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Verwandte
Anmeldungen
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Diese
Anmeldung ist eine Änderungsanmeldung
(„continuation
in part") zur US-Seriennummer 08/699.092
vom 16. August 1996, die in ihrer Gesamtheit durch Verweis hierin
aufgenommen ist.
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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung der Lipasenregulationskaskade
Pseudomonas alcaligenes. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung
die Nucleinsäure-
und Aminosäuresequenzen
verschiedener Komponenten der Lipasenregulationskaskade bereit,
die in Expressionsverfahren und -systemen verwendet werden kann,
die auf die Produktion von heterologen Proteinen ausgerichtet sind.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Isolation und Identifikation eines Mikroorganismus, der von Natur
aus ein Produkt sekretieren kann, das möglicherweise zur industrielle
Produktion geeignet ist, ist einer der wichtigsten, wenn nicht der
entscheidenste Schritt im fermentationsbiotechnologischen Verfahren.
Die Fähigkeit,
das Protein von Interesse zu sekretieren, ermöglicht üblicherweise einfaches Downstream-Processing.
Der nächste
entscheidende Schritt ist die Mutagenese eines natürlich vorkommenden
Stamms zu einem hyperproduzierenden Stamm. Im Laufe einiger Jahre
haben Wissenschaftler Screening-Strategien entwickelt, durch die
eine Reihe von Exoprotein produzierenden Bakterien isoliert wurde.
Nach der Isolation können
zahlreiche Mutagenesedurchgänge durchgeführt werden,
um kontinuierlich höher
produzierende Stämme
zu selektieren. Die klassische Stammverbesserung kann jedoch nicht
unbegrenzt eingesetzt werden, um die Produktionswerte zu erhöhen. Daher wird
ein direkteres Verfahren zur Charakterisierung und molekulargenetischen
Manipulation gebraucht, um höhere
Produktionswerte zu erreichen.
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In
verschiedenen Patenten und Veröffentlichungen
wurde ein Lipasenmodulatorgen beansprucht oder beschrieben (WO 94/02617;
EP 331.376 ; Nakanishi et
al., Lipases-Struct. Mech. Genet. Eng., GBF Monographs 16, 263–266 (1991)).
Spätere
Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass das Produkt des Gens,
das lif genannt wird, eher mit der Faltung der Lipase zusammenhängt als
mit der Regulation der Expression der Lipase. Eine Übersicht über verschiedene
Lipasenexpessionssysteme unter Verwendung des lif-Genprodukts findet
sich in Jaeger et al., FEMS Microbiol. Rev. 15, 29–63 (1994).
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In
einer weiteren Veröffentlichung
werden der Sigma-54-Promotor und die Genarten besprochen, die angeblich
von dieser Promotorart kontrolliert werden. Morrett und Segovia,
J. Bacter. 175, 6067–6074
(1993).
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Die
Suche nach einem Expressionssystem, mit dem ein heterologes Protein,
vor allem eine Lipase in Pseudomonas, insbesondere Pseudomonas alcaligenes,
effizient exprimiert werden kann, wurde fortgesetzt. Die Expression
von Lipase in Pseudomonas ist sehr schwierig und bringt häufig niedrigere
Ergebnisse als von der Industrie gewünscht.
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Die
vorliegende Erfindung löst
das Problem der geringen Expression von Proteinen in Pseudomonas sowie
in anderen mikrobiellen Wirten.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung einer Regulationskaskade
der Pseudomonas-Lipase und stellt einzelne Komponenten der Regulationskaskade
bereit, die in Expressionssystemen zur Produktion und Sekretion
von Proteinen in Wirtszellen verwendet werden können. Die Regulationskaskade
umfasst überraschenderweise
einen Zweikomponententeil, der einen Kinase und einen DNA-Bindungsregulator
umfasst. Die beiden Komponenten arbeiten mit einem Promotor und
einer stromaufwärts
liegenden Aktivierungssequenz zusammen, um ein Protein effizient
zu exprimieren. Die Regulationskaskade umfasst ferner Sekretionsfaktoren,
die in Wirtszellen verwendet werden können, um die Sekretion von
produzierten Proteinen zu erhöhen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen
für die
verschiedenen Komponenten der Regulationskaskade der Pseudomonas-alcaligenes-Lipase
bereit. Ferner stellt die vorliegende Erfindung auch neue, effiziente
Expressionssysteme, d. h. Expressionsvektoren, und Wirtszellen bereit,
die zur erhöhten
Expression von Proteinen verwendet werden können. Die neuen Expressionssysteme
ermöglichen die
erhöhte
Expression eines Proteins, dessen Gen funktionell an Komponenten
des Expressionssystems gebunden ist, d. h. an Komponenten der Lipasenregulationskaskade.
So kann ein hyperproduzierender Stamm entwickelt und kommerziell
verwendet werden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die für eine Kinase
kodiert und die Expression eines Proteins, vorzugsweise. einer Lipase,
regulieren kann. Die für
eine Kinase kodierende Nucleinsäure
stammt vorzugsweise von gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise
einer Pseudomonade, vorzugsweise Pseudomonas alcaligenes, und ist
insbesondere bevorzugt lipQ. Weiters weist die für die Kinase kodierende Nucleinsäure vorzugsweise
die in 1A–1B dargestellte
Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 1) und/oder weist zumindest 50% Homologie
zu dieser Sequenz auf. Das Kinase-Protein wird ebenfalls bereitgestellt
und stammt vorzugsweise von einem Bakterium, vorzugsweise einem
gramnegativen Bakterium, wie beispielsweise einer Pseudomonade,
und noch bevorzugter stammt die Kinase von Pseudomonas alcaligenes.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Kinase LipQ. Die Kinase weist vorzugsweise die in 1A–1B dargestellte
Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 2) und/oder oder weist zumindest 50% Homologie zu
dieser Sequenz auf.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung eine Nucleinsäure bereit, die für eine Kinase
kodiert und die Expression einer Lipase in Pseudomonas alcaligenes
regulieren kann. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende
Erfindung eine Kinase bereit, die zur Regulierung der Expression einer
Lipase in Pseudomonas alcaligenes fähig ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die für einen
DNA-Bindungsregulator kodiert und die Expression eines Proteins,
vorzugsweise einer Lipase, regulieren kann. Die DNA-Bindungsregulator-Nucleinsäure ist
vorzugsweise lipR. Ferner weist sie vorzugsweise die in 2A–2B dargestellte Sequenz auf (Seq.-ID Nr.
3) und/oder weist zumindest 50% Homologie zu dieser Sequenz auf.
Das DNA-Bindungsregulator-Protein wird ebenfalls bereitgestellt
und ist vorzugsweise LipR. Der DNA-Bindungsregulator weist vorzugsweise
die in 2A–2B dargestellte
Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 4) und/oder weist zumindest 50% Homologie
zu dieser Sequenz auf. Vorzugsweise stammt der DNA-Bindungsregulator
von einem Bakterium. Noch bevorzugter stammt der DNA-Bindungsregulator
von einem gramnegativen Bakterium, wie beispielsweise einer Pseudomonade.
