CN1425071A - 突变的aprE启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供突变的aprE启动子和在包含该突变的aprE启动子的芽孢杆菌宿主细胞中制备目的蛋白质的方法。本发明提供优选的aprE突变启动子的序列，该序列使枯草芽孢杆菌中蛋白质的产生增加100倍。

Description

突变的aprE启动子
发明领域
本发明属于分子生物学领域，涉及在芽孢杆菌属(Bacillus)物种中制备蛋白质。具体地，本发明涉及突变的aprE启动子和其在制备蛋白质的方法中的用途。
发明背景
遗传工程使得可以改良用作工业生物反应器、细胞工厂和用于食品发酵中的微生物。芽孢杆菌属物种产生并分泌大量的有用蛋白质和代谢物(Zukowski 1992 Zukowski MM(1992)制备具有商业价值的产品，DoiRH、McGlouglin M(编)《芽孢杆菌生物学：工业应用》(Biology of bacilli：applications to industry)，Butterworth-Heinemann，Stoneham，Mass第311-337页)。最常见的工业使用芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。而且，由于其的GRAS(一般被认为是安全的)状态，枯草芽孢杆菌是制备食品和制药工业中所用蛋白质的自然候选者。
枯草芽孢杆菌的aprE基因编码细胞外蛋白酶枯草杆菌蛋白酶，一种通过生物技术工业生产的有价值的酶(Debadov VG(1982)芽孢杆菌的工业用途，Dubnau DA(编)《芽孢杆菌的分子生物学》(The Molecular Biologyof the Bacilli)，Academic Press：New York/London，第1卷，第331-370页)。对使用枯草芽孢杆菌作为宿主生物的重组蛋白制备系统(尤其是由枯草杆菌蛋白酶启动子驱动的那些)的开发，为在该领域中进行研究和商业生产提供了一个重要工具(Oyama等(1989)使用枯草杆菌蛋白酶Amylosacchariticus的前原结构编码区在枯草芽孢杆菌中分泌大肠杆菌的氨肽酶P，J.Ferment.Bioeng.68：289-292)。尽管枯草杆菌蛋白酶的合成对于孢子形成是不必需的(Stahl和Ferrari(1984)用体外来源的缺失突变体置换枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶结构基因，J.Bacteriol.158：411-418)，但通过负责起始孢子形成的那些事件所共同的机制可以触发其产生，并由此成为发育相关的基因表达模型(Sonenshein AL(1989)孢子形成的代谢调节和其它稳定期现象，Smith，I，Slepecky RA，Setlow P(编)《原核生物发育的调节》(Regulation ofProcaryotic Development)，American Society for Microbiology，Washington，DC第109-130页)。aprE基因是由西格马A(σA)转录的而且其表达受到几种调节物的高度控制，这些调节物例如：DegU/DegS、AbrB、Hpr和SinR(Valle和Ferrari(1989)Smith I，Slepecky RA，Setlow P(编)《原核生物发育的调节》，American Society forMicrobiology，Washington，DC第131-146页)。共有的西格马A启动子已得到鉴定(Helman等，1995，Nucleic Acid Research，第23卷，第2351-2360页)。尽管对于蛋白质在宿主细胞中的产生的理解已有进展，但仍需要方法以增加蛋白质在宿主细胞如芽孢杆菌宿主细胞中的表达。
发明概述
本发明涉及突变aprE启动子在蛋白质制备中的用途。本发明的基础是以下未预料到的发现，即在含有该突变aprE启动子的宿主细胞中目的蛋白质的产生增加了100倍。本发明还基于以下未预料到的发现，即具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的突变aprE启动子能够增强异源和同源蛋白质的转录并且在蛋白质的产生过程中仍是可调节的。因此，本发明提供分离的突变aprE启动子，在另一实施方案中提供具有SEQ ID NO：1所给核苷酸序列的分离的突变aprE启动子。本发明还提供包含分离的突变aprE启动子的宿主细胞和使用该宿主细胞生产目的蛋白质的方法。在一个实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属物种，在另一实施方案中，该芽孢杆菌属物种包括地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。在另一实施方案中，目的蛋白质是枯草杆菌蛋白酶。
