CN102816737A - 基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物动物细胞系领域,涉及一种基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,尤其涉及一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT及其制备方法。本发明将HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT转染HepG2细胞后,通过潮霉素筛选,检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生,获得高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT;所述的细胞株其表达HBsAg、HBeAg水平明显高于HepG2.2.15,表达水平稳定,受培养环境等因素影响少,整合的HBV基因型为B或C基因型,所述的细胞对LAM及ADV均敏感,HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。本发明的基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,可用于中国人群HBV发病或耐药机制的研究和可用于筛选抗HBV药物。
Description
技术领域
本发明属微生物动物细胞系领域,具体涉及一种基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,尤其涉及一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT)及其制备方法。
背景技术
本领域公知,HBV细胞模型是筛选抗药物、研究其生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具。尤其在研究有关肝疾病的发病机制、免疫机制、抗病毒药物的筛选中具有重要作用;其中,Hep2.2.15细胞是HBV细胞模型开发研究的里程碑,有研究显示,其用含2个HBV头对尾二聚体的pDolt-HBV-1重组载体转染HepG2细胞,经G418筛选后获得一个产高水平HBsAg和HBeAg的细胞克隆,其胞内外均能检测到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒颗粒。迄今,Hep2.2.15仍是相关领域应用最为广泛的HBV细胞模型。
然而,HepG2.2.15在HBV研究方面仍存在下述缺陷:(1)HepG2.2.15HBV蛋白如HBsAg、HBeAg表达水平相对较低,不利于相关病毒蛋白的研究,且与HBV-DNA一样,其表达水平不稳定,受培养环境等因素影响较多;(2)其整合的HBV基因型非B、C基因型,对于研究中国人群HBV发病或耐药机制方面的研究存在相当的局限性。鉴于中国是肝炎发病大国,Hep2.2.15显然已经不能完全满足目前相关的研究,国内目前的有关研究需要良好的HBV细胞模型和实验平台。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足,提供一种基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,尤其涉及一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT)及其制备方法。
本发明的细胞系有利于中国人群HBV发病或耐药机制方面的深入研究,可进一步用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型的建立。
本发明的基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,能持续表达HBsAg及HBeAg,胞 内有HBV复制,并可产生HBV颗粒;与所述的的Hep2.2.15细胞相比,本发明的细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15,细胞上清HBV颗粒水平与Hep2.2.15基本持平。
本发明尤其提供了一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT),所述的细胞株HepG2.HSWT其整合的HBV基因型为B或C基因型;该细胞株对LAM及ADV均敏感;HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。
本发明将HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT转染HepG2细胞后,通过潮霉素筛选,然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生,并与Hep2.2.15细胞株相比较,最终建成基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,获得高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT,已于2011年6月1日保藏,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号:CGMCC No.4909,分类命名:人肝癌细胞株HepG2.HSWT。
本发明中,所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT,来源于福建医科大学分子病毒实验室;
所述质粒的载体骨架为pREP10载体,该载体的优势在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于细胞筛选工作以及EBNA-1基因转录蛋白能够上调含OriP复制原点的真核表达质粒中基因转录和表达;
所述HBV复制子为含cp启动子以及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体(B型,GeneBank登录号AF100309),插入切除RSV启动子的pREP10,构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT。
本发明的细胞株具有以下生物学特性:能持续表达HBsAg及HBeAg,胞内有HBV复制,并可产生HBV颗粒;与目前广泛使用的Hep2.2.15相比,其表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15,细胞上清HBV颗粒水平与Hep2.2.15基本持平,该细胞株整合的HBV基因型为B或C基因型;其对LAM及ADV均敏感;HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。
本发明的高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT)通过下述方法和步骤制备:
(1)质粒转染HepG2细胞
①细胞培养:HepG2细胞以DMEM培养液培养;
所述培养液来源于Gibco公司,培养液中含10%小牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,0.03%谷氨酰胺;
②细胞转染:将处于生长对数期的细胞,以0.25%胰酶消化,吸去胰酶后,用细胞培养液吹打成单个细胞悬液,计数;按5×105细胞/孔的浓度接种至6孔培养板,培养18-24小时后,待细胞约80-90%融合成片时,换新鲜无抗生素的培养液,准备转染;按照每孔转染2μg的量,将50μl OptiDMEM培养液与5μl Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合,同时将2μg质粒DNA稀释于50μl OptiDMEM培养液中,混匀后室温静置5分钟;将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和,室温静置20分钟;将混合物均匀滴加入6孔板中,6小时后用PBS清洗2遍后换新鲜培养液,继续培养;
