DE60036641T2

DE60036641T2 - Mutanter apre promoter

Info

Publication number: DE60036641T2
Application number: DE60036641T
Authority: DE
Inventors: Eugenio San Bruno FERRARI; Fernando Burlingame VALLE
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2000-01-07
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2008-07-03
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: US20030148461A1; CN101054588A; KR20020073497A; AU2739001A; CN1313615C; EP1244794A1; WO2001051643A1; DK1244794T3; US6911322B2; ATE374822T1; MXPA02006614A; CA2396250C; EP1244794B1; DE60036641D1; CN1425071A; CA2396250A1; US6509185B1; JP2003519492A; JP4870306B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt im Gebiet der Molekularbiologie und betrifft die Herstellung von Proteinen in Bacillus-Spezien. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen mutanten aprE-Promotor und seine Verwendung in Verfahren zur Herstellung von Proteinen.
Hintergrund der Erfindung
Die Gentechnologie hat die Verbesserung von Mikroorganismen ermöglicht, die als industrielle Bioreaktoren, Zellfabriken und in Lebensmittelfermentationen verwendet werden. Die Bacillus-Gattungen produzieren und scheiden eine große Anzahl von nützlichen Proteinen und Metaboliten aus (Zukowski 1992, Zukowski M. M. (1992), Produktion of commercially valuable products. In: Doi R. H., McGlouglin M. (Hg.), Biology of bacilli: applications to industry. Butteworth-Heinemann, Stoneham, Mass., S. 311-337). Die üblichsten Bacilli, die in der Industrie verwendet werden, sind B. licheniformis, B. amyloliquefaciens und B. subtilis. Aufgrund seines GRAS(allgemein als sicher erkannten)-Status ist B. subtilis ferner ein natürlicher Kandidat für die Herstellung von Proteinen, die in den Lebensmittel- und Pharmaindustrien verwendet werden.
Das aprE-Gen von B. subtilis codiert die extrazelluläre Protease Subtilisin, ein wertvolles, durch die Biotechnologie-Industrie erzeugtes Enzym (Debadov V. G. (1982), The Industrial Use of Bacilli. In: Dubnau D. A. (Hg.), The Molecular Biology of the Bacilli. Academic Press: New York/London, Band 1, S. 331-370). Die Entwicklung von rekombinanten Protein-Herstellungssystemen unter Verwendung von B. subtilis als ein Wirtsorganismus, besonders derer, die durch den Subtilisin-Promotor angetrieben bzw. gesteuert werden, stellt ein wichtiges Werkzeug für die Forschung und kommerzielle Herstellung in diesem Bereich bereit (Oyama et al. (1989), Secretion of Escherichia coli Aminopeptidase P in Bacillus subtilis using the Prepro-Structure Coding Region of Subtilisin Amylosacchariticus. J. Ferment. Bioeng. 68: 289-292). Obwohl die Synthese von Subtilisin nicht für die Sporulation erfordert wird (Stahl und Ferrari (1984), Replacement of the Bacillus subtilis Subtilisin Structural Gene With an In Vitro-Derived Deletion Mutation. J. Bacteriol. 158: 411-418), wird ihre Produktion durch Mechanismen getriggert, die üblich für die Ereignisse sind, die für die Initiierung der Sporulation verantwortlich sind, und hat somit als ein Modell für die Entwicklungs-assoziierte Genexpression fungiert (Sonenshein A. L. (1989), Metabolic Regulation of Sporulation and Other Stationary-Phase Phenomenon. In: Smith I., Slepecky R. A., Setlow P. (Hg.), Regulation of Procaryotic Development. American Society for Microbiology, Washington, DC, S. 109-130). Das aprE-Gen wird durch sigma-A (σ^A) transkribiert und seine Expression wird stark durch mehrere Regulatoren kontrolliert, wie: DegU/DegS, AbrB, Hpr und SinR (Valle und Ferrari (1989). In: Smith I., Slepecky R. A., Setlow P. (Hg.), Regulation of Procaryotic Developmt. American Society for Microbiology. Washington, DC, S. 131-146). Ein Consensus-sigma-A-Promotor ist identifiziert worden (Helman et al. 1995, Nucleic Acid Research, Band 23, S. 2351-2360). Trotz Fortschritte im Verstehen der Produktion von Proteinen in Wirtszellen, bleibt eine Notwendigkeit für Verfahren zur Expressionserhöhung von Proteinen in Wirtszellen wie Bacillus-Wirtszellen bestehen.
Park et al., J. Bacteriol., 171(5):2657-2665, 1989, beschreibt den aprE-Promotor aus Bacillus subtilis und die Tatsache, dass Mutationen stromaufwärts des Nukleotids –45 die Transkription reduzieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen mutanten aprE-Promotor und seine Verwendung in der Herstellung von Proteinen, wie in den Ansprüchen dargelegt. Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten Erkenntnis, dass eine hundertfache Erhöhung in der Produktion eines gewünschten Proteins in einer Wirtszelle vorgekommen ist, die den mutanten aprE-Promotor enthielt. Die vorliegende Erfindung basiert auch auf der unerwarteten Erkenntnis, dass der mutante aprE-Promotor mit der wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigten Nukleotidsequenz in der Lage war, sowohl die Transkription von heterologen als auch von homologen Proteinen zu erhöhen und während der Herstellung der Proteine regulierbar blieb. Die vorliegende Erfindung stellt folglich einen isolierten mutanten aprE-Promotor bereit, und stellt in einer weiteren Ausführungsform einen mit der wie in SEQ ID Nr.: 1 angegebenen Nukleotidsequenz isolierten mutanten aprE-Promotor bereit. Die vorliegende Erfindung sieht auch Wirtszellen vor, die einen isolierten mutanten aprE-Promotor umfassen, sowie Verfahren zur Verwendung solcher Wirtszellen, um gewünschte Proteine herzustellen. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Bacillus-Spezies, und in einer weiteren Ausführungsform schließt die Bacillus-Spezies B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und Bacillus thuringiensis ein. In einer weiteren Ausführungsform ist das gewünschte Protein Subtilisin.