在再一实施方案中，包含分离的突变aprE启动子、尤其是SEQ ID NO：1的分离的突变aprE启动子的宿主细胞，还包含编码对于宿主细胞可以是同源或异源的目的蛋白质的核酸。该核酸可以编码治疗上有意义的蛋白质或肽，例如生长因子、细胞因子、配体、受体和抑制剂、以及疫苗和抗体。该核酸可以编码商业上重要的工业蛋白质或肽，例如蛋白酶(包括枯草杆菌蛋白酶)、糖酶如淀粉酶和葡糖淀粉酶、纤维素酶、氧化酶和脂酶。该核酸可以是天然存在的基因、突变基因或合成基因。工业蛋白质的例子包括酶如包括蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、糖酶和脂酶在内的水解酶；异构酶如消旋酶、差向异构酶、互变异构酶(tautomerases)、或变位酶；转移酶、激酶和磷酸酶。在一个实施方案中，该蛋白质与细胞异源，在另一实施方案中其与细胞同源。在本文所公开的一个举例说明性实施方案中，该蛋白质是β-半乳糖苷酶，在本文所公开的另一举例说明性实施方案中，该蛋白质是枯草杆菌蛋白酶。
本发明提供在芽孢杆菌属物种中制备目的蛋白质的方法，包括培养包含分离的aprE启动子的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌还包含编码该目的蛋白质的核酸；和任选地回收所述目的蛋白质。在一个实施方案中，该分离的突变aprE启动子具有SEQ ID NO：1所示序列。在该方法的一个实施方案中，所述编码目的蛋白质的核酸整合在芽孢杆菌的基因组中，在另一实施方案中，编码目的蛋白质的核酸存在于复制型质粒上。本发明还提供方法以制备包含分离的突变aprE启动子的宿主细胞。
附图简述
图1是野生型和突变型aprE启动子的DNA序列比较，虚线箭头指示了突变的碱基(仅绘出了aprE调节区的相关序列)。通过双头箭头指示出-35和-10盒的间隔。还显示了所形成的mRNA的第一个碱基。
图2显示了通过SDS-PAGE检测到的JJ6菌株中β-半乳糖苷酶的合成。每个泳道上方的数字代表在特定间隔期(小时)时采取的样品，因此是具有特定表达时间的样品(见正文)。使用LacZ蛋白质(116kDa)作为分子标记。
详述定义
野生型形式的aprE启动子是指RNA聚合酶识别并用以起始转录的区域，其包括图1所示位于-35和-10的两个盒。围绕-35和-10盒显示的其它元件，例如-35和-10盒间的间隔区、和-10盒的下游(3’)向下至+40的区域对于启动子的强度起着重要作用。正如本文所用，术语“突变的aprE启动子”是指在-35盒中具有修饰的aprE启动子，该启动子还可以在间隔区中、-35盒上游区域、-10盒中及-10盒下游区域具有额外的修饰。在一个优选实施方案中，突变aprE启动子具有命名为SEQ ID NO：1的序列TGGGT CTTGA CAAAT ATTAT TCCAT CTATT ACAAT AAATT CACAGA。突变aprE启动子是增强按每单位时间产生的mRNA分子数量测量的转录频率的启动子。
正如本文所用，芽孢杆菌属包括本领域技术人员已知的所有成员，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
正如本文所用，“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列、和其片段或部分、以及基因组来源的或合成来源的DNA或RNA，其既可以是双链也可以是单链，而且不论其是有义链还是反义链。正如本文所用，“氨基酸”是指肽或蛋白质序列或其部分。
术语“分离的”或“纯化的”在本文中是指除去其天然相关的至少一个成分的核酸或氨基酸。
正如本文所用，术语“异源蛋白质”是指非天然存在于革兰氏阳性宿主细胞中的蛋白质或多肽。异源蛋白质的例子包括酶如包括蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、糖酶和脂酶在内的水解酶；异构酶如消旋酶、差向异构酶、互变异构酶或变位酶；转移酶、激酶和磷酸酶。该蛋白质可以是治疗上有意义的蛋白质或肽，例如生长因子、细胞因子、配体、受体和抑制剂、以及疫苗和抗体。该蛋白质可以是商业上重要的工业蛋白质或肽，例如蛋白酶、糖酶如淀粉酶和葡糖淀粉酶、纤维素酶、氧化酶和脂酶。编码该蛋白质的基因可以是天然存在的基因、突变基因或合成基因。
