CN105062976A - 肺动脉高压治疗药物的干细胞筛选模型及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于应用干细胞技术建立肺动脉高压新型治疗药物筛选的技术，以BMP信号下游关键基因Id1基因为靶点，设计双报告基因原件插入Id1基因组构建重组载体，并转入人胚胎干细胞株，获得稳定表达的CGMCC11091的细胞株，将待测抗肺动脉高压的化合物刺激CGMCC11091的细胞株，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Id1启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Id1表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型，本发明还包括模型在上调骨形态形成蛋白(BMP)信号的调节剂；上调骨形态形成蛋白II型受体表达水平的调节剂；改善肺动脉血流动力学的制剂；改善肺血管重构的制剂；肺动脉高压治疗药物以及心肺血管疾病治疗药物筛选中的应用。

Description

肺动脉高压治疗药物的干细胞筛选模型及应用
技术领域
本发明属于应用干细胞技术建立肺动脉高压新型治疗药物筛选方法的技术邻域。
背景技术
肺动脉高压(PAH)是由于肺小动脉原发病变而导致的肺动脉阻力增加，是一种少发但高致死率的病症。肺血管阻力进行性升高，最终导致患者右心衰竭而死亡。其主要病理特征是严重肺血管重构，包括内皮功能紊乱和平滑肌细胞增殖所致的小肺动脉内膜纤维化，中膜肥厚，外膜增生，丛样病变及动脉管腔闭塞。在过去20年里包括前列环素和其类似物，内皮素受体拮抗剂，磷酸二酯酶抑制剂在内的几类新药已经批准上市，但3年死亡率仍然在40％左右。并且这些治疗方案主要针对减轻血管紧张而达到治疗效果。因此我们迫切需要研发改善血管重构，延缓肺动脉高压病程，提高患者生存率为目的的药物。
优化设计PAH理性治疗方案应基于对此疾病细胞分子机理的透彻认识。研究表明肺动脉高压中存在着BMP二型受体(BMPRII)表达缺陷和Id基因表达下调[YangJatalCirculationReserch2008,102:1212-1221]。恢复生理水平BMP信号,尤其是血管细胞中Id基因的表达是改善血管重构的肺动脉高压药物的新靶点之一[YangJatalAmJPhysiolLungCellMolPhysiol201315:305(4):L312-21]。
骨形成蛋白BMPs是TGFβ家族中的一类蛋白，它们在早期发育和分化，包括肺的器官形成以及血管生成中起着重要作用。在BMP配体包括BMP2，BMP4，BMP6，BMP9和BMP10存在的情况下，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的BMPRII，通过一型受体，磷酸化受体调节Smad蛋白(R-Smad)。在BMP/Smad诱导转录的效应基因中，目前研究最清楚的是DNA结合蛋白抑制因子家族成员(inhibitorofDNAbindingprotein，Id)。Id蛋白属于螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子，Id蛋白竞争性结合具基本螺旋-环-螺旋结构的转录因子(bHLH)而抑制其转录活性，Id在细胞生长、衰老及分化中均发挥作用。实验结果明显提示BMPR-II受体以及其下游Id基因表达下降在肺动脉高压发生中起主导作用。提高BMP配体浓度是一种有效的提高下游Id表达水平的方法。BMP2表达上调剂初筛模型-即包含小鼠bmp2启动子和荧光素酶报告基因的报告质粒稳定转染得到的小鼠颅骨细胞MC3T3-E1是第一发明人2002年首次在国内建立的,并在抗骨质疏松药物或其先导化合物的发现中应用至今。经过十余年的BMP2上调剂药物筛选工作，得到了包括2-乙酰苯并噻吩及其类似物，并开展了抗骨质疏松活性方面的研究。最近BMP信号上调剂也被认为是治疗肺动脉高压的一个有前景的药靶，EddaSpiekerkoetter等人[EddaSpiekerkoetteratalTheJournalofClinicalInvestigation2013,123(8):3600-3612]通过C2C12-BRE细胞株进行了对BMP信号上调剂的筛选，发现FK506有较好的改善和逆转肺动脉高压的效果，但由于其毒副作用未进入临床。