CN109481433A - Dehydrophyllodulcin在制备抗肿瘤转移药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是Dehydrophyllodulcin(DPL)用于制备抗肿瘤转移药物的新用途。体外实验发现，DPL能明显抑制小鼠黑色素瘤B16细胞迁移，侵袭和粘附。体内实验显示，DPL能显著降低LPS诱导的小鼠黑色素瘤肝转移能力，减少黑色素瘤转移灶的形成和数量，降低血清和肝组织炎性因子的表达。因而DPL可用于制备治疗抗肿瘤转移的药物。

Description

Dehydrophyllodulcin在制备抗肿瘤转移药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是Dehydrophyllodulcin在抗肿瘤转移药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁着人类健康，目前恶性肿瘤死亡占全死因中的第一位。而肿瘤转移是恶性肿瘤发生和演变过程中最危险的阶段，临床上有60％以上的恶性肿瘤患者在发现时已经转移，是癌症治疗困难、失败和肿瘤患者死亡的首要原因。

中医药广泛应用于恶性肿瘤的治疗，主要治疗原则有：活血化瘀法、扶正补益法、清热解毒法和软坚散结法。大量研究表明，活血化瘀中药在恶性肿瘤治疗中能直接杀灭肿瘤细胞、抑制肿瘤转移、改善血液流变性和微循环障碍、调节机体免疫能力等。三棱的干燥块茎为传统活血化瘀中药三棱。Dehydrophyllodulcin(DPL)是从三棱块茎中首次提取分离得到异香豆素化合物[Dong SH et al.(2016).Chemical constituents from the tubersof Scirpus yagara and their anti-inflammatory activities.J Asian Nat ProdRes，18(8)：791-7.]。但至今未见有关DPL抑制肿瘤转移的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供化合物Dehydrophyllodulcin(DPL)一种治疗肿瘤转移药物的新用途。

本发明的目的是通过下列方法实现的：

Dehydrophyllodulcin在制备抗肿瘤转移药物中的应用，尤其是针对黑色素瘤的抗肿瘤转移药。其发挥抗肿瘤转移作用的机制是抑制小鼠黑色素瘤细胞B16迁移和侵袭，降低小鼠黑色素瘤B16肝转移能力，减少黑色素瘤转移灶的形成和数量，降低血清和肝组织炎性因子的表达。

本发明有益效果：

(1)Dehydrophyllodulcin能抑制LPS诱导的小鼠黑色素瘤细胞B16的迁移；

(2)Dehydrophyllodulcin能抑制LPS诱导的小鼠黑色素瘤细胞B16的侵袭；

(3)Dehydrophyllodulcin能显著降低LPS诱导的小鼠黑色素瘤细胞B16肝转移能力，减少黑色素瘤转移灶的形成和数量，降低血清和肝组织炎性因子的表达。

因此，Dehydrophyllodulcin可用于制备治疗肿瘤转移疾病的药物，具有制备抗肿瘤转移药物的应用前景。

附图说明

图1.不同浓度DPL对小鼠黑色素瘤细胞B16存活率的影响。(与对照组相比，^*P＜0.05，n＝3)

图2.DPL对LPS诱导小鼠黑色素瘤细胞B16迁移的影响。(与对照组相比，^#P＜0.05；与LPS组相比，^*P＜0.05，n＝3)

图3.DPL对LPS诱导小鼠黑色素瘤细胞B16侵袭的影响。(与对照组相比，^#P＜0.05；与LPS组相比，^*P＜0.05，n＝3)

图4.DPL对LPS诱导小鼠黑色素瘤细胞B16粘附的影响。(与对照组相比，^#P＜0.05；与LPS组相比，^*P＜0.05，n＝3)

图5.DPL对LPS诱导B16肝转移的影响。A：各组小鼠肝组织；B：小鼠肝表面肿瘤转移灶的数量；C：小鼠肝脏中TNF-α含量；D：小鼠肝脏中IL-6含量。(与对照组相比，^#P＜0.05；与LPS组相比，^*P＜0.05)

具体实施方式

本发明通过如下实验，说明Dehydrophyllodulcin(DPL)具有治疗肿瘤转移疾病的作用。

1实验材料

Balb/c小鼠，SPF级，18～22g，雌性，6～8周，购自浙江省实验动物中心；IL-6和TNF-α试剂盒，美国eBioscience公司生产；小鼠黑色素瘤细胞株B16购自中国科学院上海生命科学院细胞库；1640培养基和胎牛血清购自维森特生物技术有限公司；LPS和MTT购自Sigma公司；4％多聚甲醛和0.1％结晶紫购自北京索莱宝科技公司。

2实验方法

2.1细胞培养

小鼠黑色素瘤细胞B16培养在含有10％胎牛血清的1640完全培养基中，细胞在含有5％CO₂的37℃培养箱中培养。B16细胞呈单层贴壁生长，3天传代一次，0.25％胰酶消化传代。

2.2 MTT法测定细胞活力

选取小鼠黑色素瘤细胞B16为细胞模型。以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，并与铺板后24h进行药物处理，使用不同浓度DPL处理肿瘤细胞，并于24h后通过MTT法检测细胞的变异水平(以细胞变异率计)。

