DE69731210T2

DE69731210T2 - Expressionssystem abgeleitet von der lipase-regulationskaskade von pseudonomas alcaligenes

Info

Publication number: DE69731210T2
Application number: DE69731210T
Authority: DE
Inventors: Gijsbert Gerritse; J. Wilhelmus QUAX
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1997-08-15
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2017-08-16
Also published as: WO1998006836A3; CA2262510A1; ATE279513T1; DK1555320T3; AU4070997A; DE69731210D1; US6313283B1; DE69738723D1; CA2262510C; DK0918851T3; EP1557467B1; EP0918851B1; US6048710A; EP1555320A2; DK1557467T3; WO1998006836A2; DE69738724D1; ATE396268T1; EP0918851A2; US6225106B1

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung ist eine Änderungsanmeldung („continuation in part") zur US-Seriennummer 08/699.092 vom 16. August 1996, die in ihrer Gesamtheit durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung der Lipasenregulationskaskade Pseudomonas alcaligenes. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen verschiedener Komponenten der Lipasenregulationskaskade bereit, die in Expressionsverfahren und -systemen verwendet werden kann, die auf die Produktion von heterologen Proteinen ausgerichtet sind.
Hintergrund der Erfindung
Die Isolation und Identifikation eines Mikroorganismus, der von Natur aus ein Produkt sekretieren kann, das möglicherweise zur industrielle Produktion geeignet ist, ist einer der wichtigsten, wenn nicht der entscheidenste Schritt im fermentationsbiotechnologischen Verfahren. Die Fähigkeit, das Protein von Interesse zu sekretieren, ermöglicht üblicherweise einfaches Downstream-Processing. Der nächste entscheidende Schritt ist die Mutagenese eines natürlich vorkommenden Stamms zu einem hyperproduzierenden Stamm. Im Laufe einiger Jahre haben Wissenschaftler Screening-Strategien entwickelt, durch die eine Reihe von Exoprotein produzierenden Bakterien isoliert wurde. Nach der Isolation können zahlreiche Mutagenesedurchgänge durchgeführt werden, um kontinuierlich höher produzierende Stämme zu selektieren. Die klassische Stammverbesserung kann jedoch nicht unbegrenzt eingesetzt werden, um die Produktionswerte zu erhöhen. Daher wird ein direkteres Verfahren zur Charakterisierung und molekulargenetischen Manipulation gebraucht, um höhere Produktionswerte zu erreichen.
In verschiedenen Patenten und Veröffentlichungen wurde ein Lipasenmodulatorgen beansprucht oder beschrieben (WO 94/02617; EP 331.376 ; Nakanishi et al., Lipases-Struct. Mech. Genet. Eng., GBF Monographs 16, 263–266 (1991)). Spätere Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass das Produkt des Gens, das lif genannt wird, eher mit der Faltung der Lipase zusammenhängt als mit der Regulation der Expression der Lipase. Eine Übersicht über verschiedene Lipasenexpessionssysteme unter Verwendung des lif-Genprodukts findet sich in Jaeger et al., FEMS Microbiol. Rev. 15, 29–63 (1994).
In einer weiteren Veröffentlichung werden der Sigma-54-Promotor und die Genarten besprochen, die angeblich von dieser Promotorart kontrolliert werden. Morrett und Segovia, J. Bacter. 175, 6067–6074 (1993).
Die Suche nach einem Expressionssystem, mit dem ein heterologes Protein, vor allem eine Lipase in Pseudomonas, insbesondere Pseudomonas alcaligenes, effizient exprimiert werden kann, wurde fortgesetzt. Die Expression von Lipase in Pseudomonas ist sehr schwierig und bringt häufig niedrigere Ergebnisse als von der Industrie gewünscht.
Die vorliegende Erfindung löst das Problem der geringen Expression von Proteinen in Pseudomonas sowie in anderen mikrobiellen Wirten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung einer Regulationskaskade der Pseudomonas-Lipase und stellt einzelne Komponenten der Regulationskaskade bereit, die in Expressionssystemen zur Produktion und Sekretion von Proteinen in Wirtszellen verwendet werden können. Die Regulationskaskade umfasst überraschenderweise einen Zweikomponententeil, der einen Kinase und einen DNA-Bindungsregulator umfasst. Die beiden Komponenten arbeiten mit einem Promotor und einer stromaufwärts liegenden Aktivierungssequenz zusammen, um ein Protein effizient zu exprimieren. Die Regulationskaskade umfasst ferner Sekretionsfaktoren, die in Wirtszellen verwendet werden können, um die Sekretion von produzierten Proteinen zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen für die verschiedenen Komponenten der Regulationskaskade der Pseudomonas-alcaligenes-Lipase bereit. Ferner stellt die vorliegende Erfindung auch neue, effiziente Expressionssysteme, d. h. Expressionsvektoren, und Wirtszellen bereit, die zur erhöhten Expression von Proteinen verwendet werden können. Die neuen Expressionssysteme ermöglichen die erhöhte Expression eines Proteins, dessen Gen funktionell an Komponenten des Expressionssystems gebunden ist, d. h. an Komponenten der Lipasenregulationskaskade. So kann ein hyperproduzierender Stamm entwickelt und kommerziell verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die für eine Kinase kodiert und die Expression eines Proteins, vorzugsweise. einer Lipase, regulieren kann. Die für eine Kinase kodierende Nucleinsäure stammt vorzugsweise von gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise einer Pseudomonade, vorzugsweise Pseudomonas alcaligenes, und ist insbesondere bevorzugt lipQ. Weiters weist die für die Kinase kodierende Nucleinsäure vorzugsweise die in 1A–1B dargestellte Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 1) und/oder weist zumindest 50% Homologie zu dieser Sequenz auf. Das Kinase-Protein wird ebenfalls bereitgestellt und stammt vorzugsweise von einem Bakterium, vorzugsweise einem gramnegativen Bakterium, wie beispielsweise einer Pseudomonade, und noch bevorzugter stammt die Kinase von Pseudomonas alcaligenes. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Kinase LipQ. Die Kinase weist vorzugsweise die in 1A–1B dargestellte Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 2) und/oder oder weist zumindest 50% Homologie zu dieser Sequenz auf.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Nucleinsäure bereit, die für eine Kinase kodiert und die Expression einer Lipase in Pseudomonas alcaligenes regulieren kann. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Kinase bereit, die zur Regulierung der Expression einer Lipase in Pseudomonas alcaligenes fähig ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die für einen DNA-Bindungsregulator kodiert und die Expression eines Proteins, vorzugsweise einer Lipase, regulieren kann. Die DNA-Bindungsregulator-Nucleinsäure ist vorzugsweise lipR. Ferner weist sie vorzugsweise die in 2A–2B dargestellte Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 3) und/oder weist zumindest 50% Homologie zu dieser Sequenz auf. Das DNA-Bindungsregulator-Protein wird ebenfalls bereitgestellt und ist vorzugsweise LipR. Der DNA-Bindungsregulator weist vorzugsweise die in 2A–2B dargestellte Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 4) und/oder weist zumindest 50% Homologie zu dieser Sequenz auf. Vorzugsweise stammt der DNA-Bindungsregulator von einem Bakterium. Noch bevorzugter stammt der DNA-Bindungsregulator von einem gramnegativen Bakterium, wie beispielsweise einer Pseudomonade. Insbesondere bevorzugt ist ein DNA-Bindungsregulator von Pseudomonas alcaligenes.