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Wirtselle, die einen isolierten mutanten aprE-Promotor und genauer gesagt den isolierten mutanten aprE-Promotor von SEQ ID Nr.: 1 umfasst, ferner eine Nukleinsäure, die ein gewünschtes Protein codiert, das homolog oder heterolog zur Wirtszelle sein kann. Die Nukleinsäure kann therapeutisch signifikante Proteine oder Peptide codieren, wie Wachstumsfaktoren, Cytokine, Liganden, Rezeptoren und Inhibitoren sowie Impfstoffe und Antikörper. Die Nukleinsäure kann kommerziell wichtige industrielle Proteine oder Peptide codieren, wie Proteasen, einschließlich Subtilisin, Carbohydrasen, wie Amylasen und Glucoamylasen, Cellulasen, Oxidasen und Lipasen. Die Nukleinsäure kann ein natürlich vorkommendes Gen, ein mutiertes Gen oder ein synthetisches Gen sein. Beispiele von industriellen Proteinen schließen Enzyme wie Hydrolasen, einschließlich Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen ein. In einer Ausführungsform ist das Protein heterolog zur Zelle, und in einer anderen ist es homolog zur Zelle. In einer veranschaulichenden hierin beschriebenen Ausführungsform ist das Protein β-Galactosidase, und in einer weiteren veranschaulichenden hierin beschriebenen Ausführungsform ist das Protein Subtilisin.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in einer Bacillus-Spezies bereit, umfassend das Kultivieren eines Bacillus, der einen isolierten aprE-Promotor umfasst, wobei der Bacillus ferner eine Nukleinsäure umfasst, die das gewünschte Protein codiert und optional das gewünschte Protein gewinnt. In einer Ausführungsform weist der isolierte mutante aprE-Promotor die in SEQ ID Nr.: 1 gezeigte Sequenz auf. In einer Ausführungsform des Verfahrens ist die Nukleinsäure, die das gewünschte Protein codiert, im Bacillus-Genom integriert, und in einer weiteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure, die das gewünschte Protein codiert, auf einem replizierenden Plasmid vorhanden. Die vorliegende Erfindung sieht auch Verfahren zur Herstellung von Wirtszellen vor, die einen isolierten mutanten aprE-Promotor umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 Vergleich der DNA-Sequenzen des Wildtypus (SEQ ID Nr.: 6) und des mutierten aprE-Promotors; mutierte Basen sind mit den gepunkteten Pfeilen gekennzeichnet (es ist nur die relevante Sequenz der regulatorischen aprE-Region dargestellt). Die Trennung der –35- and –10-Boxen ist durch die zwei darüber liegende Pfeile gekennzeichnet. Die erste Base der gebildeten mRNA wird ebenfalls gezeigt.
2 β-Galactosidase-Synthese im durch SDS-PAGE nachgewiesenen Stamm JJ6. Die Nummer über jeder Spur repräsentiert die Proben, die in spezifischen Intervallen genommen wurden (in Stunden), und zwar entsprechend der spezifischen Expressionszeit (siehe Text). LacZ-Protein (116 kDa) wurde als der Molekulare Marker verwendet.
Ausführliche Beschreibung
Definitionen
Der aprE-Promotor in seiner Wildtypform bezieht sich auf den Bereich, den die RNA-Polymerase erkennt und verwendet, um die Transkription zu beginnen, und schließt bei –35 und –10 2 Boxen ein, wie in der 1 dargestellt. Andere Elemente, die um die –35- und –10-Boxen gezeigt werden, wie der Spacer zwischen der -35- und -10-Box, und stromabwärts (3') der –10-Box, hinunter auf +40, spielen eine wichtige Rolle in der Promotorstärke. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Terminus „mutanter aprE-Promotor" auf einen aprE-Promotor mit einer Modifikation in der –35-Box und kann zusätzliche Modifikationen in der Spacer-Region, der Region stromaufwärts der –35-Box, in der –10-Box und der Region stromabwärts der –10-Box stromaufwärts der –35-Box, in der –10-Box und der Region stromabwärts der –10-Box aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der mutante aprE-Promotor die Sequenz TGGGTC TTGACA AATATTATTCCATCTAT TACAAT AAATTCACAGA auf, bezeichnet als SEQ ID Nr.: 1. Ein mutanter aprE-Promotor ist einer, der die Transkriptionsfrequenz verstärkt, wie durch die Anzahl der pro Zeiteinheit hergestellten mRNA-Moleküle gemessen.
Wie hierin verwendet, schließt die Gattung Bacillus alle dem Fachmann bekannten Vertreter ein, einschließlich aber nicht beschränkt auf B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und B. thuringiensis.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Nukleinsäure" auf eine Nukleotid- oder Polynukleotidsequenz und Fragmente oder Abschnitte davon, und auf DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die doppelsträngig oder einzelsträngig sein kann, ob nun auf den Sense- oder Antisense-Stamm bezogen. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Aminosäure" auf Peptid- oder Proteinsequenzen oder Abschnitte davon.
Die Termini „isoliert" oder „gereinigt", wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder Aminosäure, die von mindestens einer Komponente entfernt wurde, mit der sie natürlicherweise assoziiert ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Terminus "heterologes Protein" auf ein Protein oder Polypeptid, das nicht natürlich in einer gram-positiven Wirtszelle vorkommt. Beispiele von heterologen Proteinen schließen Enzyme wie Hydrolasen, einschließlich Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen, wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen ein. Das Protein kann ein therapeutisch signifikantes Protein oder Peptid sein, wie Wachstumsfaktoren, Cytokine, Liganden, Rezeptoren und Inhibitoren sowie Impfstoffe und Antikörper. Das Protein kann ein kommerziell wichtiges industrielles Protein oder Peptid sein, wie Proteasen, Carbohydrasen, wie Amylasen und Glucoamylasen, Cellulasen, Oxidasen und Lipasen. Das Gen, welches das Protein codiert, kann ein natürlich vorkommendes Gen, ein mutiertes Gen oder ein synthetisches Gen sein.