C2C12-BRE细胞株是通过将Id的启动子区上的BMP效应元件(BMPResponsiveElement,BRE)与萤火虫荧光素酶报告基因相连，稳定转染C2C12细胞得到的[KatagiriTatalGenesCells20027：949-960]，通过生物发光检测可检出pm级BMP9低剂量刺激后引起的荧光素酶活性。本发明首先采用BMP2上调剂模型，发现获得的BMP2表达上调剂可提高BMP信号并应用于肺动脉高压药物初筛，继而利用具有心血管分化能力的干细胞系，构建获得特异地改善肺血管重构的Id蛋白表达上调剂药物筛选模型。
本发明的创新点之一在于将人胚胎干细胞应用于药物筛选：在过去的药物筛选模型中经常利用具有无限繁殖能力的肿瘤细胞以满足高通量筛选的需要，但单一肿瘤细胞系不能对不同疾病类型和患者个体进行针对性药物筛选。这是由于患者细胞不易获得，且培养代数有限。有一些药物在经过最先进的高通量筛选和严格的临床前分析后，在临床试验第三阶段失败而不能成药时，造成的损失可能超过10亿美元。之前建立的BMP2上调剂药物筛选平台基于鼠骨肉瘤细胞系进行的，还存在与人类细胞有种属差异这一缺陷。将人胚胎干细胞应用于药物筛选的优势在于1.干细胞的无限增殖能力,符合高通量药物筛选；2.基于其多功能潜性，可以分化形成相关的细胞类型。3.诱导多功能干细胞技术可以根据病人个体差异‘定身量衣’，打破单一细胞系缺乏有效模拟生物个体差异的局限，避免漏筛和错筛[WillardVPatalArthritisRheumatol.2014,66(11):3062-72]。因此用一种可以来自任何个体的细胞代替肿瘤细胞是一种有益的选择。
人胚胎干细胞具有肿瘤细胞没有的优势，但该细胞是否能够成功用于抗肺动脉高压药物筛选，目前没有报道。本发明人将人胚胎干细胞应用于抗肺动脉高压药物的筛选，意外的发现测定结果灵敏，稳定，简单，具有现有技术无法比拟的优势。
所以在通过对遗传性和特发性肺动脉高压致病关键信号通路进行透彻研究后，我们以BMP信号下游关键基因Id1基因为靶点，设计双报告基因原件插入Id1基因组构建重组载体，并转入人胚胎干细胞株，获得稳定表达的细胞株，以此建立以荧光素酶表达量作为指标，获得对Id1表达上调的治疗肺动脉高压的化合物筛选模型。对候选化合物进行了测试，达到了理想的技术效果。
发明内容
本发明的目的是建立一种用于筛选肺动脉高压治疗药物的干细胞模型，发现新型的提高BMP信号的肺动脉高压治疗药物先导化合物。
为此，本发明提供一种保藏编号为CGMCC11091的细胞株。所述细胞命名为为ID1-V-LUChES，保藏于：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.11091。
本发明提供一种筛选抗肺动脉高压的化合物的模型，所述模型特征在于:
以BMP信号下游关键基因Id1基因为靶点，设计双报告基因原件插入Id1基因组构建重组载体，并转入人胚胎干细胞株，获得稳定表达的CGMCC11091的细胞株，将待测抗肺动脉高压的化合物刺激CGMCC11091的细胞株，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Id1启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Id1表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型。
本发明进一步提供构建模型的方法，步骤如下：
(1)从数据库中找到Id1基因的基因组序列，确定打靶位点为其外显子1，检索包含Id1基因完整序列的BAC质粒(5’和3’上下游5Kb序列)。
(2)生物信息学分析：利用AOS电脑程序，设计并选择最优的位于Id1基因1号外显子ATG下游231bp的U5和D3位点，用于重组打靶。
(3)PCR反应产生基因特异性重组片段：
用于扩增重组片段的引物是由通用引物序列和Id1基因序列共同组成，电转将抗性筛选框插入已诱导重组酶活性的BAC质粒中，获得带筛选框的BAC-Id1质粒。
(4)中间载体的构建：
