CH671032A5

CH671032A5 -

Info

Publication number: CH671032A5
Application number: CH4424/86A
Authority: CH
Inventors: Shigezo Udaka; Norihiro Tsukagoshi; Hideo Yamagata
Original assignee: Shigezo Udaka
Priority date: 1985-11-07
Filing date: 1986-11-06
Publication date: 1989-07-31
Also published as: JPH07108224B2; GB8626680D0; JPS62201583A; FR2589880B1; SE8604636L; GB2182664A; SE469560B; FR2589880A1; DK533386A; GB2182664B; DK533386D0; SE8604636D0; DE3638033A1; DE3638033C2; US4994380A

Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Expression von Genen durch den Bacillus brevis, dadurch gekennzeichnet, dass in eine Zelle des Bacillus brevis ein replizierbares Plasmid eingeführt wird, welches folgendes umfasst:

(a) eine Mukleotid-Sequenz (a), dargestellt durch die allgemeine Formel MNOACP;

(ß) eine Nukleotid-Sequenz (b), die sich stromabwärts nach der Nukleotid-Sequenz (a) befindet und durch die allgemeine Formel QRSWXY dargestellt ist;

(y) eine Nukleotid-Sequenz (c), die sich stromabwärts nach der Nukleotid-Sequenz (b) befindet und als Bindungszentrum für Ribosomen in der Zelle des Bacillus brevis wirksam ist;

(8) eine Nukleotid-Sequenz (d), die sich stromabwärts nach der Nukleotid-Sequenz (c) befindet und als Transla-tions-Initialcodon in der Zelle des Bacillus brevis wirksam ist;

(s) ein Gen, das direkt mit der Nukleotid-Sequenz (d) verbunden ist und in der Zelle des Bacillus brevis exprimiert wird;

worin M G oder T bedeutet; N C, T oder A bedeutet; O A, C oder T bedeutet; P T oder G bedeutet; Q T oder A bedeutet; R T oder A bedeutet; S T, C oder A bedeutet; W A oder G bedeutet; X A oder C bedeutet; und Y T oder G bedeutet; und im übrigen bedeuten A Adenin, C Cytosin, G Guanin und T Thymin.

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Expression von Genen durch den Bacillus brevis.

Wenn ein gewisses Gen durch die rekombinante DNA-Technik. unter Verwendung von Prokaryonten, exprimiert werden muss, scheint die Wahl des Wirts und ebenfalls die Wahl einen Vektors, welcher passend für den Wirt ist, sehr wichtig. Der Bacillus brevis scheidet eine grosse Menge Protein aus zum Äussern seiner Zelle und das ausgeschiedene Protein besitzt eine sehr niedere Protease-Aktivität, demzufolge ist der Bacillus brevis zur Verwendung als Wirt zweckmässig. Der Bacillus brevis ist jedoch bisher noch nicht als Wirt verwendet worden, da mittels der rekombinanten DNA-Technik ein zweckmässiger Plasmid-Vektor noch nicht zugänglich war.

Man hat nun die Aufmerksamkeit auf die Tatsache gerichtet, dass der Bacillus brevis, wie oben erwähnt, ausgezeichnete Eigenschaften besitzt, um als Wirt verwendet zu werden, demzufolge sind erschöpfende Studien unternommen worden, um Vektoren, welche zweckmässig für die Einführung in den Bacillus brevis sind, auszunutzen. Als Ergebnis wurde gefunden, dass ein Strukturgen gut durch den Bacillus brevis exprimiert werden kann, wenn der Bacillus brevis mit einem Plasmid transformiert worden ist, welches im Bacillus brevis replizieren kann und folgendes umfasst:

- eine Nukleotid-Sequenz (a), dargestellt durch die allgemeine Formel MNOACP

- eine Nukleotid-Sequenz (b), welche sich stromabwärts nach der Nukleotid-Sequenz (a) befindet und durch die allgemeine Formel QRSWXY dargestellt ist

- eine Nukleotid-Sequenz (c), die sich stromabwärts nach der Nukleotid-Sequenz (b) befindet und als Bindungszentrum für Ribosomen in der Zelle des Bacillus brevis aktiv ist

- eine Nukleotid-Sequenz (d), die sich stromabwärts nach der Nukleotid-Sequenz (c) befindet und als Transla-tions-Initialcodon in der Zelle des Bacillus brevis wirksam ist

- ein Gen, das direkt mit der Nukleotid-Sequenz (d) verbunden ist und das in der Zelle des Bacillus brevis exprimiert wird.

