CN102399749A - 中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 - Google Patents
中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102399749A CN102399749A CN2011103537560A CN201110353756A CN102399749A CN 102399749 A CN102399749 A CN 102399749A CN 2011103537560 A CN2011103537560 A CN 2011103537560A CN 201110353756 A CN201110353756 A CN 201110353756A CN 102399749 A CN102399749 A CN 102399749A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hbv
- virus
- cell
- cell line
- hepatitis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title abstract description 70
- 230000010076 replication Effects 0.000 title abstract description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 8
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 title 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 claims description 19
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 claims description 19
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 16
- 229960000980 entecavir Drugs 0.000 claims description 15
- YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N entecavir hydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)C1=C YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N 0.000 claims description 15
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 15
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 10
- -1 adefovir ester Chemical class 0.000 claims description 6
- 229960001997 adefovir Drugs 0.000 claims description 5
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- 101150104269 RT gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 abstract description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 5
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000002547 new drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 abstract description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 abstract 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000007771 core particle Substances 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 108091036055 CccDNA Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-CSMHCCOUSA-N telbivudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000050510 Cunninghamia lanceolata Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000024835 cytogamy Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000011450 sequencing therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960005311 telbivudine Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明构建了一株从13000余例中国慢性乙肝患者血清中分离得到的多重耐药人HBV的稳定复制细胞系。经实验证实,该细胞系能够持续进行HBV复制并合成分泌特异性抗原和分泌型完整病毒颗粒,能够稳定支持高抗原表达、病毒复制及病毒分泌;该细胞系含有典型的多重耐药突变位点,对目前常用核苷(酸)类抗病毒药物具有明确的敏感或耐药特性。该细胞系在针对中国人群HBV的耐药监测、交叉耐药分析和新药开发等方面具有较高应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)稳定复制表达细胞系,特别是所含病毒来源于我国患者C基因型HBV株,且具备多重耐药突变位点的HBV稳定复制表达细胞系。
