CN105969725B - 枸杞红素的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及活性物质领域,尤其涉及枸杞红素的用途。本发明通过实验表明,枸杞红素能够通过抑制凋亡因子、炎症因子的表达、提高氧化还原能力、抑制PKC/Raf‑1/MAPK/NF‑κB通路、调节miR‑210的表达来提高干细胞的抗逆性,从而达到提高干细胞移植效率的目的。并且实验表明,移植经枸杞红素处理的干细胞能够起到治疗急性肝衰竭的作用。
Description
技术领域
本发明涉及活性物质领域,尤其涉及枸杞红素的用途。
背景技术
干细胞(stem cell)是一类具有自我更新能力(self-renewing)的多潜能细胞。基于干细胞自我更新能力和高度增殖及多向分化的潜能,其在物种发育研究、制药安全性试验以及疾病治疗、生物修复、器官移植、美容等多种领域有着广泛的应用。虽然现在有很多关于干细胞及其分化后细胞进行移植治疗的报道,但是总体来说,干细胞的临床治疗现在还处于非常初期的阶段,对干细胞本身的了解,治疗机制的阐明,治疗安全性和有效性的保障及其伦理规范的制定都亟待深入研究探讨。其中,干细胞移植治疗效率的提高是临床治疗上最需要解决的问题之一。从动物实验的结果来看,干细胞的移植效率依然偏低。如何提高干细胞治疗疾病的移植效率是当今干细胞研究领域最为急迫的任务之一。
枸杞作为当今平常的营养品,其具有很多的方面的药理作用。已经有很多研究报道证明枸杞提取物对于多种疾病都具有很好的保护作用,例如有研究表明枸杞提取物中含有某些生物活性分子,该分子能够通过抗氧化等作用缓解神经变性紊乱疾病,从而达到神经保护作用(Olatunji et al,2016);还有研究表明枸杞提取物可以抑制乳腺癌细胞的增殖,并能够下调Bcl-2基因的表达以达到抗肿瘤效应(Li et al,2002);另外还有研究表明枸杞提取物中含有某些成分能够显著抑制机体炎症,并且能够对酒精诱导的胃肠损伤起到胃保护作用,其有可能作为胃溃疡治疗药物(Opeyemi et al,2015);同时也有研究表明枸杞提取物对于肝脏具有保护作用(Gündüz et al,2015)。
枸杞提取物中的成分主要为多糖、类胡萝卜素和类黄酮等物质,有研究表明枸杞多糖能够缓解氧化压力、炎症、凋亡及细胞坏死等以达到神经保护作用(Xing et al,2016)。也有研究表明在干枸杞中枸杞红素(zeaxanthin dipalmitate,ZD)含量最高(Inbaraj et al,2008)。
枸杞红素(zeaxanthin dipalmitate,ZD),结构式如式I,
目前的研究结果表明枸杞红素有保肝作用,但目前尚无研究表明枸杞红素对干细胞具有保护作用。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供枸杞红素的用途,本发明通过实验表明,枸杞红素能够通过抑制凋亡因子、炎症因子的表达、提高氧化还原能力、抑制PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路、调节miR-210的表达来提高干细胞的抗逆性,从而达到提高干细胞移植效率的目的。并且实验表明,移植经枸杞红素处理的干细胞能够起到治疗急性肝衰竭的作用。
本发明提供了枸杞红素在抑制干细胞凋亡因子活性和/或炎症因子表达中的应用。
本发明中,凋亡因子为caspase3、Caspase7和/或Caspase8;炎症因子为TNFα和/或IL-6。
本发明研究发现,ZD能够提高细胞的抗凋亡及抗炎症效应,以LPS+H2O2诱导细胞凋亡的干细胞模型为研究对象,ZD能够降低干细胞中细胞凋亡因子的活性,与不添加ZD进行保护的细胞相比,caspase3/7、Caspase8的活性显著降低(p<0.001);ZD降低细胞中炎症因子的表达量,与不添加ZD进行保护的细胞相比,TNFα和/或IL-6的表达量显著降低(p<0.001)。本发明研究采用的干细胞为脂肪间充质干细胞,具体的,其为人源脂肪间充质干细胞。
本发明提供了枸杞红素在提高干细胞还原能力中的应用。
本发明所述的提高干细胞还原能力包括下调干细胞ROS信号表达、提高干细胞GSH/GSSG比率、促进干细胞CAT和/或SOD1表达。
研究发现,LPS/H2O2明显上调ROS信号表达,而ZD能够缓解这一现象;且LPS/H2O2明显上调胞内氧化压力,加入ZD后能够显著上调胞内还原力。以LPS+H2O2诱导细胞凋亡的干细胞模型为研究对象,与不添加ZD进行保护的细胞相比,添加ZD的干细胞中ROS信号的表达显著降低(p<0.001);与不添加ZD进行保护的细胞相比,添加ZD的干细胞中,GSH/GSSG比率显著提高(p<0.001),提高后的水平与空白对照无显著差异,说明GSH被氧化的情况得到显著改善。并且,在ZD的保护下,干细胞内的CAT和SOD1的表达量相对于未经ZD保护的干细胞也得到了显著的提高(p<0.001)。本发明研究采用的干细胞为脂肪间充质干细胞,具体的,其为人源脂肪间充质干细胞。
本发明还提供了枸杞红素作为干细胞PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路抑制剂中的应用。
本发明中干细胞PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路抑制包括抑制干细胞内PKC、NF-κB和/或Elk1的表达、抑制干细胞内Raf-1和/或MAPK家族成员的激活。
