CN103436494B - C基因型阿德福韦酯耐药hbv稳定复制表达细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明构建了一种耐阿德福韦酯乙型肝炎病毒（HBV）稳定复制表达细胞系，病毒来源于中国阿德福韦酯耐药慢乙肝患者，为我国流行的C基因型HBV株，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有核苷酸类似物阿德福韦酯耐药突变位点。本发明通过筛选方法使病毒基因组整合到人类肝癌细胞系HepG2细胞染色体上，产生病毒的自主复制和完整的生命周期循环。病毒抗原分泌稳定，病毒DNA复制活跃，培养上清可检测到病毒颗粒，细胞核内具有稳定水平的HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）。该细胞系中的HBV复制对现有核苷（酸）类药物阿德福韦酯耐药，对拉米夫定、恩替卡韦和替诺福韦酯敏感。本发明的细胞系可为抗耐药HBV药物的评价及新药研发提供稳定可靠的细胞模型。
Description
技术领域
本发明属于微生物动物细胞系领域，涉及一种乙型肝炎病毒（HBV）稳定复制表达细胞系，特别是所含病毒来源于我国患者C基因型HBV株，且其DNA聚合酶/逆转录酶（RT）区含有核苷酸类似物阿德福韦酯耐药突变位点的病毒稳定复制表达细胞系。
背景技术
建立HBV稳定复制细胞模型，具有完整的病毒生命周期并能长期持续分泌病毒颗粒，是进行体外抗HBV药物的标准化筛选以及研究抗病毒机制的必需工具。由于HBV基因组结构紧凑，不同的读码框架及调控序列高度重叠，需要构建携带大于一个完整3.2kb HBV基因组序列的重组载体才能在转染的细胞系里建立稳定的HBV复制状态，保证3.5kb前基因组RNA的有效转录。已有的研究证实从1.05拷贝至4.0拷贝质粒均可用于产生稳定复制细胞系。国内外学者经过不同的尝试，建立了数株HBV复制细胞系，如目前公认并广泛应用的整合了D基因型/ayw亚型野生HBV株的HepG2.2.15细胞【SellsMA，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84:1005-9】，可被四环素调控表达的HepAD38细胞【Ladner SK，et al.Antimicrob.Agents Chemother，1997，41:1715-20】以及Huh7.93细胞、HepG2.117细胞等【Sun DX，etal.J Hepatol，2006，45:636-45】。
HBV至少分为A～H等8种不同的基因型和若干基因亚型，不同基因型HBV的病毒学特点各异，影响疾病进展和临床转归，特别是抗HBV药物的敏感度有较大影响。而上述已建立的HBV复制细胞株所整合的HBV DNA是A基因型和D基因型HBV株，而中国患者流行的HBV株主要为C基因型及B基因型，尤其是中国北方地区84%的HBV感染患者为C基因型【Li X，et al.J Clin Microbiol，2010，48(12):4363-9】。因此，已有的HBV复制成熟细胞株不一定能适用于针对我国流行HBV的抗病毒药物的研究。
此外，随着抗HBV药物核苷和核苷酸类似物种类增加及在临床长期广泛应用，HBV耐药变异株逐渐出现并成为临床抗病毒治疗失败或疗效不佳的主要原因。最早上市的核苷类似物拉米夫定因很好的抗病毒疗效且价格便宜而广为临床应用，但该药耐药率较高(5年达70%)，而阿德福韦酯为第一个上市的核苷酸类似物，因能有效抑制LAM耐药病毒和野生病毒复制，而成为临床LAM耐药患者和初治患者的最常用抗病毒药物，然而长期应用仍有较高耐药率发生，原发阿德福韦酯耐药突变位点为rtA181V+rtN236T。
为满足耐药突变株的病毒学特性研究以及一些新研发的抗病毒药物的药效评价，耐药突变HBV稳定复制细胞株也相继在一些实验室建立。如Ladner等在1998年率先建立了拉米夫定耐药突变（rtM204V/I）稳定复制细胞株【Ladner SK，et al.Antimicrob AgentsChemother，1998，42:2128-31】，Seifer等通过人为定点突变野生D基因型病毒，产生8株不同含拉米夫定耐药突变（rtL180M+rtM204V/I）、阿德福韦酯耐药突变（rtN236T+rtA181V）、替诺福韦酯耐药突变（rtA194T）及替比夫定耐药突变（rtL80I/rtM204I）稳定复制细胞株【Seifer M，et al.Antiviral Research，2009，81:147-55】，分析评价药物的抗HBV活性。由于这些耐药突变株都是通过定点突变技术人为产生的，得到的仅为非自然存在的突变株，人为定点突变会修改病毒的某些自然遗传特征，难以完全反映患者血清直接分离耐药株的表型特征。