背景技术
建立某种病毒的稳定复制细胞模型,产生具有完整的病毒生命周期并能长期持续分泌病毒颗粒,是进行体外抗病毒药物筛选以及研究抗病毒机制的必需工具。特别是在需要标准化的实验,如进行药物的抗病毒效果评价时,病毒的稳定复制表达细胞系的建立尤其重要。
由于HBV基因组不同的读码框架及调控序列之间相互重叠,需要携带大于一个完整3.2kb基因组序列的载体才能在转染的细胞系里建立稳定的HBV复制状态,保证3.5kb前基因组RNA的有效转录。已有的研究证实从1.05拷贝至4.0拷贝质粒均可产生稳定复制细胞系。国内外学者经过不同的尝试,建立了数株HBV复制细胞系,如目前公认并广泛应用的整合了D基因型/ayw亚型野生HBV株的HepG2.2.15细胞【Sells MA,et al.Proc Natl Acad SciUSA,1987,84:1005-9】,可被四环素调控表达的HepAD38细胞【Ladner SK,et al.Antimicrob.Agents Chemother,1997,41:1715-20】以及Huh7.93细胞、HepG2.117细胞等【Sun DX,et al.J Hepatol,2006,45:636-5】。
随着抗HBV药物核苷(酸)类似物种类增加及在临床长期广泛应用,HBV耐药突变株逐渐出现并成为临床抗病毒治疗失败或疗效不佳的主要原因。为满足耐药突变株的病毒学特性研究以及一些新研发的抗病毒药物的药效评价,耐药突变HBV稳定复制细胞株也相继在一些实验室建立。如Ladner等在1998年率先建立了拉米夫定(LAM)耐药突变(rtM204V/I)稳定复制细胞系【Ladner SK,et al.Antimicrob Agents Chemother,1998,42:2128-31】,Delaney等利用定点突变方法先后建立了LAM耐药突变(rtL180M±rtM204V/I),阿德福韦酯(ADV)耐药突变(rtA181V/T±rtN236T)细胞系【Delaney WE,et al.Antimicrob AgentsChemother,2001,45:1705-13】,Seifer等也人为突变野生D基因型病毒,产生8株不同含LAM耐药突变(rtL180M+rtM204V/I)、ADV耐药突变(rtN236T+rtA181V)、替诺福韦酯(TDF)耐药突变(rtA194T)及替比夫定(LdT)耐药突变(rtL80I/rtM204I)稳定复制细胞系【Seifer M,et al.Antiviral Research,2009,81:147-55】。
已知HBV至少分为A~H等8个不同的基因型和若干基因亚型,不同基因型的HBV复制表达细胞系具有不同的病毒学特点和表型耐药特征。上述建立的HBV复制细胞株所整合的是A基因型或D基因型HBV,而中国流行的HBV株主要为C基因型及B基因型,尤其是北方地区84%的HBV感染患者为C基因型【Li X,et al.J Clin Microbiol,2010,48(12):4363-9.】。另外,上述耐药突变HBV大多是通过人为定点突变产生,其建立的稳定复制细胞系表型特点并不能真实反映临床患者分离的HBV耐药株的病毒学特点,因此,已有的成熟细胞株难以适用于针对我国流行的C基因型HBV,尤其是耐药突变HBV的抗病毒药效研究。
值得注意的是,虽然目前我国临床上仅有4种核苷(酸)类抗HBV药物,用药组合方式却多达40余种,耐药变异形式也复杂多样。临床上核苷(酸)类药的长期序贯治疗有可能在产生针对第一种药物耐药的基础上,增加了对随后使用药物的耐药率,并增加了多重耐药病毒产生的风险。所谓的多重耐药病毒是指HBV基因组上同时含有核苷类药物(LAM、ETV、LdT)耐药位点和核苷酸类药物(ADV)耐药位点。多重耐药HBV感染的发生率的上升将给临床治疗带来新的挑战;多重耐药病毒可能的感染传播性将给公共卫生安全带来新的威胁。
为此,基于我国患者流行的C基因型HBV株,建立其DNA聚合酶/逆转录酶区含有同时针对核苷类似物拉米夫定(LAM)、恩替卡韦(ETV)和核苷酸类似物阿德福韦酯(ADV)的多重耐药突变位点稳定复制细胞系,是非常必要和迫切的。对于深入了解多重耐药HBV的表型特性,阐明其病毒学特征及体外感染力,帮助临床制订合理有效的防治策略具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是从来源于中国患者流行的C基因型HBV株中构建一种HBV稳定复制表达细胞系,其DNA聚合酶/逆转录酶区含有典型的同时针对核苷类似物拉米夫定(LAM)、恩替卡韦(ETV)和核苷酸类似物阿德福韦酯(ADV)的多重耐药突变位点。该耐药细胞系能用于各种核苷和核苷酸类似物的耐药表型分析,可为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。
本发明人进行了如下工作:
1、发明人经长期大量的筛选,从13000余例中国慢性乙肝患者血清中分离得到多重耐药HBV突变株,扩增得到了C基因型HBV逆转录酶区(RT)基因,挑选存在多重耐药突变位点的克隆序列,构建含1.1倍长HBV基因组的真核细胞表达质粒。
上述分离得到的突变细胞株命名为多重耐药人HBV稳定复制细胞系HepG2.1403F。已经在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC NO:C201162,保藏时间:2011年7月29日。