研究表明,经LPS/H2O2刺激后胞内PKC、NF-κB以及Elk1活性显著增强(p<0.01),而ZD可以在不影响其基底水平的情况下消除LPS/H2O2刺激给细胞带来的影响;且经LPS/H2O2刺激后胞内Raf-1和MAPK家族成员(MEK和p38MAPK)被激活了,ZD能够缓解其激活情况,该效果具有显著性(p<0.01)。并且,LPS/H2O2刺激或加入ZD均不影响MEK和p38MAPK的总表达情况。本发明研究采用的干细胞为脂肪间充质干细胞,具体的,其为人源脂肪间充质干细胞。
本发明还提供了枸杞红素作为干细胞miR-210表达调节剂的应用。
研究表明,发现LPS/H2O2刺激和ZD均能显著上调miR-210的表达,而经LPS/H2O2刺激后加入ZD其miR-210的表达也有所上调。提示ZD能够维持miR-210一个相对较高的表达水平。而当PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路受到抑制则细胞受损更严重且miR-210的表达也受到抑制,当ROS的表达受到诱导时,ZD能够降低由ROS诱导剂引起的miR-210的上调,但是其表达水平又比只加入ZD的水平要高。并且,本发明的研究表明,miR-210诱导细胞ROS的产生是通过抑制ROS抑制剂ISCU的表达来实现的。miR-210能显著上调ROS的产生,ZD能够缓解这一现象。miR-210能够显著下调ISCU的表达,而ZD能够恢复由miR-210诱导的ISCU下调。并且,对经LPS/H2O2刺激及加入ZD后的OE和KD细胞中miR-210的表达情况分析发现,ZD能够下调由于OE miR-210使胞内miR-210表达的上调;相反,ZD能够上调由于KD miR-210使胞内miR-210表达的显著下调。综上,本发明研究表明,ZD并非在任意条件下都对miR-210的表达产生促进作用,而是维持miR-210一个相对较高的表达水平以促进细胞正常存活。本发明研究采用的干细胞为脂肪间充质干细胞,具体的,其为人源脂肪间充质干细胞。
本发明还提供了枸杞红素在提高干细胞抗逆性中的应用。
本发明所述的干细胞抗逆性包括:抵抗LPS和H2O2联合作用、抵抗PKC抑制剂作用、抵抗MEK/MAPK抑制剂的作用、抵抗ROS诱导剂的作用、抵抗miR-210或其相似物的作用、和/或抵抗ISCU抑制剂的作用。
本发明利用ZD能够提高干细胞的抗逆性,从而使得干细胞的存活率提高和/或抑制干细胞的凋亡。
研究结果表明,ZD能够保护干细胞免受LPS和H2O2联合作用的威胁,浓度为0.5μmol/L~2μmol/L的ZD对干细胞的保护效果与依达拉奉(Eda,自由基清除剂)相似,能够显著提高细胞的存活率、抑制干细胞凋亡的产生(p<0.01)。研究表明,这一效果是通过提高细胞的抗凋亡及抗炎症效应、抑制ROS信号表达及提高胞内还原能力来实现的。
并且,在面对PKC抑制剂、MEK/MAPK抑制剂作用下,未经ZD保护的细胞存活力下降。而ZD则通过抑制TNF-α、调节miR-210的表达,从而起到提高干细胞存活抑制干细胞凋亡的作用。
对于ROS诱导剂的作用,ZD能够降低由ROS诱导剂引起的miR-210的上调,但是其表达水平又比只加入ZD的水平要高。故而,ZD能够维持miR-210的一个相对较高水平的表达,从而起到保护干细胞的作用。
ZD能够缓解由miR-210的相似物引起的ROS上调表达。且能够抑制由于ISCU抑制剂引起的ROS上调表达。所述ISCU抑制剂为ISCU1/2siRNA;所述miR-210相似物为人工合成的miR-210双链RNA类似物。
本发明提供了一种提高干细胞抗逆性的制剂,其中包括枸杞红素。
本发明提供的提高干细胞抗逆性的制剂可以仅包括枸杞红素,也可为枸杞红素的溶液、含有枸杞红素的培养基(粉剂)、培养液等。本发明对此不作限定。为了简化实验操作,本发明提供的提高干细胞抗逆性的制剂为培养液,其中还包括基础培养基。所述基础培养基是指为了维持干细胞生长繁殖配制的混合营养物制品,本发明所述的基础培养基选自:BME、MEM、DMEM、DMEM/F-12、HAM F12、PRMI1640、199。可针对不同的干细胞对基础培养基做适应性调整,本发明对此不作限定,其实施皆在本发明的保护范围之内。对于脂肪间充质干细胞,基础培养基选自DMEM/F-12。
作为优选,所述提高干细胞抗逆性的制剂可为枸杞红素的浓缩液,或者含有枸杞红素的培养液。对于枸杞红素的浓缩液,本发明对其中枸杞红素的浓度不做限定。为了方便实验操作,含有枸杞红素的培养液中,枸杞红素的浓度为0.5μmol/L~2μmol/L。
相应的,本发明提供了一种提高干细胞抗逆性的方法,该方法为使干细胞与枸杞红素混合后孵育。
在本发明中,干细胞与枸杞红素混合时,干细胞的密度为1×105cell/mL~10×105cell/mL;枸杞红素的浓度为0.5μmol/L~2μmol/L。
在一些实施例中,干细胞的密度为4×105cell/mL;枸杞红素的浓度为0.5μmol/L。
本发明中,孵育的温度为37℃,孵育的时间为2h。
本发明所述的干细胞为脂肪间充质干细胞,优选为人源脂肪间充质干细胞。
本发明还提供了枸杞红素在制备提高干细胞移植效率的制剂中的应用。
本发明还提供了一种干细胞制剂,其中,包括干细胞;所述干细胞经过枸杞红素处理。
