CN103520703B - eIF6用于检测、预防或治疗运动性疲劳或记忆力减退的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及β4整合素结合蛋白(eIF6),或具有eIF6蛋白与配体的结合部位和/或eIF6蛋白的功能部位的氨基酸序列的蛋白或eIF6蛋白衍生物,包含eIF6基因核苷酸序列的核酸分子或有效抑制eIF6基因表达的核酸分子以及包含所述核酸分子的DNA表达载体在制备用于检测、预防或治疗运动性疲劳、记忆力减退或相关疾病的药物以及相关疾病的检测试剂盒中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及β4整合素结合蛋白(Integrin beta 4 binding protein,eIF6),或具有eIF6蛋白与配体的结合部位和/或eIF6的功能部位的氨基酸序列的蛋白或eIF6蛋白衍生物,包含eIF6基因核酸序列的核酸分子或有效抑制eIF6基因表达的核酸分子,以及包含所述核酸分子的DNA表达载体,用于检测、预防或治疗运动性疲劳、记忆力减退或记忆障碍的用途。
背景技术
一、运动性疲劳
运动性疲劳主要是指由运动引起身体能力下降的现象。1982年第五届国际运动生化会议将疲劳的定义统一,运动性疲劳是“机体生理过程不能持续其机能在一定水平或和各器官不能维持预定的运动强度”。
目前,按疲劳发生的部位,习惯上把运动性疲劳分为中枢疲劳和外周疲劳两部分。其中中枢疲劳产生的机制包括:
1)5-羟色胺(5-HT):5-HT是中枢神经系统的一种抑制性递质,研究也证实,动物进行长时间运动过程中大脑5-HT含量明显增加[1,2]。
2)多巴胺(DA)和去甲肾上腺素(NE):研究结果显示,在运动过程中中脑、海马、纹状体和下丘脑的DA代谢增强[3]。Bailey等发现大鼠的疲劳与脑干和中脑中多巴胺的合成和代谢的减少有关,当脑DA合成和代谢得以维持时,疲劳就会延迟。
3)乙酰胆碱(Ach):近年来,有推测认为耐力运动中疲劳可能是由于运动中胆碱利用的衰竭、排空降低了胆碱能系统的活动而引发的[4]。Wurtman等实验发现,运动员马拉松跑后,血浆胆碱水平下降约40%,与进食无胆碱的食物有同样效果[4],暗示当中枢Ach浓度下降时,中枢疲劳就会发生。
4)谷氨酸,γ-氨基丁酸(GABA):GABA是中枢神经系统中主要的抑制性氨基酸,谷氨酸(Glu)是主要的兴奋性氨基酸。Coiro研究发现GABA可抑制腺垂体对运动的反应,减弱机体对运动的应激,降低机体的运动能力[5]。在正常生理情况下,脑内兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸保持平衡。当脑内谷氨酸含量升高时,表示大脑皮层兴奋过程占优势;当脑内γ-氨基丁酸含量升高时,表示大脑皮层抑制过程占优势,此时易出现疲劳。
5)氨浓度:运动时,肌肉可产生氨并释放到血液。氨可通过血脑屏障,具有毒害作用。脑氨增多可引起多种酶活性及ATP再合成速率下降。氨还可改变脑膜对氨基酸的通透性,影响各种神经递质的代谢,因此氨可能是中枢疲劳的重要原因之一。
二、学习记忆
学习记忆是大脑最基本、最重要的高级神经功能之一,是衡量人类智能发育的重要指标。多年来人们对学习与记忆在脑内的定位问题进行了大量的研究,目前认为边缘系统中的海马是学习、记忆等高级神经活动的重要部位,海马与学习记忆有着密切的联系[6,7]。
研究发现给予海马短暂重复的刺激,会引起突触传递增强,在无损伤的动物体实验中,增强效应将维持数小时,甚至数周,这种突触传递的增强被称作突触传递长时程增强(Long-term potentiation,LTP)。海马内三条主要的兴奋性突触都能产生长时程增强(LTP)。Richard Morris于1986年首次证明长时程增强(Long-term potentiation,LTP)是体内记忆形成所必需的[8]。Susumu Tonegawa于1996年证明海马CA1区是活体老鼠空间记忆形成的关键[9],海马NMDA受体活性的增强能产生增强的LTP和空间学习的整体提高。2001年,Joe Tsien培育了海马中高表达NR2B亚基而具有NMDA受体功能增强品系的Doogie小鼠[10],Doogie小鼠不仅长时程增强(Long-term potentiation,LTP)较强而且在空间学习任务中也表现出色,进一步加强了LTP对海马依赖性记忆形成中的重要性。目前认为,LTP产生的分子机制为兴奋性神经递质谷氨酸(Glu1)和其受体KA/AMPA结合,激活了N2甲基2D2天门冬氨酸(NMDA)受体的离子通道进而产生的[11]。
