CN104027256B - eIF6在调控黑色素合成中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于美白美发技术领域，具体涉及eIF6在调控黑色素合成中的用途。本发明要解决的技术问题为调控黑色素的合成提供一种新选择。本发明的技术方案是调控黑色素合成的药物，其主要活性成分为eIF6蛋白。本发明还提供了改善肤色的药物，其主要活性成分为eIF6蛋白。本发明还提供了改善毛发色泽的药物，其主要活性成分为eIF6蛋白。本发明为治疗色素沉着、色素缺失、白发病以及改善毛发色泽，达到美白、美发效果提供了新的选择，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于美白美发技术领域，具体涉及eIF6在调控黑色素合成中的用途。
背景技术
随着世界经济和科技的迅速发展，人们对美容美发的期望与要求也越来越高。东方女性历来崇尚白皙肌肤乌黑头发，但色素沉着、色素缺失、白发病等色素相关基本却时时困扰着人们。至今皮肤与毛发色素相关研究仍是医学美容研究的热点，也是世界性难题。人体肤色、毛色取决于皮肤、毛发中黑色素的含量与分布，而黑素细胞的结构、功能、数量及其发育是产生黑色素的决定因素，直接影响皮肤和毛发中黑色素的含量。在黑素细胞中，黑色素是由酪氨酸转化而来，其中酪氨酸酶是黑色素合成的主要限制酶，因此通过调控酪氨酸酶活性调节黑色素含量是美容美发剂的主要方法。而调控酪氨酸酶活性中最重要的转录因子是小眼畸形相关转录因子(MITF)，因此通过调控MITF的活性就可调节黑色素的含量。
eIF6蛋白(真核生物翻译起始因子Eukaryotic initiation factor6，又称整合素β4结合蛋白Integrin beta4binding protein)分布广泛，可以表达在不同的组织，或者同一组织不同细胞，或者同一细胞不同周期。研究证实，皮肤组织中大量表达eIF6蛋白；eIF6在蛋白合成、核糖体生物形成、细胞凋亡、细胞骨架以及肿瘤的增殖分化和转移中具有重要的作用。但并无eIF6在调节黑色素形成、美白美发方面的相关研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题为调控黑色素的合成提供一种新选择。
本发明的技术方案是调控黑色素合成的药物，其主要活性成分为eIF6蛋白。
进一步的，所述小鼠eIF6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，所述小鼠编码eIF6蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了改善肤色的药物，其主要活性成分为eIF6蛋白。
本发明还提供了改善毛发色泽的药物，其主要活性成分为eIF6蛋白。
本发明还提供了eIF6蛋白在制备调控黑色素合成的药物中的用途。
本发明还提供了eIF6蛋白在制备改善肤色的药物中的用途。
本发明还提供了eIF6蛋白在制备改善毛发色泽的药物中的用途。
SEQ ID No.1eIF6蛋白的氨基酸序列：
MAVRASFENNCEIGCFAKLTNTYCLVAIGGSENFYSVFEGELSDTIPVVHASIAGCRIICRMCVGNRHGLLVPNNTTDQELQHIRNSLPDTVQIRRVEERLSALGNVTTCNDYVALVHPDLDRETEEILADVLKVEVFRQTVADQVLVGSYCVFSNQGGLVHPKTSIEDQDELSSLLQVPLVAGTVNRGSEVIAAGMVVNDWCAFCGLDTTSTELSVVESVFKLNEAQPSTIATSMRDSLIDSLT
SEQ ID No.2eIF6蛋白的核苷酸序列：
ATGGCGGTCAGAGCGTCGTTCGAGAACAACTGTGAGGTCGGTTGTTTTGCCAAACTCACAAACGCCTACTGCCTGGTGGCCATCGGAGGCTCAGAGAACTTCTATAGTGTGTTCGAGGGTGAGCTCTCCGATGCCATTCCCGTGGTGCACGCATCCATCGCCGGCTGCCGAATCATCGGGCTGCAGCACATCCGCAACAGCCTGCCTGACTCCGTGCAGATACGGCGGGTGGAGGAGCGGCTCTCGGCCCTTGGCAATGTCACCACCTGCAATGACTATGTGGCCTTGGTCCACCCAGACTTGGACAGGGAGACAGAAGAGATCCTGGCTGATGTCCTCAAGGTGGAAGTCTTCAGACAGACAGTTGCTGACCAGGTGCTAGTAGGAAGCTACTGTGTCTTCAGTAATCAGGGGGGGCTGGTGCACCCTAAAACTATCGAGGACCAGGATGAGTTGTCCTCCCTTCTTCAGGTCCCCTTGTGGCAGGCACTGTGAACCGAGGGAGTGAGGTGATTGCTGCTGGGATGGTGGTGAACGATTGGTGTGCTTTCTGTGGTCTGGACACGACCAGCACGGAGCTGTCAGTGGTGGAGAGCGTCTTCAAGCTGAATGAAGCCAAGCCAAGTACCATTGCCACCAGCATGCGGGATTCCCTCATTGACAGCCTCACATGA
本发明的有益效果：本发明阐述了eIF6调控黑色素合成和在美白美发中的作用及用途。本发明为治疗色素沉着、色素缺失、白发病以及改善毛发色泽，达到美白、美发效果提供了新的选择，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1毛色观察实验结果，其中A为eIF6敲基因鼠，毛发为棕褐色；B为野生型鼠，毛发为深黑色。
图2拔毛实验结果。
图3 eIF6敲基因鼠和野生型鼠原代培养黑色素细胞中黑色素表达，A图为KO鼠、WT鼠原代培养黑色细胞透射电镜下每100μm2黑色素体个数；B图为KO鼠、WT鼠原代培养黑色细胞酪氨酸酶活性。
图4 eIF6敲基因鼠和野生型鼠原代培养黑色素细胞中MITF表达，其中图A为蛋白质印迹法检测KO鼠、WT鼠原代培养黑色细胞中MITF表达；图B为蛋白质印迹法检测KO鼠、WT鼠原代培养黑色细胞中MITF表达的灰度值比较。
图5干扰eIF6在模拟人基地皮肤色素形成实验中对黑色素合成的抑制实验，图A为阴性对照组，图B为慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-eIF6RNAi干扰组。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。本申请中未明确记载的实验步骤和调节，则采用常规的实验步骤和调节。
本发明中发现eIF6能够调控黑色素细胞中黑色素的合成，从而起到皮肤美白、促进毛发黑色素形成美发用途和效果。MITF通过调节酪氨酸酶的活性是黑色素合成的关键途径。以MITF为靶标，通过生物信息学预测，确定了eIF6能与之配对，并进行相关试验。首先发明人在eIF6敲基因鼠和野生型鼠中发现，eIF6敲基因鼠中毛发改变为棕灰色，如图1所示。进一步通过拔毛实验发现，拔毛后eIF6敲基因鼠和野生型鼠毛发生长周期中皮肤厚度和毛色发生改变，如图2所示。进而通过黑色素细胞原代培养检测eIF6敲基因鼠和野生型鼠黑色素细胞中酪氨酸酶、MITF的表达，如图3、4所示。再通过模拟人基地皮肤色素形成实验(OTC)检测eIF6对MITF表达的影响，如图5所示。结果证实，eIF6通过调节转录因子MITF的表达，通过酪氨酸酶影响黑色素的合成。由此可知，eIF6在色素沉着、色素缺失、白发病以及改善毛发色泽等美白美发方面有一定的效果，它能通过调节黑色素调节器MITF的表达调控酪氨酸酶活性而影响黑色素的形成。
实施例1eIF6敲基因鼠和野生型鼠毛色观察及拔毛实验
(1)eIF6敲基因鼠(由Stefano Biffo赠送，他的地址Molecular Histology andCell Growth Laboratory,San Raffaele Science Institute,Via Olgettina58,20132Milan,Italy)和野生型鼠毛色观察：观察出生28天毛发生长期eIF6敲基因鼠和野生型鼠毛色，并进行基因型鉴定和拍照。结果见图1，其中A为eIF6敲基因鼠，毛发为棕褐色；B为野生型鼠，毛发为深黑色。
(2)eIF6敲基因鼠(KO鼠)和野生型鼠(WT鼠)拔毛实验：取出生49天毛发静止期eIF6敲基因鼠和野生型鼠各27只，常规麻醉后用镊子拔除小鼠背部两侧后大腿部毛发。分别于拔毛后当天、第1、3、5、8、10、12、18、25天观察毛发颜色及取皮肤组织做HE染色观察皮肤厚度。结果如图2所示，拔毛后毛发周期中KO鼠较WT鼠晚两天，生长期皮肤厚度KO鼠较WT鼠薄。
实施例2eIF6敲基因鼠和野生型鼠中黑色素、酪氨酸酶、MITF表达检测实验