2、建立能够支持HBV长期高水平复制并稳定表达病毒抗原和分泌完整病毒颗粒的肝癌细胞系。所建的细胞系基因组中整合有GenBank GQ402162所示的HBV RT基因序列。
3、通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组化方法检测病毒抗原表达,通过对肝细胞质内HBV复制中间体中核心颗粒DNA、肝细胞核内共价闭合环状cccDNA、肝细胞培养上清中分泌的病毒DNA载量进行实时荧光定量PCR测定,以透射电镜观察浓缩的培养上清中HBV颗粒,评估稳定细胞克隆的复制表达情况。
4、以四种核苷和核苷酸类抗病毒药物用于体外表型分析,证实该细胞系的耐药表型特征。将LAM、ADV、ETV和TDF分别作用于该细胞系,通过比较其核心颗粒HBV DNA的荧光定量PCR及Southern杂交的结果分析其表型耐药特点。结果证明该细胞系对LAM、ETV和ADV高度耐药,对TDF敏感(见实施例4)。
本发明建立了多重耐药HBV稳定复制细胞系,其有益效果是:
1、能够持续HBV复制并产生特异性分泌抗原和分泌型病毒颗粒,能够稳定支持高抗原表达、病毒复制及病毒分泌;
2、病毒来源于中国流行的C基因病毒株,该多重耐药HBV突变株是经大样本筛选鉴定得到的,来自于13000余例中国乙肝患者;
3、含有典型的多重耐药突变位点,对目前常用核苷(酸)类抗病毒药物具有明确的敏感或耐药特性。
本发明的HBV稳定复制细胞系为中国流行C基因型病毒株,为研究中国患者来源的HBV的生物特性和药物筛选提供了一种实用工具,在针对对中国人群HBV的耐药监测、交叉耐药分析和新药开发等方面具有较高应用价值。
附图说明:
图1是重组载体pTriEx-1.1-HBV结构示意图;
图2是HepG2.1403F细胞各代DNA复制及HBsAg和HBeAg抗原表达情况;
图3是HepG2.1403F细胞与HepG2.2.15细胞平均分泌抗原及DNA定量比较结果。
图4是HepG2.1403F细胞、HepG2.2.15细胞和HepG2细胞内HBsAg和HBcAg免疫组化染色结果;
图5是HepG2.1403F细胞分泌上清中HBV全长PCR电泳图;
图6是Southern Blot检测HepG2.1403F细胞内不同形式病毒复制DNA结果;
图7是浓缩HepG2.1403F细胞培养上清病毒颗粒电镜结果,图中:A:42nm Dane颗粒B:20nm小球状表面抗原颗粒(×93,000;bar=200nm);
图8是HepG2.1403F细胞对4种药物敏感性的表型分析结果(定量PCR法);
图9是HepG2.1403F细胞对4种药物敏感性的表型分析结果(Dot Blot法);
生物材料保藏信息
培养物名称:多重耐药人HBV稳定复制细胞系HepG2.1403F
保藏编号:CCTCC NO:C201162
保藏单位:中国典型培养物保藏中心
保藏时间:2011年7月29日
具体实施方式
实施例中所使用的试剂和材料来源如下:
Taq DNA聚合酶及限制性内切酶均购自TaKaRa公司;
JM109感受态细胞购自Promega公司;
DNA凝胶回收试剂及转染级质粒提取试剂盒均购自Qiagen公司;
DMEM、无血清培养基购自Gibco公司;
转染试剂FuGENE HD及地高辛标记dUTP等Southern杂交试剂均购自Roche公司;
荧光定量PCR试剂Taqman PCR fluorescence detection kit for HBV购自上海复星公司;
HBsAg和HBeAg定性检测ELISA试剂盒购自北京科卫公司。
HBsAg定量检测由302医院临检中心完成。
其他生化试剂购自Sigma公司。
免疫组化抗体和显色试剂为北京中杉公司产品。
引物由上海生工公司合成。
克隆测序由北京天一辉远生物科技公司完成。
人肝癌细胞系HepG2细胞及表达neo基因抗性的质粒pSV2-neo由解放军302医院病毒性肝炎研究室保存;
支持病毒复制的载体pTriEx-mod由法国里昂大学Fabien Zoulim教授馈赠。
血清S5857取自2009年3月解放军第302医院确诊的慢性乙型肝炎患者,男,45岁,排除其他因素所致肝功能损害。提取血清中病毒DNA,扩增HBV逆转录酶区基因并克隆于pGEM-Teasy载体,挑取不同克隆进行测序,确定为C基因型。其中37-17#克隆核苷(酸)类似物耐药相关的氨基酸突变:rtL180M,rtS202G,rtM204V,rtN236T。
实施例1 1.1倍长HBV重组表达载体构建
由于该患者长期服用并经常更换核苷(酸)类药物,病毒载量检测阴性(<250拷贝/ml),未能扩增出HBV全基因组DNA,因此以本课题组以前构建的pTriEx-1.1HBV-63-2重组载体为模板,替换该患者含多药耐药突变的RT区。具体方法:用XhoI/NcoI分别消化pTriEx1.1-HBV-63-2及Teasy-RT37-17载体,回收pTriEx-1.1 HBV载体和RT37-17片段,同一体系中以T4 DNA连接酶连接,产生新的1.1倍HBV基因组重组载体pTriEx-1.1HBV-37-17-1。1.1倍长HBV重组片段始于前C蛋白N端止于polyA尾,含有DR1、DR2、polyA等病毒转录复制所需的元件(图1)。在HBV序列内部合成5条引物进行全长测序鉴定,结果与原序列完全一致,逆转录酶区含有典型多重耐药突变位点rtL180M,rtS202G,rtM204V,rtN236T。
实施例2稳定细胞系筛选
(1)质粒DNA转染和细胞克隆筛选提取转染级重组质粒pTriEx-1.1HBV-37-17-1,紫外分光光度计定量浓度。在37℃、含有5%CO2、10%FBS的DMEM完全培养基中培养HepG2细胞。转染前将细胞接种到24孔板培养过夜,细胞融合达到80%时更换无血清和抗生素的DMEM,用FuGENE HD脂质体导入DNA,具体方法按操作手册进行。转染后6h补入FBS至10%。设置未转染孔为阴性对照。48h细胞培养皿内加入G418(终浓度600μg/ml)筛选,每隔2d换液,待对照组细胞完全死亡后换为维持浓度G418(300μg/ml)继续筛选,2~3周时形成细胞克隆。挑取细胞克隆至96孔板,以维持浓度的G418继续培养至大面积融合,定量检测上清分泌的抗原蛋白和HBV DNA,保留高表达株扩大培养。
