CN100500836C - Hcv病毒体外培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种体外培养HCV病毒的方法，包括步骤：在促进脂蛋白合成和分泌的适宜的培养环境下，将含有丙型肝炎病毒RNA的颗粒与能够合成并且分泌脂蛋白的细胞接触，以及收集由此得到的病毒。本发明具有诊断和治疗应用。

Description

HCV病毒体外培养方法
本发明涉及一种全新的体外培养丙型肝炎病毒的方法。
丙型肝炎病毒是通过输血获得肝炎的主要原因。丙型肝炎病毒也可以通过其他经皮途径(例如通过静脉注射毒品)传播。而且，从事健康方面的职业人士被感染的风险也是不可以被忽视的。
丙型肝炎有别于其他形式的与病毒相关的肝脏疾病，例如甲型肝炎、乙型肝炎和丁型肝炎。丙型肝炎病毒(HCV)的感染通常为慢性，在大量病例中导致诸如肝炎、腹泻和癌症等肝脏疾病。
尽管通过输血传播的风险由于选择供血者而降低，丙型肝炎病例的频数仍然保持为高水平。目前，全世界约有1.7亿人被HCV慢性感染。高危人群主要发现于曾进行输血或静脉药物使用者的个体，但是也存在不属于这些高危群体、体内发现循环抗HCV抗体的无症状供血者。对于后者，感染途径尚未确定。
HCV是第一个使用分子生物学技术分离的趋肝病毒(hepatotropicvirus)。病毒基因组序列在未观察到病毒颗粒的情况下得到克隆。
目前，即使已知存在其他形式的含有病毒RNA的颗粒，出现在感染患者血液中的仅有的天然病毒颗粒以无包膜的衣壳为特征。
出于方便起见，在本申请中，“病毒”这一术语将用来指任何含有HCV病毒RNA的颗粒。这两个术语的使用也没有区别。
HCV为约9.5kb的单链正链RNA病毒，通过互补RNA的拷贝进行复制，翻译产物为一个单独的、约3000个氨基酸的多聚蛋白质。HCV基因组的5’末端对应为非翻译区，与编码结构蛋白质、核衣壳核心蛋白质和两种包膜糖蛋白E1和E2的基因毗邻。在不同基因型中，5’非翻译区和核心基因相对高度保守，但是E2包膜蛋白质则由高变异区编码，此高变异区在各分离株均不同。HCV基因组3’末端含有编码非结构蛋白质(NS)的基因和高度保守的3′非编码区。
由于基因组结构和假设的复制模式，HCV被分类为黄病毒科的一个新的属hepaciviruses。
术语“HCV病毒”指人类致病株、减毒株、以及来源于上述病毒株的缺陷株等任何病毒种类。当然，已知RNA病毒呈现高度自发突变率。因此存在具有更高或更低毒力的众多病毒株。鉴定这些病毒株在本领域技术人员能力范围内，例如，通过其关于参照毒株的核酸和/或肽序列同源性、和/或通过形态学和/或免疫学标准鉴定株系或分离物。
用于诊断HCV的许多技术得到了发展。例如，实施诊断性免疫试验，检测患者血清中抗HCV蛋白质的抗体。以病毒RNA反转录合成cDNA以及PCR扩增同样用于检测HCV基因组，例如对慢性感染者或对实验感染的黑猩猩的血清中隐性感染的病毒进行间接测量。此外，在基因克隆的基础上，使用DNA探针的杂交技术也得到发展。
然而，人们已经认识到，现有的诊断技术缺乏灵敏性和/或特异性和/或受累于其操作困难。例如，使用探针杂交方法，不可能将具有低感染能力的病毒与具有高感染能力的病毒区分开来。所以，有必要用待检验的病毒接种黑猩猩来检测对动物的感染结果，但是却难以实施。