Der Terminus „homologes Protein" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid, das in einer gram-positiven Wirtszelle nativ oder natürlich vorkommt. Die Erfindung schließt Wirtszellen ein, die das homologe Protein mittels rekombinanter DNA-Technologie produzieren. Die vorliegende Erfindung umfasst eine Bacillus-Wirtszelle mit einer Deletion oder Störung einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure, die das homologe Protein codiert, wie eine Protease, und mit einer Nukleinsäure, die das homologe Protein oder eine Variante davon codiert, und zwar wiedereingeführt in einer rekombinanten Form. In einer weiteren Ausführungsform produziert die Wirtszelle ein homologes Protein.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines mutanten aprE-Promotors in Verfahren zur Herstellung von Proteinen. aprE wird in einer natürlichen Weise am Ende von exponentiellem Wachstum induziert, und zwar wenn die maximale Biomasse erreicht ist, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Mutationen und Plasmid-Segregation minimiert wird. Natürliche Induktion verhindert die Notwendigkeit für artifizielle Induktoren, wie die Systeme, die auf Chemikalien wie IPTG, Sauerstoff (Walsh K., Koshland D. E. Jr. (1985)), oder physikalische Induktion mittels Wärme (Bujard et al. 1983) basieren. Diese natürliche Induktion des aprE-Gens repräsentiert einen wichtigen wirtschaftlichen Vorteil, besonders in einem großen industriellen Maßstab, und zwar aufgrund der Einfachheit der Verwendung in Fermentationsverfahren.
Die aprE-Promotorsequenz weist 17 bp zwischen den –10- und –35-Boxen auf, und ihre –10-Box befindet sich 6 bp von der Startstelle der Transkription entfernt. Es wurden Stämme konstruiert, die spezifische Mutationen trugen, die folgendes beeinflussen: i) die Transkriptionsinitiierungsrate der aprE'-lacZ-mRNA, und ii) die Transkriptionsinitiierungsrate der aprE'-Subtilisin-mRNA. Außerdem wurde der Effekt von hpr2- und degU32-Hintergründen ebenfalls analysiert. Der individuelle Effekt jeder dieser Mutationen wurde untersucht sowie ausgewählte Kombinationen von diesen.
Es wurde eine mehr als 100fache Erhöhung der β-Galactosidase-Aktivität erhalten, und eine über 30fache Erhöhung der Subtilisin-Aktivität wurde dadurch erhalten, dass die native –35-Boxsequenz im aprE-Promotor zu der TTGACA-Sequenz abgeändert wurde. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, scheint diese Modifikation eine leichtere Erkennung der Promotorregion durch RNAP zu begünstigen, womit die Bildung des offenen Komplexes erleichtert und die Rate seiner Bildung erhöht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bacillus-Spezies Bacillus subtilis, der genetisch konstruiert worden ist, um den mutanten aprE-Promotor mit der wie in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Sequenz und eine Nukleinsäure zu umfassen, die das gewünschte Protein oder Polypeptid codiert, wie eine Protease oder ein anderes Enzym. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Bacillus-Wirtszelle ferner Mutationen oder Deletionen in endogenen Proteasen, wie zum Beispiel Apr, Npr, Epr, Mpr, oder andere dem Fachmann bekannte Proteasen.
Die vorliegende Erfindung stellt Wirtszellen, Expressionsverfahren und Systeme für die verstärkte Produktion und Sekretion von gewünschten heterologen oder homologen Proteinen in Bacillus-Spezien bereit. In einer Ausführungsform wird eine Wirtszelle genetisch konstruiert, um einen mutanten aprE-Promotor und genauer gesagt den mutanten aprE-Promotor mit der wie in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Sequenz zu umfassen, und um ferner eine Nukleinsäure zu umfassen, die das gewünschte Protein oder Polypeptid codiert. Die Nukleinsäure, die das gewünschte Protein codiert, kann in das Wirtszellgenom integriert sein oder auf einem replizierenden Plasmid bereitgestellt werden. Geeignete replizierende Plasmide für Bacillus werden in Molecular Biological Methods for Bacillus, Hg. Harwood und Cutting, John Wiley & Sons, 1990, beschrieben; siehe Kapitel 3 über Plasmide.
Verschiedene Strategien für die direkte Klonierung von DNA in Bacillus sind in der Literatur beschrieben worden. Die Plasmid-Marker-Rescue-Transformation schließt die Aufnahme eines Donor-Plasmids durch kompetente Zellen ein, die ein teilweise homologes residentes Plasmid tragen (Contente et al., Plasmid 2: 555-571 (1979); Haima et al., Mol. Gen. Genet. 223: 185-191 (1990); Weinrauch et al., J. Bacteriol. 154(3):1077-1087 (1983); und Weinrauch et al., J. Bacteriol. 169(3):1205-1211 (1987)). Das eingehende Donor-Plasmid rekombiniert mit der homologen Region des residenten "Helfer"-Plasmids, und zwar in einem Verfahren, das chromosomale Transformation imitiert.
Transformation mittels Protoplasten wird für B. subtilis in Chang und Cohen (1979), Mol. Gen. Genet. 168:111-115; für B. megaterium in Vorobjeva et al. (1980), FEMS Microbiol. Letters 7:261-263; für B. amyloliquefaciens in Smith et al. (1986), Appl. and Env. Microbiol. 51:634; für B. thuringiensis in Fisher et al. (1981), Arch. Microbiol. 139:213-217; für B. sphaericus in McDonald (1984), J. Gen. Microbiol. 130:203; und B. larvae in Bakhiet et al. (1985), 49:577 beschrieben. Mann et al. (1986, Current Microbiol. 13:131-135) berichten über Transformation von Bacillus-Protoplasten, und Holubova (1985, Folia Microbiol. 30:97) beschreibt Verfahren für das Einführen von DNA in Protoplasten, und zwar durch Verwendung von DNA-haltigen Liposomen.
Die Art und das Verfahren der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann vom Fachmann anhand der folgenden Beispiele vollständiger verstanden werden, wobei die Beispiele in keiner Weise beabsichtigt sind, den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung oder der darauf gerichteten Ansprüche einzuschränken.
Beispiel I
Materialien und Methoden
Ortsgerichtete Mutagenese der transkriptionsregulatorischen Regionen des aprE-Gens.