In den genannten Formeln bedeutet M G oder T; N bedeutet C, T oder A; O bedeutet A, C oder T; P bedeutet T 5 oder G; Q bedeutet T oder A; R bedeutet T oder A; S bedeutet T, C oder A; W bedeutet A oder G; X bedeutet A oder C; und Y bedeutet T oder G; wobei im übrigen A Adenin bedeutet, C Cytosin, G Guanin und T Thymin bedeutet. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff «stromabwärts» 10 bedeutet abwärts, wenn eine DNA-Strukturformel fortlaufend auf einer Zeile geschrieben ist, wobei die 5'-Seite darin auf der aufwärts-Seite und die 3'-Seite auf der abwärts-Seite steht.

Jede der Nukleotid-Sequenzen (a) und (b) hat die Funk-15 tion eines Transkriptions-Promotors. Bevorzugte Beispiele von Nukleotid-Sequenzen (a) sind (1) GCAACT, (2) TTCACG und (3) TATACT und bevorzugte Beispiele der Nukleotid-Sequenz (b) sind (1) TTTAAT, (2) TACACT und (3) AAAGCG. Vorzugsweise befinden sich 17 Basenpaare 20 zwischen den Nukleotid-Sequenzen (a) und (b),'im Fall der genannten bevorzugten Beispiele können jedoch 15 bis 20 Basenpaare zwischen beiden Nukleotid-Sequenzen liegen. Die Nukleotid-Sequenz (c) wirkt als Bindungsteil zum Ribo-som und bedeutet das, was eine Shine-Dalgarno-Sequenz ge-25 nannt wird. Die Nukeotid-Sequenz (d) wirkt als Transla-tions-Initialcodon und bedeutet normalerweise die Nukleotid-Sequenz ATG oder TTG.

Um ein Strukturgen, welches von einer anderen Art abgeleitet ist, unter Kontrolle der obigen Promotors zu expri-30 mieren, ist es erforderlich, dass die Verknüpfung so durchgeführt wird, dass die Nukleotid-Sequenzen (c) und (d) zwischen der Promotor-Nukleotid-Sequenz (b) und dem Strukturgen liegen. Um die Nukleotid-Sequenzen (c) und (d) zwischen der Promotor-Sequenz (b) und dem Strukturgen einzu-35 fügen, wird vorzugsweise das Strukturgen in einen Plasmid-Vektor eingefügt, welcher ursprünglich sowohl den ribosomen Bindungsteil als auch den Translations-Initialcodon aufwies. Alternativ ist es möglich, dass ein Strukturgen, welches sowohl den ribosomen Bindungsteil als auch den Trans-40 lations-Initialcodon aufweist in einen Plasmid-Vektor eingefügt wird. Falls von einem Plasmid-Vektor Gebrauch gemacht wird, welcher weder den ribosomen Bindungsteil noch den Translation-Initialcodon und auch nicht beide miteinander aufweist, muss ein Strukturgen in den Plasmid-Vektor 45 eingefügt werden, welches entweder den ribosomen Bindungsteil oder den Translations-Initialcodon oder beide aufweist, andernfalls muss der ribosome Bindungsteil oder der Translations-Initialcodon zusätzlich in den Plasmid-Vektor eingefügt werden. Es kann von einem Vektor Gebrauch ge-50 macht werden, worin eine DNA-Sequenz dem Signal-Peptid entspricht.

Das Strukturgen kann im weiteren ebenfalls eine native Promotor-Sequenz aufweisen. Überdies kann von einem Strukturgen Gebrauch gemacht werden, worin eine DNA-55 Sequenz dem Signal-Peptid entspricht.

Es ist nicht erforderlich, dass von einem spezifischen von Bacillus brevis Gebrauch gemacht wird. Bevorzugte Beispiele von Bacillus brevis sind Bacillus brevis 47 und Bacillus brevis 481. Bacillus brevis 47 wurde ursprünglich am 7. Sep-60 tember 1983 unter der Nationalen Hinterlegungs-Nr. FERM P7224 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministery of International Trade and Industry 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305, Japan, hinterlegt; die Hinter-65 legungs-Nummer wurde am 28. November 1986 in die International Nummer FERM BP-1223 umgewandelt. Der Bacillus brevis 481 wurde ursprünglich beim obengenannten Fermentation Research Institute am 7. März 1984 unter der Na

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tionalen Hinterlegungs-Nr. FERM P7531 hinterlegt; am 28. November 1986 wurde diese dann in die Internationale Hinterlegungs-Nummer FERM BP-1224 umgewandelt.