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nucleinsäure bereit, die für einen DNA-Bindungsregulator kodiert, die die Expression einer Lipase in Pseudomonas alcaligenes regulieren kann. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen DNA-Bindungsregulator selbst bereit.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Nucleinsäure bereitgestellt, die für einen Teil einer Polymerase kodiert und die Expression eines Proteins, vorzugsweise einer Lipase, regulieren kann. Die Polymerase-Nucleinsäure ist vorzugsweise orfZ. Ferner weist sie vorzugsweise die in 9A–9B dargestellte Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 36) und/oder weist zumindest 75% Homologie zu dieser Sequenz auf. Ein Teil des Polymerase-Proteins wird ebenfalls bereitgestellt und ist vorzugsweise OrfZ. Das Polymerase-Protein weist vorzugsweise die in 9A–9B dar gestellte Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 37) und/oder weist zumindest 75% Homologie zu dieser Sequenz auf. Vorzugsweise stammt die Polymerase von einem gramnegativen Bakterium, wie beispielsweise einer Pseudomonade. Insbesondere bevorzugt ist Polymerase von Pseudomonas alcaligenes.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Kinase, der DNA-Bindungsregulator und ein Teil der Polymerase in einer Nucleinsäure vorhanden. In einer weiteren Ausführungsform weisen die Kinase, der DNA-Bindungsregulator und die Polymerase die in 4A–4G dargestellte Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 28).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die für einen Sigma-54-Promotor von Pseudomonas alcaligenes kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die für eine stromauf liegende Aktivierungssequenz von Pseudomonas alcaligenes kodiert. Die stromauf liegende Aktivierungssequenz ist vorzugsweise UAS. Ferner weist sie vorzugsweise die in Seq.-ID Nr. 5 dargestellte Sequenz auf und/oder weist zumindest 50% Homologie zu dieser Sequenz auf. Vorzugsweise stammt die stromauf liegende Aktivierungssequenz von einem Bakterium. Noch bevorzugter stammt die stromauf liegende Aktivierungssequenz von einem gramnegativen Bakterium, wie beispielsweise einer Pseudomonade. Insbesondere bevorzugt ist eine stromauf liegende Aktivierungssequenz von Pseudomonas alcaligenes.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden isolierte Nucleinsäuren bereitgestellt, die für Sekretionsfaktoren kodieren. Die Sekretionsfaktoren sind vorzugsweise XcpP, XcpQ, OrfV, OrfX, XcpR, XcpS, XcpT, XcpU, XcpV, XcpW, XcpX, XcpP, XcpZ oder ein anderes Protein, OrfY, mit der in Seq.-ID Nr. 35 dargestellten C-terminalen Aminosäuresequenz. Ferner weisen sie vorzugsweise die in Seq.-ID Nr. 12, 14, 30, 16, 6, 8, 10, 18, 20, 22, 24, 26, 32 bzw. 34 dargestellte Nucleinsäuresequenz auf und/oder weisen zumindest 90% Homologie zu dieser Sequenz auf. Die Sekretionsfaktor-Proteine werden ebenfalls bereitgestellt und weisen vorzugs weise die in Seq.-ID Nr. 13, 15, 31, 17, 7, 9, 11, 19, 21, 23, 25, 27, 33 bzw. 35 dargestellte Aminosäuresequenz auf und/oder weisen zumindest 90% Homologie zu dieser Sequenz auf. Vorzugsweise stammen die Sekretionsfaktoren von Bakterien. Noch bevorzugter stammen die Sekretionsfaktoren von gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise Pseudomonaden. Insbesondere bevorzugt sind Sekretionsfaktoren von Pseudomonas alcaligenes.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Gene, die für die Sekretionsfaktoren XcpP, XcpQ, OrfV, OrfX, XcpR, XcpS, XcpT, XcpU, XcpV, XcpW, XcpY, XcpX und OrfY kodieren, in einer Nucleinsäure mit der in 3AA–3BB dargestellten DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 29) vorhanden. Die beiden xcp-Gencluster, xcpP~Q und xcpR~Z, sind in entgegengesetzter Richtung zwischen OrfV und OrfX angeordnet, wie in 8 zu sehen ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst eine isolierte Nucleinsäure, die für ein lux-Box-Bindungselement und orfV-Box-Bindungselemente von Pseudomonas alcaligenes kodieren, welche die Expression eines Proteins regulieren können.
Eine weitere Ausführungsform stellt Nucleinsäuren bereit, die unter äußerst stringenten Bedingungen an die in Seq.-ID Nr. 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 32, 34 und 36 dargestellten Nucleinsäure hybridisieren können.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Expressionssystem bereitgestellt, das ein Gen, das für ein funktionell an Nucleinsäuren, die für eine Kinase kodieren, gebundenes Protein kodiert, einen DNA-Bindungsregulator, eine Polymerase, einen Promotor und eine stromauf liegende Aktivierungssequenz umfasst. Das Expressionssystem kann auch Sekretionsfaktoren und ihre regulatorischen Regionen umfassen. Vorzugsweise stammen die Regulationselemente und die Sekretionsfaktoren von Bakterien. Noch bevorzugter stammen die Regulationselemente und die Sekretionsfaktoren von gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise einer Pseudomonade.
Insbesondere bevorzugt sind Regulationselemente und Sekretionsfaktoren von Pseudomonas alcaligenes.
Eine weitere Ausführungsform stellt ein Expressionssystem bereit, das die Expression einer Lipase in Pseudomonas alcaligenes regulieren kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden replizierende Plasmide und integrierende Plasmide bereitgestellt, die das Expressionssystem oder eine für einen oder mehrere der Sekretionsfaktoren kodierende Nucleinsäure enthalten.
Ferner werden Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle mit einem Plasmid, welches das Expressionssystem und/oder eine für einen oder mehrere Sekretionsfaktoren kodierende Nucleinsäure enthält, sowie transformierte Wirtszellen bereitgestellt, die das Expressionssystem und/oder eine für einen, oder mehrere Sekretionsfaktoren kodierende Nucleinsäure enthalten. Eine Wirtszelle wird transformiert, indem das Plasmid unter geeigneten Bedingungen in die Wirtszelle insertiert wird. Vorzugsweise wird die Wirtszelle elektroporiert, damit das Plasmid in die Wirtszelle eindringen kann. Die Wirtszelle ist vorzugsweise ein Bakterium. Noch bevorzugter ist die Wirtszelle ein gramnegatives Bakterium, wie beispielsweise eine Pseudomonade. Noch bevorzugter ist die Wirtszelle Pseudomonas alcaligenes.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1A–1B zeigen die DNA- (Seq.-ID Nr. 1) und Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 2) der LipQ von Pseudomonas alcaligenes.
2A–2B zeigen die DNA- (Seq.-ID Nr. 3) und Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 4) der LipR von Pseudomonas alcaligenes.