(2)亚克隆将其中一株高表达细胞克隆进行有限稀释,具体方法:制备细胞悬液5×103个细胞/ml,倍比稀释50倍并调整悬液浓度为10个细胞/ml,接种于96孔板中,100μl/孔,每孔再补充100μl适应性培养基。细胞培养约1周左右,孔中形成较大克隆达到50%孔底面积时,转入48孔板并加入600μg/ml G418筛选。持续检测HBV抗原和HBV DNA,保留稳定高表达复制细胞一株命名为HepG2.1403F,每3天传一代,稳定传代50代以上(>6个月),批量冻存。
实施例3对本发明所构建细胞系的检测
1.HBV主要抗原表达
(1)ELISA检测收集HepG2.1403F细胞系第5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60代(每3天传代1次)细胞培养上清液和HepG2.2.15对照组培养上清,ELISA(双抗体夹心法)检测HBsAg、HBeAg的表达,波长设为450nm。HepG2.1403F细胞平均OD值HBsAg为2.51±0.77,HBeAg为1.31±0.64(图2),相应的HepG2.2.15细胞分别为0.93±0.29和3.11±0.61(图3)。
(2)免疫组化多聚赖氨酸处理的玻片置于6孔板内,加入1403F细胞5×105/孔,各2孔,使细胞爬片72h,细胞固定后采用二步法进行免疫组化染色,一抗为兔抗HBs/抗HBc,1∶100稀释使用;PV-9000替代传统二抗分子直接放大结合信号,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG多聚体;AEC液显色。结果显示细胞浆内有红染的阳性信号,HBsAg为浆型分布,HBcAg以核型分布为主,结果类似于HepG2.2.15细胞,阴性对照HepG2细胞未见染色(图4)。
2.稳定传代50代后HBV DNA检测
(1)上清全长HBV基因组扩增提取培养细胞分泌上清中的病毒DNA,根据Gunther的方法以引物PF(CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA)和PR(CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG)扩增全长基因组【Gunther S,et al.J Virol,1995,69:5437-44】,3.2Kb处可见单一扩增条带,PCR产物全长测序结果与原病毒序列完全一致,提示细胞产生了分泌性的完整病毒(图5)。
(2)上清及细胞内HBV DNA定量检测细胞传代3d后,先后经NP-40裂解,DNase/RNase和蛋白酶K消化后,用酚/氯仿抽提、异丙醇沉淀和乙醇漂洗后,分别提取细胞裂解液中的HBV核心颗粒DNA(HBV复制中间体)和分泌上清中的HBV DNA。采用Taqman探针法进行绝对定量PCR反应,根据已设定的标准曲线计算样本DNA量。分泌上清及细胞复制中间体核心颗粒DNA分别为5.55×105和6.58×107拷贝/ml。而相应的HepG2.2.15细胞分泌上清及细胞复制中间体核心颗粒DNA分别为4.78×105和8.08×107拷贝/ml(图2)。可见,新建立的HepG2.1403F细胞系能够稳定支持HBV抗原分泌和DNA复制,与2215细胞相当(图3)。
(3)Southern印记检测取25μL HBV核心颗粒溶液用Southern杂交检测病毒复制中间体。1%琼脂糖凝胶,50V电压电泳3~4h,0.3A的电流转膜20min,80℃固定2h。DIG EasyHyb 42℃预杂交30min,用含变性随机引物探针的DIGEasy Hyb 42℃杂交过夜。化学发光法显色,压片拍照。结果显示病毒复制中间体的rcDNA、dsDNA和ssDNA三条清晰显影带,提示细胞中有完整病毒复制(图6)。
(4)细胞内HBV cccDNA检测:以本课题组前期建立的滚环扩增法检测肝细胞内HBV共价闭合环状cccDNA【任晓强,等.解放军医学杂志,2009,34:675-8】。Qiagen试剂盒提取约2×106个细胞的全部DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化后进行滚环扩增反应,再以其为模板用跨缺口引物和Taqman探针介导进行实时荧光定量PCR反应,用β-actin作为内参校正实际细胞数,量化结果显示,HepG2.1403F细胞系每个细胞内平均含有1个拷贝HBV cccDNA分子。
3.电镜检测病毒颗粒
大量培养HepG2.1403F细胞,取20ml病毒分泌上清3000rpm离心30min,0.22μm滤膜过滤。另外将HBV表面抗体阳性健康献血员血清4ml,1∶5PBS稀释,0.22μm滤膜过滤。病毒上清液与健康抗血清1∶1混匀,4℃过夜,12000rpm 4℃离心30min,弃上清,沉淀物用100μl细胞培养液重悬,滴于有支持膜的铜网上,2%的磷钨酸负染,透射电镜下观察可见到42nm左右大颗粒和20nm左右小球型颗粒(图7)。结果提示:新建立的HepG2.1403F细胞系能够分泌完整HBV颗粒。
实施例4细胞株用于4种抗病毒药物的体外表型分析
1、实验目的
将本发明所获得的多重耐药人HBV稳定复制细胞系HepG2.1403F用目前常见核苷(酸)类似物进行药物敏感性实验,评价该细胞系实际应用效果。
2、方法
实验药物:拉米夫定(LAM)、恩替卡韦(ETV)、阿德福韦酯(ADV)及替喏福韦酯(TDF)