三、eIF6的基本特征
eIF6基因(SEQ ID NO 2,NCBI genebank登记号为NM-002212)在真核生物中高度保守[12,13],人和小鼠eIF6氨基酸序列有98%序列同源性。在人类基因组中,eIF6定位于20号染色体的长臂20q11.2区,5’端缺少TATA启动子结合区,CpG岛,mRNA全长1108bp,含有7个外显子和6个内含子,开放读框含有735个核苷酸,245个氨基酸,分子量大小为27KD[14]。eIF6蛋白分布广泛,研究证实,在上皮细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、激活的T细胞、活化的肥大细胞及肌肉组织纤维中均有eIF6蛋白的表达,也有研究证实只要表达α6β4整合素的细胞均表达eIF6[15]。细胞水平,eIF6蛋白表达在胞浆(中间丝附近)和胞核(主要位于核仁外周)[16]。
eIF6的生物学功能包括:
1)参与调控蛋白合成:在真核生物翻译起始阶段,eIF6促进40s亚基和60s亚基结合形成80s亚基,从而启动蛋白质的翻译[17-20]。敲除eIF6基因后核糖体60s亚基丢失,证明其对核糖体60s的形成具有重要的作用[16]。并且对胞外信号的反应中eIF6是作为最早的真核细胞翻译起始因子参与调节蛋白的翻译[21]。另一方面,eIF6与RISC(RNA诱导沉默复合体)结合,特异性地促进相应microRNA的作用,从转录水平上干扰mRNA形成,抑制其对应靶蛋白的表达,反之敲除eIF6后则会解除microRNA对靶蛋白的表达抑制作用而促进靶蛋白的表达[22,23]。
2)参与调节细胞黏附及细胞骨架的形成:整合素家族为黏附分子受体,参与介导细胞与细胞外基质、细胞与细胞间的相互作用。细胞间的黏附作用有接合作用、桥粒连接、半桥粒连接等,半桥粒连接的细胞外基质主要为层黏蛋白,β4整合素为层黏蛋白受体,故其与桥粒、半桥粒的形成有密切的联系。eIF6为β4整合素结合蛋白,与中间丝和α6β4整合素的胞内结构域的功能区结合,作为两者的桥梁介导半桥粒的形成,介导细胞的黏附功能[24]。此外,eIF6还存在于核基质中,通过与核基质、中间丝等细胞骨架结构的连接,参与了细胞骨架的形成。有实验已证明eIF6在中间丝和核基质上高表达[15],并且eIF6还可以调节Wnt信号通路中的β-联蛋白的表达,从而影响细胞骨架[25]。
3)与肿瘤发生和转移的关系:肿瘤最明显的特点是细胞增殖异常,凋亡抑制,且容易转移。有实验证实eIF6作为翻译调节因子参与了细胞的增殖。在对分化诱导前后的肝癌细胞核基质成分进行亚细胞蛋白组学分析发现,eIF6在分化后的细胞中高表达,提示可能参与癌细胞分化[26]。eIF6在正常粘膜细胞可以检测到,但是在癌细胞中过表达,如在结直肠癌中eIF6的表达上调[27],并且在淋巴结转移灶中尤为明显[28],故而提示eIF6的高表达可能参与了肿瘤的增殖和转移。
从上面可以看出,eIF6在核糖体合成、细胞骨架以及肿瘤的增殖分化和转移中具有重要的作用,但是目前对于eIF6蛋白的相关文献较少,尤其是对于其与学习记忆功能的关系和在对抗记忆力减退或记忆障碍方面的作用还未见报道。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题,做出了本发明。
在本发明中,β4整合素结合蛋白eIF6(下面简称为“eIF6蛋白”)涵盖具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、在SEQ ID NO:1的序列的基础上发生1-3个氨基酸残基保守置换的同源氨基酸序列或与SEQID NO:1的序列具有至少80%以上的同源性且能与β4整合素,优选α6β4整合素特异性结合的氨基酸序列的多肽。因此,在本发明中当提及eIF6蛋白时,并不仅仅特指具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的野生型eIF6蛋白本身,而是涵盖来源于各种物种的eIF6蛋白的各种衍生物或同源物。
同样,下述的“eIF6核酸分子”涵盖包含SEQ ID NO:2所示的eIF6基因核酸序列、与SEQ ID NO:2的序列具有至少80%以上同源性的核酸序列的核酸分子。有效抑制eIF6基因表达的核酸分子(下面有时简称为“eIF6抑制核酸分子”)是指包含以eIF6基因序列(例如,SEQ ID NO:2所示的小鼠eIF6基因核酸序列)为靶序列的有效抑制eIF6基因表达的核酸序列的核酸分子(例如,反义核酸分子、小RNA(miRNA)、微小非编码RNA(tncRNA)、小调节RNA(smRNA)、短干扰RNA(siRNA)等。