关于我国临床分离的C基因型阿德福韦酯耐药突变HBV稳定复制细胞系尚未见报道。如果能够从长期用阿德福韦酯治疗的中国乙肝患者血清分离克隆含有阿德福韦酯耐药突变位点的HBV基因序列，建立中国流行的C基因型阿德福韦酯耐药HBV稳定复制细胞模型，对于抗C基因型阿德福韦酯耐药HBV的防治和新药药效评价具有十分重要意义。
发明内容
本发明的目的是从来源于中国流行的C基因型HBV株中构建一种耐阿德福韦酯HBV稳定复制表达细胞系，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有阿德福韦酯耐药突变位点rtA181V+rtN236T。该阿德福韦酯耐药细胞系能用于各种核苷和核苷酸类似物的耐药表型分析，可为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。
本发明进行了如下工作：
1、从中国阿德福韦酯临床耐药的慢性乙型肝炎患者血清中分离C基因型HBV逆转录酶区序列，挑选含有典型的阿德福韦酯耐药突变位点rtA181V+rtN236T的克隆序列，构建含1.1倍长HBV基因组的真核细胞表达质粒。
2、建立了能够支持HBV长期高水平复制并稳定表达病毒抗原和分泌完整病毒颗粒的肝癌细胞系。所建的细胞系在中国典型培养物保藏中心（地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072）保藏，名称为阿德福韦酯耐药人HBV稳定复制细胞系HepG2.B111，保藏编号为CCTCC NO：C2012175；保藏时间为2012年11月21日。
3、通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫组化方法检测病毒抗原表达，通过对细胞质内HBV复制中间体中核心颗粒DNA、细胞核内HBV cccDNA水平和基因序列、培养上清中分泌的病毒DNA载量进行实时荧光定量PCR测定，以透射电镜观察浓缩的培养上清中HBV颗粒，评估稳定细胞克隆的复制表达情况。
4、以四种核苷和核苷酸类抗病毒药物处理HepG2.B111细胞，分析该细胞系的耐药表型特征。将拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替诺福韦酯分别作用于该细胞系，以荧光定量PCR及Southern杂交比较HBV核心颗粒DNA水平变化，分析表型耐药特性。结果表明该细胞系对阿德福韦酯高度耐药，对拉米夫定、恩替卡韦和替诺福韦酯敏感。
本发明提供了一种C基因型阿德福韦酯耐药HBV稳定复制表达细胞系HepG2.B111，在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）的保藏编号为CCTCC NO:C2012175，其特征在于能够持续表达HBsAg和HBeAg，细胞核内有稳定水平的HBV cccDNA，分泌高水平HBVDNA，并可产生完整病毒颗粒。
所述的细胞系，其特征在于所含病毒来源于中国流行的C基因型HBV株，且其DNA聚合酶/逆转录酶区含有典型的核苷酸类似物阿德福韦酯耐药突变位点：rtA181V+rtN236T。
所述的细胞系，其特征在于所述细胞系对核苷酸类似物阿德福韦酯耐药，对核苷类似物拉米夫定和恩替卡韦敏感，对核苷酸类似物替诺福韦酯敏感。
本发明还提供了所述的细胞系在筛选抗HBV药物、评价抗耐药HBV药物、HBV耐药监测以及交叉耐药分析中的应用。
本发明还提供了包含所述细胞系的组合物。
包含所述细胞系的组合物在筛选抗HBV药物、评价抗耐药HBV药物、HBV耐药监测以及交叉耐药分析中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明建立了C基因型阿德福韦酯耐药HBV稳定复制表达细胞系，其有益效果是：
1、能够持续支持HBV稳定高水平复制并产生特异性分泌抗原和分泌型病毒颗粒，能够稳定支持高抗原表达、病毒复制及病毒分泌；
