DE69916812T2

DE69916812T2 - Prokaryontische zelle, die zwei kopien eines genes enthält, die in zwei verschiedene richtungen transkribiert werden.

Info

Publication number: DE69916812T2
Application number: DE69916812T
Authority: DE
Inventors: Steen Troels Joergensen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1998-02-12
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2019-02-11
Also published as: AU2610399A; WO1999041358A1; ATE265523T1; CN1272135A; JP4350894B2; EP1062318A1; CN1160448C; EP1062318B1; DE69916812D1; JP2002503458A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Eine prokaryontische Zelle, die ein Gen von Interesse exprimiert und mindestens zwei Kopien des Gens am Chromosom umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prokaryontische, Mehrfachkopien erzeugende Zellen, d. h. Zellen, die mehr als eine Kopie eines Gens von Interesse umfassen, wurden bei der Herstellung von Proteinen von Interesse mit industriellem Maßstab verwendet.
Bevorzugte Mehrfachkopien erzeugende Zellen sind Zellen, welche die individuellen Kopien des Gens von Interesse während Fermentierung stabil beibehalten.
Ferner besteht aufgrund von Umweltbedenken ein steigender Wunsch nach der Herstellung von Zellen, die keine integrierten Antibiotika-Restistenzgene am Chromosom umfassen, und demzufolge nach diesen Reihen erzeugenden Zellen, welche die Kopien des Gens von Interesse in einem Fermentierungsmedium, das KEIN Antibiotikum umfasst, stabil beibehalten können.
EP 284126 beschreibt eine Lösung der vorstehenden Stabilitätsfrage durch Bereitstellen eines Verfahrens zum Aufbau einer prokaryontischen Zelle, die am Chromosom mindestens zwei Kopien eines Gens von Interesse umfasst, das durch endogene DNA, die für die Wirtszelle lebensnotwendig (essentiell) ist, abgetrennt wird (siehe Anspruch 1 von EP28126).
Die individuellen Kopien des Gens von Interesse werden in einer fermentierten Zellpopulation aufgrund der essentiellen DNA stabil beibehalten. Deaktiviert die Zelle diese lebensnotwendige DNA durch homologe Rekombination zwischen den beiden Kopien des Gens von Interesse aus, verliert die Zelle lebensnotwendige DANN, und diese spezifische Zelle stirbt.
Dadurch ist es möglich, eine stabile Zellpopulation beizubehalten, welche die Kopien des Gens von Interesse umfasst.
Das Verfahren erfordert eine Kenntnis davon, welche DNA-Regionen für die Zelle lebensnotwendig sind. In einer anderen Ausführungsform ist das Gen an sehr entfernten Plätzen im Chromosom integriert, wodurch eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass dort lebensnotwendige DNA zwischen den Kopien vorliegt (siehe 2 von EP 284126 ). Dies ist ein relativ aufwendiger und unsicherer Prozess.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das durch die vorliegende Erfindung zu lösende Problem ist, eine prokaryontische Zelle bereitzustellen, die ein Gen von Interesse exprimiert und mindestens zwei Kopien des Gens am Chromosom umfasst.
Ferner sollte die prokaryontische Zelle

a) in dem Sinne stabil sein, dass sie während der Fermentierung zwei Kopien des Gens am Chromosom beibehalten kann und
b) zwei Kopien des Gens ohne ein sich zwischen den beiden Kopien des Gens befindendes DNA-Segment stabil beibehalten kann, wobei das Segment für das Wachstum der Zelle wie z. B. in EP 284126 beschrieben essentiell ist.

Die Lösung basiert darauf, dass die Erfinder ermittelten, dass es während der Fermentierung möglich ist, zwei antiparallel transkribierte Kopien eines Gens am Chromosom einer Zelle stabil beizubehalten (siehe 1) und die beiden anti parallel transkribierten Gene können sogar ohne ein sich zwischen den beiden Kopien des Gens liegendes DNA-Segment, das für das Wachstum der Zelle essentiell ist, stabil beibehalten.
Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt eine prokaryontische Zelle, die ein Gen von Interesse exprimiert, dadurch gekennzeichnet, dass

i) die Zelle am Chromosom zwei antiparallel transkribierte Kopien des Gens von Interesse, und
ii) ein zwischen zwei Kopien des Gens von Interesse unter Punkt i) liegendes DNA-Segment, das lediglich eine DNA-Sequenz umfasst, die für das Wachstum der Zelle nicht essentiell ist.

In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Aufbau einer prokaryontischen Zelle, die ein Gen von Interesse exprimiert, das den Aufbau einer Zelle umfasst, wobei

i) die Zelle am Chromosom zwei antiparallel transkribierte Kopien des Gens von Interesse umfasst, und
ii) ein zwischen zwei Kopien des Gens von Interesse unter Punkt i) liegendes DNA-Segment, das lediglich eine DNA-Sequenz umfasst, die für das Wachstum der Zelle nicht essentiell ist.

In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung und Isolierung eines Polypeptids von Interesse, umfassend

i) Züchten einer prokaryontischen Zelle nach dem ersten Aspekt der Erfindung unter geeigneten Bedingungen, die das Exprimieren des durch das Gen von Interesse kodierten Polypeptids von Interesse gewähren, und
ii) Isolieren des Polypeptids von Interesse.

Einer der Vorteile einer wie hier beschriebenen prokaryontischen Zelle ist, dass die beiden Kopien eines Gens antiparallel transkribiert (d. h. entweder konvergent oder divergent transkribiert) sind, wodurch das Risiko minimiert wird, dass eine Kopie des Gens aus der Zelle durch homologe Rekombination, im Gegensatz dazu, wenn die Gene parallel transkribiert sind (siehe 1 zur Veranschaulichung), verloren geht.
Dies beinhaltet einen weiteren Vorteil der prokaryontischen Zelle, da es dann möglich ist, eine stabile Integration der beiden Kopien eines Gens ohne ein zwischen den beiden Kopien des Gens liegendes DNA-Segment, dass für das Wachstum der Zelle essentiell ist, vorzuweisen.
Demzufolge besteht keine Notwendigkeit für das Integrieren der individuellen Kopien des Gens von Interesse an sehr entfernten Plätzen am Chromosom wie in EP 284126 beschrieben (siehe 2 von EP 284126 ). Dies macht es relativ einfacher, eine prokaryontische Zelle (wie hier beschrieben) im Gegensatz zum Aufbau einer Zelle von EP 284126 aufzubauen. Siehe nachstehend weitere Details über bevorzugte Aufbauwege einer wie hier beschriebenen prokaryontischen Zelle.
Ferner war auf dem Fachgebiet das für das Wachstum der Zelle essentielle DNA-Segment ein Antibiotikumresistenz-Markierungsgen, das zum Ausbau von prokaryontischen Zellen, die eine oder mehrere Kopien eines Gens von Interesse umfassen, verwendet wurde (siehe z. B. EP 166 628 und WO 94/14968).
Demzufolge ist es ein weiterer Vorteil eines wie hier beschriebenen Verfahrens zum Ausbau einer prokaryontischen Zelle, dass es ein einfaches Verfahren zur Herstellung einer prokaryontischen Zelle bereitstellt, die ein Gen aus zwei Kopien des Gens exprimiert, ohne dass die Zelle ein eingefügtes Antibiotikumresistenzgen umfasst.
DEFINITIONEN
Bevor die Erfindung im Detail beschrieben wird, werden nachstehend weiter Begriffe der unabhängigen Aspekte der Erfindung definiert.
Der Begriff „ein Gen" bedeutet hier ein Gen (einer DNA-Sequenz), das in ein Polypeptid in der Zelle exprimieren kann. Demzufolge ist die Gensequenz als offenes Ablese-Gerüst, wobei mit einem Start-Kodon (gewöhnlich „ATG","GTG" oder „TTG") gestartet und mit einem Stop-Kodon (gewöhnlich „TAA", „TAG" oder „TGA") geendet wird.