3AA–3BB zeigen die DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 29) aus 17,612 bp, beginnend vom Insert auf Cosmid Nr. 600, das die Sekretionsfaktoren XcpQ, XcpP, OrfV, OrfX, XcpR, XcpS, XcpT, XcpU, XcpV, XcpW, XcpX, XcpY, XcpZ und einen Teil eines anderen Proteins OrfY von Pseudomonas alcaligenes umfasst. Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der offenen Leseraster (Seq.-ID Nr. 13, 15, 31, 17, 7, 9, 11, 19, 21, 23, 25, 27, 33 bzw. 35) sind durch Einbuchstabencodes unter der DNA-Sequenz angeführt. Auf ähnliche Weise sind die Terminatorsequenzen in Form von zwei dicken, aufeinander zeigenden Pfeilen und die Bindungselemente für den Regulator, OrfV (orfV-Boxen), in Form von dicken, abgegrenzten Linien dargestellt.
4A–4G zeigen die DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 28) des überlappenden 4.377 bp langen Fragments von Cosmid Nr. 71, Nr. 201, Nr. 505 und Nr. 725, das die offenen Leseraster von LipQ, LipR und eines Teils von OrfZ von Pseudomonas alcaligenes umfasst. Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der offenen Leseraster (Seq.-ID Nr. 2, 4 bzw. 37) sind durch Einbuchstabencodes unter der DNA-Sequenz angeführt. Auf ähnliche Weise sind die Terminatorsequenz in Form von zwei dicken, aufeinander zeigenden Pfeilen und das Bindungselement für Autoinduktoren (lux-Box) und das Bindungselement für OrfV (orfV-Boxen) in Form einer dicken, abgegrenzten Linien dargestellt.
5 zeigt die Wirkung von Cosmid Nr. 505 auf die Lipasenproduktion im 10-Liter-Maßstab. Nach einer Fermentation wurde eine dreifach höhere Lipasenausbeute erzielt.
6 zeigt die Stabilität des Produktionsplasmids im Produktionsstamm Ps1084 und Ps1084 + Cosmid Nr. 600, bestimmt durch Neomycinresistenz.
7 zeigt das theoretische Schema der Wirkung von LipQ, LipR, des Sigma-54-Promotors und der stromauf liegenden Aktivierungssequenz auf dem für LipR kodierenden DNA-Strang. Das kleine Rechteck auf dem DNA-Strang unter der D-Domäne von LipR ist die stromauf liegende Aktivierungssequenz (UAS).
8 zeigt die Ausrichtung der xcp-Gene von Pseudomonas alcaligenes auf der Karte von Cosmid Nr. 600, entnommen aus Seq.-ID Nr. 29.
9A–9B zeigen die DNA (Seq.-ID Nr. 36) und Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 37) von OrFZ von Pseudomonas alcaligenes.
10 zeigt das vorgeschlagene Modell für die Regulationskaskade der Lipase von Pseudomonas alcaligenes.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Um die Lipasenexpression in Pseudomonas alcaligenes weiter zu verbessern, wurde eine pragmatische Suche nach Begrenzungsfaktoren gestartet. Eine Cosmid-Bibliothek des P.-alcaligenes-Genoms vom Wildtyp wurde als Donor von DNA-Fragmenten verwendet, die in einen Lipasenproduktionsstamm von P. alcaligenes mit hoher Kopienzahl insertiert werden sollten. Insgesamt wurden 485 Cosmide transformiert, wonach die Cosmide, die P.-alcaligenes-Stämme enthielten, auf ihre Lipasenproduktionsaktivität gescreent wurden. Zwanzig Cosmid-Stämme wurden selektiert, von denen jeder eine bedeutende Verbesserung der Lipasenexpression aufwies, wie sich in verschiedenen Flüssigkeits- und Plattentests zeigte. Die entsprechenden Cosmide wurden auch in einem Einzelkopie-Lipasenstamm getestet, und einige davon wiesen eine dreifache Erhöhung der Lipasenexpression auf. Die vier besten Cosmide wiesen alle ein Überlappungsfragment mit 5,6 kb auf. Die Lipasenstimulationsaktivität wurde auf einem 4,5 kb großen Fragment lokalisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung einer Regulationskaskade einer Pseudomonas-alcaligenes-Lipase, die mehrere Komponente umfasst, die mit der Expression von Lipase zu tun haben. Die Bezeichnung „Regulationskaskade" bezieht sich hierin auf den gesamten Komplex von einzelnen hierin identifizierten Komponenten, wie beispielsweise Kinase, DNA-Bindungsregulator, Polymerase, UAS, lux-Box, orfv-Boxen, Sekretionsfaktoren und ihre regulatorischen Regionen. Komponen ten der Regulationskaskade können alleine oder in Kombination mit anderen Komponenten verwendet werden, um die Expression von Proteinen in Wirtszellen zu modulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle ein gramnegativer Wirt. In einer weiteren Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pseudomonade. In einer weiteren Ausführungsform ist die Wirtszelle Pseudomonas alcaligenes.
Bevorzugte gewünschte Proteine zur Expression umfassen Enzyme, wie beispielsweise Esterasen; Hydrolasen, einschließlich Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen, wie beispielsweise Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen. Die Proteine können therapeutisch von Bedeutung sein, beispielsweise Wachstumsfaktoren, Cytokine, Liganden, Rezeptoren und Inhibitoren sowie Vakzinen und Antikörper. Die Proteine können auch kommerziell von Bedeutung sein, wie beispielsweise Proteasen, Carbohydrasen, wie z. B. Amylasen und Glucoamylasen, Cellulasen, Oxidasen und Lipasen. Das für das Protein von Interesse kodierende Gen kann ein natürlich vorkommendes Gen, ein mutiertes Gen oder ein synthetisches Gen sein.
Das 4,5-kb-Fragment wurde sequenziert, und es zeigte sich, dass es für LipQ, LipR und Polymerase-Proteine kodiert (4A–4G). Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, wird angenommen, dass diese Proteine bei der Regulierung des Sigma-54-Promotors vor der Lipasen- (LipR) und der Lipasenmodulator- (LipR) Genregion mitwirken (siehe 7). Diese Sigma-54-Promotoren weisen charakteristischerweise eine stromauf liegende Enhancer-Region auf, hierin die stromauf liegende Aktivierungssequenz oder UAS, die durch Proteine reguliert wird. Eine Regulierung kann entweder durch ein Zweikomponentensystem, wie z. B. NtrB-NtrC, oder durch ein Einkomponentensystem, wie z. B. NifA, erreicht werden, wobei das Protein eng mit dem Substrat verbunden ist (für einen Überblick siehe Morett und Segovia, w. o.).
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Expression eines Proteins reguliert werden, wenn eine Kinase und ein DNA-Bindungsregulator, die in trans-Form bereit gestellt sind, mit einem Promotor und/oder einer stromaufwärts liegenden Aktivierungssequenz Wechselwirken, die funktionell an ein Gen gebunden sind, das für das Protein von Interesse kodiert. Vorzugsweise wird die Expression des Proteins erhöht.
Eine „Kinase" ist ein Enzym, das den Transfer von Phosphat entweder auf sich selbst oder anderes Protein katalysieren kann. Die Kinase der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise LipQ, eine Kinase, welche die Expression einer Lipase regulieren kann. Ein LipQ wurde aus Pseudomonas alcaligenes isoliert. Als solches kodiert für die Kinase vorzugsweise eine Nucleinsäure mit der in 1A–1B gezeigten Sequenz (Seq.-ID Nr. 1), und sie weist die in 1A–1B dargestellte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) auf. Eine Kinase kann alleine oder als Teil eines Expressionssystems wirken, um die Expression des Proteins zu regulieren. In manchen Fällen führt die Abwesenheit dieser Kinase zu einer Verringerung oder einem Aussetzen der Expression des Proteins.