将一个基于Psc101质粒框架、四环素(Tet)诱导重组的质粒Psc101gbaA，转化至携带含Id1基因BAC质粒(BAC-Id1)的E.Coli克隆中；通过第一次同源重组将带有gatewayR1/R2位点和细菌正(zeocin)负(pheS)筛选标记的DNA片段插入到BAC-Id1质粒U5/D3位点中；第二次同源重组将带有R3和R4两个gateway位点的pBR322质粒片断与BAC-Id1进行gap-repair反应，获得中间载体。
(5)目的重组载体的构建：
目的载体的构建基于Gateway系统的三个质粒：本发明构建的中间载体和含有靶向元件的pL1L2_BacT质粒以及含负筛选标记的pL3L4_DTA质粒组成。经两次gateway的转换体系，最终产生高拷贝的目的重组载体Id1-Venus-Luc-MC1-DTA。
(6)筛选细胞株的获得
将Id1-Venus-Luc-MC1-DTA质粒用AsiSI线性化处理，电转P57代人胚胎干细胞H9，获得整合型Id1启动子驱动Venus-Luci双报告基因表达的人胚胎干细胞株，得到CGMCC11091的细胞株，进行早期中胚层分化，将待测抗肺动脉高压的化合物刺激CGMCC11091的细胞株，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Id1启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Id1表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型。
本发明还包括用本发明的模型筛选后得到的化合物在制备抗肺动脉高压的药物中的应用，所述化合物选自：
哌啶基-嘌呤类衍生物:1H-吡唑[3,4-d]嘧啶,1-苯-4-(1-哌啶基)-1H-Pyrazolo[3,4-d]pyrimidine,1-phenyl-4-(1-piperidinyl)-(CasNo:23000-46-6)，
2-乙酰苯并噻吩2-Acetyldibenzophen(CasNo：22720-75-8)，
芒柄花黄素Formononetin(CasNo:485-72-3)。
本发明所述的应用还包括对以下药物的筛选：
(1)上调骨形态形成蛋白(BMP)信号的调节剂；
(2)上调骨形态形成蛋白II型受体表达水平的调节剂；
(3)改善肺动脉血流动力学的制剂；
(4)改善肺血管重构的制剂；
(5)肺动脉高压治疗药物；
(6)心肺血管疾病治疗药物。
本发明的筛选方法主要包括以下步骤：
一、发现BMP2表达上调剂可提高BMP信号并应用于肺动脉高压药物初筛:BMP2上调剂模型筛选所得化合物对成肌细胞C2C12-BRE的作用(实施例一)。
二、肺动脉高压药物干细胞复筛模型的建立和应用
(1)以BMP信号下游关键基因Id基因为靶点，构建人胚胎干细胞Id1基因打靶载体(实施例二)。
(2)干细胞筛选模型的建立：Id1上调剂双报告体系载体构建和稳定表达报告体系的人胚胎干细胞株ID1-V-LUChES的获得。(实施例三)。
(3)哌啶基-嘌呤类衍生物在人胚胎干细胞株ID1-V-LUChES上调Id1表达的作用。(实施例四)
三、通过肺动脉高压野百合碱大鼠检测化合物对肺动脉高压的治疗效果(实施例五)
本发明中所用的原料都是可以从市场上购买到的。
附图说明：
附图1、C2C12-BRE报告系统对化合物上调BMP2的验证
其中：AOUR系列1-19；BBUR系列1-12。
附图2、打靶载体构建流程
附图3、Id1基因打靶位点设计
附图4、中间载体构建流程
附图5、目的载体的构建组成
附图6、目的载体的构建
附图7、目的载体
附图8、不同克隆在BMP4刺激下荧光素酶活性与内源性Id表达水平的比较；其中A：荧光素酶活性；B：内源性Id表达水平
附图9、BMP4刺激克隆ID1-V-LuchES后显示浓度依赖性和时间依赖性
附图10、ID1-V-LuchES在不同化合物刺激后荧光素酶活性
附图11、ID1-V-LuchES在哌啶基-嘌呤类衍生物刺激后荧光素酶活性；其中：纵坐标：荧光素酶上调率，横坐标：化合物浓度(μg/ml)
附图12、化合物对MCT-PAH大鼠存活率的作用
其中：control：生理盐水，MCT：野百合碱，sildenafil：阳性药西地那非，PP：哌啶基-嘌呤类衍生物
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
