DE69928830T2

DE69928830T2 - Proteinproduktion in gram-positiven mikroorganismen

Info

Publication number: DE69928830T2
Application number: DE69928830T
Authority: DE
Inventors: Maria Diaz-Torres; Eugenio Ferrari
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2019-12-22
Also published as: EP1141310A2; GB9828711D0; EP1141310B1; WO2000039323A2; ES2251256T3; DK1141310T3; ATE312177T1; WO2000039323A3; DE69928830D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und insbesondere die Produktion von Proteinen in grampositiven Mikroorganismen. Die Erfindung betrifft insbesondere grampositive Mikroorganismen, welche eine Mutation in dem opp-Operon aufweisen, und Verfahren zur Produktion von Proteinen in solchen Wirtszellen.
Hintergrund
Grampositive Mikroorganismen, wie Bacillus, sind für die industrielle Fermentation in großem Maßstab z.T. aufgrund ihrer Fähigkeit, ihre Fermentationsprodukte in das Kulturmedium zu sezernieren, verwendet worden. Sezernierte Proteine werden durch eine Zellmembran und eine Zellwand hindurch exportiert und werden dann nachfolgend in das äußere Medium freigesetzt. Es ist vorteilhaft, Proteine von Interesse in grampositiven Mikroorganismen zu produzieren, da exportierte Proteine üblicherweise ihre native Konformation beibehalten.
Das opp-Operon von Bacillus (das in diesem Fachgebiet auch als spoOK-Operon bekannt ist) kodiert eine Oligopeptid-Permease, die für die Initiation der Sporulation und die Entwicklung von genetischer Kompetenz erforderlich ist (Rudner et al., 1991, Journal of Bacteriology, 173: 1388–1398). Das opp-Operon ist ein Mitglied der Familie von ATP-bindenden Kassetten-Transportern, die am Import oder Export von Oligopeptiden aus 3–5 Aminosäuren beteiligt sind. Es gibt fünf Genprodukte des opp-Operons: oppA ist ein Liganden-bindendes Protein und ist an der Außenseite der Zelle durch einen Lipidanker angeheftet; oppB und oppC sind die Membranproteine, die einen Komplex, durch welchen der Ligand transportiert wird, bilden; oppD und oppF (Perego et al., 1991, Mol. Microbiol. 5: 173–185) sind die ATPasen, von denen angenommen wird, dass sie Energie für den Transport bereitstellen (Le-Deaux et al., 1997, FEMS Microbiology Letters 153: 63–69). Das opp-Operon ist von Rudner et al., 1991, J. Bacteriol. 173: 1388–1398) auch als SpoOK bezeichnet worden.
Obwohl Deletionsmutationen in dem B. subtilis-opp-Operon hergestellt worden sind (La-Deaux, 1997, FEMS Microbiology Letters 153: 63–69), sind diese Deletionen nicht mit einer verstärkten Expression von rekombinanten Proteinen in B. subtilis korreliert worden. Es bleibt ein Bedarf an verbesserten Methoden für die Produktion von Proteinen in Bacillus wie auch anderen grampositiven Mikroorganismen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert z.T. auf der Entdeckung, dass ein Bacillus-Stamm, welcher eine Mutation in dem opp-Operon enthält, mehr rekombinantes Protein produziert als der Wildtyp-Bacillus-Stamm. Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins in einem grampositiven Mikroorganismus bereit, welches die Schritte umfasst, einen grampositiven Mikroorganismus zu erhalten, welcher Nukleinsäure, welche das Protein kodiert, umfasst, wobei der Mikroorganismus eine Mutation in dem oppA-Gen in dem opp-Operon aufweist, wobei die Mutation zu der Inaktivierung des oppA-Produkts des opp-Operons führt; und den Mikroorganismus unter Bedingungen, die für die Expression des Proteins geeignet sind, zu kultivieren. In einer anderen Ausführungsform ist der grampositive Mikroorganismus ein Mitglied der Familie Bacillus. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Bacillus B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. cirrulans, B. lautus und Bacillus thuringiensis.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Protein ein Hormon, ein Enzym, einen Wachstumsfaktor und ein Zytokin. In noch einer anderen Ausführungsform ist das Protein ein Enzym und umfasst Proteasen, Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen, wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen. Unter einem Aspekt der Erfindung ist das Protein eine Protease, die von einer Bacillus-Spezies erhalten werden kann. Unter einem anderen Aspekt der Erfindung ist die Protease Subtilisin.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A–1M zeigen die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz des B. subtilis-opp-Operons. Die oppA-, oppB-, oppC-, oppD- und oppF-Gene sind angegeben.
Detaillierte Beschreibung
Definitionen
Wie hier verwendet, umfasst die Gattung Bacillus alle Mitglieder, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und B. thuringiensis.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Bacillus subtilis-opp-Operon" auf die B. subtilis-Operonsequenz, die in den 1A–1M offenbart ist, wobei die individuellen Gene oppA, oppB, oppC, oppD und oppF angegeben sind. Der Ausdruck „opp-Operon" umfasst opp-Operons, die in grampositiven Organismen vorhanden sind. Ein grampositiver Mikroor ganismus kann einen Cluster aus einer Mehrzahl von Genen, welche das opp-Operon umfasst, ähnlich wie bei B. subtilis aufweisen. Der Ausdruck opp-Operon bezieht sich kollektiv auf den Cluster von Genen. Opp-Operons von grampositiven Mikroorganismen werden in Podbielski et al. (1996, Molecular Microbiology 21: 1087–1099, und Tynkkynen et al. (1993, Journal of Bacteriology 175: 7523–7532) offenbart. Bacillus-opp-Operons werden Nukleinsäure umfassen, die wenigstens 50%, wenigstens 55%, wenigstens 60%, wenigstens 65%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90% oder wenigstens 95% Identität mit dem B. subtilis-opp-Operon, das in 1 gezeigt ist, aufweist, und werden so funktionieren, dass sie Peptide für die Bacillus importieren. Die prozentuale Identität kann über die gesamte Länge des opp-Operons bestimmt werden oder kann auf der Basis eines Gens für ein jegliches individuelles Gen in dem opp-Operon-Gen-Cluster bestimmt werden.