术语“同源蛋白质”是指革兰氏阳性宿主细胞自身或天然存在的蛋白或多肽。本发明包括通过重组DNA技术产生同源蛋白质的宿主细胞。本发明包括在编码该同源蛋白如蛋白酶的天然核酸中具有缺失或中断的芽孢杆菌宿主细胞，该细胞中以重组形式重新导入了编码该同源蛋白质或其变体的核酸。在另一实施方案中，该宿主细胞产生同源蛋白质。
优选实施方案的详述
本发明涉及突变aprE启动子在制备蛋白质的方法中的用途。aprE在指数生长结束、当达到最大生物质时，以自然方式被诱导，从而使突变和质粒分离的可能性最小化。自然诱导避免了对人为诱导剂的需要，例如那些基于IPTG、氧等化学物质的系统(Walsh K，Koshland DE Jr.(1985))、或通过热进行的物理诱导(Bujard等，1983)。由于其在发酵过程中应用的简单性，aprE基因的这种自然诱导尤其对于大的工业规模生产有着重要的经济优点。
aprE启动子序列在-10和-35盒之间有17bp，而且其-10盒位于距转录起始位点6bp的位置。构建携带如下特定突变的菌株，其中所述特定突变影响：i)aprE’-lacZ mRNA的转录起始速率，和ii)aprE’-枯草杆菌蛋白酶mRNA的转录起始速率。而且，我们还分析了hpr2和degU32背景的作用。对这些突变的每一个的各自作用及它们的选择的组合进行了检测。
通过将aprE启动子中的天然-35盒序列改变为TTGACA序列，β半乳糖苷酶活性增加了100倍以上而枯草杆菌蛋白酶的活性增加了30倍以上。不受理论的束缚，该修饰似乎使RNAP更易于识别该启动子区域，由此促进了开放复合物的形成并增加了其形成的速率。
在一个优选实施方案中，芽孢杆菌属物种是经遗传改造包含具有SEQID NO：1所示序列的突变aprE启动子和编码目的蛋白质或多肽(如蛋白酶或其它酶)的核酸的枯草芽孢杆菌。在其它实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞还在内源性蛋白酶(如Apr、Npr、Epr、Mpr、或本领域技术人员已知的其它蛋白酶)中包含突变或缺失。
本发明提供用于在芽孢杆菌属物种中增加产生和分泌目的异源或同源蛋白质的宿主细胞、表达方法和系统。在一个实施方案中，宿主细胞经遗传改造包含突变的aprE启动子、尤其是具有SEQ ID NO：1所示序列的突变aprE启动子，并还包含编码目的蛋白质或多肽的核酸。编码目的蛋白质的核酸可以整合在宿主细胞的基因组中或在复制型质粒上提供。对于芽孢杆菌适当的复制型质粒描述在芽孢杆菌的分子生物学方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)(Harwood和Cutting编，John Wiley & Sons，1990)中，该文献特此并入作为参考；见关于质粒的第3章。
在该文献中描述几种在芽孢杆菌中直接克隆DNA的策略。质粒标记拯救转化包括由携带部分同源居住质粒(resident plasmid)的感受态细胞摄取供体质粒(Contente等，Plasmid 2：555-571(1979)；Haima等，Mol.Gen.Genet.223：185-191(1990)；Weinrauch等，J.Bacteriol.154(3)：1077-1087(1983)；和Weinrauch等，J.Bacteriol.169(3)：1205-1211(1987))。进入的供体质粒与居住的“辅助”质粒的同源区域在模拟染色体转化的过程中重组。
通过原生质体进行的转化，对于枯草芽孢杆菌，描述在Chang和Cohen(1979)Mol.Gen.Genet 168：111-115；对于巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，描述在Vorobjeva等(1980)FEMS Microbiol.Letters7：261-263；对于淀粉液化芽孢杆菌，描述在Smith等(1986)Appl.andEnv.Microbiol.51：634；对于苏云金芽孢杆菌，描述在Fisher等(1981)Arch.Microbiol.139：213-217；对于球形芽孢杆菌(B.sphaericus)，描述在McDonald(1984)J.Gen.Microbiol.130：203；和对于幼虫芽孢杆菌(B.larvae)，描述在Bakhiet等(1985)49：577。Mann等(1986，Current Microbiol.13：131-135)报道了芽孢杆菌原生质体的转化，而Holubova((1985)Folia Microbiol.30：97)公开了使用含有DNA的脂质体将DNA导入原生质体中的方法。
实施本发明的方式和方法可以通过参考以下实施例更完整地为本领域技术人员所理解，这些实施例并不任何方式对本发明的范围或权利要求书的范围构成限制。