2、病毒来源于中国患者流行的C基因病毒株，而非实验室人为定点突变获得；
3、含有典型的阿德福韦酯耐药突变位点，对目前常用核苷（酸）类抗病毒药物具有明确的敏感性或耐药特性。
本发明的HBV稳定复制表达细胞系为中国患者流行C基因型病毒株，为研究中国患者来源的阿德福韦酯耐药HBV的生物特性和药物筛选提供了一种实用工具，在针对中国人群HBV的耐药监测、交叉耐药分析和新药开发等方面具有较高应用价值。
附图说明
图1是重组载体pTriEx-1.1-HBV结构示意图；
图2是1.1倍HBV重组复制载体转染HepG2细胞后的克隆筛选图像，左图为×40倍放大；右图为×100倍放大；
图3是HepG2.B111细胞各代监测的HBsAg和HBeAg抗原表达、细胞内和上清HBV DNA水平；
图4是HepG2.B111细胞与HepG2.2.15细胞比较抗原分泌和DNA复制情况；
图5是HepG2.B111细胞、HepG2.2.15细胞和HepG2细胞内HBsAg（左图）和HBcAg（右图）免疫组化染色结果；
图6是HepG2.B111细胞分泌上清中扩增出3.2kb HBV全长PCR电泳图；
图7是HepG2.2.15细胞和HepG2.B111细胞核内HBV cccDNART基因扩增电泳图；
图8是细胞系上清分泌的HBV DNA和细胞核内HBV cccDNA的RT基因测序峰图，均显示典型的阿德福韦酯耐药突变位点（rtA181V+rtN236T）；
图9是浓缩HepG2.B111细胞培养上清病毒颗粒电镜结果，图中：A:42nm Dane颗粒B：20nm小球状表面抗原颗粒(×65,000；bar=200nm)；
图10是HepG2.B111细胞4种药物处理后的定量PCR表型分析结果；
图11是HepG2.B111细胞以阿德福韦酯和拉米夫定作用的Southern杂交结果。
生物材料保藏信息
培养物名称：阿德福韦酯耐药人HBV稳定复制细胞系HepG2.B111，保藏编号：CCTCC NO:C2012175；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072；
保藏时间：2012年11月21日。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中所使用的试剂和材料来源如下：
Taq DNA聚合酶及限制性内切酶均购自TaKaRa公司；
JM109感受态细胞购自Promega公司；
DNA凝胶回收试剂及转染级质粒提取试剂盒均购自Qiagen公司；
DMEM、无血清培养基购自Gibco公司；
转染试剂FuGENE HD及地高辛标记dUTP等Southern杂交试剂均购自Roche公司；
Taqman探针等荧光定量PCR试剂购自上海复星公司；
HBsAg和HBeAg定性检测ELISA试剂盒购自北京万泰公司；
不降解质粒的ATP依赖的DNA酶（PSAD）等滚环扩增试剂购自NEB公司；
免疫组化抗体和显色试剂为北京中杉公司产品；
其它生化试剂购自Sigma公司。
引物由上海生工公司合成，克隆测序由北京天一辉远生物科技公司完成。
人肝癌细胞系HepG2细胞及表达neo基因抗性的pSV2-neo质粒由解放军302医院病毒性肝炎研究室保存；
支持病毒复制的载体pTriEx-mod由法国里昂大学Fabien Zoulim教授馈赠。
血清（编号B111）取自2007年8月解放军第302医院确诊的慢性乙型肝炎患者，女，55岁，排除其它因素所致肝功能损害，长期阿德福韦酯抗病毒治疗，就诊时抗病毒治疗失败临床疑似阿德福韦酯耐药。分离扩增HBV RT基因并克隆于pGEM-Teasy载体中，进行基因测序，确定为C基因型。逆转录酶区核苷（酸）类似物耐药相关的氨基酸突变显示为rtA181V+rtN236T。
实施例1 1.1倍长HBV表达载体构建
该患者长期服用阿德福韦酯抗病毒治疗，病毒载量一直处于检测阴性(<250拷贝/ml)，转氨酶水平正常。就诊时出现病毒学突破，血清病毒载量由阴性增加到3.9log10HBV DNA，但仍达不到扩增全长基因组DNA的水平，因此采取扩增逆转录酶区全基因再以本课题组以前构建的pTriEx-1.1HBV-63-2重组载体为范本（该重组复制载体含异源鸡肌动蛋白启动子，能在体外高效启动HBV基因表达），酶切替换该患者含阿德福韦酯耐药突变的RT区。具体方法：用XhoI/NcoI分别消化pTriEx1.1-HBV-63-2及Teasy-RTB111载体，回收pTriEx-1.1HBV载体和RTB111片段，同一体系中以T4DNA连接酶连接，产生新的1.1倍HBV基因组重组载体pTriEx-1.1HBV-B111。1.1倍长HBV重组片段始于前C蛋白N端止于poly A尾，含有DR1、DR2、poly A等病毒转录复制所需的组件（图1）。在HBV序列内部合成5条引物进行全长测序鉴定，结果与原序列完全一致，逆转录酶区含有典型阿德福韦酯耐药突变位点rtA181V+rtN236T。