In einer Ausführungsform ist der grampositive Organismus ein Bacillus. In einer anderen Ausführungsform ist der grampositive Organismus B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. cirrulans, B. lautus und B. thuringiensis. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der grampositive Mikroorganismus Bacillus subtilis.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Nukleinsäure" auf eine Nukleotid- oder Polynukleotidsequenz und Fragmente oder Abschnitte davon und auf DNA oder RNA von genomischer oder synthetischer Herkunft, die doppelsträngig oder einzelsträngig sein kann bzw. können, unabhängig davon, ob sie den Sinn- oder Antisinn-Strang repräsentiert bzw. repräsentieren. Wie hier verwendet, bezieht sich „Aminosäure" auf Peptid- oder Proteinsequenzen oder Abschnitte davon.
Die Begriffe „isoliert" oder „gereinigt", wie hier verwendet, beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder Aminosäure, die von wenigstens einer Komponente, mit der sie natürlicherweise assoziiert ist, befreit ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „heterologes Protein" auf ein Protein oder Polypeptid, das in einer grampositiven Wirtszelle natürlicherweise nicht vorkommt. Beispiele von heterologen Proteinen umfassen Enzyme, wie Hydrolasen, einschließlich Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen, wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen. Das heterologe Gen kann therapeutisch signifikante Proteine oder Peptide, wie Wachstumsfaktoren, Zytokine, Liganden, Rezeptoren und Inhibitoren, wie auch Impfstoffe und Antikörper kodieren.
Das Gen kann kommerziell bedeutende industrielle Proteine oder Peptide, wie Proteasen, Carbohydrasen, wie Amylasen und Glucoamylasen, Cellulasen, Oxidasen und Lipasen, kodieren. Das Gen von Interesse kann ein natürlicherweise vorkommendes Gen, ein mutiertes Gen oder ein synthetisches Gen sein.
Der Ausdruck „homologes Protein" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid, welches in einer grampositiven Wirtszelle nativ ist oder natürlicherweise vorkommt. Die Erfindung umfasst Wirtszellen, die das homologe Protein über die Technik der in vitro-DNA-Rekombination produzieren. Die Erfindung umfasst eine grampositive Wirtszelle, die eine Deletion oder Unterbrechung der Nukleinsäure, die das natürlicherweise vorkommende homologe Protein, wie eine Protease, kodiert, aufweist und Nukleinsäure, die das homologe Protein kodiert, aufweist, die in einer rekombinanten Form erneut eingeführt worden ist. In einer anderen Ausführungsform produziert die Wirtszelle das homologe Protein. Ein rekombinantes Protein bezieht sich auf ein jegliches Protein, welches durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die in den Mikroorganismus eingeführt worden ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Mutation" auf eine jegliche Veränderung in wenigstens einem der Gene in dem opp-Operon, so dass das Genprodukt inaktiviert oder eliminiert wird und der Transport von Oligopeptiden von 3–5 Aminosäuren verringert oder eliminiert wird. Beispiele von Mutationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Punktmutationen, Leserasterverschiebungsmutationen und Deletionen eines Teils oder der Gesamtheit eines Gens in dem opp-Operon-Gen-Cluster. Der Begriff „Mutation" umfasst Veränderungen in einem jeglichen oder allen der Gene in dem opp-Operon-Gen-Cluster.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass das Mutieren von wenigstens einem Gen des opp-Operons in einem grampositiven Mikroorganismus zu einer erhöhten Produktion von heterologen Proteinen in dem mutierten Mikroorganismus führt. Die Entdeckung liefert eine Grundlage für die Erzeugung von Wirts-Mikroorganismen und für Expressionsmethoden, die verwendet werden können, um heterologe Proteine zu produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Bacillus-Spezies, die eine Mutation in oppA aufweist derart, dass das oppA-Genprodukt inaktiviert ist. Der Bacillus ist des weiteren gentechnologisch so modifiziert, dass er ein heterologes oder homologes Protein oder Polypeptid produziert. In einer Ausführungsform umfasst das heterologe Protein Proteasen, Carbohydrasen, wie Amylasen und Glucoamylasen, Cellulasen, Oxidasen und Lipasen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid eine Protease, die aus einer Bacillus-Spezies erhalten werden kann. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Protease Subtilisin. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für Subtilisin finden sich in den folgenden Veröffentlichungen: B. subtilis: Stahl, M. L., und E. Ferrari, 1984, J. Bacteriol. 158, 411–418; B. amyloliquefaciens: Wells, J. A., E. Ferrari, D. J. Henner, D. A. Estell und E. Y. Chen, 1983, Nucleic Acid Res. 11, 7911–7925; N. Vasantha, L. D. Thompson, C. Rhodes et al., 1984, J. Bacteriol., 159, 811–819; B. amylosachariticus: Kurhara, M., Markland, F. S., und Smith, E. L., 1972, J. Biol. Chem., 247, 5619–5631; B. lentus: Hastrup, S., Brannner, S., Norris, F., et al., 1989, Internationales Patent Nr. WO 89/0629; B. licheniformis: Jacobs, M. Eliasson, M., Uhlen, M., und Flock, J., 1985, Nucleic Acid Res. 13, 8913–8927.
