stelle erstreckt, durch Nuclease Bal 31 abgetrennt, wozu BamHI-Linker gegeben wurde. Die erhaltenen Produkte wurde in eine zirkuläre Form gebracht, um das Plasmid pHY 483ΔP zu erhalten. Einerseits wurde das Plasmid pHY 483 mit dem Restriktionsenzym PstI gespalten, dann wurde ein Bereich, der sich in der Richtung abwärts (d. h. zu der gerade vor der umgekehrten Wiederholungssequenz liegende Stelle) von der Schnittstelle zu der Stelle in einer Entfernung von 270 Basenpaaren von der Stelle BamHI erstreckt, in der gleichen Weise abgetrennt. Dazu wurden BglII-Linker (5′CAGATCTG3′; 3′GTCTAGAC5′) gegeben und nachfolgend wurde das erhaltene Produkt in Ringform gebracht, um das Plasmid pHY 483ΔN zu bilden. Andererseits wurde das Plasmid pHY 483ΔP DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und mit der DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu erhalten. Dazu wurden BglII-Linker (5′CAGATCTG3′; 3′GTCTAGAC5′) gegeben, dann wurde mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten und nachfolgend durch Agarose-Gelektrophorese abgetrennt, um ein BglII-SalI-Fragment zu erhalten, das 1,1 Kb aufweist und die 5′-Region des Amylase-Gens enthält. Weiterhin wurde in ähnlicher Weise pHY 483ΔN DNA mit den Restriktionsenzymen BGlII und SalI gespalten, um von dem Amylsasegen ein Fragment zu erhalten, das dessen 5′-Region nicht aufwies und 4,7 Kb hatte. Beide Fragmente wurden durch T4-Ligase ligiert, um das Plasmid pHY 4833 zu erhalten, welches eben das gleiche war wie jenes, das aus einem transformierten Stamm von Bacillus brevis 47 erhalten wurde. Das Plasmid pHY 4833 behielt die umgekehrten Wiederholungssequenzen und die Shine-Dalgarno-Sequenz im oberen Teil des Amylase-Gens bei, wies aber keine Regionen -35 und -10 auf, wie aus Fig. 5 ersichtlich ist. Fig. 5 ist ein Diagramm zur Erläuterung eines Verfahrens zum Herstellen des Plasmidvektors pHY 4833 für den Einsatz in erkennenden Promotoren und zeigt Regionen von Plasmiden, die der Region entsprechen, die sich über die mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI zu spaltenden Stellen erstrecken, wie in Fig. 4 gezeigt. In Fig. 5 gibt das Zeichen eine umgekehrte Wiederholungssequenz und das Zeichen den weggelassenen Bereich an. Die Linie 2 bezeichnet die Stelle der Shine-Dalgarno-Sequenz sowie die Transkriptionsrichtung des α-Amylase-Gens.

4.1 Promotoraktivität der 5′-Region des Zellwandproteingens unter Verwendung des Plasmids pHY 4833 in Bacillus brevis 47 als Wirt

