CN101016536A - 乙型肝炎病毒细胞株HepG2－RHBV的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2－RHBV的构建，属人体疾病的预防与治疗的前期研究。本发明构建能稳定表达HBV相关抗原并复制的HepG2细胞株，作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外；以HepG2－RHBV细胞株应用于抗HBV药物的筛选；以构建的HepG2－RHBV细胞株为基础，进一步研究HBV对HepG2细胞的影响。由于本发明构建HBV自主复制的肝细胞株，使HBV在HepG2细胞中不仅能长期复制、表达特异性抗原及产生病毒颗粒，而且作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外，从而研究HBV对HepG2细胞的总体影响，分析HBV的可能致病机制，为临床治疗提供指导和依据。
Description
技术领域
本发明涉及人体疾病的预防与治疗的前期研究，具体的说是一种为临床治疗提供指导和依据的乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的构建。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种部分双链环状嗜肝DNA病毒，是迄今为止已发现的最小的DNA病毒，约3.2Kb，含4个开放读码框(ORF)，即Pre-S/S、Pre-C/C、Pol和X ORF，分别编码表面抗原(包括大、中、小表面抗原)、核心/e蛋白、DNA聚合酶及X蛋白。Pol ORF最长，Pre-S/S ORF完全与Pol ORF重叠，Pre-C/C ORF和X ORF也部分与Pol ORF重叠。HBV主要宿主是人类，具有高度种属和组织特异性，宿主范围狭窄。HBV可引起急慢性乙型肝炎，肝纤维化，并与原发性肝细胞癌的发生发展关系密切。
乙型肝炎的临床表现呈多样化，可由无症状携带者至急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎等，普遍认为HBV在肝细胞中增殖不会引起直接的肝细胞损伤，针对存在肝细胞表面的HBV抗原所引起宿主的细胞免疫应答，是肝细胞损伤的决定性因素。近来研究表明HBV的编码产物具有直接的致病作用。美国学者Foo等人发现，HBV表面抗原大蛋白可引起Huh7肝细胞空泡化和凋亡，提示HBV表面抗原大蛋白本身具有肝细胞致病性。此外X蛋白(HBx)是乙型肝炎病毒相关性肝细胞疾病最重要的致病因子之一，与HCC的发生、发展密切相关。HBx可激活HBV基因组转录，促进HBV复制；活化AP-1、NF-κB等转录因子，促进肝细胞原癌基因的转录，影响细胞生长周期，增强肿瘤细胞侵袭转移能力等。除正常的基因编码产物外，乙型肝炎病毒还可因基因组剪接产生新蛋白。现已证实某些HBV基因组剪接变异体产生的新蛋白具有肝细胞致病性，如诱导肝细胞凋亡，加重肝炎病情等。
目前，关于HBV编码蛋白功能的研究越来越多，但多是单组分研究，HBV对宿主的整体影响尚鲜见报道。事实上，HBV感染宿主细胞后的致病性是其各编码蛋白共同作用的总体结果，细胞模型和动物模型是研究HBV的主要途径，动物模型中黑猩猩是公认的HBV感染模型，由于黑猩猩数量有限，来源困难，价格昂贵，在实验中的应用有很大的困难。因此有学者试图寻找其它的动物模型，目前已有转X、S、C基因的转基因动物，这些部分片段转基因小鼠模型仅表达单一基因产物，不能产生病毒，不适宜研究病毒复制。HBV全长的转基因小鼠均不能检测到细胞内cccDNA。建立HBV细胞株是从整体水平研究HBV致病机制的重要途径。1986年美国学者Sells MA等用重组载体pDoLT-HBV-1(含2个HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联)转染HepG2细胞，经G418筛选，获得能够复制HBV的细胞克隆，即HepG2.2.15，是目前广泛使用的HBV细胞株，但在该细胞中HBV DNA整合于染色体上，其复制与转录可能受到其它启动子的影响，与HBV自然感染状态不同；由于缺乏严格的对照，在HBV功能研究中的应用受到了很大的限制。为此，本研究拟采用新策略构建HBV肝细胞株，使HBV在HepG2细胞中不仅能长期复制、表达特异性抗原及产生病毒颗粒，而且作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外，从而进一步研究HBV对HepG2细胞的总体影响，分析HBV的可能致病机制。
从包括中国专利在内的有关资料检索表明，目前尚未见到乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的构建的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是要：
1.构建能稳定表达HBV相关抗原并复制的HepG2细胞株，该细胞株中HBV不仅能长期复制、表达特异性抗原及产生病毒颗粒，而且作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外。
2.以HepG2-HBV细胞株应用于抗HBV药物的筛选。
3.以构建的HepG2-HBV细胞株为基础，进一步研究HBV对HepG2细胞的总体影响，分析HBV的致病机制，为临床治疗提供指导和依据。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的构建，其特征是：
1、试剂：
p56为pUC18重组载体，含全基因组HBV DNA，HBV DNA的preS2起始密码由CTG定点突变成ATG；HepG2细胞及HepG2.2.15细胞购自ATCC，均以含10％小牛血清的DMEM培养。
真核表达载体pREP10、DMEM、Lipofectamine2000培养基及小牛血清购自Invitrogen公司；Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity购自Invitrogen公司；限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；蛋白酶K购自Merck公司；潮霉素(Hygromycin)、DNase I、RNaseA、DNA探针标记试剂盒(Random primerDNA labeling kit)购自Roche公司；pSEAP2-Basic载体购自Clontech公司；胶回收及质粒小量抽提试剂盒购自Promega公司；质粒大量抽提试剂盒购自Qiagen公司；HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂盒购自上海科华生物公司、32P-dCTP购自北京亚辉公司。
2、构建1.2倍体HBV DNA重组真核表达载体
(1)片段A的获取
以引物TBf和TBr(TBf：5’ACGC
GTCGACAATAAAATATCTTTATTTTC3’下划线为Sal I酶切位点，TBr：5’CGC