Zum Exprimieren des Gens müssen dort wie auf dem Fachgebiet bekannte Elemente zusammen mit dem Gen vorliegen, die für die Expression des Gens in der Zelle nötig sind. Solche Standardelemente können einen Promoter, eine Ribosombindungsstelle, eine Terminierungssequenz und andere wie auf dem Fachgebiet bekannte Elemente einschließen. Der Begriff „zwei antiparallel transkribierte Kopien des Gens" bedeutet hier, dass die Gene entweder konvergent oder divergent transkribiert sind, d. h. in gegensätzlicher Orientierung in Bezug aufeinander vorliegen. Siehe 1 für eine graphische Veranschaulichung.
Der Begriff „die Zelle umfasst am Chromosom zwei antiparallel transkribierte Kopien des Gens von Interesse" in Verbindung mit einer erfindungsgemäßen prokaryontischen Zelle bedeutet, dass die prokaryontische Zelle mindestens die zwei Kopien des Gens von Interesse umfasst, das wie in dem ersten Aspekt der Erfindung vorliegt. Neben diesen beiden Kopien des Gens von Interesse kann die prokaryontische Zelle ferner Kopien des Gens am Chromosom umfassen.
Die weiteren Kopien können zwei weitere Kopien des erfindungsgemäß an einem entfernten Platz am Chromosom liegenden Gens umfassen oder nur (eine) einzelne Kopie/Kopien des am anderen Teil des Chromosom liegenden Gens sein.
Der Begriff „ein DNA-Segment das lediglich eine DNA-Sequenz umfasst, die für das Wachstum der Zelle nicht essentiell ist" bedeutet ein DNA-Segment, das, wenn es aus dem Chromosom der Zelle deletiert die Zelle dann immer noch mit im Wesentlichen derselben Wachstumsgeschwindigkeit unter ähnlichen Wachstumsbedingungen, im Gegensatz dazu, bevor das DNA-Segment deletiert wurde, wachsen kann.
Im Gegensatz dazu bedeutet dies, wenn ein DNA-Segment als „für das Wachstum der Zelle essentiell" bezeichnet wird, dass, wenn das DNA-Segment aus der Zelle deletiert ist, die Zelle dann NICHT mit im Wesentlichen derselben Wachstumsgeschwindigkeit unter ähnlichen Wachstumsbedingungen im Gegensatz dazu, bevor das DNA-Segment deletiert wurde, wachsen kann.
Ein solches essentielles DNA-Segment kann ein Teil der ursprünglichen (vom Wildtyp) Chromosomensequenz (wie z. B. in EP 284126 beschrieben) oder ein selektierbares Markierungsgen wie ein Antibiotikumrestistenz-Markierungsgen sein, wobei die selektierbare Markierung am Chromosom eingefügt wurde (siehe z. B. EP166628; WO 94/14968).
Die Ausführungsform oder Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nachstehend lediglich mittels Beispielen beschrieben.
ZEICHNUNGEN
1
Teil A veranschaulicht zwei am Chromosom einer Zelle liegende Gene, die parallel transkribiert sind. Wie durch gekreuzte Linien dargestellt, kann eine Kopie des Gens aus der Zelle durch homologe Rekombination der identischen DNA-Sequenzen verloren gehen.
Teil B veranschaulicht zwei am Chromosom einer Zelle liegende Gene, die divergent transkribiert sind. In dieser Lage sind keine direkten identischen Sequenzen zwischen den beiden Genen zu finden, wobei das Risiko von homologer Rekombination zwischen den beiden Genen, die zu dem Verlust einer der Genkopien führt, drastisch minimiert wird.
Teil C veranschaulicht zwei am Chromosom einer Zelle liegende Gene, die konvergent transkribiert sind. Wie für Teil B liegt keine homologe Rekombination zwischen den beiden Genen vor.
2
Diese Abbildung veranschaulicht eine bevorzugte Strategie zum Aufbau einer wie hier beschriebenen prokaryontischen Zelle.
Teil A
Die DNA-Segmente „ABC" und „DEF" liegen am Chromosom in der Zelle vor.
Die DNA-Segmente „ABC", „123", „456", „XXX" (Gen von Interesse) und „DEF" sind in die Zelle vorzugsweise an einem temperaturempfindlichen Plasmid eingefügt.
Teil B
Nach homologer Rekombination zwischen den DNA-Segmenten „ABC" und „DEF" umfasst das Chromosom nun „ABC", „123", „456", "XXX" und „DEF".
Ein neues Plasmid wird dann in die Zelle transformiert, welche die Segmente „123", „XXX" und „456" umfasst, wobei das Gen „XXX" verglichen mit Teil A in gegensätzliche Richtung transkribiert wird.
Teil C
Nach homologer Rekombination zwischen den DNA-Segmenten „123" und „456" umfasst das Chromosom nun „ABC", „123, „XXX", „456", „XXX" und „DEF", wobei die Gene von Interesse „XXX" antiparallel transkribiert sind. In dem hier dargestellten spezifischen Beispiel sind sie divergent transkribiert.
3–14
Diese Abbildungen zeigen Plasmide, die hier in den Arbeitsbeispielen 1 bis 3 zur Herstellung einer erfindungsgemäßen prokaryontischen Zelle durch ein Verfahren zum Aufbau einer erfindungsgemäßen prokaryontischen Zelle verwendet werden.
Demzufolge wird eine Bezugnahme auf die Beispiele 1 bis 3 zur weiteren Beschreibung der Plasmide durchgeführt.
15–29
Diese Abbildungen veranschaulichen Strategien und Plasmide, die hier im Arbeitsbeispiel 4 zur Herstellung einer erfindungsgemäßen prokaryontischen Zelle durch ein Verfahren zum Aufbau einer erfindungsgemäßen prokaryontischen Zelle verwendet werden.
Demzufolge wird eine Bezugnahme auf das Beispiel 4 zur weiteren Beschreibung der Abbildungen durchgeführt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Gen von Interesse gemäß den vorstehend beschriebenen Aspekten der Erfindung ein Gen, das ein aus einer Zelle sekretiertes Polypeptid exprimieren kann.
Ein solches Gen kann vorzugsweise ein kondensiertes Polypeptid kodieren, das ein Signal-Peptid und das sekretierte ausgereifte Polypeptid umfasst. Solche Signalpeptide sind auf dem Fachgebiet weithin bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kodiert das Gen ein Enzym. Ein solches Enzym kann eine Protease, Amylase, Zellulase, Lipase, Xylanase, Phytase und andere auf dem Fachgebiet bekannte Enzyme sein.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die prokaryontische Zelle eine grampositive prokaryontische Zelle, wie eine Bazilluszelle oder eine Streptomyces-Zelle.
Bevorzugte Bazilluszellen sind Spezies wie Bacillus subtilis, Bacillus lichenformis, Bacillus lentus. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus circulars, und eine Zelle von Bacillus thuringiensis.
Ferner betrifft eine Ausführungsform der Erfindung das DNA-Segment, das zwischen zwei Kopien des Gens liegt, mindestens 10 Bp, stärker bevorzugt 10 Bp bis 6000 Bp und noch stärker bevorzugt 75 Bp bis 4500 Bp lang ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das DNA-Segment, das zwischen zwei Kopien des Gens liegt, ferner kein Gen umfasst, das ein screenbares Protein wie ein Green-Fluoreszenz-Protein (GFP) kodiert. Ein solches screenbares Protein kann zum Aufbau einer prokaryontischen Zelle verwendet werden, die mehr als eine Kopie eines Gens von Interesse umfasst (siehe DK 0792/97 und WO 99/01562 für eine weitere Beschreibung solcher screenbarer Proteine).
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine prokaryontische Zelle des ersten Aspekts der Erfindung oder ein Verfahren des zweiten Aspekts der Erfindung, wobei das DNA-Segment, das zwischen den beiden Kopien des Gens von Interesse liegt, kein Antibiotikumresistenz-Markierungsgen wie ein Ampicillinresistenz-Gen, ein Erythromycinresistenz-Gen; ein Kanamycinresistenz-Gen; ein Neomycinresistenz-Gen; oder ein Chloramphenicolresistenz-Gen umfasst.