实施例2 稳定细胞系筛选
（1）质粒DNA转染和细胞克隆筛选提取转染级重组质粒pTriEx-1.1-HBV B111，紫外分光光度计定量浓度。在37℃、含有5%CO2、10%FBS的DMEM完全培养基中培养HepG2细胞。转染前将细胞接种到24孔板培养过夜，细胞融合达到80%时更换无血清和抗生素的DMEM，用FuGENE HD脂质体导入DNA，具体方法按操作手册进行。转染后5h补入FBS至10%。设置未转染孔为阴性对照。48h细胞培养皿内加入G418（终浓度600μg/ml）筛选，每隔2d换液，待对照组细胞完全死亡后换为维持浓度G418（300μg/ml）继续筛选，2～3周时形成细胞克隆（图2）。挑取细胞克隆至96孔板，以维持浓度的G418继续培养至大面积融合，定量检测上清分泌的抗原蛋白和HBV DNA，保留高表达株扩大培养。共对1925个细胞克隆进行了检测筛选。
（2）亚克隆将其中一株高HBsAg和HBeAg表达并且稳定产生高水平HBV DNA的细胞克隆进行有限稀释，具体方法：制备细胞悬液5×103个细胞/ml，倍比稀释50倍并调整悬液浓度为10个细胞/ml，接种于96孔板中，100μl/孔，每孔再补充100μl适应性培养基。细胞培养约1周左右，孔中形成较大克隆达到50％孔底面积时，转入48孔板并加入600μg/ml G418筛选。持续检测HBV抗原和HBVDNA，保留稳定高表达复制细胞一株命名为HepG2.B111，扩大培养，每3天传一代，稳定传代60代以上（>6个月），批量冻存。
实施例3 构建所得细胞系的相关检测
1、HBV主要抗原表达
（1）ELISA检测收集HepG2.B111细胞株第1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60代细胞培养上清液，ELISA（双抗体夹心法）检测HBsAg、HBeAg的水平，波长设为450nm。随细胞传代代数增加，抗原表达量逐渐增加并趋于稳定，平均OD值HBsAg为2.64，HBeAg为1.25（图3），相应的HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分别为0.93和3.01（图4）。
（2）免疫组化多聚赖氨酸处理的玻片置于6孔板内，加入HepG2.B111细胞5×105/孔，各2孔使细胞爬片72h，细胞固定后采用二步法进行免疫组化染色，一抗为兔抗HBs/抗HBc，1:100稀释使用；PV-9000替代传统二抗分子直接放大结合信号，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG多聚体；AEC液显色。结果显示细胞浆内有红染的阳性信号，HBsAg为浆型分布，HBcAg以核型分布为主，结果类似于HepG2.2.15细胞，阴性对照HepG2细胞未见染色（图5）。
2、稳定传代60代后HBV DNA检测
（1）上清全长HBV基因组扩增提取培养细胞分泌上清中的病毒DNA，根据Gunther的方法以引物PF（CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA）和PR（CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG）扩增全长基因组【Gunther S，et al.J Virol，1995，69:5437-5444】，3.2Kb处可见单一扩增条带（图6），PCR产物全长测序结果与原病毒序列完全一致，提示细胞产生了分泌性的完整病毒。