GGATCCAGAGAAATGTTCTGGCACC3’下划线为BamH I酶切位点)从质粒pSEAP2-Basic中扩增0.1Kb的TB片段(Transcription Blocker)，总体积为50ul，反应体系如下：10×High Fidelity PCRBuffer 5μl，10mM dNTP mixture 1μl(0.2mM each)，50mM MgSO4 2μl(2mM)，TBf(10μM)1μl(0.2μM)，TBr(10μM)1μl(0.2μM)，pSeap2-Basic(10μg/μl)1μl(10μg)，Platinum Taq High Fidelity 0.2μl(1.0U)，ddH2O 38.8μl，共50μl。用ABI 9700 PCR扩增仪扩增，采用热启动方式，待温度上升至94℃后加入聚合酶，反应经94℃预变性2分钟后进入循环，即，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环；循环结束后72℃延伸7分钟；PCR产物与0.2倍体积的6×DNA上样缓冲液混匀后上样，1.5％琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，稳压120V，电泳30分钟；在紫外灯下将含目的基因片段的琼脂糖凝胶切下，置离心管中，用胶回收试剂盒回收DNA片段，每100mg琼脂糖凝胶加入300μl Solution I，65℃水浴10分钟，每隔两分钟颠倒一次，使胶完全溶解。混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；吸附柱中加入500μl Solution II，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；同法以solution II液重复洗柱一次；空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置2分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌双蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA。
PCR回收产物以Sal I、BamH I酶切，反应体系20μl，成份如下：PCR回收产物14μl(0.5μg)，10×BamH I Buffer 2μl，10×BSA 2μl，BamH I 1μl(20U)，Sal I 1μl(20U)，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收(方法同前)，该片段记为A。
(2)片段B的获取
以Sap I完全酶切p56-mut，反应体系100μl，成份如下：p56-mut 60μl(10μg)，10×Buffer4 10μl，Sap I 5μl(10U)，ddH2O 25μl，共100μl，37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收3.2kb的片段即完整的全基因组HBV DNA(方法同前)；回收产物进行自身连接，反应体系20μl，成份如下：酶切回收产物17μl(5μg)，10×Ligase Buffer 2μl，Ligase 1μl(1U)，共20μl，4℃连接24h，连接产物用DNA纯化试剂盒纯化，加入250μl Solution I，混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；吸附柱中加入500μlSolution II，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；同法以solution II液重复洗柱一次；空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置2-3分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌双蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA；获得的环状HBV DNA记为#56-mut HBVDNA，以BamH I和Xba I双酶切，反应体积20μl，体系如下：#56-mut HBV DNA14μl(0.5μg)，10×Buffer2 2μl，10×BSA 2μl，BamH I 1μl(20U)，Xba I 1μl(20U)，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收约2.0Kb片段(方法同前)，该片段记为B。
(3)片段C的获取
以Xba I和Rsr II双酶切p56-mut，反应体积20μl，体系如下：p56-mut 4μl(0.5μg)，10×Buffer4 2μl，10×BSA 2μl，Rsr II 1μl(4U)，Xba I 1μl(20U)，ddH2O 10μl，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约1.3Kb片段，该片段记为C。
(4)片段D的获取
用引物PC和PD(PC：5’CATTTCCATGGCTGCTAGGC 3’，PD：5’ACGC
GTCGACGAGA TCTCGAATAGAAGGAAAG 3’，下划线为Sal I酶切位点)从#56-mut HBV DNA中扩增0.6Kb DNA，总体积为50ul，反应体系如下：10×High Fidelity PCR Buffer 5μl，10mM dNTP mixture 1μl(0.2mM each)，50mMMgSO4 2μl(2mM)，PC(10μM)1μl(0.2μM)，PD(10μM)1μl(0.2μM)，#56-mutHBV DNA(0.12μg/μl)1μl(0.12μg)，Platinum Taq High Fidelity 0.2μl(1.0U)，ddH2O 38.8μl，共50μl，PCR扩增条件同前，1.5％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约0.6Kb片段，并以RsrII酶切，反应体积20μl，体系如下：PCR回收产物17μl(1.5μg)，10×Buffer4 2μl，Rsr II 1μl(4U)，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经DNA纯化试剂盒纯化，纯化产物用SalI酶切，反应体积20μl，体系如下：纯化产物15μl(0.5μg)，10×Sal I Buffer 2μl，10×BSA 2μl，Sal I1μl(20U)，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约0.4Kb片段，该片段记为D。
(5)pREP10载体的酶切
以Sal I切除pREP10载体上的真核表达盒相关片段，包括CMV启动子、多克隆位点、SV40加尾信号等，反应体积20μl，体系如下：pREP10 2μl(0.5μg)，10×Sal I Buffer 2μl，10×BSA2μl，Sal I 1μl(20U)，ddH2O 13μl，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约8.2Kb载体片段。
(6)目的片段与载体的连接及转化