2.3划痕实验

在划痕实验中，选取小鼠黑色素瘤细胞B16为细胞模型。以2×10⁵个/孔接种于6孔板中。细胞汇合率达到90％时，用200μL枪头划数条直线，PBS冲洗3次，用LPS或DPL处理肿瘤细胞。随机选取5个视野进行连续观察，分别于0h和24h采集图像。将所得图像数据用ImagePro Plus 6.0进行处理分析。

2.4 Transwell侵袭实验

在Transwell实验中，选取小鼠黑色素瘤细胞B16为细胞模型。用matrigel铺入小室，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养2h，小室接种3×10⁴个/孔B16细胞，用LPS或DPL处理肿瘤细胞，下室加入含20％胎牛血清培养液0.6mL，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h；结束后，用棉签轻拭去上室面未穿模细胞，结晶紫染色。随机选取5个视野，计数滤膜下室面的细胞数。

2.5细胞粘附实验

在粘附实验中，将B16细胞更换成含药或含诱导剂的无血清培养基培养24h。于96孔板中并加入纤维粘连蛋白(Fibronectin)，4℃孵育16h。PBS洗板两次，随机加入牛血清白蛋白(100μL/孔)37℃孵育30min以封闭非特异性位点，PBS冲洗2次。消化刺激后的细胞制成浓度为3×10⁵/ml的细胞悬液，以100μL/孔接种于96孔培养板，每组设3个复孔，37℃培养箱中孵育1h后吸出培养液，用PBS冲洗一次，加入100μL 4％多聚甲醛，固定15min。冲洗2次，加入100μL 0.1％结晶紫，染色20min。冲洗2次，将96孔板置倒置显微镜下，随机选取5个高倍视野(×100)进行拍照、计数，并计算粘附率。

2.6 B16肝转移模型制备

在肝转移模型中，选取雌性Balb/c(周龄4-6周)小鼠。小鼠黑色素瘤细胞B16提前用LPS和DPL刺激。实验分设control组(B16细胞未处理)、LPS组(1μg/mL LPS刺激B16细胞)和DPL组(1μg/mL LPS与DPL共同加入刺激B16细胞)。细胞刺激4h后，小鼠采用10％的水合氯醛腹腔注射麻醉，在左侧助弓下缘1cm处向下剪开2cm皮肤，暴露内脏。用镊子小心拨出脾脏下极，用1mL注射器从脾脏下极进针向脾门方向约2～5mm开始注射细胞，细胞按2.5×10⁵个/0.1mL/只注射于小鼠体内。注射区苍白隆起消失后，结扎脾蒂，切除脾脏，缝合肌肉、皮肤关腹。术后继续在实验室饲养。9天后小鼠处死，取肝并拍照。ELISA法检测肝组织匀浆液中的TNF-α和IL-6含量。

3.实验结果

3.1 DPL对B16细胞活力的影响

DPL对B16细胞活力的影响见图1，与正常对照组比，5μM DPL并不能明显降低B16细胞的变异率。故DPL进行抗肿瘤转移活性评价实验的最大试药浓度为：5μM。

3.2 DPL抑制黑色素瘤细胞B16迁移

实验研究表明，与阴性对照组相比，LPS组B16细胞迁移数在12h和24h时都显著增加。同时用LPS和DPL孵育后，B16细胞迁移数量明显减少，特别是5μM DPL在12h和24h分别降低了54.54％和60.87％(图2)。DPL能抑制LPS诱导的B16细胞迁移。

3.3 DPL抑制黑色素瘤细胞B16侵袭

实验研究表明，与阴性对照组相比，LPS组B16细胞侵袭增加了86.88％。DPL与LPS共同孵育B16细胞后，细胞侵袭明显减少，5μM DPL组细胞侵袭减少了50.897％(图3)。DPL能抑制LPS诱导的B16细胞侵袭。

3.4 DPL抑制LPS诱导的B16细胞粘附

实验研究表明，用Fibronectin包被后，与阴性对照组相比，LPS组B16细胞粘附增加了162.32％。DPL与LPS共同孵育B16细胞后，细胞粘附明显减少，5μM DPL组细胞粘附减少了148.897％(图4)。DPL能抑制LPS诱导的B16细胞粘附。

3.5 DPL抑制小鼠黑色素瘤细胞B16肝转移

实验研究表明，小鼠接种未经处理的B16细胞，肝表面的出现黑色转移灶。体外用LPS处理B16细胞4h后，同样经过脾脏注射到小鼠体内，解剖时可见转移灶数量明显增加。用LPS和DPL共同孵育细胞后，B16细胞转移能力显著下降，肝部的转移灶仅散在分布，与空白对照组无显著性差异(图5A和B)。另外，与空白组相比，LPS组小鼠肝组织TNF-α和IL-6含量显著升高，DPL组肝组织TNF-α和IL-6含量均显著降低(图5C和D)。

Claims (1)

1.Dehydrophyllodulcin在制备抗肿瘤转移药物中的应用。