Ein „DNA-Bindungsregulator" ist eine proteinische Substanz, die physikalisch mit DNA wechselwirkt und dabei die Expression von Genen beeinflusst, die nahe der Bindungsstelle liegen. Der DNA-Bindungsregulator ist vorzugsweise LipR, ein DNA-Bindungsregulator, der die Expression einer Lipase regulieren kann. Ein LipR wurde aus Pseudomonas alcaligenes isoliert. Als solches kodiert für den DNA-Bindungsregulator vorzugsweise eine Nucleinsäure mit der in 2A–2B gezeigten Sequenz (Seq.-ID Nr. 3), und sie weist die in 2A–2B dargestellte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 4) auf. Ein DNA-Bindungsregulator kann alleine oder als Teil eines Expressionssystems wirken, um die Expression des Proteins zu regulieren. Ein DNA-Bindungsregulator der vorliegenden Erfindung kann alleine oder in Kombination mit einer Kinase verwendet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst Varianten des hierin offenbarten DNA-Bindungsregulators, die zur Autophosphorylierung fähig sind. Solche Varianten können eine konstitutiv höhere Expression des Zielproteins anführen. In manchen Fällen führt die Abwesenheit dieses DNA-Bindungsregulators zu einer Verringerung oder einem Aussetzen der Expression des Proteins.
„Polymerase" bezieht sich hierin auf ein Enzym, das DNA oder RNA verlängert, um längere DNA- bzw. RNA-Stränge zu erhalten. Dies ist einer der entscheidensten Faktoren bei der Produktion von Proteinen, wie beispielsweise einer Lipase. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Polymerase OrfZ. Somit kodiert in einer bevorzugten Ausführungsform für die Polymerase vorzugsweise eine Nucleinsäure mit der in 9A–9B dargestellten DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 36), und sie weist die in 9A–9B dargestellte Aminosäuresequenz auf (Seq.-ID Nr. 37). Die Polymerase kann bei der Modifikation der Expression des gewünschten Proteins eine Rolle spielen.
Promotoren sind DNA-Elemente, welche die Expression eines Proteins fördern können. Ein „Sigma-54-Promotor" ist ein bakterieller Promotor und gehört zur Klasse der Sigma-Faktoren mit einer Größe von etwa 54 kDa. Diese Sigma-Faktoren sind auch als RpoN-Proteine bekannt. Sigma-54-Promotoren und ihre Funktionen sind in Morrett und Segovia, J. Bacter. 175, 6067–6074 (1993), erläutert. Vorzugsweise ist der Promotor ein Pseudomonas-alcaligenes-Sigma-54-Promotor. Noch bevorzugter ist der Sigma-54-Promotor der Lipasenpromotor von P. alcaligenes (Seq.-ID Nr. 5) (WO 94/02617). Gemäß der vorliegenden Erfindung weist der Sigma-54-Promotor eine stromauf liegende Aktivierungssequenz auf.
Eine „stromauf liegende Aktivierungssequenz" ist eine Bindungsstelle für einen positiv wirkenden DNA-Bindungsregulator. Wie schon der Name sagt, befindet sich die stromauf liegende Aktivierungssequenz stromauf von der Transkriptionsausgangsstelle und ist eine Nucleinsäure. Die stromauf liegende Aktivierungssequenz ist vorzugsweise eine UAS, eine stromauf liegende Sequenz, welche die Expression einer Lipase regulieren kann, und stammt vorzugsweise von Pseudomonas alcaligenes. Eine stromauf liegende Aktivierungssequenz kann alleine oder als Teil eines Expressionssystems wirken, um die Expression des Proteins zu regulieren. In manchen Fällen führt die Abwesenheit dieser stromauf liegenden Aktivierungssequenz zu einer Verringerung oder einem Aussetzen der Expression des Proteins. Vorzugsweise handelt es sich bei der stromauf liegenden Aktivierungssequenz um die Consensus-Sequenz TGR(N)₁₁ACA. In der Gensequenz der Pseudomonas-alcaligenes-Lipase entspricht eine spezifische Region etwa –200 bp vom ATG-Startcodon dieser Consensus-Sequenz: TGTtcccctcggtaACA (Seq.-ID Nr. 5) (WO 94/02617).
Ein Sekretionsfaktor ist ein Protein, das die Sekretion eines weiteren Proteins aus einer Zelle unterstützt. Vorzugsweise gehört der Sekretionsfaktor zur Familie der Xcp-Proteine und wirkt mit anderen Mitgliedern der Xcp-Proteinfamilie zusammen. Die für ein Genomfragment kodierenden Gene xcpQ, xcpP, orfV, orfX, xcpR, xcpS, xcpT, xcpQ, xcpV, xcpW, xcpR, xcpP, xcpZ und der C-terminale Teil des Proteins OrfY wurden aus Pseudomonas alcaligenes isoliert. Als solches kodiert für die Sekretionsfaktoren vorzugsweise eine Nucleinsäure mit der in 3AA–3BB dargestellten Sequenz (Seq.-ID Nr. 29). Genauer gesagt kodiert für den XcpP-Sekretionsfaktor noch bevorzugterweise die in Seq.-ID Nr. 12 gezeigte DNA-Sequenz und weist die in Seq.-ID Nr. 13 dargestellte Aminosäuresequenz auf; für den XcpQ-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 14 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 15 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für das OrfV-Protein die in Seq.-ID Nr. 30 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieses die in Seq.-ID Nr. 31 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, für das OrfX-Protein die in Seq.-ID Nr. 16 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieses die in Seq.-ID Nr. 17 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpR-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 6 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpS-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpT-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 10 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 11 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpQ-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 18 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 19 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpV-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 20 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 21 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpW-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 22 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 23 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpR-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 24 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 25 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpY- Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 26 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 27 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpZ-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 32 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 33 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; und für einen Teil des Proteins OrFY kodiert die in Seq.-ID Nr. 34 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 35 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Stromauf vom ligQ-Gen wurde eine Promotorregion identifiziert. Innerhalb dieser Promotorregion kann eine lux-Box erkannt werden; siehe Seq.-ID Nr. 28. Diese lux-Box weist starke Homologie zur Bindungsstelle für Regulatorelemente vom luxR-Typ auf, die bekannterweise von einem Autoinduktor kontrolliert werden (Latifi et al., Molec. Microb. 17(2), 333–323 (1995)). Diese lux-Box stellt wahrscheinlich eine Verbindung zwischen dem Autoinduktorsystem, LipR und der Lipasenregulation dar. Als solches umfasst eine weitere Ausführungsform der Erfindung eine Nucleinsäure, die für ein lux-Box-Element kodiert.