以Sal I切除pREP10载体后回收的8.2Kb载体片段与上述A-D四个片段连接，构建重组载体pREP-HBV，反应体积30μl，体系如下：载体片段4μl，10×Ligase Buffer 3μl，Ligase 3μl(3U)，片段A 5μl，片段B 5μl，片段C 5μl，片段D 5μl，共30μl，4℃连接24h，将连接产物加入100μl感受态Top10细菌，冰浴30分钟，42℃热休克2分钟，快速置冰浴2分钟，加入0.8ml LB培养液，37℃、300rpm/分钟摇育45分钟；4000g离心2分钟收集细菌，将细菌涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育16小时。
(7)筛选重组克隆
氨苄青霉素琼脂平板上挑取菌落，转种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、300rpm/分钟摇育8小时；取1.5ml菌液用质粒小量抽提试剂盒提取质粒，4000g离心2分钟收集细菌，加入250μl Solution I(25mM Tis-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)震荡重悬细菌，加入250μl Solution II(0.2N NaOH，1％SDS)，颠倒混匀至菌液变清，加入350μl Solution III(3M KAc，pH5.5)，混匀；12000g离心10分钟，上清移入吸附柱内，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入500μl SolutionIV，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入650μl SolutionV，10000g离心1分钟，弃收集管内的液体，同法重复洗柱一次，弃收集管内的液体，空柱12000g离心2分钟；在吸附柱中央加入30μl灭菌三蒸水，12000g离心1分钟洗脱质粒DNA，该质粒记为pREP-HBV。
pREP-HBV质粒含A-D四个外源DNA片段：A为扩增自pSEAP2-Basic载体的TB(Transcription Blocker)片段；B、C、D共同组成1.2倍体HBV DNA，由此构成一个完整的HBV转录单位，其中B片段位于HBV基因组1402nt-249nt，其5’端含HBV的核心启动子(Basic Core promoter，BCP)，C片段位于HBV基因组249nt-1573nt，D片段位于HBV基因组1573nt-2000nt，其3’端含加尾信号；取5μl质粒DNA，以Sal I酶切，反应体积为20μl，体系如下：pREP-HBVDNA 5μl(0.5μg)，10×Sal I Buffer 2μl，10×BSA 2μl，Sal I 1μl(20U)，ddH2O 10μl，共20μl，37℃水浴5小时，产物以1％的琼脂糖凝胶电泳。pREP-HBV经SalI酶切出现两条DNA带，分别为8.2kb和3.9kb，后者由1.2倍体HBV DNA(3.8Kb)及TB片段(0.1Kb)组成；经BamH I酶切后，在8.9kb和3.2kb处可见两条DNA带，后者为1单位长度的HBV DNA；上述酶切结果与预期符合；相关序列以ABI3730型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定，测序引物如下：
P1：5’AGACCACCAAATGCCCCTATC 3’
P2：5’GGGTCACCATATTCTTGGGAAC 3’
P3：5’CTCCGCGAGGACTGGGGACCC 3’
P4：5’GCCATTTGTTCAGTGGTTCG 3’
P5：5’CGCATGCGTGGAACCTTTGTG 3’
PCR：5’AAGCCCAGTAAAGTTTCCCAC 3’
Rep10-7：5’GTTGTACCAACCAACTGAAG 3’
Reo10-1087：5’GTCCACGACTGGACTGAGCAG 3’
测序结果证实1.2倍体HBV DNA(3.8Kb)与原模板序列完全一致。
3、质粒DNA抽提、定量及DNA转染
以Qiagen Plasmid Midi Kits大量抽提pREP-HBV质粒；菌株按1∶100接种至500ml LB培养液(含氨苄青霉素100μg/ml)，37℃震荡培养16小时；4000g离心10分钟收集细菌，加入10ml P1液，震荡重悬菌体；加入10ml P2液裂解细菌，置室温3分钟，使菌体完全裂解。加入10ml P3液，颠倒混合，冰浴20分钟；20000g离心30分钟，收集上清液体缓慢注入已用10ml QBT缓冲液平衡的Qiagen-tip500纯化柱，待样品滴完后用30ml QC缓冲液洗柱两次，后用15mlQF缓冲液洗脱DNA；洗脱液中加入10.5ml异丙醇，20000g离心30分钟，以5ml 70％乙醇漂洗DNA沉淀，42℃温箱中干燥5分钟后，将DNA溶于500μl灭菌三蒸水；取所获DNA 10μl，以紫外分光光度计测定OD260、OD280及比值，确定浓度为0.459μg/μl，OD260/OD280为1.968。
HepG2细胞以含10％小牛血清的DMEM培养HepG2细胞，传代之前以0.25％胰酶、0.1％EDTA进行消化，按6×105细胞/孔，接种至6孔细胞培养板；20小时后，换新鲜的培养液(此时平皿中细胞覆盖已达80-90％)，4小时后进行转染；将Qiagen试剂盒大量抽提的质粒pREP-HBV，以Lipofectamine2000转染细胞；转染的质粒DNA量与Lipofectamine2000用量比例为1μg∶2μl；转染16小时后加入250μg/ml潮霉素筛选，每3d换培养液一次(含潮霉素)，约3周后形成抗潮霉素细胞集落，挑取细胞集落置24孔板，继续用含潮霉素的培养液培养、扩增、冻存。
本发明的检测：
1、HBsAg及HBeAg检测
以Lipofectamine2000将pREP-HBV重组体转染HepG2细胞并以潮霉素筛选，获得抗性克隆，命名为HepG2-RHBV。扩增细胞，收集第5、10、20、30、40代潮霉素抗性细胞培养上清，用ELISA法检测HBV特异抗原HBeAg、HBsAg的表达情况。各代细胞均能表达HBsAg和HBeAg，且随着细胞培养天数的延长，培养液中HBsAg和HBeAg含量逐渐增高。
2、细胞内HBV病毒颗粒DNA的提取及Southern印迹检测HBV DNA
潮霉素抗性细胞接种在60mm平皿中，每皿细胞量为1.8×106，培养3d后的细胞以冰预冷的PBS洗2遍。以裂解液(10mM Tris，pH 7.9，1mM EDTA，50mMNaCl，1％NP40，8％蔗糖)裂解细胞，离心后保留上清，加入35％PEG8000/1.75mol/L NaCl浓缩裂解液中的HBV核心颗粒，并以DNase I、RNaseA处理，以确保完全降解可能残留的pREP-HBV。病毒核心颗粒以SDS/蛋白酶K消化12h，饱和酚、酚/氯仿各抽提1次，乙醇沉淀病毒DNA并溶于20μl去离子水。提取的HBV DNA于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，常规虹吸转移至尼龙膜。以随机引物法制备探针，所用模板为全长HBV DNA，以32P-dCTP标记。核酸杂交按常规方法进行。结果显示第5、10、20、30、40代潮霉素抗性细胞均可见明显的杂交拖带，说明存在HBV DNA复制中间体，提示获得的潮霉素抗性细胞内有HBV复制。条带密度扫描显示各代细胞的杂交信号相对强度分别为20.86、11.04、16.98、19.68、10.72。
3、电镜检测HBV颗粒