I. Opp-Operon
Das opp-Operon steht bekanntermaßen mit dem Transport, d.h. Import von Oligopeptiden von 3–5 Aminosäuren in Verbindung. Die Sequenz für das Bacillus subtilis-opp-Operon ist in den 1A–1M angegeben. Die Erfindung umfasst eine Mutation in wenigstens einem der Gene des opp-Operon-Gen-Clusters, so dass das Genprodukt inaktiviert oder eliminiert und der Peptidtransport unterbrochen wird. Ein Assay auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines funktionierenden opp-Operons besteht dann, den Wirts-Mikroorganismus einer Vermehrung in Gegenwart eines toxischen Oligopeptids von 3 Aminosäuren, wie Bialaphos, einem Tripeptid, bestehend aus zwei L-Alanin-Molekülen und einem L-Glutaminsäure-Analog (Meiji Seika, Japan), zu unterwerfen. Ein Mikroorganismus mit einem funktionsfähigen opp-Operon wird eine gehemmte Vermehrung aufweisen. Ein Mikroorganismus mit einer Mutation in wenigstens einem Gen des opp-Operon-Gen-Clusters wird keine Vermehrungshemmung in Gegenwart des toxischen Oligopeptids zeigen.
Grampositive Polynukleotid-Homologe des B. subtilis-opp-Operons können durch Standardprozeduren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, ausgehend von beispielsweise klonierter DNA (z.B. einer DNA-„Bibliothek"), genomischen DNA-Bibliotheken, durch chemische Synthese, sind sie einmal identifiziert, durch cDNA-Klonierung oder durch die Klonierung von genomischer DNA oder von Fragmenten davon, gereinigt aus einer gewünschten Zelle, identifiziert und erhalten werden. (Siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprng Harbor, New York; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford; Vereinigtes Königreich, Band I, II). Das isolierte opp-Operon oder alternativ individuelle opp-Operon-Gene A, B, C, D oder F können in einen geeigneten Vektor für eine Vermehrung molekular kloniert werden. Bei der molekularen Klonierung des Gens ausgehend von genomischer DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen kodieren werden. Die DNA kann an speziellen Stellen unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in Ge genwart von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physisch geschert werden, wie beispielsweise durch Beschallen. Die linearen DNA-Fragmente können dann gemäß der Größe durch Standardtechniken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese und Säulenchromatographie, aufgetrennt werden.
Sind die DNA-Fragmente einmal erzeugt, kann eine Identifizierung des speziellen DNA-Fragments, welches das opp-Operon enthält, auf verschiedene Weisen erfolgen. Beispielsweise kann ein B. subtilis-oppA-Gen oder dessen spezifische RNA oder ein Fragment davon, wie eine Sonde oder ein Primer, isoliert und markiert und dann in Hybridisierungsassays verwendet werden, um ein grampositives oppA-Gen zu detektieren (Benton, W., und Davis, R., 1977, Science 196: 180; Grunstein, M., und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961). Jene DNA-Fragmente, die substantielle Sequenzähnlichkeit zu der Sonde aufweisen, werden unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäure bindenden Komplexes, wie in Berger und Kimmel (1987), Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego, CA), welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, gelehrt wird, und verleihen eine definierte „Stringenz", wie nachfolgend erläutert wird.
„Maximale Stringenz" tritt typischerweise bei ungefähr Tm-5°C (5°C unterhalb der Tm der Sonde) auf; „hohe Stringenz" bei ungefähr 5°C bis 10°C unterhalb der Tm; „mittlere Stringenz" bei ungefähr 10°C bis 20°C unterhalb der Tm; und „niedrige Stringenz" bei ungefähr 20°C bis 25°C unterhalb von Tm. Wie sich für die Fachleute auf diesem Gebiet versteht, kann eine Hybridisierung unter maximaler Stringenz verwendet werden, um identische Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren, während eine Hybridisierung unter mittlerer oder niedriger Stringenz verwendet werden kann, um Polynukleotidsequenz-Homologe zu identifizieren oder zu detektieren.
Der Ausdruck „Hybridisierung", wie er hier verwendet wird, soll „das Verfahren, durch welches ein Strang von Nukleinsäure sich mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung verbindet" ("the process by which a strand of nucleic acid joins with a complementary strand through base-pairing"; Coombs, J., (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY), umfassen.
Das Amplifizierungsverfahren, wie es in Polymerasekettenreaktions (PCR)-Techniken ausgeführt wird, wird in Dieffenbach, C. W., und GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY beschrieben. Eine Nukleinsäuresequenz von wenigstens ungefähr 10 Nukleotiden und bis zu ungefähr 60 Nukleotiden aus B. subtilis-opp-Operon-Genen, vorzugsweise ungefähr 12 bis 30 Nukleotiden und mehr bevorzugt ungefähr 20–25 Nukleotiden kann als Sonde oder PCR-Primer verwendet werden.
II. Expressionssysteme
Die Erfindung stellt Wirts-Mikroorganismen und Expressionsverfahren für die Produktion und Sekretion von gewünschten heterologen Proteinen in grampositiven Mikroorganismen bereit. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle gentechnologisch so modifiziert, dass sie eine Mutation in wenigstens einem Gen des opp-Operon-Gen-Clusters derart aufweist, dass das Genprodukt eliminiert oder inaktiviert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation eine Leserasterverschiebungsmutation in dem oppA-Gen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist ein grampositiver Mikroorganismus, der eine Mutation in wenigstens einem Gen des opp-Operons aufweist, gentechnologisch so modifiziert, dass er des weiteren Nukleinsäure umfasst, die ein heterologes oder homologes Protein kodiert.