所述经过枸杞红素的处理为使干细胞与枸杞红素混合后孵育。
所述干细胞的密度为1×105cell/mL~10×105cell/mL。
所述枸杞红素的浓度为0.5μmol/L~2μmol/L。
在一些实施例中,干细胞的密度为4×105cell/mL;枸杞红素的浓度为0.5μmol/L。
本发明中,孵育的温度为37℃,孵育的时间为2h。
本发明中,孵育采用的培养基为DMEM/F-12培养基。
本发明所述的干细胞为脂肪间充质干细胞,优选为人源脂肪间充质干细胞。
本发明所述干细胞制剂中,还包括生理盐水。
本发明中,干细胞的密度为1×106cell/mL~10×106cell/mL。
一些实施例中,干细胞至密度为4×106cell/mL。
本发明提供的干细胞制剂的制备方法为,将干细胞在基础培养基和枸杞红素存在条件下孵育,孵育温度为37℃,孵育时间为2h;孵育后以生理盐水重悬干细胞,制得本发明提供的干细胞制剂。
本发明中,生理盐水重悬干细胞至密度为1×106cell/mL~10×106cell/mL。
一些实施例中,生理盐水重悬干细胞至密度为4×106cell/mL。
本发明提供的干细胞制剂在制备治疗急性肝衰竭的产品中的应用。
实验表明,注射经ZD处理后的干细胞缓解急性肝损伤的效果最好,且经ZD处理后的干细胞在注射后在宿主体内存活率更高,使得小鼠体内人员细胞的数量增加。在注射经ZD处理后的干细胞小鼠产PCNA+细胞最多,干细胞发生凋亡的细胞量最少,且,相对于未经处理的干细胞,ZD处理的干细胞在注射后能够显著降低小鼠AST(谷草转氨酶)和ALT(谷丙转氨酶)水平,(p<0.01)、提高TNF-α、IL-6、EGF和OSM水平(p<0.01)。
本发明还提供了一种治疗急性肝衰竭的产品,包括本发明提供的干细胞制剂。
本发明还提供了一种治疗急性肝衰竭的方法,该方法为移植本发明提供的干细胞制剂。
本发明通过实验表明,枸杞红素能够通过抑制凋亡因子、炎症因子的表达、提高氧化还原能力、抑制PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路、调节miR-210的表达来提高干细胞的抗逆性,从而达到提高干细胞移植效率的目的。并且实验表明,移植经枸杞红素处理的干细胞能够起到治疗急性肝衰竭的作用。
附图说明
图1示经LPS/H2O2刺激后干细胞的存活情况;其中***示与ctrl存在极显著性差异,p<0.001;
图2示经LPS/H2O2刺激后干细胞的凋亡情况;其中,***示与ctrl存在极显著性差异,p<0.001;**示与ctrl存在极显著性差异,p<0.01;*示与ctrl存在显著性差异,p<0.05;
图3示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内Caspase3/7的活性情况;其中,***示与ctrl存在极显著性差异,p<0.001;*示与ctrl存在显著性差异,p<0.05;###示与L+H组存在极显著差异,p<0.001;
图4示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内Caspase-8的活性情况;其中,***示与ctrl存在极显著性差异,p<0.001;###示与L+H组存在极显著差异,p<0.001;
图5示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内TNF-α的表达情况;其中,***示与ctrl存在极显著性差异,p<0.001;*示与ctrl存在显著性差异,p<0.05;###示与L+H组存在极显著差异,p<0.001;
图6示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内IL-6的表达情况;其中,***示与ctrl存在极显著性差异,p<0.001;**示与ctrl存在极显著性差异,p<0.01;###示与L+H组存在极显著差异,p<0.001;
图7示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内ROS信号表达情况;其中,图7-a示未经处理的正常细胞内ROS信号表达情况;图7-b示经LPS/H2O2刺激的细胞内ROS信号表达情况;图7-c示经浓度为0.5μmol/L的ZD处理的干细胞内ROS信号表达情况;图7-d示经LPS/H2O2刺激后经浓度为0.5μmol/L的ZD处理的干细胞内ROS信号表达情况;
图8示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内ROS信号表达情况;其中,***示与ctrl存在极显著性差异,p<0.001;**示与ctrl存在极显著性差异,p<0.01;###示与L+H组存在极显著差异,p<0.001;
图9示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内GSH/GSSG比率变化情况;其中,***示与ctrl存在极显著性差异,p<0.001;###示与L+H组存在极显著差异,p<0.001;
图10示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内CAT及SOD1的表达变化;