本项目是在中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学重点实验室进行,天然与合成化合物样品由中国医学科学院医药生物技术研究所新药(微生物)筛选实验室提供。
一、发现BMP2表达上调剂可提高BMP信号，并应用于肺动脉高压药物初筛:实施例1利用C2C12-BRE细胞发现BMP2表达上调剂可提高BMP信号并应用于肺动脉高压药物初筛
(1)荧光素酶表达活性的测定
采用Promega公司的LuciferaseAssaySystem报告基因检测系统，利用PerkinElmer公司的EnVision2104-0010型多功能读板仪测定荧光素酶表达活性。
(2)具有BRE转录激活功能小分子化合物的筛选
消化对数生长期的C2C12-BRE细胞(一种改造的成肌细胞,中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学系提供)，以50,000个/孔接种96孔板，待细胞生长至70％～90％汇合时，移去原有培养基，用PBS轻轻漂洗细胞一次，以除去血清中各种活性因子的干扰，向各孔中加入等量的无血清DMEM培养基，再分别加入一定量的哌啶基-嘌呤类衍生物BUR1-12和OUR1-19共31个化合物，使每种化合物的终浓度分别为2μg/mL和10μg/mL，每种化合物的每个浓度均平行设立三个复孔，同时以只加入1‰DMSO的孔作为空白对照。37℃，5％CO2条件下培养18～24h后，用CCLR(Promega)细胞裂解液裂解细胞，按LuciferaseAssaySystem报告基因检测系统说明书所述方法检测荧光素酶表达活性。
按如下公式计算化合物在各个浓度下的荧光素酶表达活性调节率：
结果表明，31个化合物中，除BUR9、OUR1、OUR9外，其余化合物均具有较为明显的(≥1.5倍)BRE转录激活功能，附图1A和B中显示31个化合物上调BRE转录活性的比值。
二、肺动脉高压药物干细胞复筛模型的建立和应用
以BMP信号下游关键基因Id基因为靶点，构建Id基因打靶载体；Id基因启动子驱动双报告基因体系载体和稳定表达的人胚胎干细胞株的获得。
针对人类干细胞Id基因的打靶是通过GATWAY方法进行的。首先是利用已建的包含全人基因组信息的细菌人工染色体文库，寻找包含目的基因的合适长度的BAC质粒。然后通过电脑设计进行基因序列与功能区域分析，确定该基因的关键外显子，然后利用AOS(ArrayOligoSelector)计算机程序挑选合适的打靶位点。继而利用基因特异的重组引物以及96-孔板高通量PCR，获得基因特异的重组片段。然后将一个高效的、Tet诱导型的重组质粒导入96孔板中的BAC克隆，加入纯化的重组片段，通过两次重组反应(第一次重组将顺式元件插入到单拷贝的BAC质粒，第二次利用gap-repair反应将携带合适大小同源臂的BAC亚克隆到另一个质粒框架中)，实现基因特异重组片段与相对应BAC克隆的重组，获得中间载体文库。最后利用3-waygateway系统，将所需元件插入中间载体，获得最终的基因打靶载体。最后利用25孔板，将纯化获得的基因打靶载体电转导入胚胎干细胞，通过负筛选获得基因打靶克隆。干细胞高通量基因打靶载体构建及细胞株获得流程示意图见图2。
实施例二：人胚胎干细胞Id1基因打靶载体的构建
1.从数据库中找到Id1基因的基因组序列，确定打靶位点为其外显子1，检索包含Id1基因完整序列的BAC质粒[Sanger研究所提供](5’和3’上下游5Kb序列)。
2.生物信息学分析：利用AOS电脑程序，在箭头所示的候选区，设计并选择最优的核苷酸片段，用于重组打靶。共设计4个重组打靶位点(图3)：U5和D3位点位于Id1基因1号外显子ATG下游231bp；G5位于U5上游约6kb的位置；G3位于D3下游约4kb的位置。
3.PCR反应产生基因特异性重组片段流程：
用于扩增重组片段的引物由70个碱基组成。其中位于引物3’端的20bp为抗性筛选框的通用引物，而引物5’端50bp则为Id1基因序列。高通量的引物是以96孔板的形式订制，其排列顺序与96孔板中基因特异的BAC克隆相对应。然后在96孔板中完成PCR反应，通过超滤纯化PCR产物(约10kb)，最后将2ug纯化的片段电转至已诱导重组酶活性的BAC克隆中。
4.中间载体的构建过程：
高通量Id1基因中间载体的构建在96孔板中进行，主要包括三个步骤(图4)
(1)Bac转化