因此，从公共卫生角度而言，最为重要的是能够发展特异、灵敏且可行的方案来诊断和筛查HCV携带者。一种解决方法可以是产生一个体外培养HCV的有效系统，从而使实现病毒繁殖成为可能，尤其是用于研究复制机制、检测中和抗体或抗病毒试剂，同时用来发展生物材料、诊断检测物和疫苗制剂。事实上，尽管HCV的完整序列自从1989年即可获得(Q.L.Choo等，Science 244，359(1989))，有关HCV生活周期和复制模式的认识却由于缺乏适宜的体外培养系统而受到阻碍。Ito等人(J.Gen.Virol.77：1043-1054(1996))真正证实了在人类肝细胞原代培养中HCV保持复制，其中这些细胞来自携带HCV、缓慢起病和传递感染的病人，但是关于病毒的繁殖(长期培养的不确定性)的问题仍然存在，而且所发展的系统由于费力且需要人类肝脏供应而受到限制。另外，关于HCV的向性至今尚未形成普遍认可，而且，并非该病毒的所有细胞受体均得到鉴定。
在HCV感染者血浆中，发现含有病毒RNA的颗粒密度具有很强的异质性。含有病毒RNA的颗粒的密度异质性归结于这些颗粒与不同比例的脂蛋白结合(Thomsen等，1993，Med.Microbiol.Immunol.182：639)。在本发明申请的描述中，发明者将这些杂合颗粒称为LVPs(脂-病毒-颗粒)。每个患者中各种形式颗粒的密度梯度分布均有不同。现有的对低密度颗粒的分析显示，其密度包括LDLs(低密度脂蛋白)和VLDLs(极低密度脂蛋白)的密度。
含有病毒RNA的LVPs的性质现在尚无精确的认识。
专利申请WO 01/09289描述了一种使用具有内吞途径的细胞对病毒(例如HCV)进行体外培养的方法，病毒来自感染者血清或血浆LVPs的至少一个级分，细胞的内吞途径依赖至少一种脂蛋白受体，且可以被激活剂调节。此方法尤其致力于促进级分在培养基中进入细胞。然而，病毒复制仍然受限，因而必须优化。
专利申请WO 02/10353描述了一种与已知数据相反(Hijikata等，1993，J.Virol.，1953-1958)的由结合人免疫球蛋白的LVPs组成的复合物，密度小于或等于1.063g/ml，主要含有HCV病毒RNA。事实上，Hijikata等显示，当颗粒密度小于1.06g/ml时，对黑猩猩具有高度传染性，因此这种类型的低密度颗粒中不可能含有密度很大的人免疫球蛋白。这些复合物组成了具有很强的感染性的HCV病毒的一种特殊形式。
在那个专利申请中同样描述了一种由LVP/免疫球蛋白复合体体外培养HCV的方法，该方法中使用的细胞其表面至少有一种类型的免疫球蛋白Fc片段受体、或具有免疫球蛋白结合能力的一种受体。此方法再次促进了复合物在培养基中进入细胞，但是却不允许病毒的大量繁殖。
现在，本发明的发明者发现了一种全新的HCV体外培养方法，可以解决上述缺点，即，使用兼具促成含有HCV病毒RNA的颗粒进入和促进复制、繁殖能力的细胞。
事实上，本发明者令人惊讶的证实了称为LVPs的含有HCV RNA的颗粒：
-是完整的球状单位颗粒；因此它们并不是像现有技术所提示的结合到正常脂蛋白上的病毒体团块，
-含有载脂蛋白B和载脂蛋白E以及甘油三酯：它们因此具有脂蛋白结构，尤其是VLDL或乳糜微粒的结构类型，和
-含有病毒包膜和RNA：它们因此有别于通常发现于人类的脂蛋白，并组成病毒的非常规形式。
由于LVPs是杂合颗粒，即含有病毒组件的脂蛋白，因此使用能够合成脂蛋白的细胞可以出乎意料的促进复制。
因此，本发明的主题为HCV的体外培养方法，包括步骤有：在促进脂蛋白合成和分泌的适宜的培养基中，将含有丙型肝炎病毒RNA的颗粒与能够合成并且分泌脂蛋白的细胞接触，以及收集由此得到的病毒。
词语“含有HCV RNA的颗粒”意为病毒颗粒，尤其是诸如LVP/免疫球蛋白复合物形式，或出现在HCV检测阳性并且含有这样颗粒的形式的患者血清或血液中，以及含有病毒RNA的接种物，无论上述接种物中病毒RNA的制备模式如何。