（2）上清及细胞内HBV DNA定量检测细胞传代3d后，先后经NP-40裂解，DNase/RNase和蛋白酶K消化后，用酚/氯仿抽提、异丙醇沉淀和乙醇漂洗后，分别提取细胞裂解液中的HBV核心颗粒DNA（即HBV复制中间体）和分泌上清中的HBV DNA。采用荧光定量PCR反应方法测定样本DNA量。分泌上清及细胞复制中间体核心颗粒DNA平均值分别为3.34×105拷贝/ml和6.04×107拷贝/ml。而相应的HepG2.2.15细胞分泌上清及细胞复制中间体核心颗粒DNA平均值分别为5.52×105拷贝/ml和6.10×107拷贝/ml。可见，本发明建立的HepG2.B111细胞株能够稳定支持HBV抗原分泌和DNA复制，检测指标与2215细胞相当（图3，图4）。
（3）细胞内cccDNA检测：以本课题组前期建立的滚环扩增法检测肝细胞内HBV共价闭合环状cccDNA【任晓强，等.解放军医学杂志，2009，34:675-678】。Qiagen DNA试剂盒提取约5×105个细胞的总DNA，包括细胞内rcDNA、dsDNA、ssDNA和cccDNA，以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶（PSAD）将非闭合DNA消化后进行滚环扩增反应，再以其为范本用跨缺口引物和Taqman探针介导进行实时荧光定量PCR反应，用β-actin作为内参校正实际细胞数，量化结果显示，HepG2.B111细胞株每个细胞内平均含有3.84个拷贝cccDNA分子。HepG2.B111细胞株和HepG2.2.15细胞的cccDNA均能扩增出RT区条带，而母本HepG2细胞显示为阴性（图7）。扩增后将产物测序分析显示HBV基因组RT区含有rtA181V+rtN236T突变，与细胞系上清分泌的HBV DNA RT序列结果一致，为典型的阿德福韦酯耐药突变（图8）。
3、电镜检测病毒颗粒
大量培养HepG2.B111细胞，取20ml病毒分泌上清3000rpm离心30min，0.22μm滤膜过滤。取12ml加至Amicon Ultra超滤离心管，置于固定角度离心转子中（滤膜面向上）5000g离心45min。定量检测超滤前后的病毒液HBV DNA，浓缩了约10～50倍，病毒载量达到106copies/ml，将其滴于有支持膜的铜网上，2%的磷钨酸负染。透射电镜下观察病毒典型的形态，可见到42nm左右大颗粒和20nm左右小球型颗粒（图9）。结果提示：本发明建立的HepG2.B111细胞株能够分泌完整HBV颗粒。
实施例4 细胞株用于4种抗病毒药物的体外表型分析
将获得的稳定细胞株HepG2.B111用目前常见核苷（酸）类似物：拉米夫定（LAM）、恩替卡韦（ETV）、阿德福韦酯（ADV）及替诺福韦酯（TDF）四种药物进行药物敏感性实验，以评价该细胞株实际应用效果。
细胞以7×104/ml密度接种在24孔板中，12h后更换为含5%FBS的DMEM培养基，加入上述四种药物，浓度分别设定为LAM：0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L；ETV：0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L；ADV：0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0μmol/L；TDF：0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L，连续更新5天含相同浓度药物的培养基。随后提取细胞核心颗粒，用于DNA的荧光定量PCR检测和Southern杂交分析，分别取25μL HBV核心颗粒溶液用Southern杂交检测病毒核心颗粒DNA。1%琼脂糖凝胶，50V电压电泳3～4h，0.3A的电流转膜20min，80℃固定2h。DIG Easy Hyb42℃预杂交30min，用含变性随机引物探针的DIG Easy Hyb42℃杂交过夜。化学发光法显色，压片拍照。改良寇氏法计算每种药物处理的50%病毒有效抑制率(EC50)。
结果一：不同药物处理HepG2.B111细胞的HBV核心颗粒DNA的荧光定量PCR分析：随着药物浓度增加ADV处理组病毒DNA没有明显下降，而LAM，ETV和TDF处理组HBV DNA随加药剂量增加而逐渐降低。ADV、LAM、ETV及TDF对该细胞系病毒株的EC50值分别为0.215μmol/L、0.0287μmol/L、0.0035μmol/L、0.231μmol/L，分别是HepG2.2.15细胞野生型病毒EC50的9.0倍、3.8倍、1.0倍和3.3倍。根据本领域权威文献【Lok AS，et al.Hepatology，2007，46(1):254-265.】报道，耐药倍数2～9倍为低水平耐药；10～99倍为中等水平耐药；大于100倍为强耐药，但在体外表型耐药实验中ADV敏感性较小幅度的增长（2～9倍）即可以导致明显耐药。因此，从本结果看出该细胞株复制的HBV对ADV具有高水平的耐药性，而对LAM、ETV和TDF仍然具有敏感性（图10）。