实施例1材料和方法
aprE基因转录调节区的定点诱变
通过将来自质粒pSG35.1(Ferrari E，Henner DJ，Perego M，HochJA(1988)枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的转录和孢子形成突变体中枯草杆菌蛋白酶的表达，J.Bacteriol.170：289-295)的、含有aprE启动子和结构基因头8个密码子的509碱基对(bp)EcoRI-BamHI片段，克隆在质粒pT7(Novagen)中，构建质粒pT7-aprE。此新质粒用作模板，根据Merino等(1992)一种在pUC/M13载体上进行单个或组合的寡核苷酸指导的诱变的一般基于PCR的方法(Biotechniques 12：509-510)所描述的实验方案，进行单个或组合寡核苷酸指导的PCR诱变。使用Taq DNA聚合酶(Promega Co.)在Perkin Elmer PCR系统中进行PCR。引入5’aprE调节区中的核苷酸替代如下：A-34→T、C-33→G、T-32→A、A-31→C、A-12→G、G+1→A。PCR诱变的终产物通过使用Sanger等(1977)描述的双脱氧链终止法确定核苷酸序列得以验证。用EcoRI和BamHI消化这些DNA，并将其克隆在整合型质粒pSG-PLK的相同限制性位点中。质粒pSG-PLK是pSG35.1的衍生物，其中EcoRI-BamHI区被来自pUC19的多聚接头置换，留下无启动子的lacZ基因。pSG-PLK中的这个改变使得可以较为容易地选择转化子，因为铺在X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖)琼脂上的菌落仅在它们携带有aprE启动子的时候才可是蓝色的。表1提供了构建的枯草芽孢杆菌的索引。
                           表1菌株            描述                            参考BSR1            Δnpr hisA glyB                 实验室贮藏BSR2            Δnpr hisA hpr2                 实验室贮藏BSR3            Δnpr glyB degU32 cat           实验室贮藏BSR6            BSR1 amyE∷pSG35.1 cat          本工作JJ3             BSR6 hpr2                       本工作JJ5             BSR6 degU32                     本工作JJ7             BSR6 hpr2 degU32                本工作JJ1             BSR1 amyE∷pTTGAa cat           本工作JJ2             JJ1 hpr2 cat                    本工作JJ4             JJ1 degU32                      本工作JJ6             JJ1 hpr2 degU32                 本工作缩写：cat，氯霉素乙酰转移酶基因；amyE-前部，amyE基因的5’末端。
实施例II转录起始
野生型aprE调节区(rraprE-WT)的特征包括在其-10盒中具有几乎完善的σA共有序列(TAcAAT)的启动子；-35区仅具有共有序列6核苷酸的两个(TactaA)；-10和-35区之间存在17bp；而且-35盒上游存在一个AT丰富的序列，该序列对于RNA聚合酶(RNAP)α亚基的识别是重要的(Ross等，1993，细菌启动子中的第三个识别元件：由RNA聚合酶α亚基结合的DNA，Science 262：1407-1413。)。基于这些特征，在该启动子区的-35区进行定点诱变，以便获得为枯草芽孢杆菌的σA因子所识别的基因的-35共有区。考虑到aprE调节区的-35区仅具有存在于共有序列中的6个核苷酸中的两个，故引入4个核苷酸改变(ACTA-34至-31→TGAC)。此修饰的调节区在本文中命名为rraprE-TTGACA。将此突变体克隆在lacZ报道基因的上游并使其整合在枯草芽孢杆菌染色体的amy座位中，产生菌株JJ1。测试该菌株的β-半乳糖苷酶活性；-35启动子盒的修饰导致它的β半乳糖苷酶活性与携带aprE野生型启动子的亲本BSR6菌株相比增加了106倍(见表2和图2)。