Siehe z. B. Arbeitsbeispiel 3 und 4 für Beispiele für solche Zellen der Erfindung, die frei von Antibiotikumresistenz-Markierungsgenen sind.
Das Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung und seine hier beschriebenen Ausführungsformen können gemäß beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Techniken zum Einfügen von DNA-Segmenten/-Fragmenten in das Chromosom einer prokaryontischen Zelle, insbesondere beliebigen der bekannten Techniken zum Einfügen der DNA-Segmente in das Chromosom durch homologe Rekombination durchgeführt werden. Eine bevorzugte Strategie ist, eine Zelle mit einem Plasmid, das eine DNA-Segment von Interesse und einen temperaturempfindlichen Replikationsursprung umfasst, zu transformieren. Die Zelle wird dann bei der die Replikation des Plasmids nicht gewährenden Temperatur gezüchtet und das Plasmid mit dem Chromosom in der Zelle durch homologe Rekombination rekombiniert.
Für eine weitere Beschreibung solcher Verfahren wird auf EP 0 284 126 , EP 166 628 , WO 94/14968, Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. „Molecular Cloning. A laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratories, 1982; Ausubel, F. M., et al. (Hrsg.) „Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. und Cutting, S. M. (Hrsg.) „Molecular Biological Methods for Bacillus" Bezug genommen.
Allgemeine Strategien zum Durchführen des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung und seiner hier beschriebenen Ausführungsformen sind hier in den Arbeitsbeispielen offenbart (siehe Beispiel 3 und 4).
Eine bevorzugte Strategie auf der Basis von homologer Rekombination ist hier in 2 dargestellt. Siehe Arbeitsbeispiel 4 für ein praktisches Beispiel dieser Strategie.
Ein Vorteil eines hier in einem Arbeitsbeispiel beschriebenen Verfahrens und wie in 2 beschrieben, kann es sein, dass zwei Kopien des Gens von Interesse durch einen präzisen Mechanismus an denselben Ort im Wirtschromosom eingefügt wird. Dies ist bevorzugt, wenn ein besonders geeigneter Ort für ein solches Gen bekannt ist.
Demzufolge ist es eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Aufbau einer ein Gen exprimierenden prokaryontischen Zelle der Erfindung, wobei die zwei Kopien des Gens von Interesse durch einen präzisen Mechanismus in denselben Ort im Wirtschromosom eingefügt werden.
Die spezifischen Züchtungsbedingungen unter Schritt i) und das spezifische Isolierungsprotokoll des Polypeptids von Interesse unter Schritt ii) des Verfahrens zur Herstellung und Isolierung eines Polypeptids von Interesse gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung kann gemäß einem beliebigen dem Fachmann bekannten Standardprotokoll durchgeführt werden.
Wie vorstehend angegeben, ist ein Vorteil einer wie hier beschriebenen prokaryontischen Zelle, dass sie in dem Sinne stabil ist, dass sie während der Fermentierung die zwei Kopien des Gens am Chromosom beibehalten kann.
Demzufolge ist es besonders für industrielle Fermentierungen in großem Maßstab geeignet.
Solche Fermentierungen in großem Maßstab können dadurch gekennzeichnet sein, dass a) das Polypeptid von Interesse mit relativ hoher Ausbeute erzeugt wer den kann oder b), dass ein Fermentierungsprozess in großem Maßstab verwendet wird.
Demzufolge ist es eine Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung und Isolierung eines Polypeptids von Interesse des dritten Aspekts der Erfindung, wobei das Züchten einer prokaryontischen Zelle von Punkt i) unter Bedingungen durchgeführt wird, unter welchen das Polypeptid von Interesse in einer Menge von mindestens 2 g Polypeptid (Trockensubstanz)/kg Nährmedium, vorzugsweise in einer Menge von mindestens 3 g Polypeptid (Trockensubstanz)/kg Nährmedium und besonders bevorzugt in einer Menge von mindestens 5 g Polypeptid (Trockensubstanz)/kg Nährmedium exprimiert wird.
Ferner ist es eine Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung und Isolierung eines Polypeptids von Interesse des dritten Aspekts der Erfindung, wobei das Züchten einer prokaryontischen Zelle von Punkt i) in einem Fermentierungsprozess mit einer Volumenskala durchgeführt wird, die > 10 m³, vorzugsweise > 25 m³; stärker bevorzugt > 50 m³ und besonders bevorzugt > 100 m³ beträgt.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
DNA-Arbeit in vitro, Transformation von Bakterienstämmen usw. wurden unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt (Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. „Molecular Cloning. A laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratories, 1982; Ausubel, F. M., et al. (Hrsg.) „Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C R. und Cutting, S. M. (Hrsg.) „Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Wenn nicht anders erwähnt wurden Enzyme für DNA-Manipulationen gemäß den Angaben des Lieferanten verwendet.
Verwendete Medien (TY-, BPX- und LB-Agar) wurden in EP 0 506 780 beschrieben. LBPSG-Agar ist LB-Agar, der mit Phosphat (0,01 M K₃PO₄), Glukose (0,4%) und Stärke (0,5%) ergänzt wurde.
Beispiel 1. Deletion des α-Amylase(amyL)-Promoters aus dem Chromosom von B. licheniformis
1A. Plasmidaufbauten
Das α-Amylase(amyL)-Gen von B. licheniformis wurde auf einem SphI-HindIII-Fragment mit 2,4 kb geklont, was zu Plasmid pDN1981 (3) wie von Jorgensen et al., 1990 beschrieben führte. „kann" bedeutet das von pUB110 abgeleitete Kanamycinresistenzgen und „PamyL" bedeutet die alpha-Amylase-Promoter-Region.
(J
rgensen, P. L., Hansen, C. K., Poulsen, G. B., Diderichsen, B. (1990). In vivo genetic engineering: homologous recombination as a tool for plasmid construction. Gene 96, 37–41.)
pSJ2433 (4) enthält die ersten 450 Basenpaare dieser Sequenz, bezeichnet mit UPS_PamyL, geklont in pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985 (Yanish-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1985). Improved M13 phage cloning vectors und host strains: nucleotide sequences of the M13 mp18 und pUC19 vectors. Gene 33, 103–119)), und wurde wie folgt aufgebaut: pDN1981-DNA wurde als Templat zur PCR-Amplifikation mit den Primern LWN4739 + LWN4740 verwendet, das erhaltene Fragment mit 0,5 kb mit EcoRI und HindIII aufgeschlossen, an mit EcoRI + HindIII aufgeschlossenes pUC19 gebunden und in E. coli SJ2 (Diderichsen et al., 1990 (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjøholm, C. (1990). Cloning of aldB, which enkodes α-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis)) durch Elektroporation, selektierend Ampicillinresistenz (AmpR), 200 μg/ml transformiert. „bla" bedeutet das pUC19-Ampicillinresistenzgen.
Zwei Transformate wurden als SJ2433 und SJ2434 aufbewahrt. Die Identität der Einfügung wurde durch DNA-Sequenzieren der Enden bestätigt, jedoch wurde die gesamte Einfügung nicht sequenziert.
pSJ2454 (5) wurde von pSJ2433 durch Bindung eines PstI-KpnI-Fragments mit 0,5 kb von dem α-Amylase(amyL)-Gen an pDN1981 (bezeichnet als „amyL" an mit PstI + KpnI-aufgeschlossenen pSJ2433 und Transformation von E. coli SJ6 (Diderichsen et al., 1990) durch Elektroporation, selektierend AmpR, 200 μg/ml, abgeleitet.
pSJ1327 (6) enthält ein pC194 (Horinouchi und Weisblum, 1982. (Horinouchi, S., und Weisblum, B. (1982). Nucleotide sequence und functional map of pC194, a plasmid that specifies chloramphenicol resistance. J. Bacteriol., 173, 559–567)) abgeleitetes cat-Gen, das in einen Polylinker in einem pUC19-Derivat eingefügt ist. Das cat-Gen, das Chloramphenicolresistenz spezifiziert, wurde von pDN1600 als BamHI-BglII-Fragment exzidiert, an mit BamHI aufgeschlossenes pDN3000 (Diderichsen et al., 1990) gebunden und in E. coli SJ6, selektierend AmpR (200 μg/ml) transformiert.