将HepG2.1403F细胞以7×104/ml密度接种在24孔板中,12h后更换为含2%FBS的DMEM培养基,加入上述四种药物,浓度分别设定为LAM:0、0.01、0.1、1、10、100μM、ETV:0、0.001、0.01、0.1、1、10μM、ADV:0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μM、TDF:0、0.01、0.1、1、10、100μM,连续更新5天含相同浓度药物的培养基。随后提取细胞核心颗粒,用于DNA的荧光定量PCR检测和Dot blot实验,改良寇氏法计算每种药物处理的50%病毒抑制率(IC50)。
3、实验结果
结果一不同药物处理HepG2.1403F细胞的荧光定量PCR分析:LAM、ETV、ADV及TDF的IC50分别为124.5μM、0.915μM、0.434μM、0.203μM,分别是【Stephanie V,et al.J Hepatol,2007,46:531-8】和【Jun Inoue,et al.Virology,2009,395:202-9】等文献报道的野生型病毒IC50的311倍、229倍、6.2倍和4.7倍,其中LAM和ETV的敏感性降低均>100倍,体现为高耐药性;体外实验中对ADV的敏感性下降3倍即为耐药,而TDF下降2~9倍仍在药物作用的敏感区域内。定量结果说明该细胞系对LAM、ETV和ADV耐药,对TDF敏感(图8)。
结果二不同药物作用HepG2.1403F细胞的Dot blot分析:细胞对4类药物的反应趋势与定量PCR结果一致(图9),随着药物浓度增加LAM、ETV和ADV处理组病毒DNA没有明显下降,TDF处理组HBV随加药剂量增加而降低。
4、结论
多重耐药人HBV稳定复制细胞系HepG2.1403F含有典型的多重耐药突变位点,对目前常用核苷(酸)类抗病毒药物具有明确的敏感或耐药特性。
Claims (5)
1.多重耐药人HBV稳定复制细胞系HepG2.1403F,其保藏编号为:CCTCC NO:C201162。
2.多重耐药人HBV稳定复制细胞系,所述细胞系基因组中整合有GenBank GQ402162所示的HBV RT基因序列。
3.权利要求1或2所述的细胞系,所述耐药是对核苷类药物和核苷酸类抗病毒药物耐药。
4.权利要求3所述的细胞系,所述核苷类药物是拉米夫定和恩替卡韦,核苷酸类药物是阿德福韦酯。
5.权利要求1或2所述的细胞系在制备防治乙肝药物方面的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110353756 CN102399749B (zh) | 2011-11-09 | 2011-11-09 | 中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110353756 CN102399749B (zh) | 2011-11-09 | 2011-11-09 | 中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102399749A true CN102399749A (zh) | 2012-04-04 |
CN102399749B CN102399749B (zh) | 2013-03-20 |
Family
ID=45882401
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201110353756 Expired - Fee Related CN102399749B (zh) | 2011-11-09 | 2011-11-09 | 中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102399749B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103436494A (zh) * | 2013-09-02 | 2013-12-11 | 中国人民解放军第三〇二医院 | C基因型阿德福韦酯耐药hbv稳定复制表达细胞系 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101698891A (zh) * | 2009-09-10 | 2010-04-28 | 中国人民解放军第三○二医院 | 一种乙型肝炎病毒多位点基因耐药突变检测方法 |
CN102102091A (zh) * | 2010-12-13 | 2011-06-22 | 中国人民解放军第三〇二医院 | C基因型恩替卡韦耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 |
-
2011
- 2011-11-09 CN CN 201110353756 patent/CN102399749B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101698891A (zh) * | 2009-09-10 | 2010-04-28 | 中国人民解放军第三○二医院 | 一种乙型肝炎病毒多位点基因耐药突变检测方法 |
CN102102091A (zh) * | 2010-12-13 | 2011-06-22 | 中国人民解放军第三〇二医院 | C基因型恩替卡韦耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
《Journal of Virological Methods》 20110309 Zhu Y., et al. HBV DNA replication mediated by cloned patient HBV reverse transcriptase genes from HBV genotypes A-H and its use in antiviral phenotyping assays 第340-346页 1-5 第173卷, * |
LIU Y. ET AL.: "Hepatitis B virus strain S18-17 polymerase (P) gene,partial cds", 《GENBANK》 * |