将一个基于Psc101质粒框架、四环素(Tet)诱导重组的质粒Psc101gbaA(Sanger研究所提供)转化至携带含Id1基因BAC质粒(BAC-Id1)的E.Coli克隆中。
(2)关键外显子上下游序列插入
将一段包含gatewayR1和R2位点以及细菌正(zeocin)负(pheS)筛选标记的DNA片段(Sanger研究所提供)插入到BAC-Id1质粒中。插入U5和D3位点。
(3)Gaprepair
Gaprepair将包含经过修饰的关键外显子和关键外显子上下游5kb同源臂的BAC片段亚克隆到另一个载体上，目的是将同源臂两侧的BAC片段去除。Gaprepair框架是一个基于pBR322的线性化质粒(Sanger研究所提供)。这个框架包含R3和R4两个gateway位点，能与携带胚胎干细胞(ES)，打靶负筛选标记MC1启动子-白喉菌素A亚型(MC1-DTA)的高拷贝质粒的L3和L4gateway位点发生置换。最终获得的载体我们称之为“中间载体”，这个中间载体可以通过gateway系统attR1/R2和R3/R4位点置换不同的元件，最终获得理想的目的载体。
5.目的重组载体的构建流程：
目的重组载体由3个基于Gateway系统的质粒：本发明构建的中间载体和含有靶向元件的pL1L2_BacT质粒以及含负筛选标记的pL3L4_DTA质粒(Sanger研究所)(图5)组成。本实例包括两次基于gateway的转换体系，每个体系主要由2对gateway位点组成。中间载体包含四个gateway位点(R1/R2和R3/R4)，靶向元件的载体包含与R1/R2相对应的L1/L2位点，负筛选标记的载体包含与R3/R4相对应的L3/L4位点。
第一次转换，本发明中采用中间载体R1/R2位点间的负筛选标记(PheS)与含靶向元件载体的L1/L2位点间的双报告(Venus-Luc)系统元件(SA-T2A-H2B_venus-T2A-LUC-pA-promoter-puro-pA)(Sanger研究所)发生置换(图6)，第二次转化体系通过R3-L3和R4-L4反应，将含有同源臂和靶向元件的片段转移到一个含有哺乳动物负筛选标记基因(DTA)的高拷贝的质粒(Sanger研究所)中，R3和R4位点位于靶向载体同源臂的末端，L3和L4位点之间包含哺乳动物负筛选标记基因。最终通过R3/R4与L3/L4位点反应产生高拷贝的目的载体，命名为Id1-Venus-Luc-MC1-DTA的重组载体。(图7)。
实施例三：人胚胎干细胞Id1基因打靶双报告基因Id1-Venus-Luc细胞株的构建
在用AsiSI线性化处理后，将Id1-Venus-Luc-MC1-DTA的质粒电转P57代人胚胎干细胞H9(一种经过传代的人胚胎干细胞，可以从市场上购买得到)。在37℃，CO25％的条件下，通过含血清替代物的培养基在DR4MEF-滋养层细胞-(美国应用干细胞有限公司)上，每天换液培养。使用BioRad电转仪(ZAP:250V，uF500，TC8.6)电转，然后用用puromycin筛选共得到19个克隆，挑选出发绿色荧光整合型质粒克隆(带MC1-DTA质粒型的细胞不能存活)，检测荧光素活性与内源性Id基因表达的一致性(图8)。
我们发现克隆2在同量BMP4刺激下，可观察到荧光素酶表达水平与QPCR测得Id1mRNA转录水平一致，并且在刺激后1，2，3，5小时测得的酶活性随时间增长而加大，可以通过荧光素酶表达水平最大限度地反映外界刺激对Id基因表达的影响。所以选定克隆2定名为ID1-V-LUChES并进行对化合物的复筛(图9)。ID1-V-LUChES进行早期中胚层分化，获得表达平滑肌细胞标志αSMA，Calponin的血管细胞类型。ID1-V-LUChES分化细胞株在BMP4(Peprotech公司)刺激下，可观察到浓度梯度激活效应,6.25ng/mLBMP4刺激ID1-V-LUC4小时后调解率达到7.5倍。31个化合物在两个不同浓度(2μg/mL,10μg/mL)4小时刺激后比较活性水平(图10)。说明Venus-Luci双报告基因驱动Id1启动子系统人胚胎干细胞株ID1-V-LUChES模型可应用于高通量药物筛选。ID1-V-LUChES模型干细胞株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCCNo：11091
实施例四:Venus-Luci双报告基因驱动Id1启动子系统人胚胎干细胞株模型的应用