pSJ2643 (7) enthält das cat-Gen, das zwischen die beiden von amyL abgeleiteten Segmente in pSJ2454 eingefügt ist. Das cat-Gen wurde als NheI-XbaI- Fragment mit 1,1 kb von pSJ1327 exzidiert, an mit NheI aufgeschlossenes pSJ2454 gebunden und in E. coli SJ6 durch Elektorporation, selektierend Chloramphanicolresistenz (CamR, 6 μg/ml) transformiert, um PSJ2643 zu bilden. „Plac" bedeutet, den von pUC19abgeleiteten beta-Galactosidase-Promoter.
pSJ2650 (8) enthält das UPS_PamyL-cat-„amyL"-Segment an einem temperaturempfindlichen Bazillusplasmid. pSJ2643 wurde mit XbaI + HindIII aufgeschlossen, das Fragment mit 2,0 kb isoliert, an das NheI-HindIII-Fragment mit 5,1 kb von pSJ980 (9; United States Patent 5,698,415) gebunden und in kompetente Zellen von B. subtilis DN1885 (Diderichsen et al., 1990), selektierend CamR und Kanamycinresistenz (KanR), 6 μg/ml beziehungsweise 10 μg/ml auf LBPSG-Platten (WO 96/23073)) gebunden, um pSJ2650 zu erhalten. „repF" bedeutet das von pE194 abgeleitete Replikationsprotein-Gen, „+ori pE194" bedeutet den pE194-Replikationsursprung und „erm" bedeutet das Erythromycinresistenz-Gen von pE194. Dies kann auch als „ermC" bezeichnet werden.
1B. B. licheniformis transformation
Der in Beispiel 6 von U.S.-Patent 5,698,415 beschriebene Stamm von B. licheniformis, der eine Chromosomenkopie des α-Amylase(amyL)-Gens enthält, das von einem Mutant-amyL-Promoter exprimiert wurde, wurde als Wirtsstamm verwendet. pSJ2650 wurde in diesen Stamm durch Protoplast-Transformation (Akamatzu und Sekiguchi, 1984 (Akamatsu, T., Sekiguchi, J. (1984). An improved method of protoplast regeneration for Bacillus species and its application to Protoplast fusion and transformation. Agric. Biol. Chem., 48, 651–655)), selektierend Erythromycinresistenz (ErmR, 2 μg/ml) bei 30°C eingebracht. Regeneranten wurden nach zweiwöchiger Inkubation isoliert. Drei Stämme wurden aufbewahrt, SJ3034, SJ3035 und SJ3036.
1C. Chromosomen-Integration und Exzidierung
Die Stämme SJ3035 und SJ3036 wurden auf Platten mit 6 μg/ml Chloramphenicol und 5 μg/ml Erythromycin gestrichen und bei 50°C inkubiert. 8 Amylase-negative Kolonien von jedem Stamm wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer LWN4726 + LWN3825 überprüft, und durch alle wurde ein amplifiziertes Fragment mit korrekter Größe erhalten. Das amplifizierte Fragment erstreckt sich von der NcoI-Stelle im cat-Gen zu einer Position im amyL-Gen 157 Bp stromabwärts von der KpnI-Stelle, insgesamt 1007 Basenpaare. Dieses Fragment taucht nur auf, wenn pSJ2650 über die „amyL"-Homologie integriert wurde.
Jede Kolonie wurde durch zwei aufeinander folgende Inkubationen über Nacht in 10 ml TY-Medium (WO 91/09129) ohne Antibiotika bei 30°C aufgenommen, auf Platten, enthaltend 6 μg/ml Chloramphenicol, aufgetragen, nach Inkubation über Nacht bei 30°C auf Platten, enthaltend 6 μg/ml Chloramphenicol plus/minus 5 μg/ml Erythromycin, replikationsaufgetragen und mutmaßliche Erythromycin-empfindliche Kolonien auf die selbe Plattenart wieder aufgestrichen.
Drei Chloramphenicol-resistente, Erythromycin-empfindliche Stämme wurden isoliert:
SJ3047 aus SJ3035, Kolonie 1.
SJ3048 aus SJ3035, Kolonie 2.
SJ3049 aus SJ3036, Kolonie 1.
Die Integration des cat-Gens in die amyL-Promoterregion wurde durch Southern-Analyse festgestellt.
Eine Restriktionskarte der amyL-Genregion wurde vorher konstruiert, wodurch der an ein HindIII-Fragment mit 3,35 kb und an ein ClaI-Fragment mit 1,9 kb liegende amyL-Promoter gezeigt wurde.
Der Ersatz des amyL-Promoters mit dem cat-Gen sollte eine Netto-Einfügung von 835 Basenpaaren ergeben. Keine zusätzlichen HindIII- oder ClaI-Stellen werden mit dem cat-Gen eingefügt.
Demzufolge wurde Chromosomen-DNA aus SJ3047-49 extrahiert, getrennt mit HindIII und CalI aufgeschlossen, auf Agarosegelen abgetrennt, durch Vakuum-Blotten auf Immobilon-N-Membranen überführt und mit pSJ1325 (ein pUC19-Plasmid, enthaltend das cat-Gen), ³²P-markiert durch Nick-Translation, sondiert.
Hybridisierung lag wie erwartet an einem HindII-Fragment mit 4,2 kb in SJ3047 und SJ3048 vor, jedoch an einem etwas größeren Fragment in SJ3-049. Die Hybridisierung lag wieder wie erwartet an einem ClaI-Fragment mit 2,7 kb in SJ3047 und SJ3048 vor.
Demzufolge weisen die Stämme SJ3047 und SJ3048, die Amylase-negativ sind, wie erwünscht den amyL-Promoter, ersetzt durch ein Cat-Gen, auf.
Beispiel 2. Isolierung eines verbesserten α-Amylase(amyL)-Promoters
2A. Plasmid-Aufbauten
U.S.-Patent 5,698,415 beansprucht abgeänderte Promoter, die von dem amyL-Promoter von B. licheniformis abgeleitet sind. Mit Bezug auf Anspruch 1 im vorstehenden Patent ist ein solcher abgeänderter Promoter ein Fragment der in diesem Anspruch angegebenen Sequenz, in welchem N²-N⁹ die Sequenz ATGTATCA aufweist. Ein solcher abgeänderter Promoter wurde durch Einfügen der gewünschten Mutation in einen langen PCR-Primer (#28902), der die amyL- Promoterregion bedeckt, aufgebaut. Ein anderer PCR-Primer, LWN3216, liest stromaufwärts von einer Position, welche die PstI-Stelle in die amyL-Signalpeptid-Kodierungsregion überbrückt. Zusammen gewähren diese Primer PCR-Amplifikation eines abgeänderten amyL-Promoterfragments.
Ein mobilisierbares, temperaturempfindliches Plasmid, das den abgeänderten Promoter enthält, der eingegrenzt von amyL-DNA in einer Form eingegrenzt ist, die zur Integration in das Chromosom des Stamms SJ3047 von B. licheniformis geeignet ist, wurde wie folgt aufgebaut:
Das Substrat für PCR-Amplifikationen war pDN1981, das mit BglII aufgeschlossen war. Primer #28902 wurde zusammen mit Primer LWN3216 bei einer Härtungstemperatur von 45°C verwendet. Ein korrekt bemessenes PCR-Produkt wurde erhalten, mit SphI + pstI aufgeschlossen, an das SphI + PstI-Fragment mit 3,6 kb von pSJ2643 gebunden wurde, das Bindungsgemisch wurde dann mit EcoRI + HindIII aufgeschlossen und das Fragment mit 1,1 kb (isoliert aus einem Fragmentgemisch) an das EcoRI-HindIII-Fragment mit 4,4 kb von pSJ2739 gebunden (10; beschrieben in WO 96/23073 „DNA integration by transposition"). Das Bindungsgemisch wurde in kompetenten B. subtilis DN1885, selektierend Erythromycinresistenz (5 μg/ml) bei 30°C transformiert. Die rekombinanten Plasmide wurden durch Restriktionsabbilden analysiert und die amyL-Promoterregion am Plasmid, bezeichnet als pSJ4199 (11), unter Verwendung von Primer LWN3207 DNA-sequenziert, und es wurde gefunden, dass sie die gewünschte Sequenz aufwies. „oriT (pUB110)" bedeutet die cis-wirkende Sequenz von pUB110, die für konjugative Mobilisierung des Plasmids nötig ist. Siehe WO 96/23073. „PamyL 4199" bedeutet den abgeänderten amyL-Promoter.