LIU Y., ET AL.: "Genotypic resistance profile of hepatitis B virus (HBV) in a large cohort of nucleos(t)ide analogue-experienced Chinese patients with chronic HBV infection", 《JOURNAL OF VIRAL HEPATITIS》 * |
ZHU Y., ET AL.: "HBV DNA replication mediated by cloned patient HBV reverse transcriptase genes from HBV genotypes A–H and its use in antiviral phenotyping assays", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103436494A (zh) * | 2013-09-02 | 2013-12-11 | 中国人民解放军第三〇二医院 | C基因型阿德福韦酯耐药hbv稳定复制表达细胞系 |
CN103436494B (zh) * | 2013-09-02 | 2014-12-03 | 中国人民解放军第三〇二医院 | C基因型阿德福韦酯耐药hbv稳定复制表达细胞系 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102399749B (zh) | 2013-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105524924B (zh) | 环状RNA circ‑ZKSCAN1的用途 | |
Bousali et al. | Hepatitis B virus DNA integration, chronic infections and hepatocellular carcinoma | |
CN109337858A (zh) | 用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用 | |
Yuan et al. | A chimeric humanized mouse model by engrafting the human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cell for the chronic hepatitis B virus infection | |
CN106191067A (zh) | 环状RNA circ‑NFATC3及其用途 | |
CN106834290A (zh) | 一种环状rna及其用途 | |
CN105062976A (zh) | 肺动脉高压治疗药物的干细胞筛选模型及应用 | |
CN103436555B (zh) | 携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝纤维化治疗制剂的应用 | |
CN101235372B (zh) | 一种抗HBV核心区的siRNA表达模板和应用 | |
CN113897300B (zh) | 一株具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的动物双歧杆菌 | |
CN102399749B (zh) | 中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 | |
CN109897825A (zh) | 一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统 | |
CN102102091B (zh) | C基因型恩替卡韦耐药突变hbv稳定复制表达细胞系 | |
CN103436494B (zh) | C基因型阿德福韦酯耐药hbv稳定复制表达细胞系 | |
CN100497603C (zh) | 应用肝细胞系qsg-7701感染乙型肝炎病毒 | |
CN104060329A (zh) | 一种染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法 | |
CN113599412A (zh) | 党参黄芪组合物在制备预防和治疗晚期肿瘤相关症状的药物中的用途 | |
CN109680000A (zh) | 利用树鼩骨髓间充干细胞建立hcv细胞模型的方法 | |
CN110564835A (zh) | 南蛇藤提取物含药血清对hbv和mif作用的研究方法 | |
CN100500836C (zh) | Hcv病毒体外培养方法 | |
WO2024050859A1 (zh) | 一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系sysh-mpt-03及其应用 | |
WO2024050858A1 (zh) | 一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系sysh-mpt-04及其应用 | |
CN114246853B (zh) | 异阿魏酸在制备用于防治冠状病毒感染的产品中的应用 | |
Yao et al. | Functional Status Analysis of Dendritic Cell Antigen Presentation in Chronic Hepatitis B Patients under Microscope. | |
CN107541495A (zh) | 一种fgf19过表达的人肝癌细胞系及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130320 Termination date: 20201109 |