LVP/免疫球蛋白复合物以及从HCV感染者血清或血浆样品中纯化该复合物的方法已经在专利申请WO 02/10353中描述。
然而，那个文件中既没有描述也没有提示脂蛋白类型中这些LVPs的独特性质，即它们是否具有甘油三酯、载脂蛋白B以及可选的载脂蛋白E。
载脂蛋白B是与内质网膜结合的人类蛋白，它引发VLDLs组装，在微粒体甘油三酯转运蛋白出现时启动甘油三酯的转入，还引发内质网腔内VLDLs的组装。该载脂蛋白具有两种形式，apo B 100和apo B 48，在肝脏和肠内合成。
载脂蛋白E可以被许多细胞合成，尤其是肝细胞。而且，它可以在血流中被VLDLs获得。
本发明方法中使用的细胞是具有合成和分泌脂蛋白能力的所有细胞。
这些细胞既可以是原代细胞也可以是细胞系。
术语“细胞系”指建立的自发或人工永生化细胞系。在实践中，为了培养感兴趣的病毒，需要在培养基中易于维持的允许细胞(permissivecells)。因此，细胞株优选是已经建立的或者通过各种方法永生化的细胞系。这可以通过下列进行：(i)通过将允许细胞与具有相同性质的肿瘤化允许细胞共培养，建立稳定、确立的持续细胞系，所述肿瘤化允许细胞可以无限繁殖并保证病毒在培养基中繁殖，病毒接种发生在培养基中，(ii)使用病毒感染的原代细胞，接着与肿瘤化允许细胞共培养，该肿瘤化允许细胞保证了病毒在由此建立的细胞系培养物中的繁殖，(iii)用病毒感染细胞系，例如使用Epstein-Barr病毒感染永生化B淋巴细胞系，或(iv)修饰端粒酶活性。
词语“本发明中使用的具有合成和分泌脂蛋白能力的细胞”特别是指自发具有这种能力的细胞，以及在促进细胞分化或再分化的培养基质中经诱导、或者转染合成载脂蛋白B和微粒体甘油三酯转移蛋白MTP基因后获得这种能力的细胞。
适于本发明目的、具有合成和分泌脂蛋白能力的细胞的实例有肠细胞型的肠上皮细胞、脑细胞和肝脏细胞。
根据一个实施方案，所用的细胞是能在促进该细胞分化或再分化的培养基中经诱导而合成和分泌脂蛋白的细胞。
事实上，一些细胞(例如肝细胞)丧失了产生脂蛋白的能力，或者其他细胞(例如肠上皮细胞)此能力可以增强。为了克服这些障碍，可以将这些细胞与适宜的、促进分化或再分化的培养基接触，来诱导细胞的分化或再分化。
根据一个特定的实施方案，适用于本发明目的的细胞是肠上皮细胞，特别是Caco-2细胞(Van Greevenbroeck，M.M.J.等，2000，Atherosclerosis，25-31)。
为了提高其合成和分泌脂蛋白的能力，可以在包被胶原或者置于半透膜之下的培养皿中，将肠上皮细胞(例如Caco-2)在添加10％胎牛血清的DMEM培养基中预先培养3周。
肝脏细胞可以是肝细胞(Moshage，H.等，1992，Journal ofHepatology，15，404-413)和肝癌，例如Hep G2细胞(Gherardi，E，等，1992，Journal of Cell Science，103，531-539)。
根据另一个特定的实施方案，本发明方法中使用的细胞是肝癌细胞。
然而，在此例中，这些细胞可以通过与改良的DMEM培养基接触(即含有至少一种诱导脂蛋白合成的试剂)，来提高其合成和分泌脂蛋白的能力。这些细胞优选是Hep G2细胞。
至于诱导脂蛋白合成的试剂，可以以各种脂类为例，例如脂肪酸，优选C18或C20脂肪酸，例如油酸(Luchoomun，J.等，1999，The Journalof Biological Chemistry，Vol 274(28)，19565-19572))，和磷脂(例如溶血磷脂酰胆碱(Zhou，Z.，1998，Biochimica et Biophysica Acta，1391，13-24))。