Der abgeänderte amyL-Promoter wurde zum Ersetzen des an Plasmid pDN1981 gefundenen amyL-Promoters verwendet. Er wurde als SphI-PstI-Fragment mit 0,2 kb von pSJ4199 exzidiert, und an das SphI-PstI-Fragment mit 5,0 kb von pDN1981 gefunden. Das Bindungsgemisch wurde in B. subtilis DN1885, selektierend Kanamycinresistenz (10 μg/ml), transformiert. Zwei Transformate wurden als SJ4277 (DN1885/pSJ4277; 12) und SJ4278 (DN1885/pSJ4278) aufbewahrt. „rep" bedeutet das pUB110-Replikationsprotein-Gen.
2B. Mobilisierung in B. licheniformis und chromosomale Integration
Plasmid pSJ4199 wurde in kompetente Zellen von B. subtilis PP289-5 (dal-, pLS20, pBC16; WO 96/23073, Beispiel 4), selektierend Erythromycin- (5 μg/ml) und Tetracyclin- (5 μg/ml) Resistenz auf D-Alanin- (100 μg/ml) Platten bei 30°C transformiert.
Zwei Transformate wurden aufbewahrt, SJ4237 und SJ4238.
Jeder dieser Donor-Stämme wurde zum Überführen ihrer Plasmide in B. licheniformis durch Konjugation, im Wesentlichen wie beschrieben in WO 96/23073, Beispiel 11, verwendet. Die Transkonjugate waren fast ausschließlich Tetracyclin-empfindlich.
Ein von jedem Donor-Stamm abgeleitetes Transkonjugant wurde aufbewahrt: SJ4258 (von SJ4237) und SJ4259 (von SJ4238), beide enthaltend pSJ4199.
Diese Stämme wurden auf LBPSG-Platten, ergänzt mit Chloramphenicol (6 μg/ml) und Erythromycin (5 μg/ml), bei 50°C über Nacht aufgestrichen. Amylase-positive Kolonien wurden aus jedem Stamm erhalten, und 4 solcher Kolonien aus jedem Stamm wurden in TY-Medium ohne Antibiotika bei 30°C für 3–4 anschlie ßende Transfers zum Gewähren von Replikation, Exzidierung und Verlust des Plasmids geimpft. Amylase-positive, Erythromycin-empfindliche Kolonien wurden aus jedem Transkonjugat-Stamm erhalten und als SJ4270 (aus SJ4258) und SJ4271 (aus SJ4259) aufbewahrt.
2C. Test von abgeändertem Promoter-Stamm
Die Effizienz des abgeänderten Promoters wurde in Schüttelkolben-Experimenten getestet, in welchen α-Amylase-Herstellung von jedem dieser integrierten Stämme unter α-Amylase-Herstellung von dem Kontrollstamm (dem Stamm, von welchem SJ3047 durch Deletion des Promoters abgeleitet war) verglichen. Die Inkubation wurden zweifach in BPX-Medium ( EP 0 506 780 ) für eine Dauer von 7 Tagen bei 37°C durchgeführt und α-Amylase-Aktivität am Tag 2, 5 und 7 gemessen.
Die Aktivität ist in Bezug auf die vom Kontrollstamm gemessene höchste Aktivität angegeben.
Der in den Stämmen SJ4270 und SJ4271 vorliegende abgeänderte Promoter ist in Bezug auf α-Amylase-Herstellung verglichen mit dem Promoter des Kontrollstamms deutlich verbessert.
Beispiel 3: Aufbau eines Stamms, enthaltend zwei divergent transkribierte Expressionskassetten
3A. Plasmid-Aufbauten
Ein Plasmid wurde aufgebaut, in welchem eine gesamte Kopie des amyL-Gens zwischen dem UPS_PamyL-Segment und PamyL_4199Promoter an psJ4199 eingefügt war, so dass die beiden amL-Promoter am erhaltenen Plasmid in gegensätzliche Richtungen gelesen wurden.
Die Plasmide pSJ4338 (13) und pSJ4339 wurden aufgebaut. Diese sind mit dem Integrationsplasmid pSJ4199 fast identisch, außer dass ein paar zusätzliche Restriktionsstellen zwischen den UPS_PamyL- und PamyL_4199-Segmenten eingefügt sind. Plasmid pSJ4278 wurde als Templat bei einer PCR-Amplifikation mit den Primern #113123 und LWN3216 verwendet.
Ein amplifiziertes Fragment mit 0,19 kb wurde erhalten, gereinigt und mit SphI + pstI aufgeschlossen. Es wurde an das SphI-PstI-Fragment mit 3,5 kb von pSJ2643 gebunden, das Bindungsgemisch mit EcoRI + HindIII aufgeschlossen, das Fragment mit 1,13 kb gereinigt und an mit EcoRI + HindIII aufgeschlossenes pSJ2739 gebunden. Dieses Bindungsgemisch wurde dann in kompetentes DN1885, selektierend Erythromycinresistenz (5 μg/ml), bei 30°C transformiert. Drei Transformate wurden erhalten. Stanzen SJ4338 (DN1885/pSJ4338) enthielt ein Plasmid, das durch Restriktionsanalyse genau zu sehen war, und die amyL-Promoterregion wurde durch DNA-Sequenzieren als korrekt befunden.
Die Plasmide pSJ4372 und pSJ4373 (14) wurden dann durch Einfügen des gesamten amyL-Gens in das vorstehende Integrationsplasmid aufgebaut. Folglich wurde pSJ4277 mit BclI + BglII (+NcoI zum weiteren Aufschluss des ungewünschten Fragments) aufgeschlossen und das Fragment mit 2,8 kb gereinigt. Dies wurde an mit BglII aufgeschlossenes pSJ4338 gebunden und das Bindungsgemisch in kompetentes DN1885, selektierend Erythromycinresistenz (5 μg/ml), bei 30°C transformiert. Die Amylase-positive Transformate, durch Restriktionsanalyse als korrekt erachtet, waren SJ4372 (DN1885/pSJ4372) und SJ4373 (DN1885/pSJ4373).
3B. Überführen in B. licheniformis und Chromosomen-Integration
Diese Plasmide wurden anschließend in den konjugativen Donor-Wirtstamm PP289-5 transformiert, was zu den Stämmen SJ4378 und SJ4379 (beide PP289-5/pSJ4373; Erm^R Tet^R Dal^–) führte.
Plasmid pSJ4373 wurde in B. licheniformis SJ3047 durch Konjugation wie vorstehend beschrieben überführt.
Die Trankonjugante (4 unter Verwendung von SJ4378-Donor, 9 unter Verwendung von SJ4379-Donor) erschienen nach zwei Tagen.
4 Stämme wurden aufbewahrt: SJ4395 und SJ4396 aus SJ4378-Donor, SJ4397 und SJ4398 aus SJ4379-Donor.
Die Stämme wurden auf LBPSG-Platten mit Erythromycin (5 μg/ml) bei 50°C gestrichen und 10 einzelne Kolonien aus jedem Stamm dann in 10 ml TY-Kulturen geimpft und bei 30°C über Nacht vermehrt. Die Kulturen wurden dann auf einzelne Kolonien auf LBPSG-Platten gesprüht, diese Platten über Nacht bei 30°C inkubiert, auf LBPSG-Platten mit Erythromycin (5 μg/ml) Replikations-aufgetragen und Erythromycinresistenz und Amylase-Phenotyp nach Inkubation über Nacht bewertet. Die meisten Kolonien waren Erythromycin-empfindlich jedoch Amylase-negativ. Aus einer Kultur jedoch wurde ein Erythromycin- empfindlicher, Amylase-positiver Stamm isoliert. Dieser wurde als SJ4414 aufbewahrt.