Stromauf von den xcpP~Q- und xcpR~Z-Clustern sind orFX- und orfV-Gene (Seq.-ID Nr. 29), und stromauf vom orfZ-Gen (Seq.-ID Nr. 28) sind regulatorische Regionen vorhanden. Eine Box kann in der Promotorregion erkannt werden, welche die Consensus-Sequenz ANAANAANAANAA aufweist. Diese Boxen werden als orfV-Bindungselemente bezeichnet, weil OrfV Homologie zum allgemein bekannten Escherichia-coli-Regulator MaIT aufweist. Aufgrund der OrfV-Homologie zum bekannten Regulator MaIT könnte OrfV ein Regulator sein. Diese orfV-Boxen können die Expression der Xcp-Proteine, von OrfX sowie von OrfV selbst kontrollieren. Auf ähnliche Weise kann die Expression der Polymerase OrfZ durch die orfV-Boxen kontrolliert werden, wie in 10 zu sehen ist. Als solches stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform eine Nucleinsäure bereit, die für ein orfV-Box-Element kodiert.
Bei der Beschreibung von Proteinen und dafür kodierenden Genen wird die Bezeichnung für das Gen im Allgemeinen nicht groß geschrieben, d. h. lipQ. Bei der Bezeichnung des Proteins ist der erste Buchstabe groß geschrieben, d. h. LipQ.
Die Kinase, der DNA-Bindungsregulator, der Promotor und die stromauf liegende Aktivierungssequenz werden zur Vereinfachung manchmal als „Regulationselemente" bezeichnet. Die bevorzugten Regulationselemente sind LipQ, LipR, die Pseudomonas-alcaligenes-Polymerase, der Pseudomonas-alcaligenes-Sigma-54-Promotor und die Pseudomonas-alcaligenes-UAS, und diese können die Expression einer Lipase in Pseudomonas alcaligenes wie hierin beschrieben regulieren. Die Kinase, der DNA-Bindungsregulator und die Polymerase sind Proteine, während der Promotor und die stromauf liegende Aktivierungssequenz Nucleinsäuren sind. DNA, die für die Kinase und den DNA-Bindungsregulator kodierte, wurde unter Verwendung eines Plasmids in transformierten Zellen vermehrt, was wiederum zu einer höheren Produktion der Kinase und des DNA-Bindungsregulators führte. Die erhöhte Produktion der Kinase und des DNA-Bindungsregulators führt zu einer höheren Transkription vom Sigma-54-Promotor, der eine höhere Expression des Proteins von Interesse bereitstellt.
Die Kinase und der DNA-Bindungsregulator der vorliegenden Erfindung stellen ein Zweikomponenten-Regulationssystem dar. Vorzugsweise sind die beiden Komponenten LipQ und LipR und können die Expression einer Lipase in Pseudomonas alcaligenes wie hierin definiert regulieren. Obwohl auch andere zwei Komponenten umfassende Regulationssysteme bekannt sind, besteht zwischen einzelnen Teilen dieser Systeme und den in Seq.-ID Nr. 2 und 4 gezeigten Aminosäuresequenzen nur ein geringer Grad an Homologie.
Ausführungsformen der Erfindung umfassen eine Kinase oder einen DNA-Bindungsregulator, für die eine Nucleinsäure mit zumindest 50% Homologie zu der in Seq.-ID Nr. 1 bzw. 3 gezeigten DNA-Sequenz kodiert. Vorzugsweise beträgt die Homologie zumindest 70%, noch bevorzugter zumindest 90%, insbesondere zumindest 95%.
Ferner sind weitere Ausführungsformen bereitgestellt, worin für einen Sekretionsfaktor eine Nucleinsäure mit zumindest 90% Homologie zur DNA-Sequenz von Seq.-ID Nr. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 32, 34 kodiert. Vorzugsweise beträgt die Homologie zumindest 95%, noch bevorzugter zumindest 98%. Die Homologie kann bestimmt werden, indem die beanspruchte Aminosäure oder DNA-Sequenz neben eine andere Sequenz gestellt und bestimmt wird, wie viele der Aminosäuren oder Nucleotide in Prozent gerechnet gleich sind. Die Homologie kann auch unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Sequenzanalyse-Softwareprogramms bestimmt werden, wie beispielsweise mithilfe des „TFastA Data Searching Program", das im Sequence Analysis Software Package Version 6.0 (Genetic Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705) erhältlich ist.
Nach homologen Sequenzen kann wie hierin beschrieben durch Hybridisierung oder unter Verwendung von PCR mit degenerierten Primern gesucht werden. Chen und Suttle, Biotechniques 18(4), 609–610, 612 (1995).
In mehreren Ausführungsformen der Erfindung werden außerdem Nucleinsäuren bereitgestellt, die unter stringenten Bedingungen mit der DNA aus den 1A–1B, 2A–2B, 3AA–3BB und 9, Seq.-ID Nr. 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 32, 34 bzw. 36 hybridisieren können. Stringente Hybridisierungsbedingungen umfassen stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen, wie sie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die Hybridisierung und geeignete stringente Bedingungen sind in Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben.
„Bakterien" umfassen Mikroorganismen der Klasse der Schizomyzeten. Bakterien können entweder gramnegativ oder grampositiv sein. Gramnegative Bakterien um fassen Mitglieder der folgenden Gattungen: Escherichia, Hemophilus, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Vibrio, Acinetobacter und Serratia. Grampositive Bakterien umfassen Mitglieder der folgenden Gattungen: Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptomyces, Lactobacillus und Lactococcus.
Gramnegative Bakterien können Pseudomonaden sein, d. h. Stämme, die Mitglieder der Gattung Pseudomonas sind. Beispiele umfassen Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas glumae, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fragi, Pseudomonas alcaligenes und Pseudomonas mendocina. Eine bevorzugt Pseudomonade ist Pseudomonas alcaligenes. Pseudomonas alcaligenes wird manchmal auch als Pseudomonas pseudoalcaligenes bezeichnet.
Lipasen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung umfassen solche, für die LipA kodiert, das im Allgemeinen in enger Verbindung zu einem als LipB,. LipH, LipX oder Lif bekannten Modulationsgen auftritt. Lif von Pseudomonas alcaligenes ist das Thema der Patentanmeldung WO 93/02617, wie weiter oben schon erwähnt wurde. LipA-Gene finden sich in verschiedenen Bakterienarten, wie beispielsweise Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas glumae, Pseudomonas fragi, Pseudomonas mendocina, Acinetobacter calcaoceticus und Serratia marcescans.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Expressionssystem bereit, das die Expression eines Proteins, vorzugsweise einer Lipase, regulieren kann. Das Expressionssystem umfasst eine Kinase, einen DNA-Bindungsregulator, eine Polymerase, einen Sigma-54-Promotor und eine stromauf liegende Aktivierungssequenz. Das Expressionssystem kann auch Sekretionsfaktoren umfassen.
Ein Expressionssystem umfasst ein oder mehrere Proteine) und/oder Nucleinsäure(n), die, wenn sie zusammenwirken, die Expression eines Proteins in einer Wirtszelle erhöhen. Das Expressionssystem kann auf einem oder mehreren Plasmiden kodiert sein und kann sich auf demselben Plasmid befinden wie das für das Protein von Interesse kodierende Gen oder auch nicht.