在肝癌细胞再分化培养基中使用油酸组成本发明一个特定的实施方案。
根据本发明的一个实施方案，除DMEM(Gibco BRL)和诱导脂蛋白合成的试剂之外，改良DMEM培养基还由1％HEPES(Gibco)、1％谷氨酰胺(Gibco)、0.25mg/ml庆大霉素(Gibco)、1.5％Ultroser-G(Gibco)、5×10-6M毛喉素(ICN)、1.6×10-7M PMA(4-α-佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)(Sigma)、5.6IU/ml醋酸维生素A(Sigma)、0.5×10-3M丁酸钠(Sigma)、10-2Mni acidamide(ICN)、2×10-6g/ml Polybrene(Sigma)、2.9×10-8M亚硒酸钠(ICN)和1×10-9M三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(ICN)。
本发明方法中使用的其他类型的细胞由转染基因后获得的细胞组成，其中转染的基因合成载脂蛋白apo B，可选的apo E和微粒体甘油三酯转运蛋白。这些细胞可以以转染的昆虫细胞系为例，该细胞系见D.G.Gretch等在Journal of Biological Biochemistry，1998，Vol 271(15)，8682-8691中的描述。
当与具有合成和分泌脂蛋白能力的细胞接触后，含有HCV RNA的颗粒既可以经过上述细胞的LDL受体类型中的脂蛋白受体(如以LVPs为例的情况)进入这些细胞、也可以根据本领域技术人员已知的技术经转染内化(如以病毒RNA制剂为例的情况)而进入细胞。
本发明方法中因此使用促进脂蛋白合成和分泌的培养基，所述脂蛋白优选为VLDL或乳糜微粒类型。
选用的适宜的培养基是改良的DMEM，其内添加了在培养中促进细胞代谢的试剂，还有至少一种诱导脂蛋白合成的试剂。
促进细胞代谢的试剂，可以以地塞米松和胰岛素为例。
优选的改良DMEM培养基如上文所定义，并且添加地塞米松和胰岛素。
诱导脂蛋白合成的试剂例如有各种脂类，比如脂肪酸(优选C18或C20脂肪酸，例如油酸)、磷脂(例如溶血磷脂酰胆碱)，还有22-羟-胆固醇或25-羟-胆固醇。
使用油酸诱导脂蛋白合成(可选地与22-羟-胆固醇或25-羟-胆固醇联合使用)组成本发明另一个特定的实施方案。
因此，使用本发明方法培养的病毒可以通过诸如离心(例如密度梯度离心)、使用抗apo B和/或apo E抗体的免疫沉淀等各种方法收获。
本发明还涉及了至少包括根据本发明方法获得的病毒颗粒或其组分为抗原来源的诊断组合物。
本领域技术人员将能够根据使用的诊断技术确定所使用的病毒颗粒的数量。
本发明还涉及用来筛选和/或选择至少一种抗病毒分子的方法，包括步骤：在本发明培养方法过程中，将上述抗病毒分子与培养基接触。
对抗病毒分子的选择，通过广为本领域技术人员所熟知的技术完成，例如细胞内病毒RNA数量的减少、和/或在存在不同浓度的各种抑制剂时分泌到上清中的感染性病毒颗粒数量的减少。
这些抑制剂可以是核苷酸或核苷类似物，或者是病毒蛋白酶的抑制剂或干扰其他病毒蛋白质功能的别的分子的抑制剂。
然而，本发明还开辟了其他的治疗前景，使开发能定性和/或定量影响HCV体内复制和增殖的治疗组合物成为可能，该组合物的特征在于，它包含能够调节、压制或抑制脂蛋白合成的试剂(例如微粒体甘油三酯转运蛋白的抑制剂)以及其他物质。
词语“能够调节、压制或抑制脂蛋白合成的试剂”意指任何可能分别控制、降低或抑制HCV体内增殖和复制的分子。