3C. Test von Zwei-Kopie-Stamm
Das Aussehen in BPX-Schüttelkolben von Zwei-Kopie-Stamm SJ4414 wurde mit demjenigen von SJ4270 (dem entsprechenden Ein-Kopie-Stamm) in zwei separaten Experimenten verglichen.
BPX-Schüttelkolben wurden für eine Dauer von 7 Tagen bei 37°C inkubiert, kein Antibiotikum zugesetzt und die α-Amylase-Aktivität gemessen. Für jeden Versuch sind die angegebenen Aktivitäten in Bezug auf die von dem Ein-Kopie-Stamm erhaltene Aktivität angegeben.
Versuch A
Versuch B
Die Versuche A und B zeigen deutlich, dass der Zwei-Kopie-Stamm SJ4414 eine höhere Ausbeute verglichen mit dem entsprechenden Ein-Kopie-Stamm SJ4270 ergab.
Ferner wurden Proben von S74414 auf LBPSG gesprüht. Alle einzelnen Kolonien (etwa 30 von jedem Kolben, einschließlich diejenigen mit niedrigem pH-Wert) waren Amylase-positiv, was das stabile Beibehalten der zwei integrierten Kopien anzeigte.
Beispiel 4: Chromosomen-Gen-Einfügung in zwei aufeinander folgenden Schritten
Als Alternative zu dem vorstehend beschriebenen Aufbauweg (Beispiel 3) wurde ein temperaturempfindliches, mobilisierbares Vektorpaar benannt und aufgebaut, um ein leichtes Klonen und eine leichte Integration einer beliebigen Expressionskassette zu gewähren. Der erste Vektor enthält zwei Regionen mit Homologie für benachbarte Segmente des Wirtszellen-Chromosoms. Dazwischen enthält er eine Multilinkerstelle und ein großes (z. B. 5 kb) Segment von „neutraler DNA". Der zweite Vektor enthält nur das große Segment von „neutraler DNA", weist jedoch die Multilinkerstelle, eingefügt in die Mitte dieses Segments und in der gegensätzlichen relativen Orientierung verglichen mit dem ersten Vektor, auf. Die Vektoren und die Strategie hinter deren Verwendung ist in der schematischen Zeichnung in 15 veranschaulicht. Zusätzlich zu der vorstehend definierten Anmerkung, bedeutet „Segment A" eine Hälfte des großen (neutralen) DNA-Segments, bedeutet „Segment B" die andere Hälfte dieses Segments und bedeutet „GFP" ein Gen-exprimierendes Green-Fluorescent-Protein.
Als „neutrale" DNA, die zum Einfügen in Produktionsstämme geeignet ist, wurde ein Verbund aus zwei Segmenten der Genregion von Bacillus subtilis 168 pps (Zugangsnummer Z34883 in Gen-Bank/EMBL) ausgewählt, die von Stamm SJ2692 entnommen ist, der der im internationalen Genom-Sequenzierungsprogramm verwendete Stamm ist. Ein Segment liegt vollständig innerhalb des Gens pps2, das andere Segment vollständig innerhalb pps4. Sie wurden ausgewählt, da sie sehr wenig Restriktionsenzymstellen enthielten und da beim Klonen nicht zu erwarten ist, dass sie jegliche Genprodukte kodieren.
4A. Aufbau von Vektor zur Integration der ersten Expressionskassetten-Kopie
pSJ4459 (16) wurde wie folgt aufgebaut: Chromosomen-DNA von SJ2692 wurde mit den Primern PCR #119882 und #119883 PCR-amplifiziert.
Das amplifizierte Fragment mit 2,6 kb wurde mit EcoRI und HindIII aufgeschlossen und an mit EcoRI + HindIII aufgeschlossenes pUC19 gebunden. Das Bindungsgemisch wurde durch Elektroporation in E. coli SJ2, selektierend Ampicillinresistenz (200 μg/ml), auf IPTG-X-gal-Platten transformiert. Vier weiße Kolonien wurden zur Plasmidherstellung aufgesammelt. Alle waren korrekt und konnten mit den Enzymen EcoRI, HindIII, SphI und NheI aufgeschlossen werden. Ein Stamm wurde als S74459 (SJ2/pSJ4459) aufbewahrt. „z34883 10–12,5" bedeutet das amplifizierte Fragment von pps2.
Plasmid pSJ4461 (17) wurde wie folgt aufgebaut:
Chromosomen-DNA von SJ2692 wurde mit den Primern #119884 und #119885 PCR-amplifiziert.
Das amplifizerte Fragment mit 2,8 kb wurde mit EcoRI und HindIII aufgeschlossen und an mit EcoRI + HindIII aufgeschlossenes pUC19 gebunden. Das Bindungsgemisch wurde durch Elektroporation an E. coli SJ2, selektierend Ampicillinresistenz (200 μg/ml) auf IPTG-X-gal-Platten transformiert. Vier weiße Kolonien wurden zur Plasmidherstellung aufgesammelt. Drei waren korrekt und konnten mit den Enzymen HindIII, XbaI, BglII, SaII, SacII, NotI, MluI, NheI, NcoI aufgeschlossen werden. Ein Transformat wurde als SJ4461 (SJ2/pSJ4461) aufbewahrt. „z34883 25.2–28.0" bedeutet das amplifizierte Fragment von pps4.
Plasmid pSJ4498 (18) wurde wie folgt aufgebaut: Plasmid pSJ4459 wurde mit EcoRI + NheI (+BsaI zum weiteren Aufschluss des ungewünschten Teils) aufgeschlossen und das EcoRI-NheI-Fragment mit 2,6 kb aus einem Agarosegel gereinigt. Das Fragment wurde an mit EcoRI + XbaI aufgeschossenes pSJ4461 gebunden und das Bindungsgemisch in E. coli SJ6, selektierend Ampicillinresistenz (6 μg/ml), transformiert (Elektroporation). Ein Transformat wurde als SJ4498 (SJ6/pSJ4498) aufbewahrt.
Plasmid pSJ4505 (19) wurde wie folgt aufgebaut: pSJ4498 wurde mit SphI und HindIII aufgeschlossen und das Fragment mit 5,4 kb Gel-gereinigt. Dies wurde an das SphI-HindII-Fragment mit 3,2 kb gebunden, aus pSJ2643 (vorstehend beschrieben, 7) gereinigt und das Bindungsgemisch in E. coli SJ6, selektierend Ampicillinresistenz (6 μg/ml), transformiert (Elektroporation). Ein Transformat wurde als SJ4505 (SJ6/pSJ4505) aufbewahrt.
Zum Gewähren von visuellem Screenen auf Einfügen der zweiten Genkopie wurde ein Gen-kodierendes Green-Fluorescent-Protein zwischen die beiden pps-Gensegmente im ersten Integrationsvektor eingefügt. Die erste Einfügung des Gens von Interesse unter Verwendung dieses Systems würde dann die Zellen GFP-positiv machen, wohingegen die korrekte Einfügung der zweiten Kopie des Gens von Interesse die Zellen wieder GFP-negativ machen würde. Ein Plasmid-exprimierendes Green-Fluorescent-Protein ist pSJ4574 (20), beschrieben in BEISPIEL 1 und 3 in der Patentanmeldung DK 0792/97 und WO 99/01562. „bioST" bedeutet das GFP-Gen und „PamyQ" den Promoter des α-Amylasegens von Bacillus amyloliquefaciens.
Plasmid pSJ4581 (21) wurde wie folgt aufgebaut:
pSJ4574 wurde mit PstI aufgeschlossen und das Fragment mit 0,95 kb Gel-gereinigt. Dieses Fragment wurde an mit NsiI aufgeschlossenes pSJ4505 gebunden und das Bindungsgemisch in E. coli SJ2, selektierend Ampicillinresistenz (200 μg/ml), transformiert (Elektroporation). Ein Transformat wurde als SJ4581 (SJ2/pSJ4581) aufbewahrt.