                                  表2菌株             最大比活性       与BSR6相比的相      与JJ1相比的相对
             U/mgprotA           对活性                活性BSR6               2 452                 1×                               .009×JJ3                8 105               3.3×                                .03×JJ5               89 000              36.3×                                0.3×JJ7              162 330                66×                                0.6×JJ1              261 360               106×                                    1×JJ2              472 090               192×                                1.8×JJ4              335 810               137×                                1.3×JJ6              712 300               290×                                2.7×表2显示了不同菌株中获得的β半乳糖苷酶水平比较。A.所示值是三次独立实验的平均值。所测定的活性是从aprE’-lacZ融合物表达的β-gal。
实施例IIIhpr2和degU32背景对aprE’-lacZ表达的影响
已有报道，hpr2突变可增加枯草杆菌蛋白酶的表达水平。该突变是在该359bp结构基因的DNA区段中具有一个缺失，该缺失导致其活性降低65％(Perego和Hoch 1988，一种枯草芽孢杆菌中蛋白酶产生和孢子形成的调节基因，hpr座位的序列分析和调节，J.Bacteriol.170：2560-2567)。degU32是由A2006→T的替代组成的突变，该突变将该蛋白质第12位的氨基酸从组氨酸残基改变为亮氨酸残基(Henner等，1988，枯草芽孢杆菌sacU(Hy)突变定位在类似于两组分信号转导系统的保守原核生物家族的两个相连基因上，J.Bacteriol.170：5120-9)。此突变增加了DegU-PO4态，因此其可使其激活作用持续较长的时间。
为了构建超量生产菌株，将hpr2和degU32基因型以单独和组合的方式转移至BSR6(BSR1 amyE∷pSG35.1)和JJ1(BSR1 amyE：pTTGACA)菌株中(见表1)。表2中展示了这些菌株的β半乳糖苷酶活性数据。具有hpr2突变的JJ3菌株产生3.3倍的增加，而JJ2菌株有1.8倍的增加。带有degU32遗传背景的菌株JJ5和JJ4分别有36.3和1.3倍的增加。在同时带有degU32和hpr2遗传背景菌株的JJ7和JJ6中获得的活性水平，与它们的亲本菌株相比分别是66和2.7倍。
在Bolanos等(2.8倍)和Olmos等(4.6倍)制备的同源菌株JJ3中获得了类似结果(Bolanos 1994硕士论文：Sobreproduccion de la enzimaβ-galactosidasa de Escherichia coli en Bacillus sublitis，Instituto de Biotechnologia，Universidad Nacional Autonoma deMexico，Cuernavaca，Mor.Mexico.；Olmos等，1996，功能性SpoOA是枯草芽孢杆菌中aprE的最大表达所必需的，FEBS Lett.381：29-31)。hpr2突变不仅对野生型启动子也对菌株JJ2中的修饰启动子起作用。
尽管不愿受理论的束缚，但可以想到突变degU32和-35共有序列的改变以相似方式促进了RNAP对该启动子序列的识别，并可以帮助和稳定DNA-RNAP开放复合物的形成。
总之，为了构建超量生产的枯草芽孢杆菌菌株在该方法中分析了几个元件。最有意义的改变出现在将图1所示突变启动子序列并入aprE基因的调节区中时，产生菌株JJ1。该改变允许相对于本研究中被认作野生型的菌株(BSR6)出现100倍以上的增加。尽管菌株JJ6的β半乳糖苷酶活性达到了最大水平，但它与JJ1菌株不同的是有几个多效作用。