图11示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内PKC的表达情况;其中,**示与ctrl存在极显著性差异,p<0.01;#示与L+H组存在显著差异,p<0.05;
图12示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内NF-κB的p65亚基活性变化;其中,**示与ctrl存在极显著性差异,p<0.01;###示与L+H组存在极显著差异,p<0.001;
图13示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内Elk1的表达情况;其中,***示与ctrl存在极显著性差异,p<0.001;###示与L+H组存在极显著差异,p<0.001;
图14示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内Raf-1及MAPK家族成员(MEK和p38MAPK)的表达情况;
图15示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后胞内miR-210的表达情况;其中,*示与ctrl存在显著性差异,p<0.05;
图16示加入两种抑制剂后干细胞的细胞存活情况;其中,**示与不经处理的细胞存在极显著性差异,p<0.01;##示与经LPS/H2O2刺激的细胞存在极显著性差异,p<0.01;@示与经LPS/H2O2刺激的并以ZD保护的细胞存在显著性差异,p<0.05;@@示与经LPS/H2O2刺激的并以ZD保护的细胞存在极显著性差异,p<0.01;
图17示加入两种抑制剂后干细胞的细胞凋亡情况;其中,***示与不经处理的细胞存在极显著性差异,p<0.001;###示与经LPS/H2O2刺激的细胞存在极显著性差异,p<0.001;@示与经LPS/H2O2刺激并以ZD保护的细胞存在显著性差异,p<0.05;@@示与经LPS/H2O2刺激的并以ZD保护的细胞存在极显著性差异,p<0.01;
图18示加入两种抑制剂后胞内TNF-α的表达情况;其中,***示与不经处理的细胞存在极显著性差异,p<0.001;###示与经LPS/H2O2刺激的细胞存在极显著性差异,p<0.001;@@示与经LPS/H2O2刺激并以ZD保护的细胞存在极显著性差异,p<0.01;
图19示加入两种抑制剂后胞内miR-210的表达情况;其中,**示与不经处理的细胞存在极显著性差异,p<0.01;@示与经LPS/H2O2刺激并以ZD保护的细胞存在显著性差异,p<0.05;
图20示ROS两种诱导剂不同浓度刺激细胞后胞内miR-210的表达情况;其中,***示存在极显著差异,p<0.001;**示存在极显著差异,p<0.01;
图21示用ROS两种诱导剂的最佳浓度刺激不同时间后胞内miR-210的表达情况;其中,**示与ctrl相比存在极显著差异,p<0.01;***示与ctrl相比存在极显著差异,p<0.001;
图22示用两种ROS诱导剂的最佳浓度作用最佳时间胞内miR-210的表达情况;其中,***示与未经处理的细胞相比具有极显著差异,p<0.001;###示与各自未加NAC共同处理的细胞相比具有极显著差异,p<0.001;##示与各自未加NAC共同处理的细胞相比具有极显著差异,p<0.01;
图23示分别加入两种ROS诱导剂及ZD胞内miR-210的表达情况;其中,***示与未经处理的细胞相比具有极显著差异,p<0.001;,**示与未经处理的细胞相比具有极显著差异,p<0.01;##示与Rotenone处理后的细胞相比具有极显著差异,p<0.01;
图24示miR-210刺激细胞及加入ZD后细胞内ROS的产生情况;其中,图24-a示未经刺激的细胞内ROS产生情况;图24-b示经miR-210类似物刺激的细胞内ROS产生情况;图24-c示经经miR-210类似物刺激后以ZD保护的细胞内ROS产生情况;
图25示miR-210刺激细胞及加入ZD后细胞内ROS的产生情况;其中,***示与crtl相比具有极显著差异,p<0.001;###示与经miR210-mimic处理的细胞相比具有极显著差异,p<0.001;
图26示miR-210刺激细胞及加入ZD后细胞内线粒体中ROS的产生情况;
图27示miR-210刺激细胞及加入ZD后细胞内ISCU的表达情况;
图28示用ISCU siRNA干扰ISCU表达的效果;
图29示干扰胞内ISCU的表达及加入ZD后胞内ROS的产生情况;其中,图29-a示未经干扰细胞内ISCU的表达;图29-b示经ISCU siRNA干扰胞内ISCU的表达情况;图29-c示经ISCU siRNA干扰后以ZD保护的细胞内ISCU的表达情况;
图30示干细胞内ISCU的表达及加入ZD后胞内ROS的产生情况;其中,***示与crtl相比具有极显著差异,p<0.001;###示与经ISCU和siRNA处理的细胞相比具有极显著差异,p<0.001;
图31示干扰胞内ISCU的表达及加入ZD后胞内线粒体中ROS的产生情况;
图32示OE和KD两种表达体系的建立;其中,***示OE极显著的调高表达,p<0.001;###示KD极显著的调低表达,p<0.001;