Die 5′-Region des Zellwandproteins wurde abgespalten und abgetrennt, um ein AluI-AluI-Fragment von 600 Basenpaaren, ein AluI-RsaI-Fragment von 165 Basenpaaren und ein RsaI-AluI-Fragment von 435 Basenpaaren zu bilden. Insbesondere war das AluI-AluI-Fragment aus den Nucleotiden von 116-715 aufgebaut, einschließlich Transkriptionsinitiationsstellen P 1, P 2, P 3 und P 4 sowie ihrer entsprechenden -10- und -35-Regionen, wie in Fig. 3 gezeigt ist, das AluI-RsaI-Fragment war zusammengesetzt aus den Nucleotiden von 116-280, einschließlich Transkriptionsinitiationsstellen P 1 und deren -10- und -35-Regionen, und das RsaI-AluI-Fragment war zusammengesetzt aus den Nucleotiden von 281-715, einschließlich der Transkriptionsinitiationsstellen P 2 , P 3 und P 4 sowie ihrer entsprechenden -10- und -35-Regionen. Nach der Zugabe von BamHI-Linker (5′CGGATCCG3′; 3′GCCTAGGC5′) zu jedem dieser Fragmente wurde jedes erhaltene Fragment in eine BgLII-Schnittstelle des Plasmids pHY 4833 eingesetzt, um die Plasmide pTA1, pTA3 und pTA2 zu erhalten, wie in Fig. 6 gezeigt ist. Fig. 6 zeigt 5′-Region-Fragmente des Zellwandproteingens, die durch Einsetzen jedes der genannten entsprechenden Fragmente in den Plasmidvektor pHY 4833 für den Einsatz bei der Bestimmung der Promotoraktivität hergestellt wurden. Jedes der Plasmide pHY 4833, pTA3, pTA2 und pTA1 wurde in Bacillus brevis 47 eingebracht, um die entsprechenden transformierten Stämme zu bilden, und jeder erhaltene Transformante wurde aerob in einem T3-Medium (lösliche Stärke 2%, MgCl₂ · 6H₂O 0,1%, Hefeextrakt 0,4%, Polypepton 2%, Fleischextrakt 0,5%, Uracil 0,01%, pH 7) bei 37°C während einem oder drei Tagen inkubiert, und dann wurde die Menge der extrazellulären Amylase nach der Methode von Saito unter Verwendung von löslicher Stärke als Substrat bestimmt (Arch. Biochem. Biophys., Band 155 (1973), Seiten 290-298). In der Tabelle III sind die so gefundenen extrazellulären Amylaseaktivitäten angegeben. 4.2 Bestimmung der Promotoraktivität der 5′-Region des Zellwandproteingens unter Verwendung des Plasmids pHY 4833 in Bacillus brevis 47 als Wirt Das Zellwandproteingen wurde zuerst mit verschiedenen Restriktionsenzymen oder Bal-31-Nuclease behandelt, um die 5′-Region des Gens zu kürzen, und dann wurden BamHI-Linker (5′CGGATCCG3′; 3′GCCTAGGC5′) zu den gekürzten Enden gegeben, um Fragmente herzustellen. Jedes der Fragmente wurde in die BglII-Stellen in dem Plasmidvektor pHY 4833 eingesetzt, der zur Bestimmung der Promotoraktivität diente und gemäß dem vorhergehenden Abschnitt erhalten worden ist. Auf diese Weise wurden die Plasmide pTA1-pTA8 erhalten, wie in Fig. 7 angegeben ist. Jedes der Plasmide pTA1-pTA8 wurde in Bacillus brevis 47 eingeführt, und jede Transformation wurde aerob in einem T3-Medium (Zusammensetzung wie vorstehend angegeben) bei 37°C inkubiert. Die Menge der extrazellulären Amylase wurde nach der Methode von Saito unter Verwendung von löslicher Stärke als Substrat bestimmt (Tabelle IV). Außerdem zeigt der obere Teil der Fig. 7 Stellen der Promotoren P 1-P 4, eine Shine-Dalgarno-Sequenz und ein Translationsinitiationscodon, gezeigt in Fig. 3. Der untere Teil der Fig. 7 zeigt 5′-Region-Fragmente des Zellwandproteingens, eingesetzt in den Plasmidvektor pHY 4833 für den Einsatz in erkennenden Promotoren in Beziehung zu den genannten Stellen im oberen Teil. Die Nucleotidzahlen in Fig. 7 stehen in Übereinstimmung mit jenen in Fig. 3. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, daß in Bacillus brevis 47 eine Transkriptionsinitiationsfrequenz, ausgehend von der Transkriptionsinitiationsstelle P 1, sehr niedrig ist und diese Stelle -10 und -35 Sequenzen hat, ähnlich Consensus-Sequenz, während eine Transkriptionsinitiationsfrequenz, ausgehend von jeder der Transkriptionsinitiationsstellen P 2, P 3 und P 4, weit höher ist und diese Stellen -10 und -35 Sequenzen aufweisen, unähnlich der Consensus-Sequenz. Insbesondere war die Transkriptionsinitiationsfrequenz von der Stelle P 3 sehr hoch, und ein transformierter Bacillus brevis 47, der das Plasmid pTA7 einschließlich eines P3 alleine aufweisenden Fragments trug, produzierte α-Amylase in einer Menge, die das fünfzigfache von jener betrug, die von irgendeinem transformierten Bacillus brevis 47 gebildet wurde, der das Plasmid pHY 4833 ohne Fragment oder das Plasmid pTA3 einschließlich P 1 allein trug. Außerdem ist die Menge von intrazellulärer Amylase um 10% geringer als jene der extrazellulären Amylase. Die Consensus-Sequenz bedeutet die Nucleotidsequenz einschließlich der Sequenz TTGACA in der -35-Region und der Sequenz TATAAT in der -10-Region, wobei zwischen beiden Sequenzen 17 Basenpaare vorliegen. Bacillus brevis 47, der das Plasmid pTA2 trägt, wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, unter FERM P-8504 hinterlegt.

Claims

Verfahren zum Exprimieren von Genen durch Bacillus brevis, dadurch gekennzeichnet, daß in eine Zelle von Bacillus brevis ein replizierbares Plasmid eingebracht wird, das
- 1. eine Nucleotidsequenz (a) der Formel GCAACT, TTCACG oder TATACT,
- 2. eine Nucleotidsequenz (b) der Formel TTTAAT, TACACT oder AAAGCG, die im unteren Teil der Nucleotidsequenz (a) angeordnet ist, wobei zwischen den Nucleotidsequenzen (a) und (b) 15 bis 20 Basenpaare liegen,
- 3. eine Nucleotidsequenz (c), die im unteren Teil der Nucleotidsequenz (b) angeordnet ist und als Ribosomen-Bindungsstelle in der Zelle von Bacillus brevis wirkt, und das bedeutet, was eine Shine-Delgarno-Sequenz genannt wird,
- 4. eine Nucleotidsequenz (d), die im unteren Teil der Nucleotidsequenz (c) angeordnet ist und als Translationsinitiationscodon mit der Nucleotidsequenz ATg oder TTg in der Zelle von Bacillus brevis wirkt, und
- 5. ein Gen, das mit der Nucleotidsequenz (d) direkt verbunden ist, für die Expression in der Zelle von Bacillus brevis,
umfaßt, worin A Adenin, C Cytosin, G Guanin und T Thymin bedeuten.