(2)潮霉素筛选细胞克隆
①转染后细胞培养24小时后扩大培养至10cm培养皿,并设空白对照(未转染HepG2细胞);
②待细胞贴壁后加入潮霉素浓度至300ug/ml;
③每3天换液一次;
④约14-21天待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况;
⑤挑取细胞克隆至24孔培养板,以潮霉素浓度150ug/ml继续培养;
⑥待24孔培养板中细胞克隆密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平;
⑦获取6株HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆,将阳性克隆传至6孔培养板以潮霉素浓度150ug/ml继续培养;
(3)细胞克隆的有限稀释
步骤(2)中获得的6株阳性克隆中的1株细胞克隆,HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平较高,经定量后上清HBsAg为30IU/ml左右,HBeAg水平60PeIU/ml左右,HBV-DNA水 平维持于104-105copies/ml;细胞传至10代左右,采用有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆;
将处于生长对数期的细胞,以0.25%胰酶消化,吸去胰酶后,用细胞培养液吹打成单个细胞悬液,计数后细胞密度稀释为10cell/ml,接种96孔培养板,每孔150ul培养基(含潮霉素浓度150ug/ml);显微镜下观察每孔细胞数,标记只接种1cell的培养孔,继续培养,每周换液一次;2-3周后待细胞密度约60%左右后传至24孔培养板继续培养;待24孔中细胞密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平,将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高的一株细胞克隆定义为pREP-HBV-WT;
(4)HBV野生型细胞株的生物学特征及表型耐药分析
①细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测
HBsAg及HBeAg精确定量试剂盒采用Abbott公司Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit,HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒,检测步骤按照试剂盒提供的说明书中记载的步骤,real-time PCR扩增仪采用ABI-7300,检测结果如图1所示;
②细胞内病毒复制检测
细胞总DNA抽提,6孔板中细胞90%汇合度时加入400ul细胞裂解液,37℃过夜(细胞裂解液1XSDS/Pronase buffer,2mg/ml pronase、50mM Tris.HCl Ph7.5、10mM EDTA、100mM NaCl、0.2%SDS),加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE。1.3%凝胶电泳后20XSSC转膜,southern-blot杂交;结果显示HBV杂交信号提示胞内HBV复制;
③HBV野生型细胞株细胞表型耐药分析
105cell/孔细胞密度接种12孔板,细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物,拉米夫定设0、0.1uM、0.3uM、1uM、3uM、10uM、30uM、100uM 8个浓度梯度,阿德福韦设0、0.1uM、0.3uM、1uM、3uM、10uM 6个浓度梯度,每个浓度梯度设复孔,隔天换液,第10天检测细胞上清HBV-DNA水平,细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况。
检测分析所述的高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT,结果显示,细胞上清HBV-DNA水平随LAM以及ADV浓度梯度升高从104下降至检测水平以下,表明对LAM 及ADV均敏感(如图2所示);杂交结果显示,HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。
本发明建立了一种基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,尤其是高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT),该细胞系HBsAg、HBeAg表达水平明显高于HepG2.2.15,表达水平稳定,受培养环境等因素影响少,且整合的HBV基因型为B或C基因型,有利于研究中国人群HBV发病或耐药机制,可用于筛选抗HBV药物。
附图说明
图1显示了pREP-HBV(WT)HBV细胞株上清HBsAg、HBeAg表达水平,HBsAg水平维持于20-40IU/ml之间,为Hep2.2.15细胞2-4倍左右;HBeAg水平40-70PeIU/ml之间,为Hep2.2.15细胞4-8倍左右,HBV-DNA维持于104-105之间,略低于Hep2.2.15细胞,随传代次数增加无明显下降。
图2显示了pREP-HBV(WT)HBV细胞株耐药表型分析,细胞上清HBV-DNA水平随LAM和ADV浓度梯度升高从104下降至检测下限之下,表明对LAM及ADV均敏感。
图3显示了pREP-HBV(WT)HBV细胞株细胞上清HBV-DNA基因测序结果表明野生型,与转染质粒相同。
图4为pREP-HBV(WT)细胞株镜下细胞形态图,其中,左图为高倍镜下(20×)细胞形态图,右图为低倍镜下(10×)细胞形态图。
具体实施方式
实施例1建立HepG2.HSWT细胞株
将HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT转染HepG2细胞后,通过潮霉素筛选,然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生,并与Hep2.2.15细胞株相比较,最终建成基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,获得高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT,已于2011年6月1日保藏,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号:CGMCC No.4909,分类命名:人肝癌细胞株HepG2.HSWT。
所述的细胞株HepG2.HSWT通过下述方法和步骤制备:
(1)质粒转染HepG2细胞
①细胞培养:HepG2细胞以DMEM培养液培养;
所述培养液来源于Gibco公司,培养液中含10%小牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,0.03%谷氨酰胺;
②细胞转染:将处于生长对数期的细胞,以0.25%胰酶消化,吸去胰酶后,用细胞培养液吹打成单个细胞悬液,计数;按5×105细胞/孔的浓度接种至6孔培养板,培养18-24小时后,待细胞约80-90%融合成片时,换新鲜无抗生素的培养液,准备转染;按照每孔转染2μg的量,将50μl OptiDMEM培养液与5μl Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合,同时将2μg质粒DNA稀释于50μl OptiDMEM培养液中,混匀后室温静置5分钟;将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和,室温静置20分钟;将混合物均匀滴加入6孔板中,6小时后用PBS清洗2遍后换新鲜培养液,继续培养;
(2)潮霉素筛选细胞克隆
①转染后细胞培养24小时后扩大培养至10cm培养皿,并设空白对照(未转染HepG2细胞);
②待细胞贴壁后加入潮霉素浓度至300ug/ml;
③每3天换液一次;