Die Bezeichnung „funktionell gebunden" oder „funktionell verbunden" bedeutet, dass die Regulationselemente (DNA oder Protein) physisch wechselwirken, um ihre Funktion auszuüben. Hierbei kann es sich um eine Protein-Protein-, DNA-Protein- oder DNA-DNA-Wechselwirkung handeln. Der DNA-Bindungsregulator wechselwirkt beispielsweise mit dem Promotor, aber dafür kodierende Gene können sich an unterschiedlichen Stellen auf dem Chromosom befinden. Als solches können sich Gene, die für die Elemente kodieren, auf anderen Plasmiden befinden als ein anderes solches Gen oder ein für das Protein von Interesse kodierendes Gen und noch immer zusammenarbeiten, um die Expression des Proteins zu regulieren.
Ein Plasmid ist ein Nucleinsäuremolekül, das kleiner ist als das Chromosom und sich unabhängig vom Mechanismus, der zur chromosomalen Replikation verwendet wird, replizieren kann. Typischerweise ist ein Plasmid ein ringförmiges DNA-Molekül. Plasmide können in Wirtszellen insertiert werden, wo sie sich replizieren und mehrere Kopien des Plasmids herstellen können; deshalb werden sie replizierende Plasmide genannt. Einige Plasmide, die integrierende Plasmide genannt werden, können die Plasmid-DNA in das Chromosom der Wirtszelle insertieren. Die Plasmid-DNA wird so in das Chromosom der Wirtszelle integriert. Wenn das geschieht, repliziert sich das Plasmid nicht länger autonom, sondern repliziert sich in Übereinstimmung mit dem Chromosom, in das es insertiert wurde. Während also ein nichtintegriertes Plasmid pro Chromosom in mehreren Dutzend Kopien vorhanden sein kann und sich unabhängig vom Chromosom replizieren kann, ist das integrierte Plasmid in einer Kopie pro Chromosom vorhanden und kann sich nur gemeinsam mit dem Chromosom replizieren.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle mit einem Plasmid, umfassend die Nucleinsäure, die für das Expressionssystem kodiert. Eine Wirtszelle ist eine Zelle, in die ein Plasmid gemäß vorliegender Erfindung durch beispielsweise Transformation insertiert werden kann. Die Wirtszelle ist vorzugsweise ein Bakterium. Ein einer Ausführungsform ist die Wirtszelle vorzugsweise ein gramnegatives Bakterium. In einer weiteren Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pseudomonade. Vorzugsweise ist die Wirtszelle Pseudomonas alcaligenes, und die Regulationselemente des Expressionssystems stammen von Pseudomonas alcaligenes. Die gleiche Wirtszelle kann mit einem weiteren Plasmid transformiert werden, das eine Nucleinsäure enthält, die für einen oder mehrere Sekretionsfaktoren kodiert. Vorzugsweise stammen die Sekretionsfaktoren von Pseudomonas alcaligenes.
Eine transformierte Wirtszelle ist eine Wirtszelle, in die ein oder mehrere Plasmide insertiert wurden. Eine Transformation kann stattfinden, indem zuerst die Wirtszelle kompetent gemacht wird, um das Plasmid aufzunehmen. Dann wird die nackte DNA direkt zu den Zellen zugesetzt, und einige der Zellen nehmen sie auf und replizieren oder integrieren sie. Eine Möglichkeit, die Zellen zur Aufnahme des Plasmids kompetent zu machen, besteht in einer Elektroporation, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben ist. Ein weiteres Verfahren, das zur Herstellung und zum Transfer von Cosmid-Bibliotheken geeignet ist, ist triparentale Kreuzung. Kelly-Wintenberg und Montie, J. Bacteriol. 171(11), 6357–62 (1989).
Gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Lipasen sind für verschiedene Anwendungen geeignet. Lipasen können in Detergenzien und anderen Reinigungsformulierungen sowie in zahlreichen industriellen Verfahren eingesetzt werden.
Experimenteller Teil
Materialien und Verfahren
Bakterienstämme
Alle Bakterienstämme wurden, sofern nicht anders angegeben, mit 2×TY als flüssiges oder festes Medium vermehrt und sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Bei P.-alcaligenes-Stämmen wurden zum Medium geeignete Antibiotika zugesetzt: Neomycin (10 mg/l), Tetracyclin (5 mg/l) und Chloramphenicol (3 mg/l); und bei transformiertem Escherichia coli wurden 100 mg/l Ampicillin zugesetzt. Bei Cosmid-hältigen Escherichia-coli-Stämmen wurde zum Medium Tetracyclin zugesetzt (10 mg/l). P. alcaligenes und E. coli wurden bei 37°C aerob gezüchtet.
Tabelle 1. Verwendete Bakterienstämme. Tet^R, gegen Tetracyclin resistent; Neoⁿ, gegen Neomycin resistent; Cap^R, gegen Chloramphenicol resistent; lip, Lipase
Tabelle 2 Verwendete Plasmide
Extraktion von extrachromosomaler DNA
Cosmid- und Plasmidisolationen wurden an 1-ml-Übernachtkultur unter Verwendung des QIAprep-Spin-Plasmid-Sets und an 100-ml-Kulturisolationen unter Verwendung des QIAfilter-Plasmid-Midi-Sets (beide von Qiagen) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Bei Pseudomonas-Stämmen wurde Lysozym (10 ul/ml) zum Resuspensionsgemisch zugesetzt und 5 min lang bei 37°C inkubiert, um die Zelllyse zu unterstützen. Cosmid-DNA wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers aus den QIAprep-Säulen mit 70°C heißem milliQ-Wasser eluiert. Für die Cosmid-Isolation aus 100-ml-Kulturen wurden Stämme über Nacht in einer Luria-Bertani-(LB-) Kulturlösung gezüchtet, und der Elutionspuffer wurde auf 50°C erhitzt.
Transformation von Pseudomonas alcaligenes
Eine Übernachtkultur von P. alcaligenes wurde 1 : 100 mit einem frischen 2×TY-Medium (mit 10 mg/l Neomycin) verdünnt, und die Kultur wurde in einem Rundschüttler bei 37°C inkubiert, bis sie eine OD₅₅₀ von 0,6–0,8 erreichte. Nach einer Zentrifugation (10 min bei 4.000 U/min) wurde das Bakterienpellet zweimal mit einem halben Volumen SPM-Medium (276 mM Saccharose; 7 mM NaHPO₄ (pH 7,4); 1 mM MgCl₂) gewaschen. Die Zellen wurden dann in einem 1 : 100-Volumen SPM-Medium resuspendiert. Cosmid-DNA und 40 μl Zellen wurden vermischt und auf eine Elektroporationsküvette mit 2 mm Abstand übertragen (BTX). Die Zellen wurden mit 1,4 kV, 25 μF, 220 Ω im Gene Pulser elektroporiert. Die Elektroporationsküvette wurde mit 1 ml 2×TY-Medium ausgewaschen, und das Zellengemisch wurde in eine saubere 1,5-ml-Eppendorf gegeben. Das Transformationsgemisch wurde dann 45 min lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 μl auf 2×TY-Agar ausplattiert, das mit Tetracyclin (5 mg/l) oder Neomycin (10 mg/l) oder beidem ergänzt war (je nachdem, welcher P.-alcaligenes-Stamm für die Elektroporation verwendet wurde). Die Transformation der P.-alcaligenes-Zellen wurde bei Raumtemperatur durchgeführt.
Transformation von Escherichia coli
Die Transformation der E.-coli-Wk6-Zellen wurde unter Verwendung von Elektroporation durchgeführt. Die Übertragung der Cosmide auf E.-coli-K802-Zellen wurde durch Infektion gemäß den Anleitungen des Herstellers (Promega Corporation) durchgeführt.