此外,在本发明中,当提及“eIF6基因”时,其不限于鼠eIF6基因,而是泛指各种种属来源的eIF6基因,因为在进化中,eIF6基因在真核细胞中是非常保守的。
因此,在第一个方面,本发明提供了eIF6蛋白、eIF6核酸分子或eIF6抑制核酸分子以及包含所述核酸分子的DNA载体在制备用于检测、预防和/或治疗运动性疲劳、记忆力减退或记忆障碍及其相关疾病的药物中的用途。
在本发明中,包含核酸分子的DNA表达载体包括但不限于病毒载体、噬菌体载体、大肠杆菌载体、质粒载体、蓝藻穿梭载体、农杆菌载体、酵母载体等原核和真核基因表达载体,病毒载体优选本领域中常用的腺病毒载体或慢病毒载体等。
在一个优选的实施方案中,以eIF6基因序列为靶序列的有效抑制eIF6基因表达的核酸分子是长度在20~30个,优选21~27个核苷酸分子范围内的包含SEQ ID NO:15或和SEQ ID NO:16所示的序列的siRNA分子。
在另一个优选的实施方案中,以eIF6基因序列为靶序列的有效抑制eIF6基因表达的核酸分子是长度在20~40个,优选21~28个核苷酸分子范围内的包含SEQ ID NO:3-8所示的序列中的任一个序列的核酸分子。
在另一个优选的实施方案中,所述记忆力减退或记忆障碍由与海马功能受损相关的疾病或功能障碍导致。
在本发明中,所述记忆力减退或记忆障碍与下列因素有关:衰老、神经退行性疾病、抑郁症、脑部肿瘤、糖尿病、阿尔兹海默病、帕金森病、脑动脉硬化、慢性鼻窦炎、老年痴呆症、匹克氏病(Pick’s disease)、亨廷顿病、肝豆状核变性、精神分裂症、肝豆状核变性、精神分裂症、癫痫、睡眠障碍、慢性酒精中毒、甲状腺功能低下或神经性梅毒等(上述生理因素、疾病、疾病状态或功能障碍在本发明中也可以称为“与记忆力减退或记忆障碍相关的因素、疾病或疾病状态”)。
在第二个方面,本发明涉及一种用于检测运动性疲劳、记忆力减退或记忆障碍的试剂盒,所述试剂盒包括能与eIF6蛋白结合的配体或抗体(包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体等或其功能片段),与所述配体或抗体缀合(或偶联)或不缀合(或不偶联)的可检测标记物(例如,放射性同位素标记物、可显色物质(例如,辣根过氧化物酶)、荧光物质(例如荧光素)、化学发光团或其他生物发光物质(例如,水母发光蛋白),和/或显色试剂或显色底物(例如辣根过氧化物酶底物),以及适宜的稀释剂、缓冲剂、洗涤剂、检测载体(如检测板、试纸条等)等。
在第三个方面,本发明涉及用于减轻运动性疲劳、增强记忆力或预防或治疗上面提及的与所述记忆力减退或记忆障碍有关的因素或疾病的药物组合物,所述组合物包含治疗有效量的eIF6蛋白抗体(包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体等或其功能片段)、eIF6抑制核酸分子或包含所述eIF6抑制核酸分子的DNA表达载体,和适宜量的一种或多种药用辅料。
在第四个方面,本发明涉及减轻运动性疲劳、增强记忆力或预防或治疗上面提及的与所述记忆力减退或记忆障碍有关的因素或疾病的方法,所述方法包括向需要所述预防或治疗的受试者施用治疗有效量的eIF6蛋白抗体、eIF6抑制核酸分子或包含所述eIF6抑制核酸分子的DNA表达载体,所述受试者是哺乳动物,优选人。
本领域的技术人员应该理解,本发明的eIF6蛋白抗体或包含eIF6蛋白抗体的药物组合物、eIF6抑制核酸分子或包含eIF6抑制核酸分子的药物组合物可以局部给药,也可以通过口服、静脉内注射、肌内注射等常规施用方式施用;特别地,优选它们通过局部定向给药,尤其是脑室内给药(根据需要可以海马局部给药),更优选通过本领域技术人员熟知的靶向递送方式给药。另外,本领域技术人员通过常规试验能够分别确定eIF6蛋白抗体或包含eIF6蛋白抗体的药物组合物、eIF6抑制核酸分子或包含eIF6抑制核酸分子的药物组合物的剂量水平(例如,1μg~100mg/kg体重)。应该理解,关于任何具体受试者的具体剂量水平依赖于多种因素,包括受试者的年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物联合和经历治疗的具体疾病的严重性等。此外,eIF6蛋白抗体或包含eIF6蛋白抗体的药物组合物、eIF6抑制核酸分子或包含eIF6抑制核酸分子的药物组合物还可以与其记忆力减退抑制剂或记忆增强剂同时、或间隔一定时间进行施用。