④约14-21天待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况;
⑤挑取细胞克隆至24孔培养板,以潮霉素浓度150ug/ml继续培养;
⑥待24孔培养板中细胞克隆密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平;
⑦获取6株HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆,将阳性克隆传至6孔培养板以潮霉素浓度150ug/ml继续培养;
(3)细胞克隆的有限稀释
步骤(2)中获得的6株阳性克隆中的1株细胞克隆,HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平较高,经定量后上清HBsAg为30IU/ml左右,HBeAg水平60PeIU/ml左右,HBV-DNA水平维持于104-105copies/ml;细胞传至10代左右,采用有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆;
将处于生长对数期的细胞,以0.25%胰酶消化,吸去胰酶后,用细胞培养液吹打成单个细胞悬液,计数后细胞密度稀释为10cell/ml,接种96孔培养板,每孔150ul培养基 (含潮霉素浓度150ug/ml);显微镜下观察每孔细胞数,标记只接种1cell的培养孔,继续培养,每周换液一次;2-3周后待细胞密度约60%左右后传至24孔培养板继续培养;待24孔中细胞密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平,将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高的一株细胞克隆定义为pREP-HBV-WT;
(4)HBV野生型细胞株的生物学特征及表型耐药分析
①细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测
HBsAg及HBeAg精确定量试剂盒采用Abbott公司Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit,HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒,检测步骤按照试剂盒提供的说明书中记载的步骤,real-time PCR扩增仪采用ABI-7300,检测结果如图1所示;
②细胞内病毒复制检测
细胞总DNA抽提,6孔板中细胞90%汇合度时加入400ul细胞裂解液,37℃过夜(细胞裂解液1XSDS/Pronase buffer,2mg/ml pronase、50mM Tris.HCl Ph7.5、10mM EDTA、100mM NaCl、0.2%SDS),加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE。1.3%凝胶电泳后20XSSC转膜,southern-blot杂交;结果显示HBV杂交信号提示胞内HBV复制;
③HBV野生型细胞株细胞表型耐药分析
105cell/孔细胞密度接种12孔板,细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物,拉米夫定设0、0.1uM、0.3uM、1uM、3uM、10uM、30uM、100uM 8个浓度梯度,阿德福韦设0、0.1uM、0.3uM、1uM、3uM、10uM 6个浓度梯度,每个浓度梯度设复孔,隔天换液,第10天检测细胞上清HBV-DNA水平,细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况。
实施例2测试HepG2.HSWT细胞株
如图1所示,pREP-HBV(WT)HBV细胞株上清HBsAg、HBeAg表达水平,HBsAg水平维持于20-40IU/ml之间,为Hep2.2.15细胞2-4倍左右;HBeAg水平40-70PeIU/ml之间,为Hep2.2.15细胞4-8倍左右,HBV-DNA维持于104-105之间,略低于Hep2.2.15细胞,随传代次数增加无明显下降。
如图2所示,pREP-HBV(WT)HBV细胞株耐药表型分析的结果表明,细胞上清HBV-DNA 水平随LAM和ADV浓度梯度升高从104下降至检测下限之下,表明对LAM及ADV均敏感。
如图3所示,pREP-HBV(WT)HBV细胞株细胞上清HBV-DNA基因测序结果表明野生型,与转染质粒相同。
结果显示,所述的高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT,细胞上清HBV-DNA水平随LAM以及ADV浓度梯度升高从104下降至检测水平以下,表明对LAM及ADV均敏感;杂交结果显示,HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。
Claims (6)
1.基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,其特征在于,所述细胞系为高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株,保藏编号:CGMCC No.4909,分类命名:高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT;具有以下生物学特性:
能持续表达HBsAg及HBeAg,胞内有HBV复制,并产生HBV颗粒;与Hep2.2.15相比,其表达HBsAg及HBeAg高于Hep2.2.15,细胞上清HBV颗粒水平与Hep2.2.15基本持平,其整合的HBV基因型为B或C基因型;其对LAM及ADV均敏感;HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。
2.按权利要求1所述的细胞系的制备方法,其特征在于,将HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT转染HepG2细胞后,通过潮霉素筛选,然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生,并与Hep2.2.15细胞株相比较,最终建成基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系,获得高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT。
3.按权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT的载体骨架为pREP10载体。
4.按权利要求2方法,其特征在于,所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT通过含cp启动子及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体,B型(GeneBank登录号AF100309)的复制子插入切除RSV启动子的pREP10,构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT。
5.权利要求1的基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系在筛选抗HBV药物中的用途。
6.按权利要求5所述的用途,其特征在于,所述的基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系选自高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT。
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CN114149975B (zh) * | 2021-09-16 | 2023-07-07 | 济宁医学院 | 一种特定hbv序列插入到特定基因区域的细胞模型及其构建方法与应用 |
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