将ID1-V-LUChES模型干细胞接种于96孔板，待细胞集落长满全孔的80％左右时，移去原有培养基，用PBS轻轻漂洗一次，加入人胚胎干细胞mTeSR培养基(杭州百通生物技术公司)饥饿6h后，将1H-吡唑[3,4-d]嘧啶,1-苯-4-(1-哌啶基)-(CasNo:23000-46-6)，2-乙酰苯并噻吩(CasNo：22720-75-8)，芒柄花黄素(CasNo:485-72-3)。用上述培养基逐级稀释成5,2.5,1.25,0.625,0.3μg/mL，顺次加入接种有模型干细胞的96孔板中，每个浓度平行做三个复孔，同时以只含有0.1‰DMSO的培养基作为空白对照。37℃，5％CO2条件下培养18～24h后，用CCLR(Promega)细胞裂解液裂解细胞，按LuciferaseAssaySystem报告基因检测系统说明书所述方法检测荧光素酶表达活性。
按如下公式计算化合物在各个浓度下的荧光素酶表达活性调节率：
结果表明，哌啶基-嘌呤类衍生物以剂量依赖的方式上调模型干细胞荧光素酶的表达水平，其中2.5μg/mL的上调水平最高，达到3.31倍左右(图11)。表明该化合物可以上调Id基因表达。
实施例五：哌啶基-嘌呤类衍生物对野百合碱肺动脉高压(MCT-PAH)造模大鼠的治疗效果
MCT-PAH大鼠体内实验:雄性Sprague-Dawley大鼠(中国食品药品检定研究院)单次皮下给予野百合碱(MCT，55mg/kg)或生理盐水，MCT注射1周后灌胃给予4.5mg/kg哌啶基-嘌呤类衍生物(PP)，2-乙酰苯并噻吩化合物(2AZ)，20或50mg/kg芒柄花黄素(Form)和生理盐水及阳性药对照西地那非(Sildenafil)。给药4周后，统计存活率(图12)，表明哌啶基-嘌呤类衍生物和2-乙酰苯并噻吩化合物，芒柄花黄素对肺动脉高压(MCT-PAH)造模大鼠有良好的治疗效果。

Claims (5)

1.一种保藏编号为CGMCC11091的细胞株。
2.一种筛选抗肺动脉高压的化合物的模型，所述模型特征在于，
以BMP信号下游关键基因Id1基因为靶点，设计双报告基因原件插入Id1基因组构建重组载体，并转入人胚胎干细胞株，获得稳定表达的CGMCC11091的细胞株，将待测抗肺动脉高压的化合物刺激CGMCC11091的细胞株，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Id1启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Id1表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型。
3.构建权利要求2所述模型的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)从数据库中找到Id1基因的基因组序列，确定打靶位点为其外显子1，检索包含Id1基因完整序列的BAC质粒(5’和3’上下游5Kb序列)；
(2)生物信息学分析：利用AOS电脑程序，设计并选择最优的位于Id1基因1号外显子ATG下游231bp的U5和D3位点，用于重组打靶；
(3)PCR反应产生基因特异性重组片段：
用于扩增重组片段的引物是由通用引物序列和Id1基因序列共同组成，电转将抗性筛选框插入已诱导重组酶活性的BAC质粒中，获得带筛选框的BAC-Id1质粒；
(4)中间载体的构建：
将一个基于Psc101质粒框架、四环素(Tet)诱导重组的质粒Psc101gbaA，转化至携带含Id1基因BAC质粒(BAC-Id1)的E.Coli克隆中；通过第一次同源重组将带有gatewayR1/R2位点和细菌正(zeocin)负(pheS)筛选标记的DNA片段插入到BAC-Id1质粒U5/D3位点中；第二次同源重组将带有R3和R4两个gateway位点的pBR322质粒片断与BAC-Id1进行gap-repair反应，获得中间载体；
(5)目的重组载体的构建：
目的载体的构建基于Gateway系统的三个质粒：本发明构建的中间载体和含有靶向元件的pL1L2_BacT质粒以及含负筛选标记的pL3L4_DTA质粒组成。经两次gateway的转换体系，最终产生高拷贝的目的重组载体Id1-Venus-Luc-MC1-DTA；
(6)筛选细胞株的获得