另外,要说明的是,在本发明中“eIF6蛋白”、“eIF6核酸分子”或“eIF6抑制核酸分子”的来源不限于鼠,还可以来自哺乳动物,优选人。通过clustalw2序列比对显示,发现eIF6基因在真核细胞中序列高度保守。人与小鼠eIF6氨基酸序列有98%同源性(见图7),人和小鼠eIF6核苷酸序列高度保守,有91%同源性(见图8)。因此可以预期,各种真核来源的eIF6蛋白或eIF6核酸分子均可以实现本发明。
本发明的有益效果:
1.本发明通过Morris(Morris water maze,MWM)水迷宫系统检测发现eIF6敲基因小鼠有较强学习和空间定位能力。
2.通过免疫组织化学方法显示,eIF6蛋白在大脑皮层、海马及其周边组织的神经元和神经节中的过度表达与记忆力下降或记忆障碍有关,而eIF6蛋白的低表达则是具有明显增强学习记忆作用。
3.通过转棒式疲劳仪测试,发现eIF6敲基因小鼠有较强平衡能力和抗疲劳倾向,提示敲基因小鼠有较强延缓疲劳出现能力。
4.基于本发明的发现,可以通过逆转录定量PCT等技术筛选出了特异性抑制中枢神经系统或甚至是海马eIF6基因表达的病毒RNA干扰载体或siRNA分子,从而可以用于对抗运动性疲劳和/或记忆力减退的症状及其相关疾病或功能障碍。
5.eIF6基因在真核细胞中序列高度保守,因此除了小鼠以外,在其他物种如哺乳动物,例如人中,eIF6抑制性病毒RNA干扰载体和siRNA分子同样可以产生类似的效果。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
图1.野生型和eIF6敲基因鼠旷场测试。A:小鼠在旷场中央区域停留时间。B:小鼠在旷场中央区域走过路程。C:小鼠在旷场中30分钟内跳跃次数。D:小鼠在旷场中走过的总路程。10-12周雄性小鼠,实验动物野生型12只,敲基因小鼠13只,★p<0.05,★★p<0.01。
图2.野生型和eIF6敲基因鼠在转棒式疲劳仪停留时间。A:单只小鼠在疲劳仪停留时间分布。B:野生型和敲基因小鼠在疲劳仪上平均停留时间。8-10周雄性小鼠,实验动物野生型12只,敲基因小鼠13只,*p<0.05,**p<0.01。
图3.野生型和eIF6敲基因鼠水迷宫测试。A:小鼠水迷宫中潜伏期。B:小鼠在目标象限停留时间百分比。C:小鼠水迷宫中游泳总路程。D:小鼠水迷宫中平均游泳速度。10-12周雄性小鼠,实验动物野生型12只,敲基因小鼠13只,★p<0.05,★★p<0.01。
图4.野生型和eIF6敲基因在水迷宫中空间搜索策略。A:野生型小鼠在水迷宫中的空间搜索策略。B:敲基因小鼠在水迷宫中的空间搜索策略。
图5.免疫组织化学检测eIF6基因在大脑内表达。A:eIF6在大脑海马中表达情况。B:eIF6在大脑皮质中表达。C:海马中eIF6表达放大图。D:大脑皮质中eIF6表达放大图。
图6.免疫组织化学检测eIF6基因在海马表达。A:eIF6在大脑海马中表达情况。B:eIF6在CA区中表达。C:eIF6在DG区中表达。D:海马CA区中eIF6亚细胞表达情况。
图7.大脑海马区和非海马区不同的蛋白表达。hippo:海马组织,non-hippo:除海马的大脑组织,WT:野生型小鼠,ko:敲基因型小鼠。
图8.小鼠与人eIF6氨基酸序列同源性比对。黑色表示匹配,灰色表示不匹配。Homo:人类Mus:小鼠。
图9.小鼠与人eIF6核苷酸序列同源性比对。黑色表示匹配,灰色表示不匹配。Homo:人类Mus:小鼠。
具体实施方式
术语定义
记忆力减退:在本发明中,记忆力减退除与衰老相关的记忆力下降以外,还包括由心理因素和/或躯体器质性病变引起的记忆力下降。与记忆力下降有关的疾病或疾病状态如神经退行性疾病、睡眠障碍、脑动脉硬化、慢性鼻窦炎、慢性酒精中毒、脑部肿瘤、糖尿病、酒精中毒、甲状腺功能低下或神经性梅毒等。同时记忆与心理健康也有十分重要的关系,长期处于社会压力大、抑郁、自卑、焦虑等心理状态时也会引起记忆障碍。记忆力下降常常令病人陷入焦虑和紧张状态,而抑郁也是造成病人注意力不集中的原因,表现为注意力下降。
记忆障碍(Impaired Memory):指个体处于一种不能记住或回忆信息或技能的状态,有可能是由于病理生理性的或情境性的原因引起的永久性或暂时性的记忆障碍。在本发明中,当指个体的记忆力状态或临床表现(例如,提及与记忆力减退或记忆障碍相关的因素、疾病或疾病状态)时,记忆力减退和记忆障碍两个术语可以互换使用。
疾病状态:是指具有相关疾病的症状或功能障碍表现,但可能具有或不具有相关器官器质性病变的状态。