Das Plasmid pT7-aprE wurde durch das Klonieren des EcoRI-BamHI-Fragments von 509 Basenpaaren (bp), das vom Plasmid pSG35.1 stammte (Ferrari E., Henner D. J., Perego M., Hoch J. A. (1988), Transcription of Bacillus subtilis subtilisin and expression of subtilisin in sporulation mutants. J. Bacteriol. 170:289-295), welches den aprE-Promotor und die ersten acht Codons des Strukturgens enthält, in das Plasmid pT7 (Novagen) konstruiert. Dieses neue Plasmid wurde als eine Matrize für einfache oder kombinatorische Oligonukleotid-gerichtete PCR-Mutagenese verwendet, und zwar gemäß des von Merino et al. (1992) (A general PCR-based method for single or combinatorial oligonucleotide-directed mutagenesis an pUC/M13 vectors. Biotechniques 12:509-510) beschriebenen Protokolls. PCRs wurden mit Taq-DNA-Polymerase (Promega Co.) in einem Perkin-Elmer-PCR-System durchgeführt. Die Nukleotid-Substitutionen, die in die regulatorische 5'-aprE-Region eingeführt wurden, waren wie folgt: A-34→T, C-33→G, T-32→A, A-31→C, A-12→G, G+1→A. Die Endprodukte der PCR-Mutagenese wurden verifiziert, indem die Nukleotidsequenz unter Verwendung des Dideoxy-Ketten-Terminierungsverfahrens bestimmt wurde, das von Sanger et al. (1977) beschrieben wurde. Diese DNAs wurden mit EcoRI und BamHI verdaut, und in die gleichen Restriktionsstellen des integrativen Plasmids pSG-PLK kloniert. Das Plasmid pSG-PLK ist ein pSG35.1-Derivat, in welchem die EcoRI-BamHI-Region durch den von pUC19 abgeleiteten Polylinker ersetzt worden ist, wobei ein promotorloses lacZ-Gen übrig bleibt. Diese Änderung im pSG-PLK stellt eine einfachere Selektion von Transformanten bereit, weil auf X-Gal-(5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid)-Agar plattierte Kolonien nur blau sind wenn sie den aprE-Promotor tragen. Die Tabelle 1 stellt einen Index der konstruierten Stämme von B. subtilis bereit. Tabelle 1

