CN1148223C - 含Enopeptin的复合制剂及其抑制皮肤色素沉着的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Enopeptin-A和Enopeptin-B在低浓度下具有抑制黑色素合成的活性以及采用Enopeptin-A和Enopeptin-B作为活性成分和人体耐受的各种辅剂结合制备可抑制黑色素色斑生成的复合制剂的方法和其医疗及美容护肤用途。

Description

含Enopeptin的复合制剂及其抑制皮肤色素沉着的医药用途

本发明涉及含Enopcptin和其盐的复合制剂及其皮肤黑色素沉着抑制剂的医药和美容用途领域。

皮肤的颜色主要受表皮色素量的影响。黑色素由黑素细胞产生并释放给周围的角质细胞，然后在角化的过程中脱落，从而得以保持表皮内固定的浓度。因此，皮肤的颜色变得均匀，一年之间的肤色变化甚微。但是，黑色素的产生受紫外线和黑素细胞刺激激素(MSH)或老化的刺激，临床上可以看出皮肤的黑化。若黑化发生在局部，就会出现与周围正常皮肤的明显差别，并可形成色素点，例如雀斑或黄褐斑。这些色素点、雀斑、黄褐斑将随老龄化而加重或变得很难消退，因而需要有一种药物或美容护肤品能够有效预防色斑的形成或使色素点恢复到周围正常皮肤的颜色。

为此目的，一些药物被推荐，其中的一些已被应用。例如过氧化物被认为有清除黑色素的功能。被应用的类似药物有氢醌及其衍生物、氯化氨基汞、抗坏血酸、巯基胺类、4-异丙基儿茶酚以及过氧化物(过氧化氢，过氧苯酰)等。但是，这些化合物多不稳定且多为化学试剂，并非由生物体产生，对人体存在一定毒性和对肌肤的刺激性，而且防止色素沉积的实际效果不佳。近年来，含具有还原作用的维生素C(L-抗坏血酸)的化妆品已被应用，但维生素C是不稳定的而且看来很少明显效果。在欧洲和美国，应用对苯二酚及其衍生物以及各种儿茶酚治疗色素点或作为有色人种皮肤的增白剂。但这些化合物有时可引起刺激和过敏，因此从安全方面考虑是很不令人满意的。而且，在一些情况下，他们引起白斑，所以很难用作黑色素生成抑制剂(或增白化妆品)，虽被推出但存在安全性问题，且减轻黑色素沉着的实际效果不明显。

Enopeptin为日本Hiroyuki Osada在1991年进行抗病毒药物筛选时发现的一种新结构缩肽类化合物，其抗菌谱窄，对鼠的急性毒性低(LD₅₀为200mg/kg)，Enopeptin-A对链霉菌X59的黑色素合成有强的抑制活性，对黑素瘤B16细胞的黑色素合成也有一定抑制作用且稳定性好，对色素沉着有极好的预防和改善活性作用。日本专利JP0565297公开了用链霉菌制备生理活性化合物Enopeptin-A，包括水溶剂型产物和该化合物抗菌素药剂的生产方法。日本专利JP05117298公开了Enopeptin-A和B的制备方法，主要为从链霉菌RK-1051发酵代谢产物中分离出Enopeptin-A和B的技术。日本专利JP064003196和JP064003194公开了与Enopeptin有关的有机物的专利文献；但上述专利文献中未见有抑制黑色素生成的报道。

本发明的目的是提供一种能抑制人体黑色素沉着的复方制剂用于预防和治疗人体黑色素沉着。

本发明的另一目的是作为美容产品提供人们美容护肤。

本发明所涉及的黑色素抑制剂包含Enopeptin-A或Enopeptin-B。含Enopeptin的黑色素抑制剂可采用各种剂型例如搽剂、乳剂、霜剂、软膏、贴剂或在有机溶剂中的溶液等。

本发明的黑色素抑制剂还可包含用于各种化妆品的其它任意的辅料。例如油剂、湿润剂、增稠剂、防腐剂、乳化剂、香料、乳胶稳定剂等。

由此获得的本发明黑色素抑制剂由于其对黑色素生成和引起黑色素的色素沉着有极好的抑制活性可局部应用于患部，例如雀斑、炎症遗斑、妊娠黑斑，以及防止日晒后肌肤黑色素色斑形成，可用作为外用皮肤增白剂。