Insbesondere bevorzugt ist ein DNA-Bindungsregulator von Pseudomonas
alcaligenes.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nucleinsäure bereit, die
für einen
DNA-Bindungsregulator kodiert, die die Expression einer Lipase in
Pseudomonas alcaligenes regulieren kann. In einer weiteren Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung einen DNA-Bindungsregulator selbst
bereit.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird eine Nucleinsäure
bereitgestellt, die für
einen Teil einer Polymerase kodiert und die Expression eines Proteins,
vorzugsweise einer Lipase, regulieren kann. Die Polymerase-Nucleinsäure ist
vorzugsweise orfZ. Ferner weist sie vorzugsweise die in 9A–9B dargestellte
Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 36) und/oder weist zumindest 75% Homologie
zu dieser Sequenz auf. Ein Teil des Polymerase-Proteins wird ebenfalls
bereitgestellt und ist vorzugsweise OrfZ. Das Polymerase-Protein weist
vorzugsweise die in 9A–9B dar gestellte
Sequenz auf (Seq.-ID Nr. 37) und/oder weist zumindest 75% Homologie
zu dieser Sequenz auf. Vorzugsweise stammt die Polymerase von einem
gramnegativen Bakterium, wie beispielsweise einer Pseudomonade.
Insbesondere bevorzugt ist Polymerase von Pseudomonas alcaligenes.
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In
einer weiteren Ausführungsform
sind die Kinase, der DNA-Bindungsregulator und ein Teil der Polymerase
in einer Nucleinsäure
vorhanden. In einer weiteren Ausführungsform weisen die Kinase,
der DNA-Bindungsregulator und die Polymerase die in 4A–4G dargestellte Sequenz auf (Seq.-ID Nr.
28).
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die für einen
Sigma-54-Promotor von Pseudomonas alcaligenes kodiert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die für eine stromauf
liegende Aktivierungssequenz von Pseudomonas alcaligenes kodiert.
Die stromauf liegende Aktivierungssequenz ist vorzugsweise UAS.
Ferner weist sie vorzugsweise die in Seq.-ID Nr. 5 dargestellte
Sequenz auf und/oder weist zumindest 50% Homologie zu dieser Sequenz
auf. Vorzugsweise stammt die stromauf liegende Aktivierungssequenz
von einem Bakterium. Noch bevorzugter stammt die stromauf liegende
Aktivierungssequenz von einem gramnegativen Bakterium, wie beispielsweise
einer Pseudomonade. Insbesondere bevorzugt ist eine stromauf liegende
Aktivierungssequenz von Pseudomonas alcaligenes.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden isolierte Nucleinsäuren bereitgestellt, die für Sekretionsfaktoren
kodieren. Die Sekretionsfaktoren sind vorzugsweise XcpP, XcpQ, OrfV,
OrfX, XcpR, XcpS, XcpT, XcpU, XcpV, XcpW, XcpX, XcpP, XcpZ oder
ein anderes Protein, OrfY, mit der in Seq.-ID Nr. 35 dargestellten
C-terminalen Aminosäuresequenz.
Ferner weisen sie vorzugsweise die in Seq.-ID Nr. 12, 14, 30, 16, 6,
8, 10, 18, 20, 22, 24, 26, 32 bzw. 34 dargestellte Nucleinsäuresequenz
auf und/oder weisen zumindest 90% Homologie zu dieser Sequenz auf.
Die Sekretionsfaktor-Proteine werden ebenfalls bereitgestellt und
weisen vorzugs weise die in Seq.-ID Nr. 13, 15, 31, 17, 7, 9, 11,
19, 21, 23, 25, 27, 33 bzw. 35 dargestellte Aminosäuresequenz
auf und/oder weisen zumindest 90% Homologie zu dieser Sequenz auf.
Vorzugsweise stammen die Sekretionsfaktoren von Bakterien. Noch
bevorzugter stammen die Sekretionsfaktoren von gramnegativen Bakterien,
wie beispielsweise Pseudomonaden. Insbesondere bevorzugt sind Sekretionsfaktoren
von Pseudomonas alcaligenes.
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In
einer weiteren Ausführungsform
sind die Gene, die für
die Sekretionsfaktoren XcpP, XcpQ, OrfV, OrfX, XcpR, XcpS, XcpT,
XcpU, XcpV, XcpW, XcpY, XcpX und OrfY kodieren, in einer Nucleinsäure mit
der in 3AA–3BB dargestellten
DNA-Sequenz (Seq.-ID
Nr. 29) vorhanden. Die beiden xcp-Gencluster, xcpP~Q und xcpR~Z,
sind in entgegengesetzter Richtung zwischen OrfV und OrfX angeordnet,
wie in 8 zu sehen ist.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung umfasst eine isolierte Nucleinsäure, die für ein lux-Box-Bindungselement
und orfV-Box-Bindungselemente von Pseudomonas alcaligenes kodieren,
welche die Expression eines Proteins regulieren können.
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Eine
weitere Ausführungsform
stellt Nucleinsäuren
bereit, die unter äußerst stringenten
Bedingungen an die in Seq.-ID Nr. 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,
20, 22, 24, 26, 30, 32, 34 und 36 dargestellten Nucleinsäure hybridisieren
können.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird ein Expressionssystem bereitgestellt, das ein Gen, das für ein funktionell
an Nucleinsäuren,
die für
eine Kinase kodieren, gebundenes Protein kodiert, einen DNA-Bindungsregulator,
eine Polymerase, einen Promotor und eine stromauf liegende Aktivierungssequenz
umfasst. Das Expressionssystem kann auch Sekretionsfaktoren und
ihre regulatorischen Regionen umfassen. Vorzugsweise stammen die
Regulationselemente und die Sekretionsfaktoren von Bakterien. Noch
bevorzugter stammen die Regulationselemente und die Sekretionsfaktoren
von gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise einer Pseudomonade.
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Insbesondere
bevorzugt sind Regulationselemente und Sekretionsfaktoren von Pseudomonas
alcaligenes.
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Eine
weitere Ausführungsform
stellt ein Expressionssystem bereit, das die Expression einer Lipase
in Pseudomonas alcaligenes regulieren kann.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden replizierende Plasmide und integrierende Plasmide
bereitgestellt, die das Expressionssystem oder eine für einen
oder mehrere der Sekretionsfaktoren kodierende Nucleinsäure enthalten.
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Ferner
werden Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle mit einem Plasmid,
welches das Expressionssystem und/oder eine für einen oder mehrere Sekretionsfaktoren
kodierende Nucleinsäure
enthält,
sowie transformierte Wirtszellen bereitgestellt, die das Expressionssystem
und/oder eine für
einen, oder mehrere Sekretionsfaktoren kodierende Nucleinsäure enthalten.
Eine Wirtszelle wird transformiert, indem das Plasmid unter geeigneten
Bedingungen in die Wirtszelle insertiert wird. Vorzugsweise wird
die Wirtszelle elektroporiert, damit das Plasmid in die Wirtszelle
eindringen kann. Die Wirtszelle ist vorzugsweise ein Bakterium.
Noch bevorzugter ist die Wirtszelle ein gramnegatives Bakterium,
wie beispielsweise eine Pseudomonade. Noch bevorzugter ist die Wirtszelle
Pseudomonas alcaligenes.
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Kurzbeschreibung
der Abbildungen
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1A–1B zeigen
die DNA- (Seq.-ID Nr. 1) und Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 2)
der LipQ von Pseudomonas alcaligenes.
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2A–2B zeigen die DNA- (Seq.-ID Nr. 3) und
Aminosäuresequenzen
(Seq.-ID Nr. 4) der LipR von Pseudomonas alcaligenes.