与海马功能受损相关的疾病或功能障碍:原发或继发引起的海马神经元器质性病变(例如,死亡)和/或功能紊乱而导致海马暂时或永久性功能受损的各种病因诸如创伤、器官萎缩、应激或其他有害刺激、中枢神经系统退行性或进行性疾病或综合征(例如,神经退行性疾病如阿尔兹海默病,大脑认知功能进行性退化综合征如老年痴呆症等)、生理性过程(例如,衰老、睡眠障碍等)或其他疾病(例如,糖尿病、抑郁症等)等,只要表现为海马功能损害或丧失,尤其是记忆力减退或记忆障碍,甚至记忆丧失,均包括在本发明的范围内。
Morris(Morris water maze,MWM)水迷宫系统:在本发明中,采用了Morris(Morris water maze,MWM)水迷宫系统用于检测受试者记忆功能。该系统是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于学习记忆脑机制研究的,被广泛运用在神经生物学领域的基础和应用研究,可作为检测实验动物学习记忆水平的重要工具。
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解,所述实施例只是举例说明的目的,并不意欲限制本发明的范围和精神。
本发明所用的实验仪器和材料及其来源如下:
实施例1.旷场实验检测
旷场实验(open field test)又称敞箱实验,是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等,反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为,以尿便次数反应其紧张度。实验装置由旷场反应箱和数据自动采集和处理系统两部分组成。在安静的实验环境下,将12-13只8-10周龄雄性eIF6敲基因小鼠(为从意大利引进的eIF6单基因敲除小鼠,SPF级动物房繁育;eIF6敲基因小鼠纯合致死,杂合子mRNA及蛋白表达半量降低)和相同遗传背景野生型小鼠轻放入箱内底面中心,同时进行摄像和计时。30分钟后停止摄像,观察时间根据实验分为每5分钟一个间隔记录小鼠在旷场内走过的总路程,中央区域活动时间和路程,离地跳跃次数。清洗方箱内壁及底面,清除上次动物余留的信息(如动物的大、小便、气味)。更换动物,继续实验。
实施例2.转棒式疲劳仪检测
小鼠转棒式疲劳仪是根据小鼠善攀爬不善奔跑的生理特性而设计的。该仪器可用于运动医学的研究、抗疲劳药物的研究、肌松药物的研究、神经系统药物的研究以及对动物不同运动强度下的生理指标变化的研究和药物毒性对实验动物运动性能影响的研究,可同时实验6只小鼠,实验条件一致性好,实验指标准确。将12-13只8-10周龄雄性eIF6敲基因小鼠和相同遗传背景野生型小鼠轻放于转棒上,将转棒挡板插好。以20rpm/min速度让小鼠适应20分钟,记录小鼠在30rpm/min转棒上停留时间。
实施例3.水迷宫测试
实验历时4天。实验开始前半小时将小鼠置水迷宫所在房间以适应环境。每天每只小鼠训练4次,每次以半随机(semi-random)方式分别从四个象限选择入水点,实验者将小鼠以手托起令其面向池壁,轻轻放入水中。小鼠在90s内能寻找到平台,则记录其搜寻并登上平台所需要的时间,即潜伏期(latency)。若小鼠在90s内未能找到平台,则由实验者用手将其引导至平台,潜伏期记为90s。小鼠登上平台后,让其在平台上停留15s,以让其根据4个象限的参照物来进行空间学习和记忆,并减少小鼠紧张。每次训练完成后,用干毛巾将小鼠擦干,并用加热器将小鼠烘干,以防止低体温造成的应激。每只小鼠总计训练16次。计算每天各组小鼠潜伏期、游泳距离、平均游泳速度和探索模式。在本实施例中使用的实验方案如下表1中所示:
表1水迷宫测试起始象限(隐藏平台)
N(北),E(东),S(南),W(西)
实施例4.免疫组织化学染色实验检测eIF6的不同脑区表达
1)冰冻切片免疫组化
小鼠称重,以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠实施腹腔麻醉。80ml4%多聚甲醛灌注;4%多聚甲醛4度固定24-48小时,30%蔗糖沉底,冰冻切片;将脑片从保存液中用细毛笔挑出,放入装有PBS的24孔板中,PBS漂洗10分钟;0.1%Triton X-100,室温漂洗10分钟;PBS漂洗10分钟;3%H2O230min;PBS洗三次,每次10分钟;山羊血清封闭,30min;一抗孵育(1∶2500),4度过夜;取出24孔板,PBS洗三次,每次10分钟;滴加生物素标记二抗,37℃孵育30min,PBS洗三次,每次10分钟;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育30min,PBS洗三次,每次10分钟;DAB反应染色,自来水充分冲洗后,苏木素复染,常规脱水,透明,干燥,封片。