Stamm	Beschreibung	Referenz
BSR1	Δnpr hisA glyB	Laborbestand
BSR2	Δnpr hisA hpr2	Laborbestand
BSR3	Δnpr glyB degU32 cat	Laborbestand
BSR6	BSR1 amyE::pSG35.1 cat	Diese Arbeit
JJ3	BSR6 hpr2	Diese Arbeit
JJ5	BSR6 degU32	Diese Arbeit
JJ7	BSR6 hpr2 degU32	Diese Arbeit
JJ1	BSR1 amyE::pTTGACA cat	Diese Arbeit
JJ2	JJ1 hpr2 cat	Diese Arbeit
JJ4	JJ1 degU32	Diese Arbeit
JJ6	JJ1 hpr2 degU32	Diese Arbeit

Abkürzungen: cat, Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen; amyE-Front, das 5'-Ende des amyE-Gens.

Beispiel II
Transkriptionsinitiierung

Die Charakteristika der regulatorischen Wildtyp-aprE-Region (rraprE-WT) schließen einen Promotor mit einer fast perfekten σ^A-Consensus-Sequenz in seiner –10-Box (TAcAAT); die –35- Region weist nur zwei der sechs Nukleotide auf, die an der Consensus-Sequenz (TactaA) lokalisiert sind; das Vorkommen von 17 bp zwischen den –10- und –35-Regionen, und das Vorkommen einer AT-reichen Sequenz stromaufwärts der –35-Box, die für das Erkennen der α-Untereinheit der RNA-Polymerase (RNAP) wichtig ist (Ross et al. 1993, A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase. Science 262:1407-1413) ein. Basierend auf diesen Charakteristika wurde eine ortsgerichtete Mutagenese an der –35-Region der Promotorsequenz durchgeführt, um die –35-Consensus-Region für Gene zu erhalten, die durch den σ^A-Faktor von B. subtilis erkannt wurden. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die –35-Region der regulatorischen aprE-Region nur zwei der sechs in der Consensus-Sequenz vorkommenden Nukleotide aufweist, wurden vier Nukleotidänderungen (ACTA –34 bis –31 → TGAC) eingeführt. Diese modifizierte regulatorische Region wird hierin als rraprE-TTGACA bezeichnet. Diese Mutation wurde stromaufwärts des lacZ-Reporter-Gens kloniert und in den Amy-Locus des B. subtilis-Chromosoms integriert, wobei der Stamm JJ1 erzeugt wurde. Die β-Galactosidase-Aktivität dieses Stammes wurde untersucht; die Modifikationen der –35-Promotor-Box haben eine 106fache Erhöhung in seiner β-Galactosidase-Aktivität verursacht, und zwar in Bezug auf den elterlichen BSR6-Stamm, der den aprE-Wildtyp-Promotor trägt (siehe Tabelle 2 und 2). Tabelle 2

Stamm	Maximale spezifische Aktivität U/mg Prot^A	Relative Aktivität in Bezug auf BSR6	Relative Aktivität in Bezug auf JJ1
BSR6	2 452	1X	0.009X
JJ3	8 105	3.3X	0.03X
JJ5	89 000	36.3X	0.3X
JJ7	162 330	66X	0.6X

JJ1	261 360	106X	1X
JJ2	472 090	192X	1.8X
JJ4	335 810	137X	1.3X
JJ6	712 300	290X	2.7X

Die Tabelle 2 zeigt einen Vergleich der β-Galactosidase-Spiegel, die in verschiedenen Stämmen erhalten wurden.

A Die angegebenen Werte sind die Mittelwerte von drei unabhängigen Versuchen. Die untersuchte Aktivität ist β-gal, die durch die aprE'-lacZ-Fusion exprimiert wurde.