这些试剂可以从经验证对脂类代谢具有药理学活性的分子文库中筛查而选择。
能够抑制脂蛋白合成的试剂，可以以微粒体甘油三酯转运蛋白抑制剂为例。
通过下面给出的用作非限制性说明的实施例，以及附加的图1至图3，本发明将得到更加全面的理解。
图1描绘的图形，显示培养条件(添加油酸的改良DMEM培养基与标准培养基)对Hep G2细胞分泌HCV病毒颗粒的影响，HCV病毒颗粒的分泌通过对培养上清中病毒RNA定量来评价，并且是时间的函数；
图2描绘的图形，显示在改良DMEM培养基中添加油酸对病毒颗粒的分泌的影响，病毒颗粒的分泌通过对培养上清中HCV RNA定量来评价，并且是时间的函数；
图3描绘的图形，显示由Caco-2细胞培养3周分化后产生的HCV病毒，上述产物通过培养上清中病毒RNA的数量来证明，并且是时间的函数。
实施例1：LVPs的表征
1.1 LVPs完整球状形式的证实
来自丙型肝炎病毒检测阳性的病人血清中的LVPs按照专利申请WO02/10353的说明进行纯化。
纯化的LVPs以及去除LVPs的低密度(LDL)级分以PBS稀释，在200目的铜网上形成样品浮滴后，其中该铜网在室温下已用Formvar支持膜(Electron Microscopy Science，PA)包被3分钟，在以NaOH缓冲的pH7.2的4％(质量/体积)光钨酸介质中漂洗染色3分钟，干燥后使用电子显微镜(JEOL device，Centre Commun d’Imagerie deLaennec，Lyon，France)观察。
与正常LDL一样，LDL级分由具有同质球状结构、平均直径为25nm的颗粒组成。
另一方面，纯化的LVPs为平均半径100nm的异常巨大的球状结构。
1.2 检测LVP组成
a)测定LVPs脂质浓度
按照生产厂商介绍，使用胆固醇RTU、磷脂酶促PAP 150和甘油三酯酶促PAP 150试剂盒(bioMérieux，Marcy 1’Etoile，France)以及建立的标准曲线，对总胆固醇、磷脂和甘油三酯浓度进行测定。
b)测定LVPs中apo B浓度
使用ELISA实验测定纯化的LVPs中载脂蛋白apo B的浓度。为进行此实验，将96孔平底ELISA板(Maxisorb；Nunc)用抗人apo B单克隆抗体(5ul/ml；clone 1609；Biodesign，Saco，Maine)的PBS(磷酸盐缓冲液)100ul包被。将板置于4℃过夜，然后用2％BSA(牛血清白蛋白)封闭反应。
首先在添加10ug/ml人IgG的PBS-0.2％BSA混合液中，将样品在室温下孵育30分钟，然后按照100ul/孔的比例加到板上。
经过37℃孵育2小时并使用PBS-0.05％Tween 20溶液清洗后，按照100ul/孔的比例，加入含有缀合过氧化酶的山羊抗人apo B抗体(1.6μg/ml；Biodesign)的PBS-0.2％BSA混合液，将板于37℃孵育90分钟。
将板清洗后，按照150ul/孔的比例加入邻-苯二胺(Sigma)。反应可以进行10分钟，在490nm读取结果。
c)结果
结果按照甘油三酯/胆固醇(TG/Chol)和甘油三酯/apo B(TG/apo B)比值在下表中给出。此表同样包括了患者正常脂蛋白(即提取LVPs后获得的脂蛋白)的同种比值，以作比较。
表
Figure C03814092D00121
a：p≤0.04
b：p≤0.01
在密度不同的两个级分(即低密度和极低密度)中发现的LVPs比同种级分中正常脂蛋白含有更多的甘油三酯(基于每分子apo B计算)。
这些数据证明：
-LVPs的确含有脂质，