取潮霉素抗性细胞培养上清液约20ml，8000rpm(HITACHI R21A Rotor)离心30min，取上清。在超速离心管底部先加入1ml TNE垫液(10mM Tris，pH7.4，1mM EDTA，100mM NaCl，20％Sucrose)，缓慢注入上述离心后的上清，经40000rpm(Beckman Optima LE-80K超速离心机，NVT65 Rotor)4℃离心5h，弃上清，沉淀加入50μl PBS重悬后作磷钨酸负染，在电镜下检查病毒颗粒情况，可见成簇的直径约为42nm左右的HBV样颗粒以及直径为22～26nm的球形颗粒。
本发明乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的构建所得到的人肝癌细胞株HepG2-RHBV，已保存到中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2006年11月30日，编号CCTCC NO：C200635，该生物材料分类命名为人肝癌细胞株HepG2-RHBV(ren gan ai xi bao zhu HepG2-RHBV)。
本发明的有益效果是：由于本发明构建HBV自主复制的肝细胞株，使HBV在HepG2细胞中不仅能长期复制、表达特异性抗原及产生病毒颗粒，而且作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外，从而研究HBV对HepG2细胞的总体影响，分析HBV的可能致病机制，为临床治疗提供指导和依据。
附图说明
以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的描述。
图1重组载体pREP-HBV构建过程。
图1示片段A从质粒pSEAP2-Basic中扩增，片段B从#56-mut HBV DNA以BamHI和Xba I双酶切获得，片段C以Xba I和Rsr II双酶切p56-mut，片段D从#56-mutHBV DNA中扩增，A、B、C、D四个片段与切除表达元件pREP10载体连接后得到pREP-HBV。
图2是图1的1.2倍体HBV组成结构。
图3重组载体pREP-HBV酶切鉴定结果。
图3中1为Sal I切除表达盒的载体pREP10，为8.2kb；2为BamH I酶切的pREP-HBV，分别为8.9kb和3.2kb；3为Sal I酶切的pREP-HBV，分别为8.2kb和3.9kb；M为λDNA/HindIII DNA Marker。
图4不同代数HepG2-RHBV细胞及HepG2.2.15 HBsAg表达情况。
图4中横座标为时间，纵座标为HBsAg(P/N比值)，不同图示代表不同代数细胞，
第5代
第10代
第20代
第30代
第40代
HepG2.2.15
图5不同代数HepG2-RHBV细胞及HepG2.2.15 HBeAg表达情况。
图5中横座标为时间，纵座标为HBeAg(P/N比值)，不同图示代表不同代数细胞，
第5代
第10代
第20代
第30
第40代
HepG2.2.15
图6HepG2-RHBV细胞克隆southern blotting检测结果。
图6中1、2、3、4、5分别代表第5、10、20、30、40代潮霉素抗性细胞，M为DNA Marker
图7浓缩的细胞培养上清病毒颗粒电镜检测结果(bar为100nm)。
具体实施方式
实施例1：
请参阅各视图。
(一)试剂
p56为pUC18重组载体，含全基因组HBV DNA；分离自慢性乙型肝炎患者(男性，42岁)，编号#56，长3215bp，基因型B，GeneBank登录号AF100309，该HBV DNA preS2起始密码发生变异，为CTG。p56-mut为p56突变体，将#56HBV DNA的preS2起始密码由CTG定点突变成ATG。HepG2细胞及HepG2.2.15细胞购自ATCC，均以含10％小牛血清的DMEM培养。
(二)构建1.2倍体HBV DNA重组真核表达载体(pREP-HBV构建过程见图1)
1.片段A的获取
以引物TBf和TBr(TBf：5’ACGC
GTCGACAATAAAATATCTTTATTTTC3’下划线为Sal I酶切位点，TBr：5’CGC
GGATCCAGAGAAATGTTCTGGCACC3’下划线为BamH I酶切位点)从质粒pSEAP2-Basic中扩增0.1Kb的TB片段(Transcription Blocker)，总体积为50ul，反应体系如下：反应体系如下：10×High Fidelity PCR Buffer 5μl，10mM dNTP mixture 1μl(0.2mM each)，50mMMgSO4 2μl(2mM)，TBf(10μM)1μl(0.2μM)，TBr(10μM)1μl(0.2μM)，pSeap2-Basic(10μg/μl)1μl(10μg)，Platinum Taq High Fidelity 0.2μl(1.0U)，ddH2O38.8μl，共50μl。用ABI 9700 PCR扩增仪扩增，采用热启动方式，待温度上升至94℃后加入聚合酶，反应经94℃预变性2分钟后进入循环，即，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环；循环结束后72℃延伸7分钟。PCR产物与0.2倍体积的6×DNA上样缓冲液混匀后上样，1.5％琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，稳压120V，电泳30分钟。在紫外灯下将含目的基因片段的琼脂糖凝胶切下，置离心管中，用胶回收试剂盒回收DNA片段，每100mg琼脂糖凝胶加入300μl Solution I，65℃水浴10分钟，每隔两分钟颠倒一次，使胶完全溶解。混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体。吸附柱中加入500μl SolutionII，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体。同法以solutionII液重复洗柱一次。空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置2分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌三蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA。
PCR回收产物以Sal I、BamH I酶切，反应体系20μl，成份如下：PCR回收产物14μl(0.5μg)，10×BamH I Buffer 2μl，10×BSA2μl，BamH I 1μl(20U)，Sal I 1μl(20U)，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收(方法同前)，该片段记为A。
2.片段B的获取