2)石蜡切片免疫组化
石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用pH7.4的PBS冲洗三次,每次3分钟。取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液,加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,处理10分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗2×3’。每张切片加1滴3%H2O2,室温下孵育10分钟。PBS冲洗3×3’。除去PBS液,每张切片加1滴相应的第一抗体(相应稀释倍数),室温下孵育2小时。PBS冲洗3×5’。除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂(试剂A),室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。除去PBS液,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B),室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’除去PBS液,每张切片加1滴新鲜配制的DAB液,显微镜下观察。苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。
实施例5.Western Blot检测不同组织中eIF6及WT(野生型)和ko(eIF6基因敲除)小鼠中学习记忆相关蛋白表达差异
冰上处理组织,液氮研磨至均匀细粉,每样本加200μl组织裂解(含1%PMSF)液,移入一干净的1.5ml EP管,冰上放置;BCA法测定蛋白浓度。用裂解缓冲液调整样品的浓度至1ug/ul,加入5×SDS-PAGE上样缓冲液;蛋白煮沸5min;上样;SDS-PAGE电泳,电泳结束了取下凝胶放入电转缓冲液中浸泡,同时浸泡滤纸,PVDF膜,安装转膜结构,从负极到正极:三层滤纸-凝胶-PVDF膜-三层滤纸,恒压60v,电转3小时。取出PVDF在含5%BSA中室温封闭1小时;一抗4℃孵育过夜;洗膜,TBST×10min×3次;加入二抗,室温孵育1小时;洗膜;显影,美国millipore公司的化学发光液。
实施例6.慢病毒干扰载体的构建与包装
本实施例中所需eIF6基因的慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-eIF6RNAi及阴性对照干扰序列皆购自重庆金麦生物技术有限公司。二者转染293FT细胞包装后获得的慢病毒分别命名为:慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-eIF6RNAi1#、2#、3#和阴性对照。慢病毒载体的构建按SBI公司pFIV-H1/U6-copGFP siRNA试剂盒(Cat:#SI111A-1)操作说明书进行。RNA干扰筛选时选用的候选片段分别为:
eIF6RNAi1#-1:5′-AAAG GGGCTGGTGCATCCCAAGA-3′(SEQ ID NO:3)
eIF6RNAi1#-2:5′-AAAA TCTTGGGATGCACCAGCCC-3′(SEQ ID NO:4)
eIF6RNAi2#-1:5′-AAAG GGCTCAGAGAACTTCTACA-3′(SEQ ID NO:5)
eIF6RNAi2#-2:5′-AAAA TGTAGAAGTTCTCTGAGCC-3′(SEQ ID NO:6)
eIF6RNAi3#-1:5′-AAAG CAGCCTCCCAGACACAGTG-3′(SEQ ID NO:7)
eIF6RNAi3#-2:5′-AAAA CACTGTGTCTGGGAGGCTG-3′(SEQ ID NO:8)
阴性对照RNAi-1:5′-AAAGTCGACTCAGTCGGGTGGCA-3′(SEQ IDNO:9)
阴性对照RNAi-2:5′-AAAACTGCTATCGAGCCTGGCGA-3′(SEQ IDNO:10)
5.1慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-eIF6RNAi的构建