-LVPs的脂质浓度与正常脂蛋白不同，因此排除了任何污染；以及
-LVPs含有apo B。
1.3 存在载脂蛋白B和E
按照如下方法封闭PLC细胞apo B和apo E受体结合位点后，阻止了LVPs进入PLC细胞，这证实apo B和apo E的存在：
将5×105PLC/PFR/5人肝细胞瘤细胞系细胞(ATCC CRL 8024)(Alexander细胞)(人肝细胞瘤)在96孔板内，在添加10％胎牛血清(Biowhittaker，Emerainville，France)、2mM HEPES(Gibco/BRL)、1％非必需氨基酸(Gibco/BRL)和50 IU青霉素/链霉素(Gibco/BRL)的DMEM(Gibco，BRL)/ml培养基中，于37℃培养24小时。
首先，使用抗apo B受体结合位点的单克隆抗体(4G3和5E11；OttawaHeart Institute Research Corporation，Ottawa，Ontario Canada)封闭apo B受体结合位点，然后用单克隆抗体1D7(0ttawa HeartInstitute Research Corporation)封闭apo E受体结合位点。PLC细胞用PBS洗涤3次后，与纯化的LVPs孵育3小时。细胞经洗涤后，使用Rneasy试剂盒(Qiagen)中的裂解液350ul收获，按照上文说明提取RNA。
通过封闭apo B和apo E识别位点阻断了LVPs的识别，说明LVPs含有载脂蛋白，并证实了LVPs的脂蛋白结构。
1.4 LVPs中存在由核心蛋白和病毒RNA组成的衣壳
通过将LVPs在85％醚-15％丁醇溶液中孵育30分钟，同时轻柔搅拌，将纯化的LVPs去脂化，证实了衣壳的存在。按照上文1.1节中说明，使用电子显微镜(JEOL device，Centre Commun d’Imagerie de Laennec，Lyon，France)显示衣壳的存在。
将上文所述去脂化的LVPs与抗-HCV核心蛋白单克隆抗体(19D9D6；Jolivet-Reynaud，C.P.，等，1998，J.Med.Virol.，56，300-309)和10nm-金标记二抗接触，在3％乙酸双氧铀中漂洗、负染进行免疫检测，如上所述用铜网观察，从而通过Western印迹证实了HCV病毒核心蛋白的存在。
最后，使用QIAamp试剂盒(Qiagen S.A.Courtaboeuf，France)提取已纯化并去脂化的LVPs，证实了病毒RNA的存在。
实施例2：培养条件对HepG2细胞产生HCV的影响
首先，将Hep G2细胞在专利申请WO 01/09289中所述的由DMEM和10％胎牛血清组成的培养基(标准培养基)中培养或在改良DMEM培养基(即含有添加1％HEPES、1％谷氨酰胺、0.25mg/ml庆大霉素、1.5％Ultroser-G、5×10-6M毛喉素、1.6×10-7M PMA、5.6IU/ml醋酸维生素A、0.5×10-3M丁酸钠、10-2M ni acidamide、2×10-6g/mlPolybrene、2.9×10-8M亚硒酸钠和1×10-9M三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的DMEM)中培养。
按照150 000细胞/孔的比例，将细胞与标准培养基或改良DMEM培养基接种于Falcon 24孔培养板，培养24小时。
吸去培养基，在病毒存在下(按照500 000HCV RNAs/孔的比例)，将细胞在添加0.2％BSA的DMEM中培养6小时。