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3AA–3BB zeigen die DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr.
29) aus 17,612 bp, beginnend vom Insert auf Cosmid Nr. 600, das
die Sekretionsfaktoren XcpQ, XcpP, OrfV, OrfX, XcpR, XcpS, XcpT,
XcpU, XcpV, XcpW, XcpX, XcpY, XcpZ und einen Teil eines anderen
Proteins OrfY von Pseudomonas alcaligenes umfasst. Die vorhergesagten
Aminosäuresequenzen
der offenen Leseraster (Seq.-ID Nr. 13, 15, 31, 17, 7, 9, 11, 19,
21, 23, 25, 27, 33 bzw. 35) sind durch Einbuchstabencodes unter
der DNA-Sequenz
angeführt.
Auf ähnliche
Weise sind die Terminatorsequenzen in Form von zwei dicken, aufeinander
zeigenden Pfeilen und die Bindungselemente für den Regulator, OrfV (orfV-Boxen),
in Form von dicken, abgegrenzten Linien dargestellt.
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4A–4G zeigen die DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr.
28) des überlappenden
4.377 bp langen Fragments von Cosmid Nr. 71, Nr. 201, Nr. 505 und
Nr. 725, das die offenen Leseraster von LipQ, LipR und eines Teils von
OrfZ von Pseudomonas alcaligenes umfasst. Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen
der offenen Leseraster (Seq.-ID Nr. 2, 4 bzw. 37) sind durch Einbuchstabencodes
unter der DNA-Sequenz angeführt.
Auf ähnliche
Weise sind die Terminatorsequenz in Form von zwei dicken, aufeinander
zeigenden Pfeilen und das Bindungselement für Autoinduktoren (lux-Box)
und das Bindungselement für
OrfV (orfV-Boxen) in Form einer dicken, abgegrenzten Linien dargestellt.
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5 zeigt
die Wirkung von Cosmid Nr. 505 auf die Lipasenproduktion im 10-Liter-Maßstab. Nach
einer Fermentation wurde eine dreifach höhere Lipasenausbeute erzielt.
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6 zeigt
die Stabilität
des Produktionsplasmids im Produktionsstamm Ps1084 und Ps1084 +
Cosmid Nr. 600, bestimmt durch Neomycinresistenz.
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7 zeigt
das theoretische Schema der Wirkung von LipQ, LipR, des Sigma-54-Promotors und der stromauf
liegenden Aktivierungssequenz auf dem für LipR kodierenden DNA-Strang.
Das kleine Rechteck auf dem DNA-Strang unter der D-Domäne von LipR
ist die stromauf liegende Aktivierungssequenz (UAS).
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8 zeigt
die Ausrichtung der xcp-Gene von Pseudomonas alcaligenes auf der
Karte von Cosmid Nr. 600, entnommen aus Seq.-ID Nr. 29.
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9A–9B zeigen
die DNA (Seq.-ID Nr. 36) und Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 37)
von OrFZ von Pseudomonas alcaligenes.
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10 zeigt das vorgeschlagene Modell für die Regulationskaskade
der Lipase von Pseudomonas alcaligenes.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Um
die Lipasenexpression in Pseudomonas alcaligenes weiter zu verbessern,
wurde eine pragmatische Suche nach Begrenzungsfaktoren gestartet.
Eine Cosmid-Bibliothek
des P.-alcaligenes-Genoms vom Wildtyp wurde als Donor von DNA-Fragmenten verwendet,
die in einen Lipasenproduktionsstamm von P. alcaligenes mit hoher
Kopienzahl insertiert werden sollten. Insgesamt wurden 485 Cosmide
transformiert, wonach die Cosmide, die P.-alcaligenes-Stämme enthielten,
auf ihre Lipasenproduktionsaktivität gescreent wurden. Zwanzig
Cosmid-Stämme
wurden selektiert, von denen jeder eine bedeutende Verbesserung
der Lipasenexpression aufwies, wie sich in verschiedenen Flüssigkeits-
und Plattentests zeigte. Die entsprechenden Cosmide wurden auch
in einem Einzelkopie-Lipasenstamm getestet, und einige davon wiesen
eine dreifache Erhöhung
der Lipasenexpression auf. Die vier besten Cosmide wiesen alle ein Überlappungsfragment
mit 5,6 kb auf. Die Lipasenstimulationsaktivität wurde auf einem 4,5 kb großen Fragment
lokalisiert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung einer Regulationskaskade
einer Pseudomonas-alcaligenes-Lipase, die mehrere Komponente umfasst,
die mit der Expression von Lipase zu tun haben. Die Bezeichnung „Regulationskaskade" bezieht sich hierin
auf den gesamten Komplex von einzelnen hierin identifizierten Komponenten,
wie beispielsweise Kinase, DNA-Bindungsregulator, Polymerase, UAS,
lux-Box, orfv-Boxen,
Sekretionsfaktoren und ihre regulatorischen Regionen. Komponen ten
der Regulationskaskade können
alleine oder in Kombination mit anderen Komponenten verwendet werden,
um die Expression von Proteinen in Wirtszellen zu modulieren. In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle ein gramnegativer Wirt. In einer weiteren Ausführungsform
ist die Wirtszelle eine Pseudomonade. In einer weiteren Ausführungsform
ist die Wirtszelle Pseudomonas alcaligenes.
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Bevorzugte
gewünschte
Proteine zur Expression umfassen Enzyme, wie beispielsweise Esterasen; Hydrolasen,
einschließlich
Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen,
wie beispielsweise Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen;
Transferasen, Kinasen und Phosphatasen. Die Proteine können therapeutisch
von Bedeutung sein, beispielsweise Wachstumsfaktoren, Cytokine, Liganden,
Rezeptoren und Inhibitoren sowie Vakzinen und Antikörper. Die
Proteine können
auch kommerziell von Bedeutung sein, wie beispielsweise Proteasen,
Carbohydrasen, wie z. B. Amylasen und Glucoamylasen, Cellulasen,
Oxidasen und Lipasen. Das für
das Protein von Interesse kodierende Gen kann ein natürlich vorkommendes
Gen, ein mutiertes Gen oder ein synthetisches Gen sein.
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Das
4,5-kb-Fragment wurde sequenziert, und es zeigte sich, dass es für LipQ,
LipR und Polymerase-Proteine kodiert (4A–4G). Ohne sich auf eine bestimmte Theorie
festzulegen, wird angenommen, dass diese Proteine bei der Regulierung
des Sigma-54-Promotors vor der Lipasen- (LipR) und der Lipasenmodulator-
(LipR) Genregion mitwirken (siehe 7). Diese
Sigma-54-Promotoren weisen charakteristischerweise eine stromauf
liegende Enhancer-Region auf, hierin die stromauf liegende Aktivierungssequenz
oder UAS, die durch Proteine reguliert wird. Eine Regulierung kann
entweder durch ein Zweikomponentensystem, wie z. B. NtrB-NtrC, oder
durch ein Einkomponentensystem, wie z. B. NifA, erreicht werden,
wobei das Protein eng mit dem Substrat verbunden ist (für einen Überblick
siehe Morett und Segovia, w. o.).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann die Expression eines Proteins reguliert werden, wenn
eine Kinase und ein DNA-Bindungsregulator, die in trans-Form bereit gestellt
sind, mit einem Promotor und/oder einer stromaufwärts liegenden
Aktivierungssequenz Wechselwirken, die funktionell an ein Gen gebunden
sind, das für
das Protein von Interesse kodiert. Vorzugsweise wird die Expression
des Proteins erhöht.
