CN111019904A

CN111019904A - 适应羊口疮病毒增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法

Info

Publication number: CN111019904A
Application number: CN201811179275.0A
Authority: CN
Inventors: 丁国杰; 杨朋欣; 冯育宁; 周建华; 薛晓娟; 郑玉芳; 李媛妹; 池贤凤; 侯丹丹
Original assignee: Anhui Divinity Biological Products Co ltd
Current assignee: Anhui Divinity Biological Products Co ltd
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2020-04-17

Abstract

本发明公开了一种适应羊口疮病毒(ORFV)增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法，包括将SV40大T抗原通过慢病毒载体导入原代羊睾丸细胞，通过细胞克隆技术，筛选和纯化可持续传代的细胞，最终筛选出一株传代和生长性能良好的永生化细胞株。病毒感染和复制动力学试验表明，本发明所构建的永生化细胞系为ORFV适应细胞系，命名为羊睾丸细胞DST‑3，F10代细胞DST‑3接种ORFV AH‑GY13株，毒价达10^‑6.4TCID₅₀/ml，与在原代细胞中的复制水平相似。本发明为ORFV弱毒疫苗和灭活疫苗的研制与生产提供了稳定的细胞环境和标准化的培养方法。

Description

适应羊口疮病毒增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法

技术领域

本发明涉及永生化羊睾丸细胞系的构建方法，尤其涉及一种适应羊口疮病毒增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法，属于永生化羊睾丸细胞系的构建领域。

背景技术

羊传染性脓疱又称羊口疮，是一种由痘病毒科副痘病毒属的羊口疮病毒(ORFV)所致，主要侵害绵羊和山羊，使其黏膜和皮肤发生脓性溃疡的传染病。本病流行无明显季节性，但春秋季相对较易发生。常呈群发性流行，3～6月龄羔羊最易感染，病羊和带毒羊是本病的传染源。健康羊与病羊直接接触，或接触被病羊污染的用具、饮水、饲槽、饲料等而感染。病毒可随病羊的创口分泌物和唾液以及脱落的痴皮排出，主要经损伤的皮肤或黏膜而感染健康宿主。

ORFV需要在羊或牛的原代睾丸细胞中增殖。原代细胞制备工艺复杂，质量难以控制，并易污染外源病毒，有待改进。

目前，制备疫苗用细胞为羊或牛的原代睾丸细胞。该细胞生长缓慢，并随传代代次增加，细胞活力降低，细胞形态不好，最终失去传代能力。且羔羊睾丸来源有限，采集工作量大，并可能携带其他病原；细胞制作过程复杂耗时，易污染细菌，不利于批量生产使用。

永生化细胞是指体外培养的细胞自发的或在外界因素的影响下获得无限增殖能力的细胞。与肿瘤细胞不同的是，永生化细胞具有锚定依赖生长的特性和接触抑制的现象，这更类似有序的组织细胞。

提供一种适应ORFV增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法对于ORFV弱毒疫苗和灭活疫苗的研制与生产具有重要意义。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种适应ORFV增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法；

本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的：

一种适应ORFV增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法，包括：

(1)将SV40大T抗原基因克隆至慢病毒转移载体得到重组质粒；

(2)将重组质粒、包装载体和衣壳表达质粒转染至细胞进行病毒包装；将包装后的重组病毒导入原代羊睾丸细胞进行培养；

(3)通过单细胞克隆纯化筛选出适应ORFV增殖的永生化羊睾丸细胞系。

优选的，步骤(1)将SV40大T抗原基因克隆至慢病毒转移载体pSFG得到重组质粒pSFG-T；

优选的，步骤(2)所述的包装载体是Gag-pol包装载体；所述的衣壳表达质粒是VSV-G衣壳表达质粒；

优选的，步骤(3)中所述的羊睾丸原代细胞的制备方法包括：

(a)取新鲜采集的羔羊睾丸，用75％酒精清洗后再用灭菌PBS清洗，然后去除筋膜和结缔组织；

(b)将处理后的睾丸剪碎，再用灭菌PBS清洗后，加入0.25％胰酶消化；加入含10％新生牛血清的DMEM培养基终止消化；

(c)将羊睾丸细胞均匀分散开后过滤，将细胞分散计数，置于细胞培养瓶中在37℃CO₂培养箱培养，获得羊睾丸原代细胞。

本发明将SV40大T抗原通过慢病毒载体导入原代羊睾丸细胞，使其永生化，并通过细胞克隆技术，筛选和纯化可持续传代的细胞，最终筛选出一株传代和生长性能良好的细胞株。病毒感染和复制动力学试验表明，所建立的细胞系为ORFV适应细胞系，该细胞系名称为羊睾丸细胞DST-3。本发明构建的永生化羊睾丸细胞系DST-3为ORFV适应细胞，F10代细胞DST-3接种ORFV AH-GY13株，毒价达10^-6.4TCID₅₀/ml，与在原代细胞中的复制水平相似。本发明的永生化细胞系的建立为ORFV弱毒疫苗和灭活疫苗的研制与生产提供了稳定的细胞环境和标准化的培养方法。