实施例IV测量β半乳糖苷酶的合成
本实施例举例说明了异源蛋白β半乳糖苷酶的产生。
为了直接估计β半乳糖苷酶蛋白质的合成以便与在我们的超量生产菌株中发现的活性水平建立直接关系，我们通过菌株JJ6(BSR1amyE∷pTTGACA hpr2 degU32)(该菌株具有最大水平的β半乳糖苷酶活性)的SDS-PAGE分析了总蛋白谱。在Shaeffer培养基中培养菌株JJ6，并定期间隔采取样品。通过超声获得的无细胞提取物通过SDS-PAGE进行分析，并用考马斯亮兰染色(图2)。观察到具有116 kDa分子量的β半乳糖苷酶蛋白条带。孢子形成过程在接种后5小时开始。在此时，重组蛋白开始表达并在2小时后达到其最大值，相应于总细胞内蛋白质的约10％。
实施例V
本实施例描述了含有突变aprE启动子的枯草芽孢杆菌宿主细胞的构建。修饰aprE启动子后产生的细胞外蛋白酶AprE的水平通过使用菌株OS4进行定量。为了比较，在相同条件下分析了带有野生型aprE基因的几种其它菌株。这些菌株间的差异在于它们含有已知增加aprE表达的突变(Valle和Ferrari，同上)。
此分析的结果显示在表3中。正如可以看到的，与野生型菌株相比，OS4菌株产生多32.7倍的AprE。另一方面，与带有野生型aprE和degU、ScoC突变的菌株相比，OS4菌株产生的枯草杆菌蛋白酶少了50％。考虑到表2中给出的使用lacZ表达获得的结果，可能进一步使用hpr2和/或degU突变增加枯草杆菌蛋白酶的产量。使用OS4菌株获得的这些结果说明，修饰的aprE启动子也可以用于超量产生分泌至培养基的同源蛋白质。
本文中命名为OS4的PCR融合序列的构建
在以下3个步骤中构建OS4 PCR融合序列：1)通过PCR从枯草芽孢杆菌168的染色体DNA扩增2个独立的片段；2)在PCR类型的方法中不使用引物，装配2个纯化的PCR片段；和3)使用OSBS-1和OSBS-8末端引物通过PCR扩增该装配产物。
1).使用芽孢杆菌168的染色体DNA作为模板并使用2套引物，扩增aprE基因座位。第一对引物由位于芽孢杆菌染色体1101.821kb至1101.851kb间的OSBS-1(5’-ATATGTGGTG CCGAAACGCT CTGGGGTAAC-3’)SEQ ID NO：2和位于1105.149kb至1105.098kb间的Stu-1(5’-CTCAAAAAAA TGGGTCTACT AAAATATTAT TCCATCTATT ACAATAAATTCA-3’)SEQ ID NO：3组成。该扩增片段为3.327 kb并含有以下基因：截短的yhfL’、yhfM、yhfN和aprE启动子区域，枯草芽孢杆菌基因组的描述见Kunst等，1997，Nature，第390页，第249-256页。
第二对引物由位于染色体1105.098kb至1105.149kb间的Stu-2(5’-TGAATTTATTGTAATAGATGGAATAATATTTTAGTAGACCCATTTTTTTGAG-3’)SEQ ID NO：4和位于1107.733 kb至1107.704 kb间的OSBS-8(5’-CTTTTCTTCA TGCGCCGTCA GCTTTTTCTC-3’)SEQ ID NO：5组成。扩增片段为2.635kb并含有以下部分：aprE的启动子区域、yhfO、yhfP和截短的yhfQ’。两个PCR产物在启动子区域重叠。使用Stu-1和Stu-2互补引物在aprE启动子-35区中引入4个突变，其中TACTAA被TTGACA序列代替。根据厂商说明书，使用含有rTth聚合酶的Perkin ElmerGeneAmp XL PCR试剂盒进行所有的PCR。PCR反应在100μl体积中进行。
DNA-2-5μl
3.3×XL缓冲液II-30μl
10mM dNTP混合物-3μl
25mM Mg(OAc)2-4μl
25μM OSBS-1引物(或OSBS-8)-2μl
25μM Stu-1引物(或Stu-2)-2μl
2U/μl rTth聚合酶-2μl
水-调节至100μl
PCR条件是：95℃-30秒、54℃-30秒、68℃-3分钟，30个循环。所获PCR片段，3.327kb和2.635kb，使用QIAGEN PCR纯化试剂盒根据厂商说明书进行纯化并用于PCR装配。
2).将5μl等分试样的纯化PCR片段混合在一起，并加入不含引物的新鲜PCR混合物中。PCR混合物的总体积是100μl，并具有上述成分。PCR装配条件是：95℃-30秒、52℃-30秒、68℃-2分钟，10个循环。