Wenn der Plasmid-Vektor, in welchen das Strukturgen eingefügt worden ist, gemäss der vorliegenden Erfindung, in eine Zelle von Bacillus brevis, ist der resultierende Mikroorganismus so transformiert worden, dass er fähig ist, grosse Mengen von nützlichem Material wie Proteine usw. herzustellen. Es können konventionelle Verfahren verwendet werden, um das Strukturgen in den Plasmid-Vektor einzuführen und ebenfalls, um das so erhaltene Plasmid unter Verwendung einer rekombinanten DNA, gemäss der vorliegenden Erfindung, in den Bacillus brevis einzuführen. Als Strukturgen kann nicht nur ein von einem Eukaryonten abgeleitetes Gen verwendet werden, sondern ebenfalls eines von Proka-ryonten. Beispielsweise kann ein humanes Gen (d.h. Interferon, Insulin, usw.), ein Enzym-Proteingen eines Mikroorganismus (Tryptophanase, Aspartat-Ammonium-Lyase usw.) usw. verwendet werden.

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung mittels Beispielen näher erläutert:

Beispiel 1

(1) Klonierung der Promotor-Region des Zellwand-Pro-teingenes von Bacillus brevis 47:

Figur 1 zeigt eine Restriktionskarte des Zellwand-Pro-teingenes und seiner Nachbarschaft, welches durch Analysieren der chromosomalen DNA von Bacillus brevis 47 (FERM P7224) gemäss der Southern Blot-Methode (J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975) unter Verwendung einer Probe eines DNA-Fragmentes, welches einen Teil des genannten Zellwand-Proteines (das Protein hat ein Molekulargewicht von etwa 150 000 und wird nachstehend als 150K-Protein bezeichnet) hergestellt worden ist. Das genannte DNA-Fragment wurde durch Tsukagoshi et al kloniert, als Promotor-Mangelgebiet des Genes, welches das 150K-Protein codiert (J. Bacteriol., 15, 1054-1060 (1984) ). Im weiteren wurden die Transkriptionsrichtung und die Transkriptions-Initial-zentren dieses Genes, wie in Figur 1 dargestellt, bestimmt, wobei eine RNA verwendet wurde, die vom Bacillus brevis 47 gemäss Sl-Kartenmethode (J. Biol. Chem., 256, 11905-11910 (1981) ) extrahiert worden war. In Figur 1 zeigt das schraffierte Gebiet ein DNA-Fragmentgebiet mit 3100 Basenpaaren (nachstehend werden 1000 Baseripaare als Kb bezeichnet) und die Abkürzungen, welche oben und unten bei den mittleren Linien angegeben sind, zeigen die Restriktionsenzyme und die Stellen, an welchen die entsprechenden Restriktionsenzyme spalten.