将Id1-Venus-Luc-MC1-DTA质粒用AsiSI线性化处理，电转P57代人胚胎干细胞H9，获得整合型Id1启动子驱动Venus-Luci双报告基因表达的人胚胎干细胞株，得到CGMCC11091的细胞株，进行早期中胚层分化，将待测抗肺动脉高压的化合物和CGMCC11091的细胞株接触，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Id1启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Id1表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型。
4.用权利要求2所述模型筛选后得到的化合物在制备抗肺动脉高压的药物中的应用，所述化合物选自：
1H-吡唑[3,4-d]嘧啶,1-苯-4-(1-哌啶基)-(CasNo:23000-46-6)，
2-乙酰苯并噻吩(CasNo：22720-75-8)，
芒柄花黄素(CasNo:485-72-3)。
5.根据权利要求4所述的应用，所述的应用还包括对以下药物的筛选：
(1)上调骨形态形成蛋白(BMP)信号的调节剂；
(2)上调骨形态形成蛋白II型受体表达水平的调节剂；
(3)改善肺动脉血流动力学的制剂；
(4)改善肺血管重构的制剂；
(5)肺动脉高压治疗药物；
(6)心肺血管疾病治疗药物。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017020691A1 (zh) * 2015-08-05 2017-02-09 中国医学科学院基础医学研究所 一种哌啶基吡唑并嘧啶类化合物的筛选和用途
CN107164527A (zh) * 2017-06-29 2017-09-15 杭州观梓健康科技有限公司 一种筛选参与多能干细胞体外定向分化调节因子的方法
CN107436333A (zh) * 2017-09-05 2017-12-05 中国医学科学院阜外医院 精胺作为标志物在制备肺动脉高压的诊断产品中的应用及医疗器械
CN110141565A (zh) * 2019-05-10 2019-08-20 丽水市中心医院 芒柄花黄素在制备治疗肺动脉高压药物中的应用及治疗肺动脉高压药物
CN111606909A (zh) * 2020-06-09 2020-09-01 浙江大学 吡唑并嘧啶类化合物及其药物组合物及制备方法和应用
CN114317604A (zh) * 2022-03-04 2022-04-12 中国医学科学院阜外医院 一种自发性肺动脉高压模型及构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1441060A (zh) * 2003-02-28 2003-09-10 中国医学科学院医药生物技术研究所 促骨成形蛋白表达的新型抗骨质疏松药物筛选模型
WO2009106339A1 (en) * 2008-02-27 2009-09-03 Freie Universität Berlin A method for restoring bmp-receptor signaling in a cell
US20140135358A1 (en) * 2011-05-02 2014-05-15 Edda Spiekerkoetter Use of FK506 for the Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0324270D0 (en) * 2003-10-16 2003-11-19 Univ Edinburgh Improved control of ES cell self-renewal and lineage specification, and medium therefor
CN101372708A (zh) * 2008-10-17 2009-02-25 厦门大学 以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法