5.1.1退火
将上述候选片段95℃反应5分钟后冷却至室温。反应体系如下:
上游片段 | 2.5μl(约为2.5μg) |
下游片段 | 2.5μl(约为2.5μg) |
2×退火缓冲液 | 25.0μl |
ddH2O | 20.0μl |
终体积 | 50.0μl |
5.1.2连接
将退火后形成的双链DNA片段与pFIV-H1/U6-copGFP载体连接,16℃连接过夜。反应体系如下:
候选片段 | 1μl(约为0.01μg) |
pFIV-H1/U6-copGFP | 2.5μl(约为0.5μg) |
10×T4DNA连接缓冲液 | 1μl |
T4DNA连接酶 | 1μl |
ddH2O | 4.5μl |
终体积 | 10μl |
5.1.3连接产物的转化与扩增
按照本领域公知的常规大肠杆菌转化方法,将连接产物转化感受态大肠杆菌,利用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行鉴定。
5.2慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-eIF6RNAi的包装
将4×105细胞293FT细胞(购于中科院细胞库)接种至75cm2培养瓶中,待细胞达到70%融合度时转染。转染方法如下:取2.5μg包膜蛋白质粒pVSV-G,7.5μg包装质粒pFIV34N和2μg表达质粒混匀,ddH2O补充体积至1095μl。加入155μl2M CaCl2,缓慢加入1250μl2×PBS混匀。PBS清洗293FT细胞两遍,加入上述混合物;CO2孵箱中37℃培养7hr后更换新鲜无抗DMEM(10%小牛血清),每瓶10ml。继续培养至细胞出现绿色荧光。收集细胞上清,3000rpm,4℃离心5min,取上清用0.45μm的PVDF膜抽滤后即为所需要的慢病毒液。
实施例7.有效干扰eIF6基因的慢病毒的筛选
由于RNA干扰本身固有的生物学特性决定,构建的慢病毒干扰载体并非全部具有敲降效果,须筛选出最有效的序列。筛选使用24孔板(美国Corning公司)进行,每孔约有海马神经元细胞5×103个,各孔加入慢病毒上清液200μl。96小时后利用实时荧光定量PCR技术检测感染慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-eIF6RNAi1#、2#、3#及阴性对照感染组内eIF6mRNA表达情况。所用的引物序列为(同实施例5):eIF6:正向引物:5′-CCCAACAATACCACCGACCAGGA-3′(SEQ ID NO:11)反向引物:5′-GCCCTCCCTGATTGCTGAAGACA-3′(SEQ ID NO:12),GAPDH:正向引物:5′-GGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(SEQ ID NO:13)反向引物:5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATG-3′(SEQ ID NO:14)。具体步骤为:观察海马神经元细胞感染慢病毒后荧光表达约50%,细胞形态呈长梭形,阴性对照组未见荧光,弃去培养基;提取RNA,以提取的RNA作为模板进行反转录反应,实时定量PCR检测干扰效果。
实施例8.干扰eIF6基因的siRNA序列
慢病毒载体可进行长期有效eIF6基因敲降,siRNA干扰则为我们瞬时敲降eIF6基因优选方案。将海马神经元细胞接种至6孔板中,待细胞长至30-40%融合度时,Lipofectamin 2000(Invitrogen)瞬时转染细胞。每孔加入100pmol siRNA及阴性对照,所用培养基为Opti-MEM(Invitrogen)。37℃培养3hr后换液,72小时后检测敲降结果。eIF6基因siRNA序列为:5′-GAGCUUCGUUCGAGAACAAUU-3′(SEQ ID NO:15),5′-PUUGUUCUCGAACGAAGCUCUU-3′(SEQ ID NO:16)(在此序列中,P为磷酸,表示5’端被磷酸化),上海生工公司合成双链DNA片段。阴性对照为购自Dharmacon公司SiCONTROL NON-TARGETING siRNA POOL。
结果与讨论
1.旷场实验中,eIF6敲基因小鼠有焦虑倾向
实施例1的结果在图1中。在旷场实验中,与野生型相比,敲基因小鼠在旷场中央区域停留时间和路程显著高于野生型(图1A,B)。离地跳跃次数增多(图1C),而在旷场内走过的总路程和排便颗粒数没有明显差异(图1D)。以上结果暗示在旷场内,敲基因小鼠可能处于焦虑状态。