Die chromosomale DNA vom Bacillus brevis 47 wurde mit dem Restriktionsenzyme Bell gespalten und dann durch Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert. Die 9Kb BclI-Frag-mente (nahezu die gesamte Länge der DNA ist in Figur 1 dargestellt) wurden elektrophoretisch von den entsprechenden Fraktionen eluiert. Die eluierten DNA-Fragmente wurden dann mit dem Restriktionsenzym Bglll gespalten und die resultierenden 3,lKb-Fragmente wurden in gleicher Weise wie vorstehend erwähnt gesammelt und entsprechen der schraffierten Region in Figur 1. Andererseits wurde die pHW I-DNA (J. Bacteriol., 150, 804-814 (1982) ) mit dem Restriktionsenzym Hindlll gespalten, zur Abstumpfung der Enden mit DNA-Polymerase behandelt, dann wurden Bam-HI-Linkers (5' CGGATCCG 3', 3' GCCTAGGC 5') zugegeben und das resultierende Produkt wurde mit genannten DNA-Fragment von 3,1Kb durch T4-Ligase verbunden, wobei eine rekombinante DNA gebildet wurde. Die rekombi-nante DNA wurde zur Transformation des Bacillus subtilis RM 141 (rMmM arg 15 leu B8 his AI ree E4) (Mol. Gen. Ge-net., 168,111-115 (1979) ). Die so erhaltenen Transformanten wurden in Regenerations-Agarmedium, welches Erythromycin (10 |ig/ml) enthielt, gezüchtet und ein Antikörper gegen das 150K-Protein, welcher vorher hergestellt worden war, wurde zu den Transformanten zugegeben, wobei als Resultat Kolonien gefunden wurden, worin Stämme mit dem Antikörper zur Reaktion gelangten, was durch eine En-zym-Immunoassay-Methode (Gene, 16, 159 (1981) ) nachgewiesen wurden, wobei ein konjugiertes Protein mit Meerret-tich-Peroxidase A (Horseradish peroxidase-conjugated protein A E-Y Laboratories Inc.) verwendet wurde. Das Plasmid pCWP I wurde aus den umgesetzten Kolonien extrahiert und es wurde nachgewiesen, dass das genannte 3,lKb-Frag-ment eingefügt wurde,es ist durch die dicke Linie in Figur 2 angegeben, welche eine Restriktionskarte des Plasmid pCWP I darstellt. Figur 2 umfasst verschiedene Buchstabenzeichen, wie Hindlll, welche die Restriktionsenzyme und die Stellen angeben, welche durch die Restriktionsenzyme gespalten werden, wie in Figur 1.

(2) Analyse des geklonten DNA-Fragmentes und Stärke, der Promotor-Aktivität:

Die Basensequenz des geklonten DNA-Fragmentes wurde durch die Maxam-Gilbert-Methode (Methods Enzymol., 65,449-560 (1980) ) bestimmt und durch Verwendung RNA, welche aus dem Bacillus brevis 47 extrahiert wurde, wobei die Transkriptions-Initialstelle durch die SI-Karten-methode bestimmt wurde (J. Biol-Chem., 256,11905-11910 (1981) ). Als Ergebnis haben die Erfinder einen offenen Leserahmen gefunden, welcher sich von der Stelle mit der Distanz von etwa 2Kb von der BclI-Stelle gegen die Bglll-Stelle ausdehnt, wobei vier Transkriptions-Initialstellen PI, P2, P3 und P4 stromaufwärts auf dem offenen Leserahmen vorhanden sind, wie in Figur 3 dargestellt.

Im übrigen zeigt die Figur 3 eine Nukleotid-Sequenz der 5'-Region des Zellwand-Proteingens vom Bacillus brevis 47, die Transkriptions-Initialstellen sind durch einen Pfeil angegeben und eine Aminosäure-Sequenz, entsprechend dem offenen Leserahmen, welcher nun durch die Erfinder gefunden wurde, ist ebenfalls angegeben. In Figur 3 zeigt die Markierung = eine Promotor-Region und die Markierung t' ' 'pin Translations-Initialcodon, welche durch die Erfinder gefunden wurden.

Die Tabelle 1 zeigt Nukleotid-Sequenzen, die an der Stelle der Region von —10 bis —35 stromaufwärts bei jeder der genannten vier Transkriptions-Initialstellen vorhanden sind.

Das Resultat der Analyse der Sl-Kartenmethode wurde bestätigt, dass die Transkription an den Stellen P2, P3 und P4 mit einer höheren Frequenz ausgelöst wurde, als an der Stelle PI, welche eine ähnliche Sequenz aufweist, wie die Übereinstimmungssequenz und mit dem Promotor im Bacillus licheniformis-a-Amylase-Gen (Paml) verglichen wurde. Die Tabelle 2 zeigt die Promotor-Aktivitätsstärke, die durch die Sl-Kartenmethode getestet wurde und aus der Tabelle 2 wird klar, dass die Promotoren P2, P3 und P4 von höherer Aktivität sind, als der Promotor PI und Pam 1.