结果二：ADV和LAM作用HepG2.B111细胞后HBV核心颗粒DNA Southern杂交分析：结果显示HepG2.B111细胞株的HBV复制对ADV耐药，对LAM的抑制敏感，随着药物浓度增加ADV处理组HBV核心颗粒DNA没有明显下降，而LAM处理组HBV核心颗粒DNA逐渐降低，以rcDNA降低为主（图11）。
结论：阿德福韦酯耐药人HBV稳定复制细胞系HepG2.B111含有典型的阿德福韦酯耐药HBV突变病毒复制，对目前常用核苷（酸）类抗病毒药物具有明确的敏感性或耐药特性。
总之，本发明所述HBV稳定复制细胞系为中国流行C基因型病毒株，含有阿德福韦酯典型耐药突变，对目前常用核苷和核苷酸类抗病毒药物具有明确的敏感性或耐药性，能够稳定支持高抗原表达、病毒复制及病毒分泌。本发明细胞系在中国HBV的耐药监测、交叉耐药分析和新药开发等方面具有良好的应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.C基因型阿德福韦酯耐药HBV稳定复制表达细胞系HepG2.B111，在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）的保藏编号为：CCTCC NO:C2012175，其特征在于能够持续表达HBsAg和HBeAg，细胞核内有稳定水平的HBV cccDNA，分泌高水平HBV DNA，并可产生完整病毒颗粒。
2.权利要求1所述的细胞系，其特征在于所含病毒来源于中国流行的C基因型HBV株，且其DNA聚合酶/逆转录酶区含有典型的核苷酸类似物阿德福韦酯耐药突变位点：rtA181V+rtN236T。
3.权利要求1所述的细胞系，其特征在于所述细胞系对核苷酸类似物阿德福韦酯耐药，对核苷类似物拉米夫定和恩替卡韦敏感，对核苷酸类似物替诺福韦酯敏感。
4.权利要求1所述的细胞系在筛选抗HBV药物、评价抗耐药HBV药物、HBV耐药监测以及交叉耐药分析中的应用。
5.包含权利要求1所述细胞系的组合物。
6.权利要求5所述的组合物在筛选抗HBV药物、评价抗耐药HBV药物、HBV耐药监测或交叉耐药分析中的应用。
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| CN102399749A (zh) * | 2011-11-09 | 2012-04-04 | 中国人民解放军第三〇二医院 | 中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 |
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2013
- 2013-09-02 CN CN201310392782.3A patent/CN103436494B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399749A (zh) * | 2011-11-09 | 2012-04-04 | 中国人民解放军第三〇二医院 | 中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
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| 阿德福韦酯治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区新变异rtN236V的表型耐药特点分析;刘妍等;《解放军医学杂志》;20130401;第38卷(第4期);全文 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103436494A (zh) | 2013-12-11 |
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