Beispiel 1
Konstruktion einer Cosmid-Bibliothek aus
Pseudomonas-alcaligenes-DNA in E. coli
Chromosomale DNA, die aus P. alcaligenes isoliert worden war, wurde wie oben im Abschnitt über die Materialien und Verfahren beschrieben fraktioniert und in Cosmid pLAFR3 ligiert. Nach der Ligation wurde das Gemisch wie beschrieben in E. coli transferiert. Tetracyclin-resistente Kolonien wurden isoliert, und aus jeder Kolonie wurde Cosmid-DNA präpariert.
Beispiel 2
Transformation einer P.-alcaligenes-Cosmid-Bibliothek in P. alcaligenes, die Lipase überexprimieren
Insgesamt wurden 531 Plasmid-DNA-Präparate aus in E. coli gezüchteten Cosmiden isoliert. Mithilfe von Elektroporation (siehe Verfahren oben) wurden diese in den Stamm Lip34, ein P.-alcaligenes-Stamm mit Plasmid p24Lipo1, der Lipase exprimiert, transformiert, was zu 485 Cosmid-hältigen P.-alcaligenes-Stämmen führte. Zur Transformation wurden die beschriebenen Verfahren verwendet.
Beispiel 3
Selektion von die Lipasenexpression stimulierenden Cosmiden
Insgesamt wurden 485 Cosmide transformiert, wonach Cosmid-hältige P.-alcaligenes-Stämme auf ihre Lipasenproduktionsaktivität gescreent wurden. Zwanzig Cosmidstämme wurden selektiert, die, wie sich in verschiedenen Flüssigkeits- und Plattentests zeigte, eine bedeutende Erhöhung der Lipasenexpression aufwiesen (siehe Tabelle 3). Die entsprechenden Cosmide wurden auch in einem Einzelkopie-Lipasenstamm getestet, und manche von ihnen wiesen eine dreifache Erhöhung der Lipasenexpression auf. Die vier besten Cosmide wiesen ein gemeinsames Überlappungsfragment mit 5,6 kb auf. Die Lipasenstimulationswirkung wurde auf einem 4,5 kb großen Fragment von Cosmid Nr. 71, Nr. 201, Nr. 505 und Nr. 726 lokalisiert. Eine Sequenzanalyse dieses Fragments ergab zwei offene Leseraster, die Homologie zu Zweikomponentenregulationssystemen aufwiesen (siehe 4A–4G). Die Erfinder nannten diese Gene lipQ, lipR und orfZ. Es gilt anzumerken, dass im Lactat-Test (zweite Spalte in Tabelle 3) von den vier beschriebenen Cosmidstämmen nur Stämme mit den Cosmiden Nr. 71, 505 und 726, welche das vervollständigte OrfZ aufwie sen, die im Vergleich zum Stamm mit Cosmid Nr. 201 höchste Lipasenstimulation erreichten.
Tabelle 3
Beispiel 4
Beweis für die Mitwirkung von LipQ/LipR an der Lipasenexpression
Um die Rolle des lipQ/lipR-Operons zu bewerten, wurde eine Inaktivierung durch Insertion am LipR-ORF im Chromosom des Stamms PS93 durchgeführt. Die resultierende Mutante Ps1108 wies im Vergleich zu PS93 einen bedeutend verringerten Haloeffekt auf Tributyrinagarplatten auf.
In einem zweiten Versuch wurde das Lipasenexpressionsplasmid p241ipo1 in den Stamm Ps1108 eingebracht. Die Lipasenexpression war im Vergleich zu PS93, der p241ipo1 enthielt, deutlich beeinträchtigt.
Diese Beobachtung lässt vermuten, dass das lipQ/lipR-Operon ein Lipasenregulationsprotein ist.
Beispiel 5
Konstruktion und Charakterisierung eines LipQ/LipR überexprimierenden P.-alcaligenes-Stamms
Das 4,5 kb großes EcoRI-HindIII-Fragment von einem der vier lipasenstimulierenden Cosmide (Nr: 201) wurde auf pLAFR3 subkloniert und in einen P.-alcaligenes-Stamm mit einem einzelnen Lipasengen auf dem Chromosom (Ps537) insertiert. Nach einer 10-l-Fermentation wurde eine dreifach höhere Lipasenausbeute beobachtet (siehe 5).
Danach wurde das 4,5 kb große EcoRI-HindIII-Fragment in das Lipasenexpressionsplasmid p241ipo1 insertiert. Eine höhere Lipasenexpression trat auf, wie aus der Halo-Größe auf Tributyrinplatten geschlossen werden konnte. Während des Wachstums in einem Schüttelkolben wurde Plasmidinstabiltiät beobachtet. Um diese Instabilität zu überwinden, wurde das Fragment auch in das Chromosom integriert, was in einem Stamm mit 2 lipQ/lipR-Genkopien im Chromosom (Stamm Ps1084) resultierte. Die Insertion des Lipasenexpressionplasmids p24Lipo1 in diesen Stamm führte zu einer höheren Lipasenexpression auf der Platte, aber zu einer Plasmidinstabilität während der Fermentation.
Beispiel 6
Wirkung von Cosmid Nr. 600 auf die Stabilität des Produktionsplasmids in Ps1084
Ein P.-alcaligenes-Stamm wurde entwickelt, in dem eine zweite Kopie von lipQ-R in das Chromosom integriert wurde. Als ein Lipasenproduktionsplasmid (Plasmid p24Lipo1) in hoher Kopienzahl (20) in Ps1084 eingebracht und der Stamm fermentiert (10 Liter) wurde, wurde Plasmidinstabilität beobachtet. Ein Versuch mit einem Schüttelkolben wurde entwickelt, um die Situation im Fermentor nachzustellen. Um die Produktionsplasmidstabilität und Cosmidstabilität von transformiertem Ps1084 zu überwachen, wurde ein eine Woche dauerndes Schüttelkolbenexperiment durchgeführt. Nachdem sie über Nacht in 10 ml 2×TY-Kulturlösung (ergänzt mit der erforderlichen Menge Neomycin und Tetracyclin) gezüchtet worden war, wurden 1 ml transformierte Kultur verwendet, um 100 ml Fermentationsmedium 380 plus 200 μl Sojaöl in Rundschüttlern zu beimpfen. Die beimpften Schüttelkolben wurden 24 Stunden lang bei 37°C in einem Rundschüttler inkubiert. 1 ml der 24 h alten Kultur wurde dann verwendet, um die folgenden Schüttelkolben zu inokulieren. Während der gesamten Dauer des Versuchs wurden täglich Proben entnommen. Die Gegenwart eines Neomycin-Markers auf dem Lipasenproduktionsplasmid wurde verwendet, um die Plasmidstabilität zu überwachen. Der integrierte lipQ-R-Stamm mit der hohen Kopienzahl eines Lipasenproduktionsplasmids (Ps1084) wurde mit Cosmid Nr. 600 transformiert, um zu sehen, ob die Plasmidstabilität verbessert wurde.