图33示经LPS/H2O2刺激后的OE和KD细胞的存活情况;其中,***示与未经处理的细胞存在极显著差异,p<0.001;*示与未经处理的细胞存在显著差异p<0.05;###示与LPS+H2O2处理后的细胞相比存在极显著差异,p<0.001;##示与LPS+H2O2处理后的细胞相比存在极显著差异,p<0.01;
图34示经LPS/H2O2刺激后的OE和KD细胞的凋亡情况;其中,***示与未经处理的细胞存在极显著差异,p<0.001;*示与未经处理的细胞存在显著差异p<0.05;##示与LPS+H2O2处理后的细胞相比存在极显著差异,p<0.01;
图35示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后的OE和KD细胞胞内miR-210的表达情况;其中,***示与未经处理的细胞存在极显著差异,p<0.001;#示与LPS+H2O2处理后的细胞存在显著差异p<0.05;###示与LPS+H2O2处理后的细胞相比存在极显著差异,p<0.001;@@@示与LPS+H2O2+KD-miR210联合处理后的细胞相比存在极显著差异,p<0.001;
图36示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后KD细胞的存活情况;其中,***示与未经处理的细胞存在极显著差异,p<0.001;#示与经LPS/H2O2处理的细胞存在显著差异,p<0.05;@@示与经LPS/H2O2处理的KD细胞存在显著差异,p<0.01;
图37示经LPS/H2O2刺激及加入ZD后KD细胞的凋亡情况;其中,***示与未经处理的细胞存在极显著差异,p<0.001;##示与经LPS/H2O2处理的细胞存在极显著差异,p<0.01;@@示与经LPS/H2O2处理的KD细胞存在极显著差异,p<0.01;
图38示经各种处理后小鼠随时间的存活情况;
图39示经各种处理后小鼠的肝脏切片染色,其中,箭头示典型的坏死炎性细胞;其中,图39-a示未经处理的小鼠肝脏切片染色;图39-b示以GAL/LPS联合处理1天后的小鼠肝脏切片染色;图39-c示注射普通干细胞后以GAL/LPS联合处理1天后的小鼠肝脏切片染色;图39-d示注射以ZD处理干细胞后以GAL/LPS联合处理1天后的小鼠肝脏切片染色;图39-e示注射以ZD处理的KD干细胞后以GAL/LPS联合处理1天后的小鼠肝脏切片染色;图39-f示以GAL/LPS联合处理7天后的小鼠肝脏切片染色;图39-g示注射普通干细胞后以GAL/LPS联合处理7天后的小鼠肝脏切片染色;图39-h示注射以ZD处理干细胞后以GAL/LPS联合处理7天后的小鼠肝脏切片染色;图39-i示注射以ZD处理的KD干细胞后以GAL/LPS联合处理7天后的小鼠肝脏切片染色;
图40示经各种处理后小鼠的肝脏损伤情况;其中GL示以Gal/LPS联合处理;其中,*示存在显著差异,p<0.05;**示存在极显著差异,p<0.01;***示存在极显著差异,p<0.001;
图41示经各种处理后小鼠体内人源细胞的量;其中,GL示以Gal/LPS联合处理;其中,**示存在极显著差异,p<0.01;***示存在极显著差异,p<0.001;
图42示注射Gal/LPS后再注射未经ZD处理的和经ZD处理的正常及KD miR-210干细胞后小鼠体内PCNA+细胞的变化;其中,*示存在显著差异,p<0.05;**示存在极显著差异,p<0.01;
图43示注射Gal/LPS后再注射未经ZD处理的和经ZD处理的正常及KD miR-210干细胞后小鼠体内凋亡细胞的变化;其中,*示存在显著差异,p<0.05;**示存在极显著差异,p<0.01;
图44示小鼠体内ALT水平在经各种处理后第1、3、7天的变化;其中,***示与ctrl存在极显著差异,p<0.001;#示与GL组相比存在显著差异,p<0.05;##示与GL组相比存在极显著差异,p<0.01;@示与GL+MSC组相比存在显著差异,p<0.05;@@示与GL+MSC组相比存在显著差异,p<0.01;
图45示小鼠体内AST水平在经各种处理后第1、3、7天的变化;其中,***示与ctrl存在极显著差异,p<0.001;#示与GL组相比存在显著差异,p<0.05;##示与GL组相比存在极显著差异,p<0.01;@示与GL+MSC组相比存在显著差异,p<0.05;@@示与GL+MSC组相比存在极显著差异,p<0.01;
图46示小鼠血液中TNF-α水平在经各种处理后第1、3、7天的变化;其中,***示与ctrl存在极显著差异,p<0.001;#示与GL组相比存在显著差异,p<0.05;##示与GL组相比存在极显著差异,p<0.01;###示与GL组相比存在极显著差异,p<0.001;@示与GL+MSC组相比存在显著差异,p<0.05;@@示与GL+MSC组相比存在极显著差异,p<0.01;
图47示小鼠血液中IL-6水平在经各种处理后第1、3、7天的变化;其中,***示与ctrl存在极显著差异,p<0.001;###示与GL组相比存在极显著差异,p<0.001;@示与GL+MSC组相比存在显著差异,p<0.05;@@示与GL+MSC组相比存在极显著差异,p<0.01;
图48示小鼠肝脏中EGF表达水平在经各种处理后第1、3、7天的变化;其中,***示与ctrl存在极显著差异,p<0.001;**示与ctrl存在极显著差异,p<0.01;##示与GL组相比存在极显著差异,p<0.01;#示与GL组相比存在显著差异,p<0.05;@示与GL+MSC组相比存在显著差异,p<0.05;@@示与GL+MSC组相比存在极显著差异,p<0.01;