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Eine „Kinase" ist ein Enzym, das
den Transfer von Phosphat entweder auf sich selbst oder anderes Protein
katalysieren kann. Die Kinase der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise
LipQ, eine Kinase, welche die Expression einer Lipase regulieren
kann. Ein LipQ wurde aus Pseudomonas alcaligenes isoliert. Als solches
kodiert für
die Kinase vorzugsweise eine Nucleinsäure mit der in 1A–1B gezeigten
Sequenz (Seq.-ID Nr. 1), und sie weist die in 1A–1B dargestellte
Aminosäuresequenz
(Seq.-ID Nr. 2) auf. Eine Kinase kann alleine oder als Teil eines
Expressionssystems wirken, um die Expression des Proteins zu regulieren.
In manchen Fällen
führt die
Abwesenheit dieser Kinase zu einer Verringerung oder einem Aussetzen der
Expression des Proteins.
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Ein „DNA-Bindungsregulator" ist eine proteinische
Substanz, die physikalisch mit DNA wechselwirkt und dabei die Expression
von Genen beeinflusst, die nahe der Bindungsstelle liegen. Der DNA-Bindungsregulator
ist vorzugsweise LipR, ein DNA-Bindungsregulator,
der die Expression einer Lipase regulieren kann. Ein LipR wurde
aus Pseudomonas alcaligenes isoliert. Als solches kodiert für den DNA-Bindungsregulator
vorzugsweise eine Nucleinsäure
mit der in 2A–2B gezeigten
Sequenz (Seq.-ID Nr. 3), und sie weist die in 2A–2B dargestellte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 4)
auf. Ein DNA-Bindungsregulator kann alleine oder als Teil eines
Expressionssystems wirken, um die Expression des Proteins zu regulieren.
Ein DNA-Bindungsregulator der vorliegenden Erfindung kann alleine
oder in Kombination mit einer Kinase verwendet werden. Die vorliegende
Erfindung umfasst Varianten des hierin offenbarten DNA-Bindungsregulators,
die zur Autophosphorylierung fähig
sind. Solche Varianten können
eine konstitutiv höhere
Expression des Zielproteins anführen.
In manchen Fällen
führt die
Abwesenheit dieses DNA-Bindungsregulators zu einer Verringerung
oder einem Aussetzen der Expression des Proteins.
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„Polymerase" bezieht sich hierin
auf ein Enzym, das DNA oder RNA verlängert, um längere DNA- bzw. RNA-Stränge zu erhalten.
Dies ist einer der entscheidensten Faktoren bei der Produktion von
Proteinen, wie beispielsweise einer Lipase. In einer bevorzugten
Ausführungsform
ist die Polymerase OrfZ. Somit kodiert in einer bevorzugten Ausführungsform
für die
Polymerase vorzugsweise eine Nucleinsäure mit der in 9A–9B dargestellten
DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 36), und sie weist die in 9A–9B dargestellte Aminosäuresequenz
auf (Seq.-ID Nr. 37). Die Polymerase kann bei der Modifikation der
Expression des gewünschten
Proteins eine Rolle spielen.
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Promotoren
sind DNA-Elemente, welche die Expression eines Proteins fördern können. Ein „Sigma-54-Promotor" ist ein bakterieller
Promotor und gehört
zur Klasse der Sigma-Faktoren mit einer Größe von etwa 54 kDa. Diese Sigma-Faktoren
sind auch als RpoN-Proteine bekannt. Sigma-54-Promotoren und ihre Funktionen
sind in Morrett und Segovia, J. Bacter. 175, 6067–6074 (1993),
erläutert.
Vorzugsweise ist der Promotor ein Pseudomonas-alcaligenes-Sigma-54-Promotor.
Noch bevorzugter ist der Sigma-54-Promotor der Lipasenpromotor von
P. alcaligenes (Seq.-ID Nr. 5) (WO 94/02617). Gemäß der vorliegenden
Erfindung weist der Sigma-54-Promotor eine stromauf liegende Aktivierungssequenz
auf.
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Eine „stromauf
liegende Aktivierungssequenz" ist
eine Bindungsstelle für
einen positiv wirkenden DNA-Bindungsregulator. Wie schon der Name
sagt, befindet sich die stromauf liegende Aktivierungssequenz stromauf
von der Transkriptionsausgangsstelle und ist eine Nucleinsäure. Die
stromauf liegende Aktivierungssequenz ist vorzugsweise eine UAS,
eine stromauf liegende Sequenz, welche die Expression einer Lipase
regulieren kann, und stammt vorzugsweise von Pseudomonas alcaligenes.
Eine stromauf liegende Aktivierungssequenz kann alleine oder als
Teil eines Expressionssystems wirken, um die Expression des Proteins
zu regulieren. In manchen Fällen
führt die
Abwesenheit dieser stromauf liegenden Aktivierungssequenz zu einer Verringerung
oder einem Aussetzen der Expression des Proteins. Vorzugsweise handelt
es sich bei der stromauf liegenden Aktivierungssequenz um die Consensus-Sequenz TGR(N)11ACA. In der Gensequenz der Pseudomonas-alcaligenes-Lipase entspricht
eine spezifische Region etwa –200
bp vom ATG-Startcodon dieser Consensus-Sequenz: TGTtcccctcggtaACA
(Seq.-ID Nr. 5) (WO 94/02617).
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Ein
Sekretionsfaktor ist ein Protein, das die Sekretion eines weiteren
Proteins aus einer Zelle unterstützt.
Vorzugsweise gehört
der Sekretionsfaktor zur Familie der Xcp-Proteine und wirkt mit
anderen Mitgliedern der Xcp-Proteinfamilie zusammen. Die für ein Genomfragment
kodierenden Gene xcpQ, xcpP, orfV, orfX, xcpR, xcpS, xcpT, xcpQ,
xcpV, xcpW, xcpR, xcpP, xcpZ und der C-terminale Teil des Proteins
OrfY wurden aus Pseudomonas alcaligenes isoliert. Als solches kodiert
für die
Sekretionsfaktoren vorzugsweise eine Nucleinsäure mit der in 3AA–3BB dargestellten Sequenz (Seq.-ID Nr.
29). Genauer gesagt kodiert für
den XcpP-Sekretionsfaktor noch bevorzugterweise die in Seq.-ID Nr.