Plasmid pSJ4587 (22) wurde wie folgt aufgebaut: pSJ4587 wurde mit EcoRI + BglII aufgeschlossen und das Fragment mit 6,9 kb Gel-gereinigt. Dieses Fragment wurde an das EcoRI-BglII-Fragment mit 5,0 kb gebunden, aus pSJ2739 (vorstehend beschrieben, 10) gebunden und das Bindungsgemisch in kompetente Zellen von B. subtilis DN1885, selektierend Erythromycinresistenz (5 μg/ml), bei 30°C transformiert. Ein Transformat wurde als SJ4587 (DN1885/pSJ4587) aufbewahrt.
4B. Aufbau von Vektor für Integration einer zweiten Expressionskassetten-Kopie
Plasmid pSJ4465 (23) wurde wie folgt aufgebaut: Plasmid pSJ4459 wurde als Substrat in einer PCR-Reaktion mit den Primern #119882 und #119886 unter Verwendung von 60°C als Aushärtungstemperatur und nur 10 Amplifikationszyklen verwendet.
#119882: siehe vorstehend
Das amplifizierte Fragment mit 2,6 kb wurde mit EcoRI und HindIII aufgeschlossen und an mit EcoRI + HindIII aufgeschlossenes pUC19 gebunden. Das Bindungsgemisch wurde durch Elektroporation in E. coli SJ2, selektierend Ampicillinresistenz (200 μg/ml), auf IPTG X-gal-Platten transformiert. Sechs weiße Kolonien wurden zur Plasmidherstellung aufgesammelt. Drei waren korrekt und konnten mit den Enzymen EcoRI, HindII, SphI, NheI, SacII, SaII und BglII aufgeschlossen werden. Ein Transformat wurde als SJ4465 (SJ2/pSJ4465) aufbewahrt.
Plasmid pSJ4471 (24) wurde wie folgt aufgebaut: Plasmid pSJ4461 wurde als Substrat bei einer PCR-Reaktion mit den Primern #119887 und #119888 unter Verwendung von 60°C als Aushärtungstemperatur und nur 10 Amplifikationszyklen verwendet.
Das amplifizierte Fragment mit 2,8 kb wurde mit XbaI und HindIII aufgeschlossen und an mit XbaI + HindIII aufgeschlossenes pUC19 gebunden. Das Bindungsgemisch wurde durch Elektroporation in E. coli SJ2, selektierend Ampicillinresi stenz (200 μg/ml), auf IPTG-X-gal-Platten transformiert. 12 weiße Kolonien wurden zur Plasmidherstellung aufgesammelt. Eine war korrekt und konnte mit den Enzymen XbaI, HindIII, NotI, MluI, NheI, und NcoI aufgeschlossen werden. Der Stamm wurde als SJ4471 (SJ2/pSJ4471) aufbewahrt.
Plasmid pSJ4499 (25) wurde wie folgt aufgebaut: Plasmid pSJ4465 wurde mit EcoRI + NheI (+BsaI zum weiteren Aufschluss des unerwünschten Teils) aufgeschlossen und das EcoRI-NheI-Fragment mit 2,6 kb aus einem Agarosegel gereinigt. Das Fragment wurde an mit EcoRI + XbaI aufgeschlossenes pSJ4471 gebunden und das Bindungsgemisch in E. coli SJ6, selektierend Ampicillinresistenz (200 μg/ml), transformiert. Ein korrekter Transformat wurde als SJ4499 (SJ6/pSJ4499) aufbewahrt.
Plasmid pSJ4507 (26) wurde durch Aufschluss von pSJ4499 mit EcoRI + HindIII, Reinigung des Fragments mit 5,4 kb und Bindung an das EcoRI-HindIII-Fragment mit 4,3 kb von pSJ2739 aufgebaut. Das Bindungsgemisch wurde in kompetente Zellen von B. subtilis DN1885, selektierend Erythromycinresistenz (5 μg/ml), bei 30°C transformiert. Ein Transformat wurde als SJ4507 (DN1885/pSJ4507) aufbewahrt.
4C. Einfügung eines Gens, kodierend alpha-Amylase, amyL, von Bacillus licheniformis in erste und zweite Integrationsvektoren
Plasmid pSJ4457 (27) wurde aufgebaut. Dies ist mit pSJ4277, vorstehend beschrieben (12), außer für ein paar zusätzliche Restriktionsstellen stromaufwärts des Mutant-amyL-Promoters fast identisch. Es wurde durch Binden des SphI-PstI-Fragments mit 0,2 kb, gereinigt aus pSJ4338 (beschrieben in Beispiel 3A vorstehend, 13), an das PstI-SphI-Fragment von pDN1981, und Transformation des Bindungsgemischs in DN1885, selektierend Kanamycinresistenz (10 μg/ml), aufgebaut. Ein Transformat wurde als SJ4457 (DN1885/pSJ4457) aufbewahrt.
Plasmid pSJ4608 (28) enthält das in den ersten Kopie-Integrationsvektor eingefügte amyL-Gen und wurde wie folgt aufgebaut:
PSJ4457 wurde mit BglII und HindIII aufgeschlossen und das Fragment mit 1,9 Gel-gereinigt. Dieses Fragment wurde and das BglII-HindIII-Fragment von pSJ4587 gebunden und das Bindungsgemisch in kompetentes DN1885, selektierend Erythromycinresistenz (5 μg/ml), bei 30°C transformiert. Ein Amylase-positiver, GFP-positiver Transformat wurde als SJ4608 (DN1885/pSJ4608) aufbewahrt.
Plasmid pSJ4606 (29) enthält das in den zweiten Kopie-Integrationsvektor eingefügte amyL-Gen und wurde wie folgt aufgebaut:
pSJ4457 wurde mit BglII und BcII aufgeschlossen und das Fragment mit 1,9 kb Gel-gereinigt. Dieses Fragment wurde an mit BglII aufgeschlossenes pSJ4507 gebunden und das Bindungsgemisch in kompetentes DN1885, selektierend Erythromycinresistenz (5 μg/ml), bei 30°C transformiert. Ein Transformat, enthaltend das in der gewünschten Orientierung eingefügte amyL-Gen, wurde als SJ4606 (DN1885/pSJ4606) aufbewahrt.
4D. Überführung in Bacillus licheniformis und Chromosomenintegration des ersten Integrationsvektors
Plasmid pSJ4608 wurde in kompetente Zellen des konjugativen Donor-Wirtsstamms PP289-5, selektierend Erythromycin- (5 μg/ml) und Tetracyclin- (5 μg/ml) Resistenz auf LBPSG-Platten, ergänzt mit D-Alanin (100 μg/ml), transformiert und ein Transformat als SJ4611 (PP289-5/pSJ4608) aufbewahrt.
Plasmid pSJ4608 wurde in B. licheniformis SJ3047 (beschrieben in Beispiel 1) durch Konjugation wie vorstehend beschrieben überführt. Ein Amylase-positiver, GFP-positiver Transkonjugat wurde auf eine LBPSG-Platte mit Erythromycin (5 μg/ml) gestrichen und bei 50°C über Nacht inkubiert. Sechs Amylase-positive GFP-positive Kolonien wurden in einzelne 10 ml-TY-Kulturen geimpft und bei 30°C geschüttelt. Die Kulturen wurden dann auf einzelne Kolonien auf LBPSG bei 30°C aufgetragen und auf LBPSG mit Erythromycin (5 μg/ml) Replikations-aufgetragen. Mutmaßliche Erythromycin-empfindliche, Amylase-positive Kolonien wurden wieder isoliert. Der GFP-positive Phenotyp war nach etwa einer Woche auf den Platten deutlich sichtbar. Zwei Amylase-positive GFP-positive und Erythromycin-empfindliche Stämme wurden als SJ4629 und SJ4630 aufbewahrt.
4E. Überführung in Bacillus licheniformis und Chromosomenintegration des zweiten Integrationsvektors
Plasmid pSJ4606 wurde in kompetente Zellen des konjugativen Donor-Wirtsstamms PP289-5, selektierend Erythromycin- (5 ng/ml) und Tetracyclin- (5 μg/ml) Resistenz auf LBPSG-Platten, ergänzt mit D-Alanin (100 μg/ml), transformiert und ein Transformat als SJ4609 aufbewahrt.