Tabelle 1

— 35 Region —10 Region

PI GTGACAGCCCGCCATATGTCCCCTATAATA P2 GCAACTTTTGATTCGCTCAGGCGTTTAATA P3 TTCACGAATTCTAGCAGTTGTGTTACACTA

Paml TTGTTA * TACAAT

Paml: Promotor-Sequenz des Bacillus licheniformis-ot-Amylase-Gens.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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Tabelle 2

Stärke der Promotor-Aktivität durch die Sl-Kartenmethode

Art des Promotors

PI

P2

P3

P4

Paml

Promotor-Aktivität ±

+ +

+ + +

+ +

±

(3) Herstellung eines Vektors zur Bestimmung der Promotor-Aktivität im Bacillus brevis 47:

a-Amylase-Gen wurde aus dem Bacillus licheniformis 584-Stamm (Arch. Biochem. Biophys., 155, 290-298 (1973) ) und in den Plasmid-Vektor pHY 481 eingeführt, welcher im Bacillus brevis stabilgehalten werden konnte (Appi. Env. Microbiol., 49, 1076-1079 (1985) ), wobei das Plasmid pHY 483, wie in Figur 4 dargestellt, gebildet wurde. Es wurde nachgewiesen, dass alle Nukleotid-Sequenzen in diesem Amylase-Gen im allgemeinen die gleichen waren, wie diejenigen der 5'-Region des a-Amylase-Gen im Bacillus licheniformis FD02-Stamm (J. Bacteriol., 158, 369-372 (194) ) und das Amylase-Gen war vollständig das Gleiche, wie das genannte a-Amylase-Gen bezüglich der Sequenz im — 10-Ge-biet und im — 35-Gebiet, der Sequenz an der ribosomen Bindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz), der Existenz einer umgekehrten Wiederholungssequenz, von welcher angenommen wird, dass sie den Unterbruch der Transkription vom Gen, welches stromaufwärts liegt, bewirkt usw. Unter Verwendung dieses Gens wurde ein Vektor für Promotor-Akti-vitätstests welcher in der nachstehenden Weise hergestellt wurde.

Zuerst wurde das Plasmid PhY 483 mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten, dann wurde der Teil, welcher sich von der Spaltstelle zur Stelle, unmittelbar vor der Shine-Dalgarno-Sequenz im a-Amylase-Gen ausdehnt, durch die Nuklease Bai 31 entfernt, wozu BamHI-Linkers verwendet wurden, und die resultierenden Produkte wurden in die kreisförmige Form übergeführt wobei das Plasmid pHY 483 A P erhalten wurde. Einerseits wurde das Plasmid pHY 483 mit dem Restriktionsenzym Pstl gespalten, dann wurde ein Teil, welcher sich von Spaltstelle zur Stelle mit der Distanz von 270 Basenpaare von der BamHI-Stelle in der Richtung stromabwärts (d.h. an der Stelle, unmittelbar vor der umgekehrten Wiederholungssequenz) in gleicher Weise entfernt, wozu Bgllll-Linker (5'CAGATCTG3' und 3'GTCTAGAC5') zugegeben wurden, anschliessend das erhaltene Produkt unter Bildung des Plasmides pHY 483 A N zirkularisiert wurde. Andererseits wurde die Plasmid pHY 483 A P-DNA mit dem Restriktionsenzyme BamHI gespalten, mit DNA-Poly-merase behandelt, um die Enden abzustumpfen, Bglll-Lin-ker (5'CAGATCTG3' und 3'GTCTAGAC5') wurden zugefügt, dann mit dem Restriktionsenzym Sali gespalten und anschliessend durch Agarose-Gel-Elektrophorese abgetrennt, wobei ein Bglll-Sall-Fragment mit 1,1Kb und welcher die 5'-Region des Amylase-Gens enthielt. Weiter wurde in ähnlicher Weise die pHY 483 A N-DNA mit den Restriktionsenzymen Bglll und Sali gespalten, wobei ein Amylase-Gen-Fragment erhalten wurde, dem die 5'-Region davon fehlte und 4,7Kb aufwies. Beide Fragmente wurden durch T4-Ligase verknüpft, wobei das Plasmid pHY 4833 erhalten wurde, welches genau das gleiche war, wie dasjenige, welches vom transformierten Stamm des Bacillus brevis 47 erhalten wurde. Im Plasmid phY 4833 waren weiterhin die umgekehrten Wiederholungs- und Shine-Dalgarno-Sequenzen des Amylase-Gens enthalten, es fehlten ihm jedoch die -35-und die — 10-Gebiete, wie dies in Figur 5 dargestellt ist. Figur 5 ist ein Diagramm, welches das Verfahren zur Herstellung des Plasmid-Vektors pHY 4833 zur Verwendung für den Nachweis von Promotoren und zeigt die Gebiete von Plasmiden, welche dem Gebiet entsprechend, das sich über 5 die Spaltstellen der Restriktionsenzyme BamHI und Sali erstreckt, was in Figur 4 dargestellt. In Figur 5 zeigen die leeren Kasten die umgekehrte Wiederholungssequenz, die schraffierten Kasten zeigen den Deletionsteil und die Linie L2 zeigt die Stelle der Shine-Dalgarno-Sequenz und ebenfalls io die Transkriptions-Richtung des a-Amylase-Gens.