12 gezeigte DNA-Sequenz und weist die in Seq.-ID Nr. 13 dargestellte
Aminosäuresequenz
auf; für
den XcpQ-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 14 gezeigte DNA-Sequenz,
wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 15 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; für
das OrfV-Protein die in Seq.-ID Nr. 30 gezeigte DNA-Sequenz, wobei
dieses die in Seq.-ID Nr. 31 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, für das OrfX-Protein
die in Seq.-ID Nr. 16 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieses die in Seq.-ID
Nr. 17 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; für
den XcpR-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 6 gezeigte DNA-Sequenz,
wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 7 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; für
den XcpS-Sekretionsfaktor
die in Seq.-ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID
Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; für
den XcpT-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 10 gezeigte DNA-Sequenz,
wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 11 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; für
den XcpQ-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 18 gezeigte DNA-Sequenz,
wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 19 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; für
den XcpV-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 20 gezeigte DNA-Sequenz,
wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 21 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; für
den XcpW-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 22 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser
die in Seq.-ID Nr. 23 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; für den XcpR-Sekretionsfaktor
die in Seq.-ID Nr. 24 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in
Seq.-ID Nr. 25 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; für
den XcpY- Sekretionsfaktor
die in Seq.-ID Nr. 26 gezeigte DNA-Sequenz, wobei dieser die in
Seq.-ID Nr. 27 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; für
den XcpZ-Sekretionsfaktor die in Seq.-ID Nr. 32 gezeigte DNA-Sequenz,
wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 33 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist; und für
einen Teil des Proteins OrFY kodiert die in Seq.-ID Nr. 34 gezeigte
DNA-Sequenz, wobei dieser die in Seq.-ID Nr. 35 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist.
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Stromauf
vom ligQ-Gen wurde eine Promotorregion identifiziert. Innerhalb
dieser Promotorregion kann eine lux-Box erkannt werden; siehe Seq.-ID
Nr. 28. Diese lux-Box
weist starke Homologie zur Bindungsstelle für Regulatorelemente vom luxR-Typ
auf, die bekannterweise von einem Autoinduktor kontrolliert werden
(Latifi et al., Molec. Microb. 17(2), 333–323 (1995)). Diese lux-Box
stellt wahrscheinlich eine Verbindung zwischen dem Autoinduktorsystem,
LipR und der Lipasenregulation dar. Als solches umfasst eine weitere
Ausführungsform
der Erfindung eine Nucleinsäure,
die für
ein lux-Box-Element kodiert.
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Stromauf
von den xcpP~Q- und xcpR~Z-Clustern sind orFX- und orfV-Gene (Seq.-ID
Nr. 29), und stromauf vom orfZ-Gen (Seq.-ID Nr. 28) sind regulatorische
Regionen vorhanden. Eine Box kann in der Promotorregion erkannt
werden, welche die Consensus-Sequenz ANAANAANAANAA aufweist. Diese
Boxen werden als orfV-Bindungselemente
bezeichnet, weil OrfV Homologie zum allgemein bekannten Escherichia-coli-Regulator
MaIT aufweist. Aufgrund der OrfV-Homologie zum bekannten Regulator
MaIT könnte
OrfV ein Regulator sein. Diese orfV-Boxen können die Expression der Xcp-Proteine,
von OrfX sowie von OrfV selbst kontrollieren. Auf ähnliche
Weise kann die Expression der Polymerase OrfZ durch die orfV-Boxen
kontrolliert werden, wie in 10 zu
sehen ist. Als solches stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform
eine Nucleinsäure
bereit, die für
ein orfV-Box-Element kodiert.
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Bei
der Beschreibung von Proteinen und dafür kodierenden Genen wird die
Bezeichnung für
das Gen im Allgemeinen nicht groß geschrieben, d. h. lipQ.
Bei der Bezeichnung des Proteins ist der erste Buchstabe groß geschrieben,
d. h. LipQ.
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Die
Kinase, der DNA-Bindungsregulator, der Promotor und die stromauf
liegende Aktivierungssequenz werden zur Vereinfachung manchmal als „Regulationselemente" bezeichnet. Die
bevorzugten Regulationselemente sind LipQ, LipR, die Pseudomonas-alcaligenes-Polymerase,
der Pseudomonas-alcaligenes-Sigma-54-Promotor und die Pseudomonas-alcaligenes-UAS,
und diese können
die Expression einer Lipase in Pseudomonas alcaligenes wie hierin
beschrieben regulieren. Die Kinase, der DNA-Bindungsregulator und
die Polymerase sind Proteine, während
der Promotor und die stromauf liegende Aktivierungssequenz Nucleinsäuren sind.
DNA, die für
die Kinase und den DNA-Bindungsregulator kodierte, wurde unter Verwendung
eines Plasmids in transformierten Zellen vermehrt, was wiederum
zu einer höheren
Produktion der Kinase und des DNA-Bindungsregulators führte. Die
erhöhte
Produktion der Kinase und des DNA-Bindungsregulators führt zu einer
höheren
Transkription vom Sigma-54-Promotor, der eine höhere Expression des Proteins
von Interesse bereitstellt.
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Die
Kinase und der DNA-Bindungsregulator der vorliegenden Erfindung
stellen ein Zweikomponenten-Regulationssystem dar. Vorzugsweise
sind die beiden Komponenten LipQ und LipR und können die Expression einer Lipase
in Pseudomonas alcaligenes wie hierin definiert regulieren. Obwohl
auch andere zwei Komponenten umfassende Regulationssysteme bekannt
sind, besteht zwischen einzelnen Teilen dieser Systeme und den in
Seq.-ID Nr. 2 und 4 gezeigten Aminosäuresequenzen nur ein geringer
Grad an Homologie.
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Ausführungsformen
der Erfindung umfassen eine Kinase oder einen DNA-Bindungsregulator,
für die eine
Nucleinsäure
mit zumindest 50% Homologie zu der in Seq.-ID Nr. 1 bzw. 3 gezeigten
DNA-Sequenz kodiert. Vorzugsweise beträgt die Homologie zumindest
70%, noch bevorzugter zumindest 90%, insbesondere zumindest 95%.
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Ferner
sind weitere Ausführungsformen
bereitgestellt, worin für
einen Sekretionsfaktor eine Nucleinsäure mit zumindest 90% Homologie
zur DNA-Sequenz von Seq.-ID Nr. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
24, 26, 30, 32, 34 kodiert. Vorzugsweise beträgt die Homologie zumindest
95%, noch bevorzugter zumindest 98%. Die Homologie kann bestimmt
werden, indem die beanspruchte Aminosäure oder DNA-Sequenz neben
eine andere Sequenz gestellt und bestimmt wird, wie viele der Aminosäuren oder
Nucleotide in Prozent gerechnet gleich sind. Die Homologie kann
auch unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Sequenzanalyse-Softwareprogramms
bestimmt werden, wie beispielsweise mithilfe des „TFastA
Data Searching Program",
das im Sequence Analysis Software Package Version 6.0 (Genetic Computer
Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin
53705) erhältlich
ist.
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Nach
homologen Sequenzen kann wie hierin beschrieben durch Hybridisierung
oder unter Verwendung von PCR mit degenerierten Primern gesucht
werden. Chen und Suttle, Biotechniques 18(4), 609–610, 612
(1995).
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In
mehreren Ausführungsformen
der Erfindung werden außerdem
Nucleinsäuren
bereitgestellt, die unter stringenten Bedingungen mit der DNA aus
den 1A–1B, 2A–2B, 3AA–3BB und 9,
Seq.-ID Nr. 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30,
32, 34 bzw. 36 hybridisieren können.
Stringente Hybridisierungsbedingungen umfassen stringente Hybridisierungs-
und Waschbedingungen, wie sie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt sind. Die Hybridisierung und geeignete stringente Bedingungen
sind in Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Ausg., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben.
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„Bakterien" umfassen Mikroorganismen
der Klasse der Schizomyzeten. Bakterien können entweder gramnegativ oder
grampositiv sein. Gramnegative Bakterien um fassen Mitglieder der
folgenden Gattungen: Escherichia, Hemophilus, Klebsiella, Proteus,
Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Vibrio, Acinetobacter und Serratia.