细胞以PBS洗涤后，在标准培养基或改良培养基(如前文说明，但是还添加了hexamethasone、胰岛素和含有0.15mM油酸的油酸-BSA混合物)中培养。
所有的培养都在含5％CO2的空气及37℃下进行。
然后从孔中取上清样品(三份)，根据Komurian-Pradel，F.在J.Virol.Methods，2001，95，111-119中说明的程序，使用RT-PCR对HCVRNA定量。
图1中给出的结果(每毫升上清中的RNA拷贝数，其为时间的函数)，菱形代表使用标准培养基，正方形代表使用促进脂蛋白合成和分泌的培养基。
此图证明，使用具有分泌和合成脂蛋白能力的细胞、以及将细胞至于有利条件下，促进了病毒的复制及分泌。
实施例3：在培养基中加入脂质对于促进脂蛋白合成和分泌的重要性
首先将Hep G2细胞于前文实施例2中所说明的改良培养基中培养24小时，按照每孔150 000个细胞的比例加入Falcon 24孔培养板。
在病毒存在下(比例为每孔400 000HCV RNAs)，将细胞在添加0.2％BSA的DMEM中单独培养或与0.1μm25-羟-胆固醇共同培养6小时。
按照前文实施例2指示洗涤细胞，并在改良培养基中培养。
细胞接种3天后，加入含有0.15mM油酸的油酸-BSA混合液。
收集上清，通过RT-PCR对HCV RNA进行定量。
图2给出了证明使用油酸的重要性的结果，菱形代表仅使用改良培养基，正方形代表使用添加了油酸和25-OH-胆固醇的改良培养基。
实施例4：使用Caco-2细胞培养病毒
Caco-2细胞在24孔板内的半透膜(Transwell，Costar)上，于标准培养基(添加10％胎牛血清的DMEM)中分化3周。
由此制备的细胞在比例为200 000HCV RNAs/孔的病毒颗粒中孵育6小时。
细胞经洗涤后，在DMEM中培养，所述DMEM中添加了10％胎牛血清、以及含0.15mM油酸的油酸-牛磺胆酸。
取插入物上方的上清，通过RT-PCR对病毒RNA进行定量。
图3给出证明在促进脂蛋白合成和分泌的培养基中使用肠上皮细胞培养HCV病毒方法的结果。

Claims (9)

1.丙型肝炎病毒体外培养方法，其特征在于包括以下步骤：在培养基中，将含有丙型肝炎病毒RNA的颗粒与具有合成并且分泌脂蛋白能力的细胞接触，以及收集由此得到的病毒，其中所述培养基来源于改良的DMEM培养基，其中添加了地塞米松和/或胰岛素作为促进培养细胞代谢的试剂，还添加了选自油酸，22-羟-胆固醇或25-羟-胆固醇中的至少一种作为脂蛋白合成诱导试剂，其中所述细胞选自肠细胞型的肠上皮细胞、脑细胞和肝脏细胞。
2.权利要求1的方法，其特征在于，含有丙型肝炎病毒RNA的所述颗粒为脂-病毒-颗粒。
3.权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞为肠上皮细胞。
4.权利要求3的方法，其特征在于，所述细胞为Caco-2细胞。
5.权利要求3的方法，其特征在于细胞用添加10％胎牛血清的DMEM培养基预处理3周。
6.权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞为肝细胞癌细胞。
7.权利要求6的方法，其特征在于，所述肝细胞癌细胞为Hep G2细胞。
8.权利要求6的方法，其特征在于，预先将所述细胞与含有作为诱导脂蛋白合成的试剂的油酸的改良DMEM培养基接触。
9.用于筛选和/或选择至少一种抗病毒分子的方法，其特征在于，它包括在权利要求1-8中任一项的培养方法的过程中将所述抗病毒分子与培养基接触这一步骤。
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