Inaktivierung von Genen in dem opp-Operon in einer Wirtszelle
Das Herstellen eines grampositiven Mikroorganismus, welcher nicht in der Lage ist, wenigstens ein Gen des opp-Operons zu produzieren, erfordert das Inaktivieren oder Eliminieren des natürlicherweise vorkommenden opp-Operon-Gens aus dem Genom der Wirtszelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Inaktivierung das Ergebnis einer Mutation und ist vorzugsweise eine nicht umkehrbare Mutation.
Ein Verfahren zum Mutieren von Nukleinsäure, die ein opp-Operon-Gen eines grampositiven Mikroorganismus kodiert, besteht darin, die Nukleinsäure oder einen Teil davon zu klonieren, die Nukleinsäure durch ortsgerichtete Mutagenese zu modifizieren und die mutierte Nukleinsäure auf einem Plasmid erneut in die Zelle einzuführen. Durch homologe Rekombination kann das mutierte Gen in das Chromosom eingeführt werden. In der Eltern-Wirtszelle ist das Ergebnis, dass die natürlicherweise vorkommende Nukleinsäure und die mutierte Nukleinsäure sich in Tandem-Anordnung auf dem Chromosom befinden. Nach einer zweiten Rekombination bleibt die modifizierte Sequenz in dem Chromosom zurück, wodurch die Mutation wirksam in das chromosomale Gen für Nachkommen der Eltern-Wirtszelle eingeführt worden ist.
Ein anderes Verfahren zum Mutieren eines opp-Operon-Gens erfolgt durch Deletieren der chromosomalen Genkopie. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das gesamte Gen deletiert, wobei die Deletion auf eine solche Weise erfolgt, dass eine Reversion unmöglich gemacht wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine partielle Deletion produziert, vorausgesetzt, dass die im Chromosom zurückbleibende Nukleinsäuresequenz zu kurz für eine homologe Rekombination mit einem durch ein Plasmid kodierten Gen ist.
Eine Deletion des natürlicherweise vorkommenden opp-Operon-Gens eines grampositiven Mikroorganismus kann, wie folgt, ausgeführt werden. Ein opp-Gen, welches dessen 5'- und 3'-Regionen umfasst, wird isoliert und in einen Klonierungsvektor inseriert. Die kodierende Region des Gens wird aus dem Vektor in vitro deletiert, wodurch eine ausreichende Menge der 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen zurückgelassen wird, um eine homologe Rekombination mit dem natürlicherweise vorkommenden Gen in der Eltern-Wirtszelle zu ermöglichen. Mit dem Vektor wird dann die grampositive Wirtszelle transformiert. Der Vektor integriert sich in das Chromosom über homologe Rekombination in den flankierenden Regionen. Dieses Verfahren führt zu einem grampositiven Stamm, in welchem das opp-Gen deletiert worden ist.
Der in einem Integrationsverfahren verwendete Vektor ist vorzugsweise ein Plasmid. Um eine leichte Identifizierung von gewünschten rekombinanten Mikroorganismen zu ermöglichen, kann ein selektierbarer Marker mit aufgenommen werden. Wie sich für die Fachleute auf diesem Gebiet versteht, ist der Vektor zusätzlich vorzugsweise einer, der selektiv in das Chromosom integriert werden kann. Dies kann erzielt werden, indem ein induzierbarer Replikationsstart, beispielsweise eine temperatursensitive Startregion, in das Plasmid eingeführt wird. Durch Kultivieren der Transformanten bei einer Temperatur, gegenüber welcher der Replikationsstart sensitiv ist, wird die Replikationsfunktion des Plasmids inaktiviert, wodurch ein Mittel für eine Selektion von Transformanten, bei denen eine chromosomale Integration stattgefunden hat, (chromosomale Integranten) bereitgestellt wird. Integranten können hinsichtlich einer Vermehrung bei hohen Temperaturen in Gegenwart des selektierbaren Markers, wie eines Antibiotikums, selektiert werden. Integrationsmechanismen werden in WO 88/06623 beschrieben.
In der 5'-flankierenden Region des gewünschten Gens kann eine Integration durch den Mechanismus vom Campbell-Typ stattfinden, was zu einem Stamm führt, der den gesamten Plasmidvektor in dem Chromosom in dem opp-Genort trägt. Da eine illegitime Rekombination unterschiedliche Ergebnisse liefern wird, wird es erforderlich sein, zu bestimmen, ob das vollständige Gen deletiert worden ist, wie durch Nukleinsäuresequenzierung oder Restriktionskarten.
Ein anderes Verfahren zum Mutieren eines natürlicherweise vorkommenden opp-Gens besteht darin, die chromosomale Genkopie zu mutagenisieren, indem ein grampositiver Mikroorganismus mit Oligonukleotiden, die mutagen sind, transformiert wird. Alternativ kann das chromosomale opp-Gen mutiert werden, indem das chromosomale Gen durch ein mutiertes Gen durch homologe Rekombination ersetzt wird.
Die Erfindung umfasst Wirtszellen in Form von grampositiven Mikroorganismen, welche zusätzliche Protease-Mutationen, wie Mutationen in apr, npr, epr, mpr und anderen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, aufweisen.