图49示小鼠肝脏中OSM表达水平在经各种处理后第1、3、7天的变化;其中,***示与ctrl存在极显著差异,p<0.001;**示与ctrl存在极显著差异,p<0.01;@示与GL+MSC组相比存在显著差异,p<0.05;@@示与GL+MSC组相比存在极显著差异,p<0.01。
具体实施方式
本发明提供了枸杞红素的用途,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明中,细胞凋亡(apoptosis)是指干细胞在发育过程中或在某些因素作用下,通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。现有技术中,细胞凋亡情况通常根据凋亡细胞占总细胞的百分比来判断,对凋亡细胞的检测方法有形态学检测、Hoeches/PI双染法、Annexin V法、线粒体膜势能的检测、TUNEL法等,本发明对细胞凋亡的检测采用Hoeches/PI双染法。
细胞存活率(cell viability)是指总细胞数量中存活细胞的百分率。现有的检测方法多为MTT法或台酚蓝染色,被染上的为活细胞,镜下计数。本发明对细胞存活率的检测采用MTT法。
LPS(脂多糖)和H2O2联合作用能够诱导细胞的凋亡,细胞坏死、炎症反应和氧化应激反应,本发明采用浓度0.1μg/ml的LPS和200mM的H2O2共同刺激干细胞,结果表明干细胞在受到外界刺激(LPS+H2O2)时其生命活性明显受到威胁,其细胞活性显著下降。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族(caspase)是一类存在于细胞质中具有类似结构的半胱氨酸蛋白水解酶,其中,caspase3/7表示caspase3和caspase7,其能够导致细胞直接凋亡。Caspase8则参与下游的caspase蛋白酶的启动。Caspase的活化可导致细胞的凋亡。在细胞凋亡的过程中,caspase的表达量升高。
炎症因子TNFα(肿瘤坏死因子α)和IL-6(白介素6),现有研究结果表明,炎症因子TNFα和IL-6会导致干细胞凋亡。本发明对炎症因子TNFα和IL-6的检测方法采用ELISA法。
ROS为需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),包括:O2-、H2O2及HO2-、-OH等。ROS与干细胞的凋亡密切相关。在正常情况下,细胞内ROS的产生和ROS清除系统处于动态平衡状态。细胞发生凋亡时,ROS产生增多或/和机体清除ROS能力的下降,细胞ROS量升高。对ROS的检测采用体外DCFH-DA绿色荧光染色法。
GSH/GSSG比率即为抗氧化物质谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的含量比,该指标的检测采用Abcam公司GSH/GSSG比率试剂盒。正常情况下,GSH/GSSG比率会维持在一定水平,当收到氧化应激或细胞发生凋亡的情况下,GSH被氧化成为GSSG,则GSH/GSSG比率下降。
过氧化氢酶(CAT)是生物体内主要的抗氧化酶之一,能够催化细胞内过氧化氢的分解,使细胞免于遭受过氧化氢的毒害,保护细胞免受氧化胁迫。过氧化物歧化酶1(SOD1),是SOD的主要形式,是细胞内过氧自由基的特异性清除剂,能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应平衡机体内的氧自由基。本发明对CAT和SOD1的检测采用Western Blot检测法。
miR-210是一类生物体内自然生成的非编码分子,有21~22个合谷氨酸组成,能够参与多种细胞生物学功能的调控,如能量代谢、细胞周期、DNA损伤修复等,是目前备受关注的乏氧诱导性miRNA分子。本发明对miR-210表达量的检测采用荧光定量PCR法。
PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路,该通路与细胞的凋亡密切相关,其中,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一组具有单一肽链结构的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。信号传导蛋白Raf-1活化后参与细胞增殖和转化、细胞编程死亡、发育和分化,以及细胞对不良因素的应激反应。p38MAPK是分裂原激活的蛋白激酶家族(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)的成员之一,而MAPK通路是细胞外信号引起细胞核反应的汇聚通路。细胞转录因子ELK1为真核细胞转录因子ETS家族中的重要成员,其活性受磷酸化和去磷酸化的影响,磷酸化的ELK1通过与DNA结合而因子转录激活作用。核转录因子NF-κB是一种普遍存在的核转录因子,参与细胞凋亡的信号传导过程。本发明中,PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路中关键酶的检测采用Western Blot检测法。