Beispiel III
Effekt von hpr2- und degU32-Hintergründen auf die aprE'-lacZ-Expression
Es ist berichtet worden, dass die hpr2-Mutation die Expressionsspiegel von Subtilisin erhöht. Diese Mutation ist eine Deletion eines DNA-Segments von 359 bp des Strukturgens, die 65% seiner Aktivität reduziert (Perego und Hoch 1988, Sequence Analysis and Regulation of the hpr locus, a Regulatory Gene for Protease Production and Sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 170:2560-2567). degU32 ist eine Mutation, die aus der Substitution A2006 → T besteht, welche einen Histidinrest in einem Leucinrest ändert, und zwar in der 12ten Aminosäure des Proteins (Henner et al. 1988, Localization of Bacillus subtilis sacU(Hy) mutations to two linked genes with similarities to the conserved procaryotic family of two-component signalling systems. J. Bacteriol. 170:5102-9). Diese Mutation erhöht den DegU-PO₄-Status, womit sie ihren aktivierenden Effekt für längere Zeit ausübt.
Mit dem Ziel einen überproduzierenden Stamm zu konstruieren, wurden die hpr2- und degU32-Genotypen zu BSR6-(BSR1 amyE::pSG35.1) und JJ1-(BSR1 amyE::pTTGACA)Stämmen transferiert, und zwar in einer individuellen und kombinatorischen Weise (siehe Tabelle 1). Die Daten für die β-Galactosidase-Aktivitäten dieser Stämme werden in der Tabelle 2 angezeigt. Mit der hpr2-Mutation erbrachte der JJ3-Stamm eine 3,3fache Erhöhung, während der JJ2-Stamm eine 1,8fache Erhöhung aufwies. Die den genetischen degU32-Hintergrund tragenden Stämme JJ5 und JJ4 wiesen 36,3 bzw. 1,3fache Erhöhungen auf. Die Aktivitätsspiegel, die in den sowohl genetischen degU32- als auch den hpr2-Hinergrund tragenden Stämmen JJ7 und JJ6 erhalten wurden, betrugen das 66- bzw. 2,7fache, und zwar im Vergleich zu ihren elterlichen Stämmen.
Ähnliche Ergebnisse sind in den homologen Stämmen JJ3 erhalten worden, und zwar von Bolaños (2,8fach) und Olmos et al. (4,6fach) (Bolaños 1994. In master thesis: Sobreproduccion de la enzima β-galactosidasa de Escherichia coli en Bacillus subtilis. Instituto de Biotechnologia, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Cuernavaca, Mor., Mexico; Olmos et al. 1996, A functional Spo0A is required for maximal aprE expression in Bacillus subtilis. FEBS Lett. 381:29-31). Die hpr2-Mutation übt ihren Effekt nicht nur mit dem Wildtyp-Promotor, sondern auch mit dem modifizierten Promotor in Stamm JJ2 aus.
Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen ist es denkbar, dass die Mutationen degU32 und die Änderung in den –35-Consensus die Erkennung der Promotorsequenz mittels RNAP in einer ähnlichen Weise begünstigen, und können die Bildung des offenen DNA-RNAP-Komplexes unterstützen und stabilisieren.
Zusammenfassend sei gesagt, dass mehrere Elemente im Verfahren analysiert worden sind, um überproduzierende B. subtilis-Stämme zu konstruieren. Die signifikanteste Änderung trat auf, als die in der 1 dargestellte mutierende Promotorsequenz in die regulatorische Region des ap rE-Gens eingebaut wurde, wobei sich der Stamm JJ1 ergab. Diese Änderung ermöglichte eine über 100fache Erhöhung, und zwar in Bezug auf den in dieser Studie als Wildtyp betrachteten Stamm (BSR6). Obwohl der Stamm JJ6 den höchsten Spiegel von β-Galactosidase-Aktivität erreichte, weist er im Gegensatz zum JJ1-Stamm mehrere pleiotrope Effekte auf.
Beispiel IV
Messung der β-Galactosidase-Synthese
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung des heterologen Proteins β-Galactosidase.
Um eine direkte Einschätzung der Synthese des β-Galactosidase-Proteins für das Aufstellen einer direkten Beziehung mit dem in unseren überproduzierenden Stämmen gefundenen Aktivitätsspiegel zu besitzen, haben wir mittels SDS-PAGE das komplette Proteinprofil des Stammes JJ6 (BSR1 amyE::pTTGACA hpr2 degU32) analysiert, welcher der Stamm mit dem höchsten Spiegel von β-Galactosidase-Aktivität ist. Der Stamm JJ6 wurde in Shaeffer-Medium gezüchtet, und Proben wurden in regelmäßigen Intervallen genommen. Die durch Ultraschallbehandlung erhaltenen zellfreien Extrakte wurden mittels SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie-Brilliantblau-Färbung gefärbt (2). Das β-Galactosidase-Protein wurde als eine Bande mit einer Molekularmasse von 116 kDa festgestellt. Der Sporulationsprozess startete fünf Stunden nach der Inokulation. Zu diesem Zeitpunkt startete die Expression des rekombinanten Proteins und erreichte ihren Höhepunkt zwei Stunden später, wobei sie ungefähr 10% des gesamten intrazellulären Proteins entsprach.
Beispiel V
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion einer Bacillus subtilis-Wirtszelle, welche den mutanten aprE-Promotor enthält. Der Spiegel der extrazellulären Protease AprE, die nach der Modifizierung des aprE-Promotors produziert wurde, wurde unter Verwendung des Stammes OS4 quantifiziert. Zum Vergleich wurden mehrere andere Stämme, die das Wildtyp-aprE-Gen trugen, unter den gleichen Bedingungen analysiert. Die Unterschiede zwischen diesen Stämmen bestehen darin, dass sie Mutationen enthalten, welche bekannt sind, die aprE-Expression zu steigern (Valle und Ferrari, supra).
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in der Tabelle 3 dargestellt. Wie ersichtlich, produzierte der OS4-Stamm im Vergleich zum Wildtyp-Stamm 32,7fach mehr AprE. Auf der anderen Seite produzierte der Stamm OS4 im Vergleich zum Stamm, der die scoC-Mutationen Wildtyp-aprE und degU trug, 50% weniger Subtilisin. Angesichts der in der Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse, die mit der Expression von lacZ erhalten wurden, kann es möglich sein, die Produktion von Subtilisin unter Verwendung der hpr2- und/oder degU-Mutation(en) weiter zu erhöhen. Die mit dem Stamm OS4 erhaltenen Ergebnisse zeigen an, dass der modifizierte aprE-Promotor auch verwen det werden kann, um homologe Proteine überzuproduzieren, die in das Medium ausgeschieden werden.
Konstruktion einer hierin als OS4 bezeichneten PCR-Fusionssequenz
Die OS4-PCR-Fusion wurde in 3 Schritten konstruiert: 1) Amplifikation von 2 separaten Fragmenten, und zwar mittels PCR aus chromosomaler Bacillus subtilis-168-DNA; 2) Zusammenfügung von 2 gereinigten PCR-Fragmenten in einem Verfahren vom PCR-Typus ohne Primer; und 3) Amplifikation des zusammengefügten Produktes, und zwar mittels PCR mit OSBS-1- und OSBS-8-Endprimer.

1). Chromosomale DNA von Bacillus subtilis-168 wurde als eine Matrize zur Amplifikation vom aprE-Genlocus unter Verwendung von 2 Sätzen von Primern verwendet. Das erste Paar von Primern bestand aus OSBS-1 (5'-ATATGTGGTGCCGAAACGCTCTGGGGTAAC-3') SEQ ID Nr.: 2, der von 1101,821 kb bis 1101,851 kb auf dem Bacillus-Chromosom lokalisiert ist, und Stu-1 (5'-CTCAAAAAAATGGGTCTACTAAAATATTATTCCATCTATTACAATAAATTCA-3') SEQ ID NR: 3, der von 1105,149 kb bis 1105,098 kb lokalisiert ist. Das amplifizierte Fragment betrug 3,327 kb und enthielt die folgenden Gene: verkürztes yhfL', yhfM, yhfN und aprE-Promotorbereich, siehe Kunst et al., 1997, Nature, Band 390, Seiten 249-256 für eine Beschreibung des B. subtilis-Genoms.