附图说明

图1SV40大T抗原基因PCR片段的琼脂糖凝胶电泳图。

图2羊睾丸原代细胞和永生化细胞(DST-3)对接种ORFV(AH-GY13株)后出现的细胞病变图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1适应ORFV增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建及鉴定

1试验材料

1.1细胞

SV40大T抗原基因来源HEK293T细胞购于中国科学院上海细胞所，plat E细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠，原代山羊睾丸细胞由安徽东方帝维生物制品公司制备。

1.2病毒

ORFV AH-GY13株，由安徽农业大学惠赠。

1.3引物

SV40大T抗原基因扩增引物

T1：5’-CTAGGATCCATGGATAAAGTTTTAAACAG AGA-3’

T2：5’-CTGGATCCTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGG-3’

1.4细胞培养液

细胞生长液为含10％新生牛血清的DMEM。细胞接种ORFV后的维持液为含2％新生牛血清的DMEM。

2试验方法

2.1表达大T抗原的慢病毒制备

2.1.1大T抗原克隆

提取HEK293T细胞DNA，用上游引物Tl和下游引物T2经PCR扩增SV40大T抗原基因。

25μl反应体系为：Buffer 2.5μl、dNTP 2μl、引物Tl和T2各0.5μl、rTaq酶0.3μl、DNA模板1μl，去离子水补至25μl。

扩增程序为94℃3min；94℃50s、55℃50s、72℃60s，35个循环；72℃5min。

分别取扩增产物5μl，进行电泳分析及DNA测序，确认克隆的SV40大T抗原基因。对所扩增出的目的基因片段胶回收纯化，并在NcoI位点克隆至慢病毒转移载体pSFG，得到重组质粒pSFG-T。

2.1.2重组慢病毒包装和收获

取60mm培养皿，接种plat E 7×10⁵细胞。当细胞聚合度达60％时，转染重组慢病毒所需质粒，包括18μg pSFG-T转移载体、12μg Gag-pol包装载体和6μg VSV-G衣壳表达质粒。37℃CO₂培养箱培养48h，收集病毒液，10,000g离心5min，留上清，-80℃保存。

2.2原代细胞永生化

2.2.1羊睾丸原代细胞制备

取新鲜采集的1枚羔羊睾丸，用75％酒精清洗一遍，再用灭菌PBS清洗3次，然后去除筋膜和结缔组织，置于小烧杯内剪碎。灭菌PBS清洗3次后，转入盛放玻璃珠的三角瓶内，加入0.25％胰酶30ml，封口，置于37℃水浴中消化20min后，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基终止消化。其后轻轻向一个方向摇动三角瓶，在玻璃珠的作用下,羊睾丸细胞均匀分散开，取放置16层纱布的漏斗过滤，将细胞分散计数，置于75cm²细胞培养瓶中，37℃CO₂培养箱培养。由此获得羊睾丸原代细胞。

2.2.2羊睾丸细胞永生化

待原代细胞长至融合后传代，第二代细胞培养24h消化，取1×10⁶细胞至15ml离心管内，加入重组慢病毒4.5ml，室温1,500g离心2h。弃上清后，用5ml含10％新生牛血清的DMEM重悬细胞，1×10⁵细胞/孔加入六孔板中培养，每3天换液一次。大部分细胞凋亡脱落，少量细胞存活并长成岛状集落。

2.2.3永生化细胞分选

吸出有存活细胞集落细胞孔中的培养液，将浸泡0.25％胰酶后的直径5mm灭菌滤纸片覆盖集落细胞上，3min后取下，将附着的细胞移入24孔板(每孔0.5ml含10％新生牛血清的DMEM)。7天后选择细胞分裂较快的克隆，胰酶消化后转至6孔板继续培养，记为F1代。

2.2.4细胞传代特性检测

选择细胞增殖良好的克隆，扩大培养，并记录传代次数。从F4代选择5株保存，并保留一株(DST-3)继续传至F10代，并保存各代次细胞，同时检测对ORFV的易感性和支持病毒复制能力。