Plasmid pSJ4606 wurde in Stämme SJ4629 und SJ4630 von B. licheniformis durch Konjugation von SJ4609 überführt. Zwei Transkonjugate von jedem Rezipienten wurden auf Erythromycin- (5 μg/ml) Platten gestrichen und bei 50°C über Nacht inkubiert. 12 Kolonien, die bei 50°C erschienen, von jedem Rezipienten wurden in einzelne 10 ml-TY-Kulturen geimpft und bei 30°C geschüttelt. Diese Vermehrung wurde einmal wiederholt. Die Kulturen wurden dann auf einzelne Kolonien auf LBPSG bei 30°C aufgetragen und die Platten auf LBPSG mit Erythromycin (5 μg/ml) Replikations-aufgetragen.
Erythromycin-empfindliche, GFP-negative Kolonien wurden von 12 der 24 Kulturen erhalten.
Einige aufbewahrte Stämme waren SJ4669/SJ4670 und SJ4671 (von separaten TY-Kulturen von SJ4629-Rezipienten) und SJ4672, SJ4673 und SJ4674 (von separaten TY-Kulturen von SJ4630-Rezipienten).
4F. Test von Zwei-Kopie-Stämmen
Stamm SJ4270 (der Einzel-Kopie-Stamm), SJ4629 und SJ4630 (Einzel-Kopie-Stämme exprimierend auch GFP und enthaltend die eingefügten pps-Gensegmente) und die Zwei-Kopie-Stämme SJ4669-SJ4674 wurden in PBX-Schüttelkolben getestet, bei 37°C eine Woche inkubiert, und die α-Amylase-Aktivität wurde gemessen. Die Ausbeute ist als Prozentgehalt der erhaltenen Ausbeute mit der Kontrolle des Einzel-Kopie-Stamms SJ4270 ausgedrückt.
Die überraschend geringe Ausbeute, die mit dem Stamm SJ4630 erhalten wurde, lag möglicherweise aufgrund einer später nachgewiesenen Kontamination dieses Stamms vor.
Stamm SJ4671, von welchem durch Southern-Analyse (siehe nachstehend) bestimmt wurde, dass er die beiden Kopien des wie beabsichtigt eingefügten amyL-Gens in gegensätzlicher Orientierung aufwies, wurde zur weiteren Analyse durch Fermentierung in einem Labor-Fermentator ausgewählt. Am Tag 4 der Fermentierung wurde eine Probe der SJ4671-Kultur auf LBPG-Platten mit gefärbten Amylopektin zum Überprüfen des Amylase-Phenotyps aufgetragen. Die 800 Kolonien, die alle als Amylase-positiv mit dem selben Grad erschienen, reflektierten die Stabilität des Stamms.
10 dieser Kolonien wurden in BPX-Schüttelkolben mit SJ4671 von der gefrorenen Stammlösung über eine Platte als Kontrolle mit dem folgenden Ergebnis geimpft (7 Tage, 37°C).
Die Ausbeute von SJ4671 in diesem Versuch betrug 102% der im ersten Versuch erhaltenen Ausbeute von SJ4671.
Folglich ergaben die einzelnen Kolonien, die nach der Fermentierung aufgesammelt wurden, alle mit der Ausbeute des ursprünglichen SJ4671 Stamms äquivalente Ausbeuten, was die Stabilität des Stamms reflektierte.
4G. Southern-Analyse
Chromosomen-DNA der Stämme SJ3047, S74270, SJ4629 und Zwei-Kopie-Stämme, einschließlich SJ4671 wurde extrahiert und durch Southern-Blot-Hybridisierungen analysiert. DNA-Herstellungen wurden mit HindIII oder mit HindIII + KpnI aufgeschlossen und die durch Agarosegel-Elektrophorese abgetrennten DNA-Fragmente in Immobilon-N-(Milliporen)Membran durch Vakuum-Blotten überführt. Die Membran wurde mit biotinyliertem Plasmid pDN1981-DNA unter Verwendung des NE-Blot-Photope-Bausatzes und Photope-Detection-Bausatzes von New England Biolabs sondiert.
Plasmid pDN1981, das als Sonde verwendet wurde, enthält das gesamte Termamyl-Gen (an einem Sphl-HindIII-Fragment mit 2,4 kb), den pUB110-Ursprung und rep-Gen und das Kanamycinresistenzgen.
Die erhaltenen Blots zeigten wie erwartet von Stamm SJ3047 ein HindIII-Fragment mit 4,2 kb.
Von Stamm SJ4270 wird ein HindIII-Fragment mit 3,3 kb gezeigt.
Von Stamm SJ4629 wird ein HindIII-Fragment mit 9,6 kb gezeigt.
Von Stamm SJ4671 wird ein HindIII-Fragment mit 10,6 kb gezeigt.
Schließlich zeigt Stamm SJ4671, DNA-aufgeschlossen sowohl mit HindIII als auch KpnI, Fragmente mit 5,2 kb, 4,2 kb und 1,3 kb.
Dieses Hybridisierungsmuster ist wie erwartet von dem gewünschten Zwei-Kopie-Stamm, wodurch die Korrektheit von Stamm SJ4671 festgestellt wird.

Claims

Prokaryontische Zelle, die ein Gen von Interesse exprimiert, dadurch gekennzeichnet, dass i) die Zelle am Chromosom zwei antiparallel transkribierte Kopien des Gens von Interesse, und ii) ein zwischen zwei Kopien des Gens von Interesse unter Punkt i) liegendes DNA-Segment, das lediglich eine DNA-Sequenz umfasst, die für das Wachstum der Zelle nicht essenziell ist, umfasst.
Verfahren zum Aufbau einer prokaryontischen Zelle, das ein Gen von Interesse exprimiert, umfassend den Aufbau einer Zelle, wobei i) die Zelle am Chromosom zwei antiparallel transkribierte Kopien des Gens von Interesse, und ii) ein zwischen zwei Kopien des Gens von Interesse unter Punkt i) liegendes DNA-Segment, das lediglich eine DNA-Sequenz umfasst, die für das Wachstum der Zelle nicht essenziell ist, umfasst.
Prokaryontische Zelle nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Gen ein solches Gen ist, das fähig ist, aus der Zelle abgegebene Polypeptide zu exprimieren.
Prokaryontische Zelle nach Anspruch 1 oder 3 oder Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Gen ein Enzym kodiert.
Prokaryontische Zelle nach einem der Ansprüche 1 oder 3–4 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3–4, wobei die prokaryontische Zelle eine Bazilluszelle ist.
Prokaryontische Zelle nach einem der Ansprüche 1 oder 3–5 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3–5, wobei das zwischen zwei Kopien des Gens liegende DNA-Segment mindestens 10 Bp lang, vorzugsweise 10–6 000 Bp und besonders bevorzugt 75–4 500 Bp lang ist.
Prokaryontische Zelle nach einem der Ansprüche 1 oder 3–6 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3–6, wobei das zwischen zwei Kopien des Gens von Interesse liegende DNA-Segment kein Markierungsgen einer Antibiotikumresistenz umfasst.
Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines Polypeptids von Interesse, umfassend i) Züchten einer prokaryontischen Zelle nach einem der Ansprüche 1 oder 3–7 unter geeigneten Bedingungen, welche Exprimieren des durch das Gen von Interesse kodierten Polypeptids von Interesse gewähren, und ii) Isolieren des Polypeptids von Interesse.
Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines Polypeptids von Interesse des Anspruchs 8, wobei das Züchten einer prokaryontischen Zelle im Punkt i) unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass das Polypeptid von Interesse in einer Menge von mindestens 2 g Polypeptid (Trockensubstanz)/kg Nährmedium exprimiert ist.
Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines Polypeptids von Interesse des Anspruchs 8, wobei das Züchten einer prokaryontischen Zelle im Punkt i) ein Fermentierungsprozess einer Volumenskala von > 10 m³ ist.