Staurosporine是PKC的药理学抑制剂,PD98059是MEK/MAPK的药理学抑制剂,二者皆可诱导细胞凋亡。antimycin、rotenone为ROS的两种诱导剂。
铁硫簇蛋白ISCU是细胞内ROS抑制剂,是三羧酸循环、电子传递和铁代谢关键酶辅助因子。缺氧环境下,ISCU水平降低是诱导ROS生成的主要原因。本发明对ISCU的检测采用Western Blot检测法。
miR-210的过表达(OE)体系指采用慢病毒技术将miR-210过表达的脂肪干细胞,miR-210的敲除(KD)体系则指采用慢病毒技术将miR-210敲除的脂肪干细胞。二者皆购自Sigma-Aldrich公司。
Gal/LPS为氨基半乳糖(D-Gal)脂多糖(LPS)处理。
本发明中人源基因与宿主基因组之间的比率用于衡量将干细胞制剂移植入小鼠体内后,移植的人源干细胞在小鼠体内的存活情况,即衡量干细胞移植效率。本发明中用于鉴定人源干细胞或小鼠体细胞的基因是人类唐氏综合症基因。根据序列差异,设计引物并进行实时定量PCR法测定。
AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)是衡量肝功能的重要指标。当肝脏发生损伤时,AST和ALT的表达量会发生改变。急性肝衰竭小鼠的的AST和ALT的表达量升高。
EGF(表皮生长因子)是最早发现的生长因子,对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。抑瘤素M(oncostatin M,OSM)属IL-6家族细胞因子家族,由活化巨噬细胞和T细胞产生,可抑制肿瘤细胞生长,诱导某些肿瘤细胞分化,且对于肝脏再生有重要作用。EGF和OSM水平的提高提示移植细胞促进了小鼠自身肝脏的再生。
干细胞移植治疗是把健康的干细胞移植到患者体内,以达到修复或替换受损细胞或组织,从而达到治愈的目的。
急性肝损伤是指患者在无慢性肝病的基础上,由于各种病因导致肝脏细胞损伤而发生。本发明采用的急性肝损伤小鼠为NOD/SCID种小鼠,由Gal+LPS共同诱导急性肝损伤模型。
本发明采用的材料、仪器皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
然后在各组细胞中加入不同浓度的ZD,37℃,孵育2h后;以浓度为0.1μg/ml的LPS和浓度为200mM的H2O2共同刺激脂肪间充质干细胞(购自广州赛业公司),37℃孵育24h;然后以MTT法测定细胞活性和以Hoechst/PI荧光双染法检测细胞衰亡情况。
实验以未经外界刺激(LPS+H2O2)也未经ZD处理的细胞为阴性对照(ctrl)、以已经报道的具有干细胞保护效果的依达拉奉(Eda,浓度为0.1μM。)为阳性对照。
经研究发现干细胞在受到外界刺激(LPS+H2O2)时其生命活性明显受到威胁,其细胞活性显著下降,发生凋亡的效率明显提高(图1,2);而在加入ZD后,与依达拉奉(Eda)效果类似。
实施例2
以ELISA法检测细胞内的炎症因子和凋亡因子。
分组情况为:Ctrl不作处理的正常脂肪间充质干细胞。
L+H,以LPS和H2O2共同刺激的脂肪间充质干细胞。
v-ZD,不以LPS和H2O2刺激脂肪间充质干细胞,而以ZD处理细胞。
L+H+ZD,以ZD处理细胞后,以LPS和H2O2刺激脂肪间充质干细胞。
LPS和H2O2刺激为:以浓度为0.1μg/ml的LPS和浓度为200mM的H2O2共同刺激脂肪间充质干细胞(购自广州赛业公司),37℃孵育24h;
ZD处理细胞后为:在细胞中加入浓度为0.5μmol/L的ZD,37℃,孵育2h。
处理后,检测细胞内的凋亡因子和炎症因子。结果表明,以ZD处理后的细胞的抗凋亡及抗炎症效应显著提高(p<0.01)(图3~6)。
实施例3
分组情况同实施例2,采用体外DCFH-DA绿色荧光染色法对细胞内ROS信号表达进行检测。结果表明,LPS/H2O2明显上调ROS信号表达,而ZD能够缓解这一现象(图7、8);
实施例4
分组情况同实施例2,采用Abcam公司GSH/GSSG比率试剂盒对GSH/GSSG比率进行检测;采用Western Blot检测法对CAT或SOD1的表达情况进行检测。以GSH/GSSG比率和CAT、SOD1的表达情况判断胞内氧化还原力。检测发现LPS/H2O2明显上调胞内氧化压力,加入ZD后能够显著上调胞内还原力(图9、10)。
实施例5
分组情况同实施例2,采用Western Blot检测法对PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路中关键酶的检测进行检测。结果表明,经LPS/H2O2刺激后胞内PKC、NF-κB以及Elk1活性显著增强,而ZD可以在不影响其基底水平的情况下消除LPS/H2O2刺激给细胞带来的影响(图11-13);且经LPS/H2O2刺激后胞内Raf-1和MAPK家族成员(MEK和p38MAPK)被激活了,ZD能够缓解其激活情况,LPS/H2O2刺激或加入ZD均不影响MEK和p38MAPK的总表达情况(图14);
实施例6
分组情况同实施例2,采用荧光定量PCR法测定miR-210表达量。结果表明:LPS/H2O2刺激和ZD均能显著上调miR-210的表达,而经LPS/H2O2刺激后加入ZD其miR-210的表达也有所上调(图15)。似乎ZD能够维持miR-210一个相对较高的表达水平。
实施例7