(4-1) Promotor-Aktivität in der 5'-Region des Zellwand-Proteins unter Verwendung des Plasmides pHY 4833 im Bacillus brevis 47 als Wirt:

Die 5'-Region des Zellwand-Protein-Gens wurde gespal-15 ten und abgetrennt unter Bildung eines Alul-Alul-Fragmen-tes von 600 Basenpaaren, eines Alul-Rsal-Fragmentes von 165 Basenpaaren und eines Rsal-Alul-Fragmentes von 435 Basenpaaren. Insbesondere war das AIuI-AluI-Fragment aus den Nukleotiden von 116 bis 715, einschliesslich der Trans-20 kriptions-Initiationsstellen PI, P2, P3, P4 und ihrer entsprechenden —10- und — 35-Gebieten zusammengesetzt, wie dies in Figur 3 dargestellt ist, das Alul-Rsal-Fragment war aus den Nukleotiden von 116 bis 280, einschliesslich der Trans-kriptions-Initiationsstellen PI und seinen —10- und -35-25 Gebieten zusammengesetzt und das Rsal-Alul-Fragment war aus den Nukleotiden von 281 bis 715 einschliesslich der Transkriptions-Initiationsstellen P2, P3, P4 und ihren entsprechenden -10-und — 3 5-Regionen zusammengesetzt. Nach der Zugabe von BamHI-Linkern (5'CGGATCCG3' 30 und 3'GCCTAGGC5') zu jedem dieser Fragmente, wurde jedes resultierende Fragment an der Bglll-Stelle des Plasmides pHY 4833 eingefügt, wobei die Plasmide pTAl, pTA3 und pTA2 erhalten wurden, wie dies in Figur 6 dargestellt ist. Figur 6 zeigt die 5'-Region-Fragmente der Zellwand-Protein-35 Gene, welche durch Insertion jedes der genannten entsprechenden Fragmente in den Plasmid-Vektor pHY 4833 hergestellt wurden zum Gebrauch für die Bestimmung der Promotor-Aktivität.

Jedes der Plasmide pHY 4833, pTA3, pTA2, pTAl wur-40 de in den Bacillus brevis 47 eingeführt, wobei die entsprechenden transformierten Stämme erhalten wurde und jeder der resultierenden Transformanten wurde unter aeroben Bedingungen im T3-Medium (lösliche Stärke 2%,

MgCl2 ■ 6H20 0,1%, Hefeextrakt 0,4%, Polypepton 2%, 45 Fleischextrakt 0,5%, Uracil 0,01%, pH7) bei 37 °C während 1, bzw. 3 Tagen inkubiert und dann wurde der Anteil der ex-tracellularen Amylase durch die Methode nach Saito getestet unter Verwendung von löslicher Stärke als Substrat (Arch. Biochem. Biophys., 155, 290-298 (1973) ). Tabelle 3 zeigt die 50 ermittelten, extracellularen Amylase-Aktivitäten.

Tabelle 3 Plasmid

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Extracellulare Amylase-Aktivität (XIO3 Einh./ml)

pHY 4833 pTA3 pTA2 60 pTAl

1 -T ag-Kultivierung

0,24

0,17

9,2

7,8

3-T age-Kulti vierung 0,24 0,16 9,8 10,0

(4-2) Test der Promotor-Aktivität der 5'-Region von Zell-wand-Protein-Gen unter Verwendung des Plasmides pHY 4833 im Bacillus brevis 47 als Wirt: 65 Das Zellwand-Protein-Gen wurde zuerst mit verschiedenen Restriktionsenzymenen oder Bai 31-Nuklease behandelt, um die 5'-Region des Gens zu kürzen und dann wurden BamHI-Linker (5'CGGATCCG3' und 3'GCCTAGGC5') zu