以Sap I完全酶切p56-mut，反应体系100μl，成份如下：p56-mut 60μl(10μg)，10×Buffer4 10μl，Sap I 5μl(10U)，ddH2O 25μl，共100μl，37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收3.2kb的片段即完整的全基因组HBV DNA(方法同前)；回收产物进行自身连接，反应体系20μl，成份如下：酶切回收产物17μl(5μg)，10×Ligase Buffer 2μl，Ligase 1μl(1U)，共20μl，4℃连接24h，连接产物用DNA纯化试剂盒纯化，加入250μl Solution I，混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；吸附柱中加入500μlSolutionII，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；同法以solutionII液重复洗柱一次；空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置2-3分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌双蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA；获得的环状HBV DNA记为#56-mut HBVDNA，以BamH I和Xba I双酶切，反应体积20μl，体系如下：#56-mut HBV DNA14μl(0.5μg)，10×Buffer2 2μl，10×BSA 2μl，BamH I 1μl(20U)，Xba I 1μl(20U)，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收约2.0Kb片段(方法同前)，该片段记为B。
3.片段C的获取
以Xba I和RsrII双酶切p56-mut，反应体积20μl，体系如下：p56-mut 4μl(0.5μg)，10×Buffer4 2μl，10×BSA 2μl，Rsr II 1μl(4U)，Xba I 1μl(20U)，ddH2O 10μl，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收约1.3Kb片段(方法同前)，该片段记为C。
4.片段D的获取
用引物PC和PD(PC：5’CATTTCCATGGCTGCTAGGC 3’，PD：5’ACGC
GTCGACGAGA TCTCGAATAGAAGGAAAG 3’，下划线为Sal I酶切位点)从#56-mut HBV DNA中扩增0.6 Kb DNA，总体积为50ul，反应体系如下：10×High Fidelity PCR Buffer 5μl，10mM dNTP mixture 1μl(0.2mM each)，50mMMgSO4 2μl(2mM)，PC(10μM)1μl(0.2μM)，PD(10μM)1μl(0.2μM)，#56-mutHBV DNA(0.12μg/μl)1μl(0.12μg)，Platinum Taq High Fidelity 0.2μl(1.0U)，ddH2O 38.8μl，共50μl，PCR扩增条件同前，1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收约0.6Kb片段(方法同前)，并以RsrII酶切，反应体积20μl，体系如下：PCR回收产物17μl(1.5μg)，10×Buffer4 2μl，RsrII 1μl(4U)，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经DNA纯化试剂盒纯化(方法同前)，纯化产物用SalI酶切，反应体积20μl，体系如下：纯化产物15μl(0.5μg)，10×Sal I Buffer 2μl，10×BSA 2μl，SalI 1μl(20U)，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收约0.4Kb片段(方法同前)，该片段记为D。
5.pREP10载体的酶切
以Sal I切除pREP10载体上的真核表达盒相关片段，包括CMV启动子、多克隆位点、SV40加尾信号等，反应体积20μl，体系如下：pREP10 2μl(0.5μg)，10×Sal I Buffer 2μl，10×BSA 2μl，Sal I 1μl(20U)，ddH2O 13μl，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收约8.2Kb载体片段(方法同前)。
6.目的片段与载体的连接及转化
以Sal I切除pREP10载体后回收的8.2Kb载体片段与上述A-D四个片段连接，构建重组载体pREP-HBV，反应体积30μl，体系如下：载体片段4μl，10×Ligase Buffer 3μl，Ligase 3μl(3U)，片段A 5μl，片段B 5μl，片段C 5μl，片段D 5μl，共30μl，4℃连接24h，将连接产物加入100μl感受态Top10细菌，冰浴30分钟，42℃热休克2分钟，快速置冰浴2分钟，加入0.8ml LB培养液，37℃、300rpm/分钟摇育45分钟；4000g离心2分钟收集细菌，将细菌涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育16小时。
7.筛选重组克隆
氨苄青霉素琼脂平板上挑取菌落，转种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、300rpm/分钟摇育8小时。取1.5ml菌液用质粒小量抽提试剂盒提取质粒，4000g离心2分钟收集细菌，加入250μl Solution I(25mM Tis-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)震荡重悬细菌，加入250μl Solution II(0.2N NaOH，1％SDS)，颠倒混匀至菌液变清，加入350μl Solution III(3M KAc，pH5.5)，混匀。12000g离心10分钟，上清移入吸附柱内，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入500μl SolutionIV，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入650μl SolutionV，10000g离心1分钟，弃收集管内的液体，同法重复洗柱一次，弃收集管内的液体，空柱12000g离心2分钟。在吸附柱中央加入30μl灭菌三蒸水，12000g离心1分钟洗脱质粒DNA，该质粒记为pREP-HBV。
pREP-HBV质粒含A-D四个外源DNA片段(见图1B)。A为扩增自pSEAP2-Basic载体的TB(Transcription Blocker)片段；B、C、D共同组成1.2倍体HBVDNA，由此构成一个完整的HBV转录单位，其中B片段位于HBV基因组1402nt-249nt，其5’端含HBV的核心启动子(Basic Core promoter，BCP)，C片段位于HBV基因组249nt-1573nt，D片段位于HBV基因组1573nt-2000nt，其3’端含加尾信号。取5μl质粒DNA，以Sal I酶切(37℃水浴5小时)，反应体积为20μl，体系如下：pREP-HBV DNA 5μl(0.5μg)，10×Sal I Buffer 2μl，10×BSA 2μl，Sal I 1μl(20U)，ddH2O 10μl，共20μl，37℃水浴5小时，产物以1％的琼脂糖凝胶电泳。
pREP-HBV经Sal I酶切出现两条DNA带(见图2)，分别为8.2kb和3.9kb，后者由1.2倍体HBV DNA(3.8Kb)及TB片段(0.1Kb)组成；经BamH I酶切后，在8.9kb和3.2kb处可见两条DNA带，后者为1单位长度的HBV DNA。上述酶切结果与预期符合。相关序列以ABl3770型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定，测序引物如下：