CN105062976B (zh) * 2015-08-05 2018-05-11 中国医学科学院基础医学研究所 肺动脉高压治疗药物的干细胞筛选模型及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1441060A (zh) * 2003-02-28 2003-09-10 中国医学科学院医药生物技术研究所 促骨成形蛋白表达的新型抗骨质疏松药物筛选模型
WO2009106339A1 (en) * 2008-02-27 2009-09-03 Freie Universität Berlin A method for restoring bmp-receptor signaling in a cell
US20140135358A1 (en) * 2011-05-02 2014-05-15 Edda Spiekerkoetter Use of FK506 for the Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EDDA SPIEKERKOETTER, ET AL.: "FK506 activates BMPR2,rescues endothelial dysfunction,and reverses pulmonary hypertension", 《THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION》 *
GUIBIN CHEN, ET AL.: "Trophoblast Differentiation Defect in Human Embryonic Stem Cells Lacking PIG-A and GPI-Anchored Cell-Surface Proteins", 《CELL STEM CELL》 *
JUN YANG, ET AL.: "Id proteins are critical downstream effectors of BMP signaling in human pulmonary arterial smooth muscle cells", 《AM J PHYSIOL LUNG CELL MOL PHYSIOL》 *
REN-HE XU, ET AL.: "Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells", 《NATURE METHODS》 *
WILLIAM C. SKARNES, ET AL.: "A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function", 《NATURE》 *
张海玲, ET AL.: "ID1启动子的构建及其在不同细胞系中的表达", 《解剖学研究》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017020691A1 (zh) * 2015-08-05 2017-02-09 中国医学科学院基础医学研究所 一种哌啶基吡唑并嘧啶类化合物的筛选和用途
CN107164527A (zh) * 2017-06-29 2017-09-15 杭州观梓健康科技有限公司 一种筛选参与多能干细胞体外定向分化调节因子的方法
CN107164527B (zh) * 2017-06-29 2018-04-20 杭州观梓健康科技有限公司 一种筛选参与多能干细胞体外定向分化调节因子的方法
CN107436333A (zh) * 2017-09-05 2017-12-05 中国医学科学院阜外医院 精胺作为标志物在制备肺动脉高压的诊断产品中的应用及医疗器械
CN110141565A (zh) * 2019-05-10 2019-08-20 丽水市中心医院 芒柄花黄素在制备治疗肺动脉高压药物中的应用及治疗肺动脉高压药物
CN111606909A (zh) * 2020-06-09 2020-09-01 浙江大学 吡唑并嘧啶类化合物及其药物组合物及制备方法和应用
CN114317604A (zh) * 2022-03-04 2022-04-12 中国医学科学院阜外医院 一种自发性肺动脉高压模型及构建方法
CN114317604B (zh) * 2022-03-04 2022-06-17 中国医学科学院阜外医院 一种自发性肺动脉高压模型及构建方法

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