2.3病毒易感性和复制能力测定

2.3.1 ORFV制备

待原代羊睾丸细胞在75cm²培养瓶中长成单层，弃掉含10％新生牛血清的DMEM，PBS清洗3次，接种用无血清DMEM稀释为100TCID₅₀的ORFV 3ml，置37℃5％CO₂培养箱作用1h，弃去瓶内液体，然后加入2％新生牛血清DMEM维持液继续培养。待细胞病变达80％以上，收获病毒，-80℃保存备用。

2.3.2毒价测定

将原代羊睾丸细胞按1×10⁵细胞/孔接种至96孔板，培养24h。将保存的ORFV以无血清DMEM做10倍系列稀释，取10^-4-10^-8稀释度接种细胞，100μl/孔培养48h。观察细胞病变孔数，记录结果，根据Reed-Muench氏法计算病毒TCID₅₀。

3试验结果

3.1 SV40大T抗原基因扩增

293T细胞DNA为模板，以针对大T抗原基因的Tl/T2序列为引物，进行PCR扩增，得到与SV40大T抗原基因相符的大小约为2,154bp片段(图1)。

3.2原代羊睾丸细胞永生化

感染重组慢病毒的原代细胞在六孔板中持续培养后，多数细胞凋亡后脱落，但出现少量由细胞增殖后形成的集落。这些细胞集落(克隆)大多可以传代、增殖。通过筛选增殖快，细胞形态良好的克隆持续传代。经过10次传代最终选出1株永生化克隆，为羊睾丸细胞系DST-3。

3.3 ORFV在永生化羊睾丸细胞中的易感性和复制特性

用100TCID₅₀的ORFV AH-GY13株分别接种原代和永生化羊睾丸细胞(DST-3)，24h后，2种细胞均出现明显细胞病变(图2)。48h后收获细胞培养上清，检测病毒滴度(TCID₅₀)。，3次实验结果显示，原代和永生化羊睾丸细胞的病毒复制水平相似，其毒价均在10^- ^6.4TCID₅₀/ml左右(表1)。

表1.羊口疮病毒AH-GY13株在原代和永生化细胞中的复制水平

4试验结论

4.1本发明构建出羊睾丸细胞永生化细胞系，命名为DST-3。

4.2本发明构建的永生化羊睾丸细胞系为ORFV适应细胞，F10代细胞DST-3接种ORFV AH-GY13株，毒价达10^-6.4TCID₅₀/ml，与在原代细胞中的复制水平相似。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽东方帝维生物制品股份有限公司

<120> 适应羊口疮病毒增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法

<130> AH-3003-180913A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

ctaggatcca tggataaagt tttaaacaga ga 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

ctggatcctt atgtttcagg ttcaggggga gg 32

Claims

1.一种适应羊口疮病毒增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法，其特征在于，包括：

(1)将SV40大T抗原基因克隆至慢病毒转移载体得到重组质粒；

(2)将重组质粒、包装载体和衣壳表达质粒共转染细胞进行病毒包装；将包装后的重组病毒导入原代羊睾丸细胞进行培养；

(3)通过单细胞克隆纯化筛选出适应羊口疮病毒增殖的永生化羊睾丸细胞系。

2.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)将SV40大T抗原基因克隆至慢病毒转移载体pSFG得到重组质粒pSFG-T。

3.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述的包装载体是Gag-pol包装载体。

4.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述的衣壳表达质粒是VSV-G衣壳表达质粒。

5.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的羊睾丸原代细胞的制备方法包括：

(a)取新鲜采集的羊睾丸，用75％酒精清洗后再用灭菌PBS清洗，去除筋膜和结缔组织；

(b)将处理后的羊睾丸剪碎，用灭菌PBS清洗后，加入0.25％胰酶消化；加入含10％新生牛血清的DMEM培养基终止消化；

(c)将羊睾丸细胞均匀分散开后过滤，将细胞分散计数，培养，获得羊睾丸原代细胞。

6.按照权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(c)所述的培养是置于细胞培养瓶中在37℃CO₂培养箱培养。

7.由权利要求1-6任何一项所述的构建方法得到的永生化羊睾丸细胞系。

8.按照权利要求7所述的永生化羊睾丸细胞系，其特征在于，其命名为羊睾丸细胞DST-3。

9.权利要求7所述的永生化羊睾丸细胞系在研制羊口疮病毒弱毒疫苗中的应用。

10.权利要求7所述的永生化羊睾丸细胞系在研制羊口疮病毒灭活疫苗中的应用。