P1：5’AGACCACCAAATGCCCCTATC 3’
P2：5’GGGTCACCATATTCTTGGGAAC 3’
P3：5’CTCCGCGAGGACTGGGGACCC 3’
P4：5’GCCATTTGTTCAGTGGTTCG 3’
P5：5’CGCATGCGTGGAACCTTTGTG 3’
PCR：5’AAGCCCAGTAAAGTTTCCCAC 3’
Rep10-7：5’GTTGTACCAACCAACTGAAG 3’
Reo10-1087：5’GTCCACGACTGGACTGAGCAG 3’
测序结果证实1.2倍体HBV DNA(3.8Kb)与原模板序列完全一致。
(三)质粒DNA抽提、定量及DNA转染
以Qiagen Plasmid Midi Kits大量抽提pREP-HBV质粒。菌株按1∶100接种至500ml LB培养液(含氨苄青霉素100μg/ml)，37℃震荡培养16小时。4000g离心10分钟收集细菌，加入10ml P1液，震荡重悬菌体。加入10ml P2液裂解细菌，置室温3分钟，使菌体完全裂解。加入10ml P3液，颠倒混合，冰浴20分钟。20000g离心30分钟，收集上清液体缓慢注入Qiagen-tip500纯化柱(已用10ml QBT缓冲液平衡)，待样品滴完后用30ml QC缓冲液洗柱两次，后用15ml QF缓冲液洗脱DNA。洗脱液中加入10.5ml异丙醇，20000g离心30分钟，以5ml 70％乙醇漂洗DNA沉淀，42℃温箱中干燥5分钟后，将DNA溶于500μl灭菌三蒸水。取所获DNA 10μl，以紫外分光光度计测定OD260、OD280及比值，确定浓度为0.459μg/μl，OD260/OD280为1.968。
HepG2细胞以含10％小牛血清的DMEM培养HepG2细胞，传代之前以0.25％胰酶、0.1％EDTA进行消化，按6×105细胞/孔，接种至6孔细胞培养板。20小时后，换新鲜的培养液(此时平皿中细胞覆盖已达80-90％)，4小时后进行转染。将Qiagen试剂盒大量抽提的质粒pREP-HBV，以Lipofectamine2000转染细胞。转染的质粒DNA量与Lipofectamine2000用量比例为1μg∶2μl。转染16小时后加入250μg/ml潮霉素筛选，每3d换培养液一次(含潮霉素)，约3周后形成抗潮霉素细胞集落，挑取细胞集落置24孔板，继续用含潮霉素的培养液培养、扩增、冻存。
Claims (16)
1、一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的构建，其特征是：
(一)试剂：
p56为pUC18重组载体，含全基因组HBV DNA，HBV DNA的preS2起始密码由CTG定点突变成ATG；HepG2细胞及HepG2.2.15细胞，均以含10％小牛血清的DMEM培养；
(二)构建1.2倍体HBV DNA重组真核表达载体
(1)片段A的获取
以引物TBf和TBr从质粒pSEAP2-Basic中扩增0.1Kb的TB片段Transcription Blocker，总体积为50ul，用ABI 9700 PCR扩增仪扩增，采用热启动方式，待温度上升至94℃后加入聚合酶，反应经94℃预变性2分钟后进入循环，循环结束后72℃延伸7分钟；PCR产物与0.2倍体积的6×DNA上样缓冲液混匀后上样，1.5％琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，稳压120V，电泳30分钟；在紫外灯下将含目的基因片段的琼脂糖凝胶切下，置离心管中，用胶回收试剂盒回收DNA片段，每100mg琼脂糖凝胶加入300μl Solution I，65℃水浴10分钟，每隔两分钟颠倒一次，使胶完全溶解；混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；吸附柱中加入500μl Solution II，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；再以solution II液重复洗柱一次；空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置2分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌双蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA；
PCR回收产物以Sal I、BamH I酶切，反应体系20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收，该片段记为A；
(2)片段B的获取
以Sap I完全酶切p56-mut，反应体系100μl，37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收3.2kb的片段即完整的全基因组HBV DNA；回收产物进行自身连接，反应体系20μl，4℃连接24h，连接产物用DNA纯化试剂盒纯化，加入250μl Solution I，混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；吸附柱中加入500μl Solution II，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；再以solution II液重复洗柱一次；空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置3分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌双蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA；获得的环状HBV DNA记为#56-mut HBV DNA，以BamH I和Xba I双酶切，反应体积20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收约2.0Kb片段，该片段记为B；
(3)片段C的获取
以Xba I和Rsr II双酶切p56-mut，反应体积20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收1.3Kb片段，该片段记为C；
(4)片段D的获取
用引物PC和PD从#56-mut HBV DNA中扩增0.6Kb DNA，总体积为50ul；PCR扩增条件同前，1.5％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约0.6Kb片段，并以Rsr II酶切，反应体积20μl；37℃水浴16h，酶消化产物经DNA纯化试剂盒纯化，纯化产物用SalI酶切，反应体积20μl；37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约0.4Kb片段，该片段记为D；
(5)pREP10载体的酶切
以Sal I切除pREP10载体上的真核表达盒相关片段，包括CMV启动子、多克隆位点、SV40加尾信号，反应体积20μl；37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约8.2Kb载体片段；