3).10个PCR循环后，在该装配混合物中补加OSBS-1和OSBS-8引物，并再进行15个循环的PCR扩增。此次PCR条件是：95℃-30秒、52℃-30秒、68℃-5分钟。获得期望的5.962kb产物，命名为OS4-Pcons-aprE并用于转化OS1感受态细胞以产生OS4菌株。OSBS-1                                                             Stu2→                                                                 →
yhfL′   yhfM   yhfN   aprE   yhfO   yhfP  yhfQ′
                                                               ←                                         ←
                                                               Stu1                                       OSBS-8
OS1感受态细胞的转化
通过用卡那霉素基因置换aprE基因，从称为BG2822的枯草芽孢杆菌产生OS1菌株。将卡那霉素基因插入芽孢杆菌染色体上从1103.484kb至1105.663kb的位置中。因此，该菌株在LB+1.6％脱脂乳平板上不形成任何晕圈(halos)。BG2822是具有nrp缺失(编码中性蛋白酶的基因中的缺失)的枯草芽孢杆菌168衍生物(J.Bacteriol.1984，第160卷，第15-21页)。
由于OS4-Pcons-aprE PCR融合物不带有任何抗生素标记，所以通过中板集合(congression)将此融合物引入细胞中。使20μl PCR产物与1μl(约10nM)pBS19质粒混合，并用于转化OS1。将转化混合物铺在LB+1.6％脱脂乳+5μg/ml cmp平板上。第二天，挑取形成晕圈的菌落并进行单菌落划板。进行两次菌落纯化。通过对aprE启动子区域测序，分析5个独立的克隆。所有这些克隆在aprE启动子的-35区都有共有序列。表3
    菌株名称     有关基因型   相对aprE表达水平
BG2822     Wild type，nprE-     1
 OS4     PaorE TTGACA1     32.71
 BG2790     DegU32.scoC     65.14
 BG2805     DegU32，scoC，degQ     22.16
 BG2810     scoC，deg.Q     2.43
 BG2815     scoC     1.43
 BG2817     DegU32     20.54
 BG2820     DegU32，degQ     8.92
 BG2821     degQ     2.98
表3.aprE基因在不同芽孢杆菌菌株中的表达2×SMB培养基中培养48小时后测量aprE活性。1在此菌株中将aprE启动子的-35区改变为共有序列TTGACA。
实施例XI
实施例XI提供培养修饰的枯草芽孢杆菌菌株和检测蛋白酶的实验方案。培养
在2ml LB(Luria-Bertani培养基)中预培养这些菌株至A620nm处的约0.350D。然后将这些预培养物等分在96孔微滴定板中(Costar，Cat#3598)，每种菌株4个孔。使用无菌的96孔印模(stamp)，从预培养板上接种含有200μl 2×SMB培养基的96孔过滤底平板(Millipore，MAGVN2250)。在湿润摇箱中280 RPM，37℃培养该平板，并在20和48小时培养后测定蛋白酶活性。Luria-Bertani培养基向950ml去离子水中添加：细菌用胰蛋白胨     10g细菌用酵母提取物   5gNaCl              10g摇动这些溶解物至溶解。用5N NaOH(约0.2ml)调节pH至7.4。用去离子水将溶液体积调节至1升，并在15 lb/sq in通过液体循环上高压灭菌20分钟。蛋白酶测定
从培养板上采取等分试样，并使用Multispence(Asys Hitech)在96孔微量滴定板中Tris缓冲液(100mM pH8.6，0.005％Tween 80)内稀释。将来自该稀释板的等分试样分装在含有Tris缓冲液和底物(1mg/mlSuc AAPF pNA-Bachem Cat#L-1400)的96孔板来测定上述滴定板中的蛋白酶活性。然后在96孔板读数器(Molecular Devices，SpetraMax 250)读取反应物的数据。基于底物水解的速率、0.02mg/U转化因素和稀释因素，测定每孔蛋白酶浓度。