Das zweite Paar von Primern bestand aus Stu-2 (5'-TGAATTTATTGTAATAGATGGAATAATATTTTAGTAGACCCATTTTTTTGAG-3') SEQ ID Nr.: 4, der von 1105,098 kb bis 1105,149 kb auf dem Chromosom lokalisiert war, und OSBS-8 (5'-CTTTTCTTCATGCGCCGTCAGCTTTTTCTC-3') SEQ ID Nr.: 5, der von 1107,733 kb bis 1107,704 kb lokalisiert war. Das amplifizierte Fragment betrug 2,635 kb und enthielt folgendes: Promotorbereich von aprE, yhfO, yhfP und trunkiertes bzw. verkürztes yhfQ'. Beide PCR-Produkte überlappten im Promotorbereich. Komplementäre Stu-1- und Stu-2-Primer wurden zur Einführung von 4 Mutationen in den –35-Bereich des aprE-Promotors verwendet, wobei TACTAA mit der TTGACA-Sequenz ersetzt wurde. Ein rTth-Polymerase enthaltendes Perkin-Elmer-GeneAmp-XL-PCR-Kit wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers angewendet, und zwar für alle PCRs. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Volumen von 100 μl durchgeführt.
DNA – 2–5 μl
3.3x XL-Puffer-II – 30 μl
10 mM dNTP-Mischung – 3 μl
25 mM Mg(OAc)2 – 4 μl
25 μM OSBS-1-Primer (oder OSBS-8) – 2 μl
25 μM Stu-1-Primer (oder Stu-2) – 2 μl
2 U/μl rTth-Polymerase – 2 μl
Wasser – auffüllen auf 100 μl
Die PCR-Bedingungen waren: 95°C–30 s, 54°C–30 s, 68°C–3 min für 30 Zyklen. Die erhaltenen PCR-Fragmente 3,327 kb und 2,635 kb wurden mittels QIAGEN-PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt und zur PCR-Zusammenfügung verwendet.

2). 5-μl-Aliquoten von gereinigten PCR-Fragmenten wurden zusammengemischt und in frische PCR-Mischung gegeben, die keine Primer enthielt. Das gesamte Volumen der PCR-Mischung betrug 100 μl, und zwar mit wie oben beschriebenen Komponenten. Die PCR-Aufbau-Bedingungen waren: 95°C–30 s, 52°C–30 s, 68°C–2 min für 10 Zyklen.
3). Nach 10 PCR-Zyklen wurde die Zusammenfügungsmischung mit OSBS-1- und OSBS-8-Primern ergänzt und PCR-Amplifikation wurde für 15 zusätzliche Zyklen durchgeführt. Die PCR-Bedingungen diesmal waren: 95°C–30 s, 52°C–30 s, 68°C–5 min. Das gewünschte 5,962-kb-Produkt wurde erhalten, OS4-Pcons-aprE genannt und zur Transformation von kompetenten OS1-Zellen verwendet, um den OS4-Stamm zu erzeugen.

Transformation von kompetenten OS1-Zellen.
Der OS1-Stamm wurde vom als BG2822 bezeichneten Bacillus subtilis-Stamm erzeugt, indem das aprE-Gen durch ein Kanamycin-Gen ersetzt wurde. Das Kanamycin-Gen wurde in zwei Positionen von 1103,484 Kb bis 1105,663 Kb auf dem Bacillus-Chromosom eingeführt. Somit bildete der Stamm keine Halos auf LB + 1,6%-Magermilchplatten. BG2822 ist ein Derivat von Bacillus subtilis-168, das eine npr-Deletion aufweist, eine Deletion im Gen, das für eine neutrale Protease codiert (J. Bacteriol. 1984, Band 160, S. 15-21).

Da die OS4-Pcons-aprE-PCR-Fusion keinen antibiotischen Marker trug, wurde die Fusion mittels Kongression in die Zellen eingeführt. 20 μl vom PCR-Produkt wurden mit 1 μl (~10 nM) pBS19-Plasmid vermischt und zur Transformation von OS1 verwendet. Die Transformationsmischung wurde auf LB + 1.6%-Magermilch + 5 μg/ml-cmp-Platten plattiert. Am nächsten Tag wurden halo-bildende Kolonien gesammelt und für einzelne Kolonien plattiert. Die Reinigung der Kolonien wurde zweifach durchgeführt. Es wurden 5 einzelne Klone mittels Sequenzierung der aprE-Promotorregion analysiert. Alle wiesen eine Consensus-Sequenz an der –35-Region des aprE-Promotors auf. Tabelle 3

Stammbezeichnung	Relevanter Genotyp	Relativer aprE-Expressionsspiegel
BG2822	Wildtyp, nprE-	1
OS4	P_aprE TTGACA¹	32,71
BG2790	DegU³¹, scoC	65,14
BG2805	DegU³², scoC, degQ	22,16
BG2810	scoC, degQ	2,43
BG2815	scoC	1,43
BG2817	DegU³²	20,54
BG2820	DegU³¹, degQ	8,92
BG2821	degQ	2,98

Tabelle 3. Expression des aprE-Gens in verschiedenen Bacillus-Stämmen.

Die aprE-Aktivität wurde nach 48 h Wachstum in 2x SMB-Medium gemessen.

¹ In diesem Stamm wurde die –35-Region des aprE-Promotors zu der Consensussequenz TTGACA geändert.