(6)目的片段与载体的连接及转化
以Sal I切除pREP10载体后回收的8.2Kb载体片段与A-D四个片段连接，构建重组载体pREP-HBV，反应体积30μl，4℃连接24h，将连接产物加入100μl感受态Top10细菌，冰浴30分钟，42℃热休克2分钟，快速置冰浴2分钟，加入0.8ml LB培养液，37℃、300rpm/分钟摇育45分钟；4000g离心2分钟收集细菌，将细菌涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育16小时；
(7)筛选重组克隆
氨苄青霉素琼脂平板上挑取菌落，转种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、300rpm/分钟摇育8小时；取1.5ml菌液用质粒小量抽提试剂盒提取质粒，4000g离心2分钟收集细菌，加入250μl Solution I(25mM Tis-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)震荡重悬细菌，加入250μl Solution II(0.2N NaOH，1％SDS)，颠倒混匀至菌液变清，加入350μl Solution III(3M KAc，pH5.5)，混匀；12000g离心10分钟，上清移入吸附柱内，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入500μl SolutionIV，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入650μl SolutionV，10000g离心1分钟，弃收集管内的液体，同法重复洗柱一次，弃收集管内的液体，空柱12000g离心2分钟；在吸附柱中央加入30μl灭菌三蒸水，12000g离心1分钟洗脱质粒DNA，该质粒记为pREP-HBV；
pREP-HBV质粒含A-D四个外源DNA片段：A为扩增自pSEAP2-Basic载体的TB(Transcription Blocker)片段；B、C、D共同组成1.2倍体HBV DNA，由此构成一个完整的HBV转录单位，其中B片段位于HBV基因组1402nt-249nt，其5’端含HBV的核心启动子(Basic Core promoter，BCP)，C片段位于HBV基因组249nt-1573nt，D片段位于HBV基因组1573nt-2000nt，其3’端含加尾信号；取5μl质粒DNA，以Sal I酶切，反应体积为20μl，37℃水浴5小时，产物以1％的琼脂糖凝胶电泳；pREP-HBV经Sal I酶切出现两条DNA带，分别为8.2kb和3.9kb，后者由1.2倍体HBV DNA(3.8Kb)及TB片段(0.1Kb)组成；经BamH I酶切后，在8.9kb和3.2kb处可见两条DNA带，后者为1单位长度的HBV DNA；上述酶切结果与预期符合；相关序列以ABI3730型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定，测序引物如下：
P1：5’AGACCACCAAATGCCCCTATC 3’
P2：5’GGGTCACCATATTCTTGGGAAC 3’
P3：5’CTCCGCGAGGACTGGGGACCC 3’
P4：5’GCCATTTGTTCAGTGGTTCG 3’
P5：5’CGCATGCGTGGAACCTTTGTG 3’
PCR：5’AAGCCCAGTAAAGTTTCCCAC 3’
Rep10-7：5’GTTGTACCAACCAACTGAAG 3’
Reo10-1087：5’GTCCACGACTGGACTGAGCAG 3’
(三)质粒DNA抽提、定量及DNA转染
以Qiagen Plasmid Midi Kits大量抽提pREP-HBV质粒；菌株按1∶100接种至500ml LB培养液(含氨苄青霉素100μg/ml)，37℃震荡培养16小时；4000g离心10分钟收集细菌，加入10ml P1液，震荡重悬菌体；加入10ml P2液裂解细菌，置室温3分钟，使菌体完全裂解；加入10ml P3液，颠倒混合，冰浴20分钟；20000g离心30分钟，收集上清液体缓慢注入1用10ml QBT缓冲液平衡的Qiagen-tip500纯化柱，待滴完后用30ml QC缓冲液洗柱两次，后用15ml QF缓冲液洗脱DNA；洗脱液中加入10.5ml异丙醇，20000g离心30分钟，以5ml 70％乙醇漂洗DNA沉淀，42℃温箱中干燥5分钟后，将DNA溶于500μl灭菌三蒸水；取所获DNA 10μl，以紫外分光光度计测定OD260、OD280及比值，确定浓度为0.459μg/μl，OD260/OD280为1.968；
HepG2细胞以含10％小牛血清的DMEM培养HepG2细胞，传代之前以0.25％胰酶、0.1％EDTA进行消化，按6×105细胞/孔，接种至6孔细胞培养板；20小时后，换新鲜的培养液(此时平皿中细胞覆盖已达80-90％)，4小时后进行转染；将Qiagen试剂盒大量抽提的质粒pREP-HBV，以Lipofectamine2000转染细胞；转染的质粒DNA量与Lipofectamine2000用量比例为1μg∶2μl；转染16小时后加入250μg/ml潮霉素筛选，每3d换培养液一次(含潮霉素)，约3周后形成抗潮霉素细胞集落，挑取细胞集落置24孔板，继续用含潮霉素的培养液培养、扩增、冻存。
2、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的以引物TBf和TBr从质粒pSEAP2-Basic中扩增0.1Kb的TB片段用ABI 9700 PCR扩增仪扩增，采用热启动方式，待温度上升至94℃后加入聚合酶，反应经94℃预变性2分钟后进入循环，即94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环。
3、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的PCR回收产物以Sal I、BamH I酶切，反应体系20μl，成份如下：PCR回收产物14μl(0.5μg)，10×BamH I Buffer 2μl，10×BSA 2μl，BamHI 1μl(20U)，Sal I 1μl(20U)，共20μl。
4、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的以Sap I完全酶切p56-mut，反应体系100μl，成份如下：p56-mut60μl(10μg)，10×Buffer4 10μl，Sap I 5μl(10U)，ddH2O 25μl，共100μl。
5、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的引物TBf：5’ACGC
GTCGACAATAAAATATCTTTATTTTC 3’下划线为Sal I酶切位点；TBr：5’CGC
GGATCCAGAGAAATGTTCTGGCACC 3’下划线为BamH I酶切位点。