2.转棒式疲劳仪测试中,eIF6敲基因小鼠有较强平衡能力和抗疲劳倾向。
实施例2结果在图2中。在转棒式疲劳仪测试中,六只小鼠平行测试,与野生型相比,敲基因小鼠在转棒上表现活动能力和稳定时间都显著增加。转棒式疲劳仪是测量小鼠抗疲劳能力的经典模型。从本实验中,我们可以看到,敲基因小鼠无论平衡还是抗疲劳能力,较野生型小鼠都有显著增强,暗示我们敲基因小鼠有较强延缓疲劳出现能力。
3.在水迷宫测试中,eIF6敲基因小鼠有较强学习记忆能力。
实施例3的结果在图3-4中。在隐藏平台训练前,先进行4次可见平台学习。实验开始前半小时将小鼠置水迷宫所在房间以适应环境,每天每只小鼠训练4次,每次以半随机(semi-random)方式选择入水点(表1),经过4天的训练,两种小鼠寻找平台的潜伏期明显缩短(图3A),小鼠在目标象限滞留时间占总时间百分比随实验时间增长而增加(图3B),游泳总路程越来越短(图3C),两者平均游泳速度也呈降低趋势(图3D),搜索策略皆为有效的空间搜索策略,说明两种小鼠均可以在训练期间有效进行空间学习定位,完成寻找隐藏平台的任务(图4)。从训练的第一天起,敲基因小鼠潜伏期和游泳路程显著短于野生型(图3A,C),在目标象限停留百分比高于野生型(图3B),从训练第三天开始,差异逐渐消失,暗示在水迷宫系统中,敲基因小鼠有更强的空间学习记忆能力。
4.免疫组织化学染色显示,eIF6基因在小鼠大脑皮质,海马等神经元细胞中特异表达。
实施例4的结果在图5-6中。免疫组织化学结果显示,eIF6集中表达在神经元和神经节,分布在皮层,海马及周边组织(图5,6)。灰质,白质没有表达。细胞核和胞浆都有分布(图5C-D,图6D)。有研究表明大鼠的Morris水迷宫任务是由至少包括海马、纹状体、丘脑、前脑以及小脑等脑区所组成的网络作为一个整体而实现的,这些脑区的损害或脑区间联系的破坏都会影响这一功能的实现[29],我们的实验结果与此是一致的。
5.Western Blot实验显示,谷氨酸转运囊泡结构蛋白和谷氨酸受体在WT和KO小鼠中表达存在差异。
Western Blot实验显示,突触前细胞中谷氨酸囊泡运输相关蛋白SNAP25、syntaxin-1、dynamin I、complexin1/2在KO小鼠中表达降低,突出后神经元谷氨酸受体蛋白NMDAR表达量明显上升(图7),暗示我们KO小鼠中学习记忆的增强可能源于谷氨酸受体表达的增高而导致的LTP增强,并非源于突出前神经元谷氨酸释放量的增加。
从上述结果可以看出,在记忆力减退相关疾病或记忆障碍中,eIF6可能是负调控信号,eIF6蛋白或eIF6编码核酸的低表达则是具有明显增强学习记忆作用。因此,eIF6蛋白或eIF6编码核酸可以作为靶分子用于检测、预防和/或治疗记忆力减退或记忆障碍。
应该理解,尽管参考其示例性的实施方案,已经对本发明进行具体地显示和描述,但是本领域的普通技术人员应该理解,可以在其中进行各种形式和细节的变化,而不背离由权利要求所定义的本发明的精神和范围。
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Claims (7)
1.SEQ ID NO:3—8、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中任一个所示的序列的核酸分子或包含所述核酸分子的DNA表达载体在制备用于预防运动性疲劳、记忆力减退或记忆障碍的药物中的用途。
2.权利要求1所述的用途,其特征在于所述记忆力减退或记忆障碍由与海马功能受损相关的疾病或功能障碍导致。
3.权利要求1所述的用途,其特征在于所述记忆力减退或记忆障碍与下列因素或疾病有关:衰老、神经退行性疾病、抑郁症、脑部肿瘤、糖尿病、脑动脉硬化、慢性鼻窦炎、精神分裂症、癫痫、睡眠障碍、慢性酒精中毒、甲状腺功能低下或神经性梅毒。
4.权利要求3所述的用途,其特征在于所述神经退行性疾病选自阿尔兹海默病、帕金森病、老年痴呆症、匹克氏病、亨廷顿病或肝豆状核变性。
5.权利要求1所述的用途,其特征在于所述DNA表达载体是病毒载体、大肠杆菌载体、质粒载体、蓝藻穿梭载体、农杆菌载体或酵母载体。
6.权利要求1所述的用途,其特征在于所述DNA表达载体是噬菌体载体。
7.权利要求5所述的用途,其特征在于所述病毒载体是腺病毒载体或慢病毒载体。
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