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den gekürzten Enden gegeben, um die Fragmente herzustellen. Jedes der Fragmente wurde in die Bglll-Stelle des Plas-mid-Vektors pHY 4833 eingeführt, welcher zur Verwendung im Promotor-Aktivitätstest diente und gemäss dem vorhergehenden Absatz erhalten wurde und in der Folge wurden die Plasmide pTAl-pTA8 erhalten, wie in Figur 7 dargestellt. Jedes der Plasmide pTAl-pTA8 wurde in den Bacillus brevis 47 eingeführt und jeder Transformant wurden unter aeroben Bedingungen in T3-Medium (lösliche Stärke 2%, MgCl2-6H20 0,1%, Hefeextrakt 0,4%, Polypepton 2%, Fleischextrakt 0,5%, Uracil 0,01%, pH7) bei 37 °C inkubiert und der Anteil der extracellularen Amylase wurde gemäss der Methode nach Saito getestet, wobei lösliche Stärke als Substrat verwendet wurde (Arch. Biochem. Biophys., 155, 290-298 (1973) ) (Tabelle 4).

Ausserdem zeigt der obere Teil von Figur 7 die Stellen der Promotoren P1-P4, die Shine-Dalgarno-Sequenz und den Translations-Initialcodon, welcher in Figur 3 dargestellt ist und der untere Teil von Figur 7 zeigt die 5'-Regions-Frag-mente des Zellwand-Protein-Gens, welche in den Plasmid-Vektor pHY 4833 eingesetzt wurden, um die Promotoren in Relation zu den genannten Stellen des oberen Teils nachzuweisen. Die Nukleotid-Nummern in Figur 7 entsprechen denjenigen von Figur 3.

Tabelle 4

Plasmid Extracellulare Amylase-Aktivität (XIO3 Einh./ml)

Kultivierungstag

1 Tag

2 Tage

3 Tage pHY 4833

0,4

pTA 1

12,7

12,8

11,1

pTA 2

7,8

9,8

pTA 3

0,2

pTA 4

5,7

5,1

6,0

pTA 5

0,3

1,0

0,7

pTA 6 8,0 8,6 8,0

pTA 7 25,7 24,4 19,1

pTA 8 1,2 1,5 1,5

Aus diesen Resultaten wurden geschlossen, dass im Ba-5 cillus brevis 47 eine Transkriptions-Initiations-Frequenz vorliegt, die von der Transkriptions-Initiationsstelle PI herrührt, die sehr tief ist und welche, ähnlich der Übereinstimmungs-Sequenz, -10- und — 35-Sequenzen aufweist, während eine Trarskrintions-Iniriptiors-Frequenz vorbanden ist 10 die von jeder der Transkriptions-Initiationsstellen P2, P3 und P4 herrührt, die weit höher ist, wobei die Stellen —10-und —35-Sequenzen aufweisen und von der Übereinstim-mungs-Sequenz verschieden sind. Insbesondere war die Transkriptions-Initiations-Frequenz von der Stelle P3 sehr 15 hoch und ein transformierter Bacillus brevis 47, welcher das Plasmid pTA 7 mit einem Fragment, welches P3 allein aufweist, produzierte a-Amylase in einem Anteil, welcher 50mal höher war, als derjenige, welcher bei irgendeinem transformierten Bacillus brevis 47 erzeugt wurde, welcher das Plas-20 mid pHY 4833 ohne Fragment aufwies und das Plasmid pTA 3, einschliesslich PI allein. Übrigens war der Anteil als intracellularer Amylase weniger als 10% von demjenigen der extracellularen Amylase. Die Übereinstimmungs-Sequenz bedeutet die Nukleotid-Sequenz, welche die Sequenz TTGA-25 CA in der — 35-Region einschliesst und die Sequenz TA-TAAT in der — 10-Region, wobei zwischen den beiden Sequenzen 17 Basenpaare vorhanden sind.

Der Bacillus brevis 47, welcher das Plasmid pTA 2 trägt, wurde bei Fermentation Rcsearch Institute, Agency of Indu-30 strial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 35-JP, hinterlegt und trägt die Hinterlegungsnummer FERM P-8504.

Die Hinterlegung unter der obigen Nationalen Nummer 35 erfolgte am 31. Oktober 1985. Am 28. NnvriW 1QR6 wnr-de diese dann in die Internationale Hinterlegungs-Nr.

FERM BP-1225 umgewandelt.

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3 Blatt Zeichnungen