Vektorsequenzen
Zur Produktion von Proteinen in einem grampositiven Mikroorganismus wird ein Expressionsvektor, welcher wenigstens eine Kopie von Nukleinsäure, die das heterologe oder homologe Protein kodiert, umfasst und vorzugsweise eine Mehrzahl von Kopien umfasst, in die Zelle durch Transformation eingeführt unter Bedingungen, die für eine Expression des Proteins geeignet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Protein ein Protease, die aus einer Bacillus-Spezies erhalten werden kann.
Expressionsvektoren, die bei der Expression der heterologen Proteine der Erfindung in grampositiven Mikroorganismen verwendet werden, umfassen wenigstens einen mit dem Protein assoziierten Promotor, welcher Promotor in der Wirtszelle funktionsfähig ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Promotor der Wildtyp-Promotor für das ausgewählte Protein und in einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der Promotor heterolog zu dem Protein, aber nach wie vor in der Wirtszelle funktionsfähig. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Nukleinsäure, die die Protease kodiert, stabil in das Mikroorganismengenom integriert.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor eine Mehrfachklonierungsstellenkassette, die vorzugsweise wenigstens eine Restriktionsendonukleasestelle, die in dem Vektor nur einmal vorkommt, umfasst, um die Nukleinsäuremanipulation zu vereinfachen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor auch einen oder mehrere selektierbare Marker. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck selektierbarer Marker auf ein Gen, welches zu einer Expression in dem grampositiven Wirt in der Lage ist, was eine leichte Selektion von jenen Wirten, die den Vektor enthalten, ermöglicht. Beispiele von solchen selektierbaren Markern umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Antibiotika, wie Erythromycin, Actinomycin, Chloramphenicol und Tetracyclin.
III. Transformation
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle ein grampositiver Mikroorganismus und in einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Bacillus. In einer Ausführungsform der Erfindung wird Nukleinsäure, die wenigstens ein heterologes Protein kodiert, in eine Wirtszelle über einen Expressionsvektor, der zu einer Replikation innerhalb der Wirtszelle in der Lage ist, eingeführt. Geeignete replizierende Plasmide für Bacillus werden in Molecular Biological Methods for Bacillus, Hrsg. Harwood und Cutting, John Wiley & Sons, 1990, welches hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen wird; siehe Kapitel 3 über Plasmide, beschrieben. Geeignete replizierende Plasmide für B. subtilis sind auf Seite 92 aufgelistet. In der Literatur sind mehrere Strategien für die direkte Klonierung von DNA in Bacillus beschrieben worden. Eine „Plasmidmarker-Rescue-Transformation" oder Transformation unter Verwendung eines homologen Helferplasmids umfasst die Aufnahme eines Donor-Plasmids durch kompetente Zellen, die ein partiell homologes, residentes Plasmid tragen (Contente et al., Plasmid 2: 555–571 (1979); Haima et al., Mol. Gen. Genet. 223: 185–191 (1990); Weinrauch et al., J. Bacteriol. 154(3): 1077–1087 (1983); und Weinrauch et al., J. Bacteriol. 169(3): 1205–1211 (1987)). Das eintretende Donor-Plasmid rekombiniert mit der homologen Region des residenten „Helfer"-Plasmids in einem Prozess, der die chromosomale Transformation nachahmt.
Eine Transformation durch Protoplastentransformation wird für B. subtilis in Chang und Cohen, (1979) Mol. Gen. Genet. 168: 111–115; für B. megaterium in Vorobjeva et al. (1980) FEMS Microbiol. Letters 7: 261–263; für B. amyloliquefaciens in Smith et al., (1986) Appl. and Env. Microbiol. 51: 634; für B. thuringiensis in Fisher et al., (1981) Arch. Microbiol. 139: 213–217; für B. sphaericus in McDonald (1984) J. Gen. Microbiol. 130: 203; und B. larvae in Bakhiet et al., (1985) 49: 577 beschrieben. Mann et al. (1986, Current Microbiol. 13: 131–135) berichten über die Transformation von Bacillus-Protoplasten und Holubova, (1985) Folia Microbiol. 30: 97) offenbart Verfahren zum Einführen von DNA in Protoplasten unter Verwendung von DNA enthaltenden Liposomen. Die Anwesenheit/Abwesenheit eines Markergens kann den Rückschluss ermöglichen, ob das Gen von Interesse in dem Wirts-Mikroorganismus vorhanden ist.
Alternativ können Wirtszellen, die die kodierende Sequenz für ein opp-Operon-Gen enthalten und das Protein exprimieren, durch verschiedene Vorgehensweisen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, identifiziert werden. Diese Vorgehensweisen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungs- und Protein-Bioassay- oder Immunoassay-Techniken, die auf Membranen basierende, auf Lösungen basierende oder auf Chips basierende Techniken für die Detektion und/oder die Quantifizierung der Nukleinsäure oder des Proteins umfassen.
IV. Bestimmung der Proteinaktivität
Es gibt verschiedene Assays, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, zur Detektion und Messung der Aktivität von heterologen Proteinen oder Polypeptiden. Insbesondere gibt es für Proteasen Assays, die auf der Freisetzung von Säure-löslichen Peptiden aus Casein oder Hämoglobin basieren, die als Absorption bei 280 nm oder kolorimetrisch unter Verwendung der Folin-Methode (Bergmeyer et al., 1984, Methods of Enzymatic Analysis, Band 5, Peptidases, Proteinases and their inhibitors, Verlag Chemie, Weinheim) gemessen wird. Andere Assays umfassen die Solubilisierung von chromogenen Substraten (Ward, 1983, Proteinases, in Microbial Enzymes and Biotechnology (W. M. Fogarty, Hrsg.), Applied Science, London, S. 251–317).