Claims (31)

1.分离的突变aprE启动子，其在图1所示野生型启动子的-35共有盒的核苷酸中包含修饰。
2.分离的突变aprE启动子，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.包含分离的突变aprE启动子的表达载体，其中所述突变启动子在图1所示野生型启动子的-35盒中包括修饰。
4.权利要求3的表达载体，其中分离的突变aprE启动子具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。
5.包含分离的突变aprE启动子的宿主细胞，其中所述突变启动子在图1所示野生型启动子的-35共有盒的核苷酸中包括修饰。
6.权利要求5的宿主细胞，其中突变的aprE启动子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
7.权利要求5的宿主细胞，其中所述宿主细胞来自芽孢杆菌属物种。
8.权利要求7的宿主细胞，还包含与突变aprE启动子相连的编码目的蛋白质的核酸序列。
9.权利要求8的宿主细胞，其中所述目的蛋白质是与所述宿主细胞同源的。
10.权利要求8的宿主细胞，其中所述目的蛋白质是与所述宿主细胞异源的。
11.权利要求8的宿主细胞，其中所述目的蛋白质选自蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、糖酶、脂酶、异构酶、转移酶、激酶和磷酸酶。
12.权利要求7的宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属物种选自地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
13.在芽孢杆菌中制备目的蛋白质的方法，包括：培养包含编码该目的蛋白质的核酸的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌还包含分离的突变aprE启动子；和任选地回收该蛋白质。
14.权利要求13的方法，其中所述分离的突变aprE启动子具有SEQ IDNO：1所示序列。
15.权利要求13的方法，其中所述芽孢杆菌包括地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
16.权利要求13的方法，其中所述目的蛋白质包括蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、糖酶、和脂酶；异构酶如消旋酶、差向异构酶、互变异构酶、或变位酶；转移酶、激酶和磷酸酶。
17.权利要求15的方法，其中所述核酸整合在芽孢杆菌基因组中。
18.权利要求15的方法，其中所述核酸位于复制型质粒上。
19.权利要求13的方法，其中所述芽孢杆菌物种是枯草芽孢杆菌，所述目的蛋白质是蛋白酶。
20.权利要求19的方法，其中所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
21.分离的突变aprE启动子，其与野生型aprE启动子相比在-35共有盒的一或多个核苷酸中包含修饰，其中所述突变的aprE启动子增强按每单位时间产生的mRNA分子数测量的转录频率。
22.包含权利要求21的分离的突变aprE启动子的表达载体。
23.权利要求1的突变aprE启动子，还在图1所示野生型启动子的17碱基对间隔区中包含修饰。
24.权利要求1的突变aprE启动子，还在图1所示野生型启动子的-10共有盒的核苷酸中包含修饰。
25.权利要求3的表达载体，还包含编码目的蛋白质的核酸。
26.权利要求25的表达载体，其中所述目的蛋白质选自蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、糖酶、脂酶、异构酶、转移酶、激酶和磷酸酶。
27.权利要求25的表达载体，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
28.权利要求4的表达载体，还包含编码目的蛋白质的核酸。
29.包含权利要求28的表达载体的宿主细胞。
30.权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌宿主细胞。
31.权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的芽孢杆菌属物种。
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