6、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的引物TBf和TBr从质粒pSEAP2-Basic中扩增0.1Kb的TB片段，总体积为50ul，反应体系如下：10×High Fidelity PCR Buffer 5μl，10mM dNTPmixture 1μl(0.2mM each)，50mM MgSO4 2μl(2mM)，TBf(10μM)1μl(0.2μM)，TBr(10μM)1μl(0.2μM)，pSeap2-Basic(10μg/μl)1μl(10μg)，Platinum Taq HighFidelity 0.2μl(1.0U)，ddH2O 38.8μl，共50μl。
7、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的以Sap I完全酶切p56-mut，反应体系100μl，37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收3.2kb的片段即完整的全基因组HBV DNA；回收产物进行自身连接，反应体系20μl，成份如下：酶切回收产物17μl(5μg)，10×Ligase Buffer 2μl，Ligase 1μl(1U)，共20μl。
8、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的环状HBV DNA记为#56-mut HBV DNA，以BamH I和XbaI双酶切，反应体积20μl，体系如下：#56-mut HBV DNA 14μl(0.5μg)，10×Buffer22μl，10×BSA 2μl，BamH I 1μl(20U)，Xba I 1μl(20U)，共20μl。
9、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的以Xba I和Rsr II双酶切p56-mut，反应体积20μl，体系如下：p56-mut 4μl(0.5μg)，10×Buffer4 2μl，10×BSA2μl，RsrII 1μl(4U)，Xba I 1μl(20U)，ddH2O 10μl，共20μl。
10、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的引物PC：5’CATTTCCATGGCTGCTAGGC 3’，PD：5’ACGC
GTCGACGAGA TCTCGAATAGAAGGAAAG 3’，下划线为Sal I酶切位点。
11、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的引物PC和PD从#56-mut HBV DNA中扩增0.6Kb DNA，总体积为50ul，反应体系如下：10×High Fidelity PCR Buffer 5μl，10mM dNTPmixture 1μl(0.2mM each)，50mM MgSO4 2μl(2mM)，PC(10μM)1μl(0.2μM)，PD(10μM)1μl(0.2μM)，#56-mut HBV DNA(0.12μg/μl)1μl(0.12μg)，PlatinumTaq High Fidelity 0.2μl(1.0U)，ddH2O 38.8μl，共50μl；PCR扩增条件同前，1.5％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约0.6Kb片段，并以Rsr II酶切，反应体积20μl；体系如下：PCR回收产物17μl(1.5μg)，10×Buffer4 2μl，Rsr II1μl(4U)，共20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经DNA纯化试剂盒纯化，纯化产物用SalI酶切，反应体积20μl，体系如下：纯化产物15μl(0.5μg)，10×SalI Buffer 2μl，10×BSA 2μl，Sal I 1μl(20U)，共20μl。
12、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的以Sal I切除pREP10载体上的真核表达盒相关片段，反应体积20μl，体系如下：pREP10 2μl(0.5μg)，10×Sal I Buffer 2μl，10×BSA 2μl，Sal I 1μl(20U)，ddH2O 13μl，共20μl。
13、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的以Sal I切除pREP10载体后重组载体pREP-HBV，反应体积30μl，体系如下：载体片段4μl，10×Ligase Buffer 3μl，Ligase 3μl(3U)，片段A5μl，片段B 5μl，片段C 5μl，片段D 5μl，共30μl。
14、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的建立，其特征是：所述的5μl质粒DNA，以Sal I酶切，反应体积为20μl，体系如下：pREP-HBV DNA 5μl(0.5μg)，10×Sal I Buffer 2μl，10×BSA 2μl，Sal I 1μl(20U)，ddH2O 10μl，共20μl。
15、乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的检测：其特征是：
(1)HBsAg及HBeAg检测
以Lipofectamine2000将pREP-HBV重组体转染HepG2细胞并以潮霉素筛选，获得抗性克隆，命名为HepG2-RHBV。扩增细胞，收集第5、10、20、30、40代潮霉素抗性细胞培养上清，用ELISA法检测HBV特异抗原HBeAg、HBsAg的表达情况；
(2)细胞内HBV病毒颗粒DNA的提取及Southern印迹检测HBV DNA
潮霉素抗性细胞接种在60mm平皿中，每皿细胞量为1.8×106，培养3d后的细胞以冰预冷的PBS洗2遍；以裂解液裂解细胞，离心后保留上清，加入35％PEG8000/1.75mol/L NaCl浓缩裂解液中的HBV核心颗粒，并以DNase I、RNase A处理，以确保完全降解可能残留的pREP-HBV。病毒核心颗粒以SDS/蛋白酶K消化12h，饱和酚、酚/氯仿各抽提1次，乙醇沉淀病毒DNA并溶于20μl去离子水；提取的HBV DNA于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，常规虹吸转移至尼龙膜；以随机引物法制备探针，所用模板为全长HBV DNA，以32p-dCTP标记；
(3)电镜检测HBV颗粒
取潮霉素抗性细胞培养上清液约20ml，8000rpm，离心30min，取上清；在超速离心管底部先加入1ml TNE垫液10mM Tris，pH7.4，1mM EDTA，100mMNaCl，20％Sucrose，缓慢注入上述离心后的上清，经40 000rpm，4℃离心5h，弃上清，沉淀加入50μl PBS重悬后作磷钨酸负染，在电镜下检查病毒颗粒情况，可见成簇的直径约为42nm左右的HBV样颗粒以及直径为22～26nm的球形颗粒。
16、根据权利要求15所述的乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的检测：其特征是：裂解液为10mM Tris，pH 7.9，1mM EDTA，50mM NaCl，1％NP40，8％蔗糖。
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2006
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