V. Sekretion von rekombinanten Proteinen
Mittel zur Bestimmung der Sekretionsniveaus eines heterologen oder homologen Proteins in einer grampositiven Wirtszelle und zum Detektieren von sezernierten Proteinen umfassen, entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper, die für das Protein spezifisch sind, zu verwenden. Beispiele umfassen den Enzymimmunassay (ELISA), Radioimmunassay (RIA) und die Fluoreszenz-basierende Zellsortierung (FACS). Diese und andere Assays werden neben anderen Stellen in Hampton, R., et al. (1990, Serological Methods. a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN) und Maddox, DE, et al. (1983, J. Exp. Med. 158: 1211) beschrieben.
Den Fachleuten auf diesem Gebiet ist eine große Vielzahl von Markierungen und Konjugationstechniken bekannt und diese können in verschiedenen Nuklein- und Aminosäure-Assays verwendet werden. Mittel zur Herstellung von markierten Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zur Detektion von speziellen Polynukleotidsequenzen umfassen Oligomarkierung, Nick-Translation, Endmarkierung oder PCR-Amplifizierung unter Verwendung eines markierten Nukleotids. Alternativ kann die Nukleotidsequenz oder ein jeglicher Abschnitt von dieser in einen Vektor für die Produktion einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind in diesem Fachgebiet bekannt, sind kommerziell erhältlich und können verwendet werden, um durch Hinzufügung einer geeigneten RNA-Polymerase, wie T7, T3 oder SP6, und von markierten Nukleotiden in vitro RNA-Sonden zu synthetisieren.
Verschiedene Firmen, wie Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) und US Biochemical Corp. (Cleveland, OH) vertreiben kommerzielle Kits und Protokolle für diese Prozeduren. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen umfassen jene Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende, chemolumineszierende oder chromogene Agentien wie auch Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dergleichen. Patente, die die Verwendung von solchen Markierungen lehren, umfassen die U.S.-Patente 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241. Es können auch rekombinante Immunglobuline hergestellt werden, wie in dem U.S.-Patent Nr. 4,816,567, und das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, gezeigt.
VI. Reinigung von Proteinen
Grampositive Wirtszellen, die mit Polynukleotidsequenzen, die ein heterologes oder homologes Protein kodieren, transformiert sind, können unter Bedingungen, die für die Expression und Gewinnung des kodierten Proteins aus einer Zellkultur geeignet sind, kultiviert werden. Das durch eine rekombinante grampositive Wirtszelle produzierte Protein, welches eine Protease der Erfindung umfasst, wird in das Kulturmedium sezerniert werden. Andere rekombinante Konstrukte können die heterologen oder homologen Polynukleotidsequenzen mit einer Nukleotidsequenz, die eine Polypeptiddomäne kodiert, die die Reinigung von löslichen Proteinen vereinfachen wird, verknüpfen (Kroll, D.J., et al. (1993) DNA Cell Biol. 12: 441–53).
Solche, die Reinigung vereinfachende Domänen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Metallchelat-bildende Peptide, wie Histidin-Tryptophan-Module, die eine Reinigung an immobilisierten Metallen erlauben (Porath, J. (1992) Protein Expr. Purif. 3: 263–281), Protein A-Domänen, die eine Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin erlauben, und die in dem FLAGS-Verlängerungs/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, WA) verwendete Domäne. Die Aufnahme einer abspaltbaren Linkersequenz, wie Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA), zwischen die Reinigungsdomäne und das heterologe Protein kann verwendet werden, um die Reinigung zu vereinfachen.
VII. Verwendungen der Erfindung
Die Erfindung stellt gentechnologisch modifizierte grampositive Wirts-Mikroorganismen bereit, die vorzugsweise nicht-umkehrbare Mutationen in wenigstens einem Gen des opp-Operon-Gen-Clusters derart, dass die Aktivität des Genprodukts inaktiviert oder eliminiert wird und der Transportmechanismus unterbrochen wird, umfassen. Der Wirts-Mikroorganismus kann zusätzliche Protease-Deletionen, wie Deletionen der reifen Subtilisin-Protease und/oder der reifen neutralen Protease, die in dem U.S.-Patent Nr. 5,264,366 offenbart wird, enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus gentechnologisch so modifiziert, dass ein gewünschtes Protein oder Polypeptid produziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der grampositive Mikroorganismus ein Bacillus und das produzierte Polypeptid ist eine Protease, welche aus einer Bacillus-Spezies erhalten werden kann. In einer der Veranschaulichung dienenden Ausführungsform, die hier offenbart wird, ist die Protease Subtilisin. In einer anderen Ausführungsform, die hier offenbart wird, ist das Protein Amylase.
Die Art und Weise und das Verfahren zum Ausführen der Erfindung können durch die Fachleute auf diesem Gebiet vollständiger verstanden werden durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, wobei diese Beispiele in keiner Weise den Umfang der Erfindung oder der darauf gerichteten Ansprüche einschränken sollen.
Beispiel I
Beispiel I veranschaulicht die Zunahme der Produktion von Subtilisin aus B. subtilis, welcher eine Mutation in dem oppA-Gen des opp-Operons aufweist.