Beispiel XI
Das Beispiel XI stellt die Protokolle für Kulturwachstum von modifizierten B. subtilis-Stämmen und Proteasenachweis bereit.
Kulturwachstum
Vorkulturen der Stämme wurden in 2 ml LB (Luna-Bertani-Medium) zu einem OD-Wert von –0,35 bei A620 nm gezüchtet. Die Vorkulturen wurden dann in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cat #3598) aufgeteilt, und zwar vier Vertiefungen pro Stamm. Eine 96-Vertiefungsplatte mit Filterboden (Millipore, MAGVN2250) mit 200 μl 2XSMB-Wachstumsmedium wurde von der Vorkulturplatte geimpft, und zwar unter Verwendung eines sterilen 96-Vertiefungsstempels. Die Platte wurde bei 37°C inkubiert, um Wachstum anzuregen, und zwar bei 280 RPM in einer befeuchteten Schüttelbox, und nach 20 und 48 Stunden Wachstum auf Proteaseaktivität hin getestet.
Luna-Bertani-Brühe
Zu 950 ml deionisiertem Wasser wurde folgendes addiert:
Bacto-tryton 10 g
Bacto-Hefeextrakt 5 g
NaCl 10 g
Die zu lösenden Substanzen wurden bis zum Lösen geschüttelt. Der pH-Wert wurde mit 5 N NaOH (0,2 ml) auf 7,4 eingestellt. Das Lösungsvolumen wurde mit deionisiertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt und mittels Autoklavierung 20 Minuten lang bei 15 lb/sq auf einem flüssigen Zyklus sterilisiert.
Protease-Assay
Es wurden Aliquote aus der Wachstumsplatte entnommen und in Tris-Puffer (100 mM pH 8,6, 0,005% Tween-80) verdünnt, und zwar in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mittels eines Multispence (Asys Hitech). Die Proteaseaktivität dieser Platte wurde bestimmt, indem ein Aliquot von der Verdünnungsplatte in eine 96-Vertiefungsplatte dispensiert wurde, die Tris-Puffer und Substrat enthielt (1 mg/ml Suc AAPF pNA – Bachem Cat # L-1400). Die Reaktion wurde anschließend auf einem Lesegerät für 96-Vertiefungsplatten (Molecular Devices, Spectra-Max 250) gelesen. Die Protease-Konzentration jeder Vertiefung wurde auf der Basis der Rate der Substrathydrolyse, eines Konvertierungsfaktors von 0,02 mg/U und des Verdünnungsfaktors bestimmt. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isolierter mutanter aprE-Promotor, umfassend eine Modifikation in den Nukleotiden der –35-Consensusbox des Promotors vom Wildtyp, wobei die –35-Consensusbox die Nukleotidsequenz TACTAA aufweist.
Isolierter mutanter aprE-Promotor gemäß Anspruch 1 mit der Nukleotidsequenz, wie sie in der SEQ ID Nr.: 1 angegeben ist.
Mutanter aprE-Promotor gemäß Anspruch 1, wobei die Modifikation in einem oder mehreren der Nukleotide der –35-Consensusbox im Vergleich zu einem aprE-Promotor vom Wildtyp in dem mutanten aprE-Promotor die Transkriptionshäufigkeit, wie sie durch die Anzahl an pro Zeiteinheit hergestellten mRNA-Molekülen gemessen wird, erhöht.
Mutanter aprE-Promotor gemäß Anspruch 1, ferner umfassend eine Modifikation in der 17-Basenpaare-Spacerregion des Promotors vom Wildtyp, wobei die Spacerregion die Nukleotidsequenz AATATTATTCCATCTAT aufweist.
Mutanter aprE-Promotor gemäß Anspruch 1, ferner umfassend eine Modifikation in den Nukleotiden der –10-Consensusbox des Promotors vom Wildtyp, wobei die –10-Consensusbox die Nukleotidsequenz TACAAT aufweist.
Expressionsvektor, umfassend einen mutanten aprE-Promotor gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 6, ferner ein Nukleotid umfassend, das ein gewünschtes Protein codiert.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 7, wobei das gewünschte Protein aus der Gruppe gewählt wird, die aus Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen, Lipasen, Isomerasen, Transferasen, Kinasen und Phosphatasen besteht.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 8, wobei die Protease Subtilisin ist.
Wirtszelle, umfassend einen mutanten aprE-Promotor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
Wirtszelle gemäß Anspruch 10, wobei die Wirtszelle von einer Bacillus-Spezies ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 11, ferner umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, geknüpft an den mutanten aprE-Promotor.
Wirtszelle gemäß Anspruch 12, wobei das gewünschte Protein zu der Wirtszelle homolog ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 12, wobei das gewünschte Protein zu der Wirtszelle heterolog ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 12, wobei das gewünschte Protein aus der Gruppe gewählt wird, die aus Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen, Lipasen, Isomerasen, Transferasen, Kinasen und Phosphatasen besteht.
Wirtszelle gemäß Anspruch 11, wobei die Bacillus-Spezies aus der Gruppe gewählt wird, die aus B. licenformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquifaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und B. thuringiensis besteht.
Wirtszelle gemäß Anspruch 16, wobei die Wirtszelle eine Bacillus subtilis-Wirtszelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in einem Bacillus, umfassend das Kultivieren eines Bacillus, der die Nukleinsäure umfasst, welche das gewünschte Protein codiert, wobei der Bacillus ferner mutanten aprE-Promotor gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst, und gegebenenfalls das Gewinnen des Proteins.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei der Bacillus B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und Bacillus thuringiensis umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei das gewünschte Protein Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Nukleinsäure in dem Bacillus-Genom integriert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Nukleinsäure auf einem replizierenden Plasmid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Bacillus-Spezies Bacillus subtilis ist und das gewünschte Protein eine Protease ist.
Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei die Protease Subtilisin ist.