Grampositive Bakterien umfassen Mitglieder der folgenden Gattungen:
Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptomyces, Lactobacillus
und Lactococcus.
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Gramnegative
Bakterien können
Pseudomonaden sein, d. h. Stämme,
die Mitglieder der Gattung Pseudomonas sind. Beispiele umfassen
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas glumae,
Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fragi, Pseudomonas alcaligenes
und Pseudomonas mendocina. Eine bevorzugt Pseudomonade ist Pseudomonas
alcaligenes. Pseudomonas alcaligenes wird manchmal auch als Pseudomonas
pseudoalcaligenes bezeichnet.
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Lipasen
innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung umfassen
solche, für
die LipA kodiert, das im Allgemeinen in enger Verbindung zu einem
als LipB,. LipH, LipX oder Lif bekannten Modulationsgen auftritt.
Lif von Pseudomonas alcaligenes ist das Thema der Patentanmeldung
WO 93/02617, wie weiter oben schon erwähnt wurde. LipA-Gene finden
sich in verschiedenen Bakterienarten, wie beispielsweise Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas
cepacia, Pseudomonas glumae, Pseudomonas fragi, Pseudomonas mendocina,
Acinetobacter calcaoceticus und Serratia marcescans.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung stellt ein Expressionssystem bereit, das die Expression eines
Proteins, vorzugsweise einer Lipase, regulieren kann. Das Expressionssystem
umfasst eine Kinase, einen DNA-Bindungsregulator, eine Polymerase,
einen Sigma-54-Promotor und eine stromauf liegende Aktivierungssequenz.
Das Expressionssystem kann auch Sekretionsfaktoren umfassen.
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Ein
Expressionssystem umfasst ein oder mehrere Proteine) und/oder Nucleinsäure(n),
die, wenn sie zusammenwirken, die Expression eines Proteins in einer
Wirtszelle erhöhen.
Das Expressionssystem kann auf einem oder mehreren Plasmiden kodiert
sein und kann sich auf demselben Plasmid befinden wie das für das Protein
von Interesse kodierende Gen oder auch nicht.
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Die
Bezeichnung „funktionell
gebunden" oder „funktionell
verbunden" bedeutet,
dass die Regulationselemente (DNA oder Protein) physisch wechselwirken,
um ihre Funktion auszuüben.
Hierbei kann es sich um eine Protein-Protein-, DNA-Protein- oder
DNA-DNA-Wechselwirkung handeln. Der DNA-Bindungsregulator wechselwirkt
beispielsweise mit dem Promotor, aber dafür kodierende Gene können sich
an unterschiedlichen Stellen auf dem Chromosom befinden. Als solches
können
sich Gene, die für
die Elemente kodieren, auf anderen Plasmiden befinden als ein anderes
solches Gen oder ein für
das Protein von Interesse kodierendes Gen und noch immer zusammenarbeiten,
um die Expression des Proteins zu regulieren.
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Ein
Plasmid ist ein Nucleinsäuremolekül, das kleiner
ist als das Chromosom und sich unabhängig vom Mechanismus, der zur
chromosomalen Replikation verwendet wird, replizieren kann. Typischerweise
ist ein Plasmid ein ringförmiges
DNA-Molekül.
Plasmide können
in Wirtszellen insertiert werden, wo sie sich replizieren und mehrere
Kopien des Plasmids herstellen können;
deshalb werden sie replizierende Plasmide genannt. Einige Plasmide,
die integrierende Plasmide genannt werden, können die Plasmid-DNA in das
Chromosom der Wirtszelle insertieren. Die Plasmid-DNA wird so in
das Chromosom der Wirtszelle integriert. Wenn das geschieht, repliziert
sich das Plasmid nicht länger
autonom, sondern repliziert sich in Übereinstimmung mit dem Chromosom,
in das es insertiert wurde. Während
also ein nichtintegriertes Plasmid pro Chromosom in mehreren Dutzend
Kopien vorhanden sein kann und sich unabhängig vom Chromosom replizieren
kann, ist das integrierte Plasmid in einer Kopie pro Chromosom vorhanden
und kann sich nur gemeinsam mit dem Chromosom replizieren.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle
mit einem Plasmid, umfassend die Nucleinsäure, die für das Expressionssystem kodiert.
Eine Wirtszelle ist eine Zelle, in die ein Plasmid gemäß vorliegender Erfindung
durch beispielsweise Transformation insertiert werden kann. Die
Wirtszelle ist vorzugsweise ein Bakterium. Ein einer Ausführungsform
ist die Wirtszelle vorzugsweise ein gramnegatives Bakterium. In
einer weiteren Ausführungsform
ist die Wirtszelle eine Pseudomonade. Vorzugsweise ist die Wirtszelle
Pseudomonas alcaligenes, und die Regulationselemente des Expressionssystems stammen
von Pseudomonas alcaligenes. Die gleiche Wirtszelle kann mit einem
weiteren Plasmid transformiert werden, das eine Nucleinsäure enthält, die
für einen
oder mehrere Sekretionsfaktoren kodiert. Vorzugsweise stammen die
Sekretionsfaktoren von Pseudomonas alcaligenes.
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Eine
transformierte Wirtszelle ist eine Wirtszelle, in die ein oder mehrere
Plasmide insertiert wurden. Eine Transformation kann stattfinden,
indem zuerst die Wirtszelle kompetent gemacht wird, um das Plasmid aufzunehmen.
Dann wird die nackte DNA direkt zu den Zellen zugesetzt, und einige
der Zellen nehmen sie auf und replizieren oder integrieren sie.
Eine Möglichkeit,
die Zellen zur Aufnahme des Plasmids kompetent zu machen, besteht
in einer Elektroporation, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben
ist. Ein weiteres Verfahren, das zur Herstellung und zum Transfer
von Cosmid-Bibliotheken geeignet ist, ist triparentale Kreuzung. Kelly-Wintenberg
und Montie, J. Bacteriol. 171(11), 6357–62 (1989).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellte Lipasen sind für verschiedene Anwendungen
geeignet. Lipasen können
in Detergenzien und anderen Reinigungsformulierungen sowie in zahlreichen
industriellen Verfahren eingesetzt werden.
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Experimenteller Teil
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Materialien und Verfahren
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Bakterienstämme
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Alle
Bakterienstämme
wurden, sofern nicht anders angegeben, mit 2×TY als flüssiges oder festes Medium vermehrt
und sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Bei P.-alcaligenes-Stämmen wurden zum Medium geeignete
Antibiotika zugesetzt: Neomycin (10 mg/l), Tetracyclin (5 mg/l)
und Chloramphenicol (3 mg/l); und bei transformiertem Escherichia
coli wurden 100 mg/l Ampicillin zugesetzt. Bei Cosmid-hältigen Escherichia-coli-Stämmen wurde
zum Medium Tetracyclin zugesetzt (10 mg/l). P. alcaligenes und E.
coli wurden bei 37°C
aerob gezüchtet.
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Tabelle
1.
Verwendete Bakterienstämme.
Tet
R, gegen Tetracyclin resistent; Neo
n, gegen Neomycin resistent; Cap
R,
gegen Chloramphenicol resistent; lip, Lipase
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Tabelle
2
Verwendete Plasmide
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Extraktion von extrachromosomaler
DNA
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Cosmid-
und Plasmidisolationen wurden an 1-ml-Übernachtkultur unter Verwendung
des QIAprep-Spin-Plasmid-Sets und an 100-ml-Kulturisolationen unter
Verwendung des QIAfilter-Plasmid-Midi-Sets (beide von Qiagen) gemäß den Anleitungen
des Herstellers durchgeführt.