6 ist ein Diagramm, das die Produktionsplasmidstabilität im transformierten und untransformierten Ps1084 zeigt (in doppelter Ausführung). Nach 3 – 4 Tagen wurde Plasmidinstabiltät in Ps1084 detektiert, die als ein 80%iger Abfall in gegen Neomycin resistenten Kolonien beobachtet wurde. Während des 1 Woche dauernden Experiments behielt das mit Cosmid Nr. 600 transformierte Ps1084 einen hohen Grand an Resistenz gegen Neomycin bei, was darauf schließen lässt, dass Cosmid Nr. 600 das Produktionsplasmid stabilisiert.
Beispiel 7
Charakterisierung von Cosmid Nr. 600
Cosmid Nr. 600 gab ein positives Signal, als eine PCR unter Verwendung von xcpR-Primern basierend auf Peptiden von xcpR von Pseudomonas aeruginosa durchgeführt wurde. Die DNA-Sequenz von Cosmid Nr. 600 wurde mit EcoRV verdaut, und das resultierende Fragmentgemisch und gereinigte Fragmente wurden unter Verwendung des Rapid-DNA-Ligation-Sets (Boehringer Mannheim) mit SmaI-verdautem pUC19 (Appligene) ligiert. Dann wurden E.-coli-Zellen elektroporiert. Transformanten wurden auf 2×TY-Platten selektiert, die Ampicillin (100 mg/l), X-Gal (Boehringer Mannheim; 40 mg/l) und IPTG (Gibco BRL; 1 mM) enthielten. Transformanten, welche das rekombinante Plasmid enthielten, wurden als weiße Kolonien identifiziert, und einzelne Kolonien wurden auf frische 2×TY-Agarplatten (mit Ampicillin) gestrichen, um sie zu reinigen.
Eine Sequenzierung der PCR-Produkte; DNA von Cosmid Nr. 600 und Subklonen von Cosmid Nr. 600 (siehe oben) wurde durch das „Dye-Deoxy-Termination"-Verfahren erreicht, wobei das „ABI PRISM^TM Dye Termination Cycle Sequencing Ready Reaction"-Set mit AmpliTaq®-DNA-Polymerase, FS (Perkin Elmer) zusammen mit dem 373A-Sequenator von Applied Biosystems verwendet wurde.
Die Sequenzierung von Cosmid Nr. 600 wurde mit den Primern initiiert, die in der PCR zur Detektion von xcpR verwendet wurden. In Übereinstimmung mit der Restriktionskarte von Cosmid Nr. 600 (8) wurde eine EcoRV-Restriktionsstelle in der Nucleinsäuresequenz des PCR-Produkts identifiziert. Eine Sequenzanalyse ergab, dass das Amplifikationsprodukt aus 609 bp zu einer vermeintlichen Aminosäuresequenz mit 89% Homologie zu P.-aeruginosa- und 73% zu P.-putida-XcpR-Proteinen (Aminosäurereste 59–262) translatiert werden könnte, wodurch verifiziert wird, dass das xcpR-Gen durch PCR identifiziert wurde.
8 zeigt die Karte von Cosmid Nr. 600. Durch die Durchführung einer PCR-Reaktion mit verdauter DNA konnten die Erfinder die Position von xcpR auf dem Insert ableiten. Die Position des xcpR-Gens lässt vermuten, dass das gesamte Xcp-Operon in Cosmid Nr. 600 vorhanden ist.
Bis heute wurden 17.612 Nucleotide, einschließlich xcpP, xcpQ, orfV, orfX, xcpR, xcpS, xcpT, xcpQ, xcpV, xcpW, xcpR, xcpP, xcpZ und ein Teil des Proteins OrfY, sequenziert (3AA–3BB, Seq.-ID Nr. 29).
Die Erfindung wurde zwar unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben, es versteht sich jedoch, dass weitere Modifikationen daran vorgenommen werden können und dass diese Anmeldung jegliche Variationen oder Adaptationen der Erfindung einschließt, die im Allgemeinen gemäß den Prinzipien der Erfindung durchgeführt werden, wozu auch Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung gehören, die innerhalb bekannter oder herkömmlicher Praxis auf dem Gebiet der Erfindung liegen, auf wesentliche, hierin beschriebene Merkmale angewandt werden können und innerhalb des Schutzumfangs der beiliegenden Ansprüche liegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Expressionsvektor, umfassend: (i) Nucleinsäure, die für eine Kinase kodiert, worin die Nucleinsäure die in Seq.-ID Nr. 1 dargelegte Sequenz aufweist oder Nucleinsäure ist, die zumindest 50 Identität mit der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegten DNA aufweist, und (ii) Nucleinsäure, die für einen DNA-Bindungsregulator kodiert, worin die Nucleinsäure die in Seq.-ID Nr. 3 dargelegte Sequenz aufweist oder Nucleinsäure ist, die zumindest 50% Identität mit der in Seq.-ID Nr. 3 dargelegte DNA aufweist, worin die Kinase, für die von (i) kodiert wird, zur Katalyse des Transfers eines Phosphats auf den Bindungsregulator, für den von (ii) kodiert wird, fähig ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, der außerdem einen Promotor und eine stromauf liegende Aktivierungssequenz umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die für die Kinase kodierende Nucleinsäure die in Seq.-ID Nr. 1 dargelegte Sequenz aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der DNA-Bindungsregulator die in Seq.-ID Nr. 3 dargelegte Sequenz aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, worin die für die stromauf gelegene Aktivierungssequenz kodierende Nucleinsäure die in Seq.-ID Nr. 5 dargelegte Sequenz aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, worin der Promotor ein Sigma-54-Promotor ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 6, worin der Sigma-54-Promotor von Pseudomonas alcaligenes stammt.
Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der außerdem Nucleinsäure umfasst, die für zumindest einen Sekretionsfaktor kodiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 8, worin der Sekretionsfaktor aus der aus XcpP, XcpO, OrfV, OrfX, XcpR, XcpS, XcpT, XcpU, XcpV, XcpW, XcpX, XcpY und XcpZ bestehenden Gruppe ausgewählt ist, für welche die Seq.-ID Nr. 12, 14, 30, 16, 6, 8, 10, 18, 20, 22, 24, 26 bzw. 32 kodieren.
Expressionsvektor nach Anspruch 8, worin der Sekretionsfaktor OrfY ist und die dafür kodierende Nucleinsäure Seq.-ID Nr. 34 umfasst.
Plasmid, das einen Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst.
Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle, umfassend das Zusetzen des Plasmids nach Anspruch 11 zu Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Wirtszellen Bakterien sind.
Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle, umfassend das Zusetzen eines einen Expressionsvektor nach Anspruch 9 umfassenden Plasmids zu Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Wirtszellen Bakterien sind.
Transformierte Wirtszelle, die einen Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 16, worin die Wirtszelle ein Bakterium ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 17, worin das Bakterium eine Pseudomonade ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, 2 oder 8, der außerdem für ein Protein kodierende Nucleinsäure umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 19, worin das Protein ein Enzym ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 20, worin das Enzym eine Esterase, Hydrolase, Isomerase, Mutase, Transferase, Kinase oder Phosphatase ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 20, worin das Enzym eine Lipase ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 19, worin das Protein ein Wachstumsfaktor, Cytokin, Ligand, Rezeptor oder Inhibitor, Impfstoff oder Antikörper ist.
Verwendung eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 19 bis 23 zur Produktion und Sekretion des Proteins in einer Wirtszelle.