(1)鼠黑色素细胞原代培养：取小鼠背部皮肤，医用碘伏消毒1min后PBS冲洗3次，剪成约0.5cm2大小组织块，加入中性蛋白酶Ⅱ于4℃过夜；次日分离表皮、真皮，将表皮剪碎并以2.5g/L胰蛋白酶于37℃消化10min，采用含体积分数10％FCS(胎牛血清GIBCO)的DMEM培养液终止消化；过滤、离心并收集细胞计数。以K-SFM培养液调整细胞浓度为(1～2)×106个细胞/25cm2接种细胞，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱培养3天。吸弃未贴壁细胞，PBS轻洗2次，更换含体积分数10％FCS(胎牛血清GIBCO)的K-SFM(GIBCO)培养液并添加TPA10ng/mL(促黑色素细胞生长因子sigma)常规培养，每2天换液1次，培养7天即得到高纯度黑色素细胞。
(2)eIF6敲基因鼠和野生型鼠原代培养黑色素细胞中黑色素表达：采用上述黑色素细胞培养方法培养原代eIF6敲基因鼠和野生型鼠原代培养黑色素细胞。取第三代细胞做Dopa染色、透射电镜观察黑色素颗粒、酪氨酸酶的活性检测。如图3所示，A图为KO鼠、WT鼠原代培养黑色细胞透射电镜下每100μm2黑色素体个数；B图为KO鼠、WT鼠原代培养黑色细胞酪氨酸酶活性。结果表明，WT鼠原代培养黑色细胞中黑色素体显著多于KO鼠中原代培养黑色素细胞中黑色素体个数，具有显著性差异，P＝0.013；WT鼠原代培养黑色细胞中酪氨酸酶活性显著高于KO鼠中原代培养黑色素细胞中酪氨酸酶活性，具有显著性差异，P＝0.01。
(3)eIF6敲基因鼠和野生型鼠原代培养黑色素细胞中MITF表达：将原代培养第三代eIF6敲基因鼠和野生型鼠原代培养黑色素细胞以4×105个/孔接种于6孔板，培养至细胞密度为80％；加入预冷的RIPA裂解液(每106个细胞加入1mL)，按照全细胞蛋白提取试剂盒说明书提取细胞总蛋白。超声裂解，4℃下10000×g离心10min后吸取上清，二丁辛酸法进行蛋白定量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电印迹法转移蛋白，含50g/L牛血清白蛋白(BSA)封闭，分别加入稀释比为1︰100的兔抗鼠MITF抗体(sigma)于4℃过夜；Tris-吐温20缓冲液洗膜后分别加入稀释比为1︰2000的生物素标记山羊抗兔IgG二抗(sigma)，最后进行化学发光液显影。如图4所示，其中图A(GADPH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是蛋白印迹常用的内参)为蛋白质印迹法检测KO鼠、WT鼠原代培养黑色细胞中MITF表达；图B为蛋白质印迹法检测KO鼠、WT鼠原代培养黑色细胞中MITF表达的灰度值比较。结果表明，KO鼠原代培养黑色细胞中MITF表达低于WT鼠。
实施例3干扰eIF6在模拟人基地皮肤色素形成实验中对黑色素合成的抑制实验
以稳定慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-eIF6RNAi及阴性对照(干扰及对照序列皆购自重庆金麦生物技术有限公司)感染人的原代黑色细胞，经与鼠表皮细胞、成纤维细胞按1︰7︰3比例与鼠尾胶原(sigma公司)共同培养，即进行三维皮肤培养一个月。经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，银氨液浸染法染色液染色后显微镜下拍照。结果见图5所示，图A为阴性对照组，图B为慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-eIF6RNAi干扰组。结果表明，慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-eIF6RNAi干扰组较对照组的黑色素合成少，皮肤颜色较浅。
Claims (3)
1.eIF6蛋白在制备调控黑色素合成的药物中的用途，所述eIF6蛋白是氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的小鼠eIF6蛋白。
2.eIF6蛋白在制备改善肤色的药物中的用途，所述eIF6蛋白是氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的小鼠eIF6蛋白。
3.eIF6蛋白在制备改善毛发色泽的药物中的用途，所述eIF6蛋白是氨基酸序列如SEQID No.1所示、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的小鼠eIF6蛋白。
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