Bei Pseudomonas-Stämmen
wurde Lysozym (10 ul/ml) zum Resuspensionsgemisch zugesetzt und
5 min lang bei 37°C
inkubiert, um die Zelllyse zu unterstützen. Cosmid-DNA wurde gemäß den Empfehlungen
des Herstellers aus den QIAprep-Säulen mit 70°C heißem milliQ-Wasser eluiert.
Für die
Cosmid-Isolation aus 100-ml-Kulturen wurden Stämme über Nacht in einer Luria-Bertani-(LB-) Kulturlösung gezüchtet, und
der Elutionspuffer wurde auf 50°C
erhitzt.
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Transformation
von Pseudomonas alcaligenes
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Eine Übernachtkultur
von P. alcaligenes wurde 1 : 100 mit einem frischen 2×TY-Medium (mit 10 mg/l Neomycin)
verdünnt,
und die Kultur wurde in einem Rundschüttler bei 37°C inkubiert,
bis sie eine OD550 von 0,6–0,8 erreichte.
Nach einer Zentrifugation (10 min bei 4.000 U/min) wurde das Bakterienpellet
zweimal mit einem halben Volumen SPM-Medium (276 mM Saccharose;
7 mM NaHPO4 (pH 7,4); 1 mM MgCl2)
gewaschen. Die Zellen wurden dann in einem 1 : 100-Volumen SPM-Medium
resuspendiert. Cosmid-DNA und 40 μl
Zellen wurden vermischt und auf eine Elektroporationsküvette mit
2 mm Abstand übertragen
(BTX). Die Zellen wurden mit 1,4 kV, 25 μF, 220 Ω im Gene Pulser elektroporiert.
Die Elektroporationsküvette
wurde mit 1 ml 2×TY-Medium
ausgewaschen, und das Zellengemisch wurde in eine saubere 1,5-ml-Eppendorf gegeben.
Das Transformationsgemisch wurde dann 45 min lang bei 37°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 100 μl
auf 2×TY-Agar
ausplattiert, das mit Tetracyclin (5 mg/l) oder Neomycin (10 mg/l)
oder beidem ergänzt
war (je nachdem, welcher P.-alcaligenes-Stamm für die Elektroporation verwendet
wurde). Die Transformation der P.-alcaligenes-Zellen wurde bei Raumtemperatur
durchgeführt.
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Transformation
von Escherichia coli
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Die
Transformation der E.-coli-Wk6-Zellen wurde unter Verwendung von
Elektroporation durchgeführt. Die Übertragung
der Cosmide auf E.-coli-K802-Zellen wurde durch Infektion gemäß den Anleitungen
des Herstellers (Promega Corporation) durchgeführt.
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Beispiel 1
-
Konstruktion einer Cosmid-Bibliothek
aus
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Pseudomonas-alcaligenes-DNA
in E. coli
-
Chromosomale
DNA, die aus P. alcaligenes isoliert worden war, wurde wie oben
im Abschnitt über
die Materialien und Verfahren beschrieben fraktioniert und in Cosmid pLAFR3
ligiert. Nach der Ligation wurde das Gemisch wie beschrieben in
E. coli transferiert. Tetracyclin-resistente Kolonien wurden isoliert,
und aus jeder Kolonie wurde Cosmid-DNA präpariert.
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Beispiel 2
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Transformation einer P.-alcaligenes-Cosmid-Bibliothek
in P. alcaligenes, die Lipase überexprimieren
-
Insgesamt
wurden 531 Plasmid-DNA-Präparate
aus in E. coli gezüchteten
Cosmiden isoliert. Mithilfe von Elektroporation (siehe Verfahren
oben) wurden diese in den Stamm Lip34, ein P.-alcaligenes-Stamm
mit Plasmid p24Lipo1, der Lipase exprimiert, transformiert, was
zu 485 Cosmid-hältigen
P.-alcaligenes-Stämmen führte. Zur
Transformation wurden die beschriebenen Verfahren verwendet.
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Beispiel 3
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Selektion
von die Lipasenexpression stimulierenden Cosmiden
-
Insgesamt
wurden 485 Cosmide transformiert, wonach Cosmid-hältige P.-alcaligenes-Stämme auf ihre
Lipasenproduktionsaktivität
gescreent wurden. Zwanzig Cosmidstämme wurden selektiert, die,
wie sich in verschiedenen Flüssigkeits-
und Plattentests zeigte, eine bedeutende Erhöhung der Lipasenexpression
aufwiesen (siehe Tabelle 3). Die entsprechenden Cosmide wurden auch
in einem Einzelkopie-Lipasenstamm
getestet, und manche von ihnen wiesen eine dreifache Erhöhung der
Lipasenexpression auf. Die vier besten Cosmide wiesen ein gemeinsames Überlappungsfragment
mit 5,6 kb auf. Die Lipasenstimulationswirkung wurde auf einem 4,5
kb großen
Fragment von Cosmid Nr. 71, Nr. 201, Nr. 505 und Nr. 726 lokalisiert.
Eine Sequenzanalyse dieses Fragments ergab zwei offene Leseraster,
die Homologie zu Zweikomponentenregulationssystemen aufwiesen (siehe 4A–4G). Die Erfinder nannten diese Gene lipQ,
lipR und orfZ. Es gilt anzumerken, dass im Lactat-Test (zweite Spalte
in Tabelle 3) von den vier beschriebenen Cosmidstämmen nur Stämme mit
den Cosmiden Nr. 71, 505 und 726, welche das vervollständigte OrfZ
aufwie sen, die im Vergleich zum Stamm mit Cosmid Nr. 201 höchste Lipasenstimulation
erreichten.
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Beispiel 4
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Beweis für die Mitwirkung
von LipQ/LipR an der Lipasenexpression
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Um
die Rolle des lipQ/lipR-Operons zu bewerten, wurde eine Inaktivierung
durch Insertion am LipR-ORF im Chromosom des Stamms PS93 durchgeführt. Die
resultierende Mutante Ps1108 wies im Vergleich zu PS93 einen bedeutend
verringerten Haloeffekt auf Tributyrinagarplatten auf.
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In
einem zweiten Versuch wurde das Lipasenexpressionsplasmid p241ipo1
in den Stamm Ps1108 eingebracht. Die Lipasenexpression war im Vergleich
zu PS93, der p241ipo1 enthielt, deutlich beeinträchtigt.
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Diese
Beobachtung lässt
vermuten, dass das lipQ/lipR-Operon ein Lipasenregulationsprotein
ist.
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Beispiel 5
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Konstruktion und Charakterisierung
eines LipQ/LipR überexprimierenden
P.-alcaligenes-Stamms
-
Das
4,5 kb großes
EcoRI-HindIII-Fragment von einem der vier lipasenstimulierenden
Cosmide (Nr: 201) wurde auf pLAFR3 subkloniert und in einen P.-alcaligenes-Stamm mit einem einzelnen
Lipasengen auf dem Chromosom (Ps537) insertiert. Nach einer 10-l-Fermentation
wurde eine dreifach höhere
Lipasenausbeute beobachtet (siehe 5).