Bacillus subtilis wurde in Gegenwart des toxischen Peptids Bialaphos (50 μg/ml), einem Tripeptid, welches aus zwei L-Alanin-Molekülen und einem L-Glutaminsäure-Analog besteht und von welchem gezeigt worden ist, dass es eine Hemmung der Vermehrung bewirkt, kultiviert. Bacillus subtilis, welches Nukleinsäure umfasst, welche aus B. subtilis erhältliches Subtilisin kodiert, und eine Mutation in dem degU-Gen (U.S.-Patent Nr. 5,387,521) aufweist, zeigte bei einer Kultivierung auf einer Platte, welche Bialaphos (50 μg/ml) enthielt, keine Hemmung der Vermehrung. Dieser B. subtilis-Stamm wurde einer PCR unter Verwendung der folgenden Primer unterworfen:
Primer 1 GTTGTGGAAACTCAGGTTCATTTGTC und Primer 2 GGCCCGCCCGGTGCTGCTTGC. Das unter Verwendung der Primer erzeugte PCR-Fragment wurde sequenziert und es wurde festgestellt, dass es eine T-Insertion am Beginn des oppA-Gens aufwies.
Ein Plasmid, welches ein Fragment aus dem oppA-Wildtyp-Gen enthielt, wurde unter Verwendung der PCR-Technik konstruiert. 857 bp des oppA-Gens, welches in Bacillus subtilis vorhanden ist, wurden unter Hinzufügung von Restriktionsstellen unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
GCGCGCGGATCCCCTTAAATGATAACTGCTATCAGCGTAAAAACAGGC, welcher BamHI einführte, und GCGCGCCTGCAGCACAGCTTTTACTGCCACATCGTCTAGGCTGCC, welcher PstI einführte.
Die amplifizierte DNA wurde in das pTSpUCKan-Plasmid nach Verdau des Plasmids mit BamHI und PstI kloniert, wodurch das Plasmid Pm100 erhalten wurde. Das Plasmid pTSpU-CKan trägt ein Kanamycinresistenzgen (Kan^r) und einen temperatursensitiven Replikationsstart (TsOri). Das Kan^r-Gen wurde aus pJH1, einem Streptococcus faecalis-Plasmid (Trieu-Coet, P. und P. Courvalin, 1983, Gene 23: 331–341) als ein 1,5 kb-ClaI-Fragment isoliert. Das ClaI-Fragment wurde mit stumpfen Enden versehen und in die EcoRV-Stelle des Plasmids pBluescript II KS (Stratagene) kloniert, wodurch das Plasmid pJM114 hergestellt wurde. Das Plasmid pJM114 wurde mit EcoRI und ClaI verdaut und das resultierende Fragment von 1,489 kb wurde mit stumpfen Enden versehen, gereinigt und in die Ndel-Stelle des Plasmids pUC19 (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. und Messing, J. (1985) Gene 33, 103–119), welches zuvor mit Ndel verdaut/mit stumpfen Enden versehen und mit Phosphatase behandelt worden war, kloniert, wodurch das Plasmid pUS19/Kan erhalten wurde. Der TsOri wurde aus dem Plasmid pE194 (Villafane, R., Bechhofer, D. H., Narayanan, C. S., und Dubnau, D. (1987), J. Bacteriol. 169: 4822–9; Lovet, P. S., und Ambulus, N. P. Jr. (1989) Genetic manipulation of Bacillus subtilis. In Biotechnology Handbooks, Band 2 (Harwood, C. R., Hrsg.), S. 115–54, Plenum Press: New York und London) durch Verdau mit dem Restriktionsenzym HinPI erhalten. Das 1,1 kb-Fragment wurde mit stumpfen Enden versehen und in die HincII-Stelle des Plasmids pUC19 kloniert. Dieses neue Plasmid, Ts-pUC, wurde mit XbaI und PstI verdaut und das 1,163 kb-Fragment wurde mit stumpfen Enden versehen, gereinigt und in die mit stumpfen Enden versehene AatII-Stelle in dem Plasmid pUC19Kan kloniert, was das endgültige Plasmid pTSpUCKan lieferte.
Die oppA-Mutante in dem B. subtilis-Stamm, welcher Subtilisin kodierende Nukleinsäure umfasste und eine Mutation in degU aufwies, wurde durch das oppA-Wildtyp-Gen unter Verwendung des Plasmids pM100 ersetzt. Der B. subtilis-Stamm wurde mit dem Plasmid pM100 unter Verwendung von Standard-Protoplastentransformationstechniken (Prapai et al., 1994, Microbiology 140: 305) transformiert. Aufgrund des TsOri integrierte sich dieses Plasmid bei einer Kultivierung unter Selektionsdruck bei der nicht-permissiven Temperatur, z.B. 48°C, in das Chromosom bei der Region von Homologie mit dem oppA-Gen. Nach der Integration wurde der das integrierte Plasmid tragende Stamm bei permissiver Temperatur ausgiebig kultiviert. Nach Herausschneiden des integrierten Plasmids wird entweder der Elternstamm wiederhergestellt oder es wird ein Stamm, welcher das Wildtyp-Gen trägt, konstruiert. Eine Transformante, welche das Wildtyp-oppA-Gen umfasst, wurde durch Nukleinsäuresequen zierung bestätigt, indem sie eine Hemmung der Vermehrung in Gegenwart von Bialaphos zeigte.
Beispiel II
Beispiel II veranschaulicht die Produktion von Subtilisin in Schüttelkolben ausgehend von Stämmen, die einen oppA-Wildtyp und eine oppA-Mutante enthalten.