本发明的目的是通过下述方式实现的：

细胞和组织的变性是由于物质代谢障碍，在部分细胞内或间质中发生形态结构变化，出现各种异常物质或原有某些物质的堆积过多。过多色素存在组织内称为色素沉着。黑色素为内生色素，皮肤中黑色素正是由分布于人的表皮基底层细胞间的黑色素细胞所产生，体内从蛋白质分解出来的酪氨酸，进入皮肤的基底层后，经黑色素细胞所含的氧化酶的作用，氧化成颗粒状的黑色素。人体局部黑色素沉着不仅影响人的美观，甚至危害人的身心健康。黑色素合成抑制剂可预防和治疗人体局部性过量黑色素沉积，如黑痔，雀斑，炎症遗斑，妊娠黑斑等。人体组织中黑色素形成的生物合成途径如下：

由此可见，酪氨酸酶是动物、植物和微生物黑色素生物合成过程中唯一的关键酶。近年来，通过用蘑菇酪氨酸酶筛选方法，B16黑素瘤细胞筛选方法，比基尼链霉菌筛选方法以及用幼蚕液筛选方法已从天然产物中获得了一些具有黑色素合成抑制的化合物；如：Feldamycin，Melanostatin，OH-3984，Melanoxazal，MR304A等，但到目前为止，未见有将上述化合物制备成黑色素合成抑制剂。

发明人经过实验发现Enopeptin在低浓度下通过抑制酪氨酸酶的合成，从而具有抑制黑色素生成的作用，下面通过实验例对本发明作进一步地说明。

实验例1

Enopeptin对链霉菌黑色素形成的抑制作用

实验指示菌：链霉菌X59，由四川省宜宾地区土壤中分离

实验方法：将链霉菌X59接种在含有甘油1.5％，L-酪氨酸0.05％，天冬素0.1％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄ 0.05％，NaCl 0.05％，FeSO₄ 0.001％，微量元素溶液0.1ml，pH7.2～7.4的ISP7琼脂斜面上，于28℃培养5天，无菌水制成一定浓度的孢子悬液，按0.5％接种量接种于凝固的含有0.2％Bacto-酵母膏的ISP7琼脂平板上，涂布均匀，干燥后，将浸有样品溶液的无菌纸片(直径6mm)贴在平板上即采用纸片琼脂扩散法，置28℃培养4天，从平板背面测定黑色素抑制圈，对照品为四环素和维基尼亚霉素。

实验结果：

Enopeptin-A和Enopeptin-B对链霉菌X59黑色素合成抑制活性

                                           (黑色素抑制圈mm)

	250	125	62.5	31.25	16	8	4
								(μg/ml)
	Enopeptin-A	30	28	24	20	+-	+-								-
Enopeptin-B								25	19	14-	-	-	-	-
	四环素	抑菌	15	10	-	-	-								-
维基尼亚霉素								抑菌	抑菌	抑菌	6	-	-	-

+^-：活性弱

结论：Enopeptin-A对链霉菌X59黑色素合成抑制活性强于Enopeptin-B，而Enopeptin-A和Enopeptin-B对链霉菌X59黑色素合成抑制活性都强于对照组四环素和维基尼亚霉素。

实验例2

Enopeptin-A及Enopeptin-B对黑色素瘤B16细胞黑色素合成的影响

细胞株：黑色素瘤B16BL6，

实验方法：取生长良好的细胞用胰酶消化后计数，配成浓度为5×10⁵/ml的细胞液，每瓶接种4ml；第二天加药，每浓度2瓶；给药72小时后用0.25％胰酶消化细胞，然后用1ml完全培养基冲洗细胞放入离心管；台盼蓝染色，活细胞计数；离心，用1×PBS洗2遍；加1ml裂解液，室温静置30分钟，用紫外分光光度计测OD₄₇₀。计算1×10⁶个细胞含黑色素的量。