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Danach
wurde das 4,5 kb große
EcoRI-HindIII-Fragment in das Lipasenexpressionsplasmid p241ipo1 insertiert.
Eine höhere
Lipasenexpression trat auf, wie aus der Halo-Größe auf Tributyrinplatten geschlossen werden
konnte. Während
des Wachstums in einem Schüttelkolben
wurde Plasmidinstabiltiät
beobachtet. Um diese Instabilität
zu überwinden,
wurde das Fragment auch in das Chromosom integriert, was in einem
Stamm mit 2 lipQ/lipR-Genkopien im Chromosom (Stamm Ps1084) resultierte.
Die Insertion des Lipasenexpressionplasmids p24Lipo1 in diesen Stamm
führte
zu einer höheren
Lipasenexpression auf der Platte, aber zu einer Plasmidinstabilität während der
Fermentation.
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Beispiel 6
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Wirkung von Cosmid Nr.
600 auf die Stabilität
des Produktionsplasmids in Ps1084
-
Ein
P.-alcaligenes-Stamm wurde entwickelt, in dem eine zweite Kopie
von lipQ-R in das Chromosom integriert wurde. Als ein Lipasenproduktionsplasmid
(Plasmid p24Lipo1) in hoher Kopienzahl (20) in Ps1084 eingebracht
und der Stamm fermentiert (10 Liter) wurde, wurde Plasmidinstabilität beobachtet.
Ein Versuch mit einem Schüttelkolben
wurde entwickelt, um die Situation im Fermentor nachzustellen. Um
die Produktionsplasmidstabilität
und Cosmidstabilität
von transformiertem Ps1084 zu überwachen,
wurde ein eine Woche dauerndes Schüttelkolbenexperiment durchgeführt. Nachdem
sie über
Nacht in 10 ml 2×TY-Kulturlösung (ergänzt mit der
erforderlichen Menge Neomycin und Tetracyclin) gezüchtet worden
war, wurden 1 ml transformierte Kultur verwendet, um 100 ml Fermentationsmedium
380 plus 200 μl
Sojaöl
in Rundschüttlern
zu beimpfen. Die beimpften Schüttelkolben
wurden 24 Stunden lang bei 37°C
in einem Rundschüttler
inkubiert. 1 ml der 24 h alten Kultur wurde dann verwendet, um die
folgenden Schüttelkolben
zu inokulieren. Während
der gesamten Dauer des Versuchs wurden täglich Proben entnommen. Die
Gegenwart eines Neomycin-Markers auf dem Lipasenproduktionsplasmid
wurde verwendet, um die Plasmidstabilität zu überwachen. Der integrierte lipQ-R-Stamm
mit der hohen Kopienzahl eines Lipasenproduktionsplasmids (Ps1084)
wurde mit Cosmid Nr. 600 transformiert, um zu sehen, ob die Plasmidstabilität verbessert
wurde.
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6 ist
ein Diagramm, das die Produktionsplasmidstabilität im transformierten und untransformierten Ps1084
zeigt (in doppelter Ausführung).
Nach 3 – 4
Tagen wurde Plasmidinstabiltät
in Ps1084 detektiert, die als ein 80%iger Abfall in gegen Neomycin
resistenten Kolonien beobachtet wurde. Während des 1 Woche dauernden
Experiments behielt das mit Cosmid Nr. 600 transformierte Ps1084
einen hohen Grand an Resistenz gegen Neomycin bei, was darauf schließen lässt, dass
Cosmid Nr. 600 das Produktionsplasmid stabilisiert.
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Beispiel 7
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Charakterisierung von
Cosmid Nr. 600
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Cosmid
Nr. 600 gab ein positives Signal, als eine PCR unter Verwendung
von xcpR-Primern
basierend auf Peptiden von xcpR von Pseudomonas aeruginosa durchgeführt wurde.
Die DNA-Sequenz von Cosmid Nr. 600 wurde mit EcoRV verdaut, und
das resultierende Fragmentgemisch und gereinigte Fragmente wurden
unter Verwendung des Rapid-DNA-Ligation-Sets (Boehringer Mannheim)
mit SmaI-verdautem pUC19 (Appligene) ligiert. Dann wurden E.-coli-Zellen
elektroporiert. Transformanten wurden auf 2×TY-Platten selektiert, die Ampicillin
(100 mg/l), X-Gal (Boehringer Mannheim; 40 mg/l) und IPTG (Gibco
BRL; 1 mM) enthielten. Transformanten, welche das rekombinante Plasmid
enthielten, wurden als weiße
Kolonien identifiziert, und einzelne Kolonien wurden auf frische
2×TY-Agarplatten
(mit Ampicillin) gestrichen, um sie zu reinigen.
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Eine
Sequenzierung der PCR-Produkte; DNA von Cosmid Nr. 600 und Subklonen
von Cosmid Nr. 600 (siehe oben) wurde durch das „Dye-Deoxy-Termination"-Verfahren erreicht, wobei das „ABI PRISMTM Dye Termination Cycle Sequencing Ready
Reaction"-Set mit
AmpliTaq®-DNA-Polymerase,
FS (Perkin Elmer) zusammen mit dem 373A-Sequenator von Applied Biosystems
verwendet wurde.
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Die
Sequenzierung von Cosmid Nr. 600 wurde mit den Primern initiiert,
die in der PCR zur Detektion von xcpR verwendet wurden. In Übereinstimmung
mit der Restriktionskarte von Cosmid Nr. 600 (8)
wurde eine EcoRV-Restriktionsstelle in der Nucleinsäuresequenz
des PCR-Produkts identifiziert. Eine Sequenzanalyse ergab, dass
das Amplifikationsprodukt aus 609 bp zu einer vermeintlichen Aminosäuresequenz
mit 89% Homologie zu P.-aeruginosa- und 73% zu P.-putida-XcpR-Proteinen (Aminosäurereste
59–262)
translatiert werden könnte,
wodurch verifiziert wird, dass das xcpR-Gen durch PCR identifiziert
wurde.
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8 zeigt
die Karte von Cosmid Nr. 600. Durch die Durchführung einer PCR-Reaktion mit verdauter DNA
konnten die Erfinder die Position von xcpR auf dem Insert ableiten.
Die Position des xcpR-Gens lässt
vermuten, dass das gesamte Xcp-Operon
in Cosmid Nr. 600 vorhanden ist.
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Bis
heute wurden 17.612 Nucleotide, einschließlich xcpP, xcpQ, orfV, orfX,
xcpR, xcpS, xcpT, xcpQ, xcpV, xcpW, xcpR, xcpP, xcpZ und ein Teil
des Proteins OrfY, sequenziert (3AA–3BB, Seq.-ID Nr. 29).
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Die
Erfindung wurde zwar unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen
beschrieben, es versteht sich jedoch, dass weitere Modifikationen
daran vorgenommen werden können
und dass diese Anmeldung jegliche Variationen oder Adaptationen
der Erfindung einschließt,
die im Allgemeinen gemäß den Prinzipien
der Erfindung durchgeführt
werden, wozu auch Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung
gehören,
die innerhalb bekannter oder herkömmlicher Praxis auf dem Gebiet
der Erfindung liegen, auf wesentliche, hierin beschriebene Merkmale
angewandt werden können
und innerhalb des Schutzumfangs der beiliegenden Ansprüche liegen.
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