Ein B. subtilis-Stamm, welcher B. subtilis-Subtilisin kodierende Nukleinsäure und eine degU-Mutation umfasst und Wildtyp-oppA enthält, und ein Stamm, welcher B. subtilis-Subtilisin kodierende Nukleinsäure und eine degU-Mutation umfasst und eine oppA-Mutante enthält, hergestellt wie in Beispiel I, wurden in Schüttelkolben, welche 25 ml LB (Difco) plus 25 μg/ml Chloramphenicol enthielten, in einem 250 ml-Schüttelkolben kultiviert. Die Schüttelkolben wurden bei 37°C unter kräftigem Schütteln bis zu einer OD 550 von 0,8 inkubiert. 1 ml von jeder Kultur wurde mit 0,5 ml 30% Glycerol gemischt und für weitere Experimente eingefroren. 30 μl der aufgetauten Fläschchen wurden verwendet, um in 250 ml-Kolben 40 ml eines Mediums, welches 68 g/l Soytone, 300 M PIPES, 20 g/l Glucose (End-pH 6,8) enthielt, anzuimpfen. Die Schüttelkolben wurden bei 37°C unter kräftigem Schütteln drei Tage inkubiert, wonach Aliquots für die Subtilisin-Analyse des Überstands entnommen wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass der B. subtilis-Stamm, welcher die oppA-Mutation enthielt, 19% mehr Subtilisin produzierte, als wenn das oppA-Wildtyp-Gen anwesend war (Tabelle 1).
Für den Proteaseassay wurden Überstände aus Flüssigkulturen nach 3 Tagen Kultivierung geerntet und einem Assay auf Subtilisin, wie zuvor beschrieben (Estell, D., et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518–6521), in einer Lösung, welche 0,3 mM N-Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid (Vega Biochemicals), 0,1 M Tris, pH 8,6, enthielt, bei 25°C unterzogen. Die Assays maßen die Zunahme der Absorption bei 410 nm/min aufgrund der Hydrolyse und Freisetzung von p-Nitroanilin.
Tabelle 1 beschreibt die Protease-Ausbeuten, die ausgehend von den zwei getesteten Stämmen produziert wurden.
Tabelle 1
Beispiel III
B. subtilis-Wirtszellen, die eine T-Insertion am Beginn des oppA-Gens aufwiesen, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in Schüttelkolben, die 25 ml LB (Difco) enthielten, in einem 250 ml-Kolben kultiviert. Die Schüttelkolben wurden bei 37°C unter kräftigem Schütteln inkubiert und bei einer OD 550 von 0,8 wurde 1 ml Kultur mit 0,5 ml 30% Glycerol gemischt und für weitere Experimente eingefroren. 30 μl der aufgetauten Fläschchen wurden verwendet, um in 250 ml-Kolben 40 ml eines Mediums, welches 68 g/l Soytone, 300 M PIPES, 20 g/l Glucose (End-pH 6,8) enthielt, anzuimpfen. Die Schüttelkolben wurden bei 37°C unter kräftigem Schütteln mehrere Tage inkubiert, während welchen Proben für die Bestimmung der endogenen Amylaseaktivität im Überstand entnommen wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass der Stamm, welcher die oppA-Mutation enthielt, nach 48 h zweimal mehr endogene B. subtilis-Amylase produzierte, als wenn das oppA-Wildtyp-Gen, d.h. der Wildtyp-B. subtilis, vorlag. Nach 72 h ist die Zunahme 2,4-fach, wie in Tabelle II gezeigt.
Der Amylaseassay
Für den Amylaseassay wurden Proben von gesamter Brühe zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kultur abzentrifugiert und ihre Überstände wurden, wie folgt, einem Assay unterzogen. 10 μl der Probe wurden bei 25°C in einer Küvette mit 790,0 μl Substrat (Megazyme-Ceralpha-Alpha Amylase; Substrat ist in Wasser verdünnt und wird als 1 Teil Substrat plus 3 Teile Alpha Amylase-Puffer, pH 6,6, verwendet) gemischt. Alpha Amylase-Puffer besteht aus 50 mM Maleatpuffer, 5 mM CaCl₂ und 0,002% Triton X-100, pH = 6,7. Die Amylase wurde in einem Spectronic-Genesys 2-Spektrophotometer unter Verwendung eines Protokolls für die Amylaseaktivität (Wellenlänge: 410 nm, anfängliche Verzögerung („Initial Delay"): 75 s, gesamte Laufzeit („Total Run Time"): 120 s, untere Grenze („Lower Limit"): 0,08, obere Grenze („Upper Limit"): 0,12) gemessen.
Tabelle 2 beschreibt die Ausbeuten an Amylase, die ausgehend von den zwei getesteten Stämmen produziert wurden.
Tabelle II

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptids in einem grampositiven Mikroorganismus, welches die Schritte umfasst, a) einen grampositiven Mikroorganismus zu erhalten, welcher Nukleinsäure, welche das Protein oder Polypeptid kodiert, umfasst, wobei der Mikroorganismus eine Mutation in dem oppA-Gen in dem opp-Operon aufweist, wobei die Mutation zu der Inaktivierung des oppA-Produkts führt; und b) den Mikroorganismus unter Bedingungen, die für die Expression des Proteins geeignet sind, zu kultivieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der grampositive Mikroorganismus ein Mitglied der Familie Bacillus ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Mitglied der Familie Bacillus B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und Bacillus thuringiensis umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Mitglied der Familie Bacillus B. subtilis ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei B. subtilis eine Mutation in dem degU-Gen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Protein ein Hormon, ein Enzym, einen Wachstumsfaktor und ein Zytokin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Protein ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Enzym Proteasen, Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen, wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Protease eine Bacillus-Protease ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Protease Subtilisin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mutation nicht umkehrbar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mutation eine Leserasterverschiebungsmutation ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Carbohydrase eine Amylase ist.