实验结果：

样品编号	浓度(μg/ml)	抑制合成(％)	样品编号	浓度(μg/ml)	抑制合成(％)
						Enopeptin-A	0.0000195	43.9	Enopeptin-B
0.000078	48.9	0.000078	27.0
				0.000313	46.8		0.000313	28.4
0.00125	34.6	0.00125	22.6
				0.005	33.7		0.005	14.0
0.02	31.3	0.02	17.9
				0.08	0.7		0.08	1.5

结论：两样品均在低浓度时有抑制黑色素瘤产生黑色素的作用。Enopeptin-A在0.078ng/ml时对黑色素瘤细胞的黑色素合成抑制率为48.9％。

制剂实施例1

含Enopeptin-A乳膏的制备

油相：Enopeptin-A活性物质                     0.1～1000μg

      硬脂酸                                       90g

      硬脂醇                                       36g

      月桂氮卓酮(脂溶性)                           2g

      硬脂酸丁酯                                   72g

      吐温-80                                      12g

水相：1，2-丙二醇                                  100g

      甘油                                         60g

    LGP-002(防腐剂)                                1g

    水                          加足至油水相共计1000g

按处方比例分别称量，将油相、水相分别于75-85℃水浴上加热，搅拌，熔化，再将油相缓缓加入水相中，边加边搅拌待乳化完全，搅拌至冷凝，分装即得。

制剂实施例2

含Enopeptin-A的溶液剂

Enopeptin-A活性物质                                0.03-1000μg

溶剂(二甲基亚砜、水、丙二醇)                       共制成1000ml

防腐剂(LGP-002，山梨酸钾等)                        适量

将活性物质加入二甲基亚砜溶解后，再加入丙二醇、水、防腐剂至1000ml。

制剂实施例3

含Enopeptin-A的膜剂

Enopeptin-A活性物质                                0.03-1000μg

溶剂(二甲基亚砜、丙二醇等)                         2-20％

着色剂(色素、TiO2等)                               0.1-2％

成膜材料(PVA、KVP、阿拉伯胶等)                     30-40％

表面活性剂(吐温-80、十二烷基硫酸钠等)              1-2％

填充剂(液体石蜡等)                                 适量

将精制的成膜材料溶解于水中，滤过，加入已溶解的主药，充分搅拌溶解，再制膜，切割一定尺寸的膜片，用纸或聚乙烯薄膜包装。

成膜材料浆液配制-----加入已溶解的主药、着色剂等-----脱泡-----涂膜-----干燥-----脱膜-----含量测定-----包装

制剂实施例4

含Enopeptin-A的凝胶剂

Enopeptin-A活性物质                             0.03-1000μg

液体石蜡                                        5-20％

非离子表面活性剂                                1-25％

防腐剂(LGP-002、苯甲酸等)                       适量

溶剂(二甲基亚砜、水等)                          加至1000g

非离子表面活性剂：聚氧乙烯(4)月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯。

制剂实施例5

含Enopeptin-A的搽剂

Enopeptin-A活性物质                              0.03-1000μg

稳定剂芳香剂(乳酸乙酯等)                         适量

助溶剂(三乙二醇月桂酸酯、二甲基亚砜)             2-20％

PEG-200(表面活性剂)                              1-20％

1，2-丙二醇(溶剂)                                10-40％

水                                               加至1000ml

将主药溶在二甲基亚砜等中，再加入溶剂1，2-丙二醇再加入稳定剂表面活性剂，加水至1000ml。

制剂实施例6

含Enopeptin-A的凝胶剂

Enopeptin-A活性物质                              0.03-1000μg

液体石蜡                                         5-30％

非离子表面活性剂[聚氧乙烯(4)月桂酸酯]            1-2％

甘油                                             1-10％

1，2-丙二醇                                      10-20％

聚苯乙烯                                         1-40％

Claims (2)

1、Enopeptin-A或其盐为活性有效成分在制备用于抑制人体皮肤黑色素沉着药物的用途。

2、Enopeptin-B或其盐为活性有效成分在制备用于抑制人体皮肤黑色素沉着药物的用途。