采用MTT法测定干细胞经PKC及MEK/MAPK的药理学抑制剂staurosporine和PD98059与LPS/H2O2共同刺激后细胞的存活情况。
分组情况为:+为加入药物;-为不加药物
staurosporine和PD98059的加药浓度分别为10nM和25μM。
staurosporine和PD98059购自于美国Calbiochem公司。
结果表明LPS/H2O2刺激显著使细胞致死,ZD能够缓解由LPS/H2O2刺激带来的损伤,加入两种抑制剂后相比于只加入ZD其细胞存活力下降,但高于只加LPS/H2O2刺激(图16)。说明LPS/H2O2诱导的干细胞损伤及miR-210表达的变化涉及到PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路。
实施例8
分组情况同实施例7,采用Hoeches/PI双染法检测细胞凋亡、采用ELISA法检测炎症因子TNFα的表达量。
结果表明:加入PKC及MEK/MAPK的药理学抑制剂staurosporine和PD98059两种抑制剂后相比于只加入ZD其细胞凋亡及炎症情况都明显上升,虽然比只加LPS/H2O2刺激其凋亡和炎症均有所缓解(图17、18);说明ZD缓解由LPS/H2O2刺激带来的损伤是涉及到PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路。
实施例9
分组情况同实施例7,采用荧光定量PCR法检测细胞miR-210表达量。结果表明:加入PKC及MEK/MAPK的药理学抑制剂staurosporine和PD98059两种抑制剂后,miR-210的表达受抑制(图19)。说明LPS/H2O2诱导的干细胞损伤及miR-210表达的变化与PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路相关,PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路受到抑制则细胞受损更严重且miR-210的表达也受到抑制。
实施例10
用荧光定量PCR技术检测miR-210的表达量。
分组情况为:分别用不同浓度的antimycin和rotenone刺激脂肪间充质干细胞;
Antimycin为经最适浓度的antimycin刺激的脂肪间充质干细胞;
Rotenone为经最适浓度的rotenone刺激的脂肪间充质干细胞;
Ctrl为不作处理的正常脂肪间充质干细胞;
+为加入药物;-为不加药物。
antimycin和rotenone购自于美国Sigma-Aldrich公司。
结果表明:两种抑制剂分别在10nM和10pM的浓度时有最大的刺激效应(图20),且用最佳浓度刺激在作用24h其作用效果达到最强(图21)。分别用最佳浓度刺激,并在最佳作用时间检测miR-210的表达情况发现;两种诱导剂均能显著上调miR-210的表达,加入ROS清除剂NAC能维持miR-210一个与正常无刺激细胞相似的相对稳定的水平(图22)。另外在另外加入ZD后发现ZD能够降低由ROS诱导剂引起的miR-210的上调,但是其表达水平又比只加入ZD的水平要高(图23),ZD能够维持miR-210的一个相对较高水平的表达。
实施例11
采用体外DCFH-DA绿色荧光染色法对细胞内ROS信号表达进行检测。
分组情况为:Ctrl为不作处理的正常脂肪间充质干细胞;
miR-mimic为加入miR-210相似物刺激的脂肪间充质干细胞;
mimic+ZD为加入miR-210相似物刺激后加入ZD处理细胞;
miR-mimic的处理剂量为20nM,购自于美国Sigma-Aldrich公司。
结果表明:用miR-210的相似物(即miR-mimic)刺激细胞发现miR-210能显著上调ROS的产生(图24、25),对刺激后线粒体中ROS的检测也发现miR-210能显著上调ROS的产生(图26),ZD能够缓解这一现象。
实施例12
采用western blot检测ROS抑制物ISCU的表达量,采用体外DCFH-DA绿色荧光染色法对细胞内ROS信号表达进行检测。
分组情况为:Ctrl为不作处理的正常脂肪间充质干细胞;
miR-mimic为加入miR-210相似物刺激的脂肪间充质干细胞;
mimic+ZD为加入miR-210相似物刺激后加入ZD处理细胞;
ISCU siRNA scramble为加入ISCU siRNA抑制剂处理的细胞;
ISCU siRNA为加入ISCU siRNA处理的细胞;
ISCU siRNA+ZD为加入ISCU siRNA刺激后,加入ZD处理细胞。
ISCU siRNA和ISCU siRNA scramble的用量均为20nM,二者购自于美国SantaCruz生物技术公司。
结果表明:miR-210-mimic能够显著下调ISCU的表达,而ZD能够恢复由miR-210-mimic诱导的下调(图27);用ISCU siRNA干扰ISCU的表达,能够使细胞表达ISCU的量显著降低(图28),加入ISCU1/2siRNA后细胞及线粒体中ROS的产生明显增加,而ZD能够缓解这一现象(图29-31),说明miR-210诱导细胞ROS的产生是通过抑制ROS抑制剂ISCU的表达来实现的。
实施例13
采用qPCR技术检测miR-210的表达量,以MTT法测定细胞活性和以Hoechst/PI荧光双染法检测细胞衰亡情况。
分组情况为:Ctrl为不作处理的正常脂肪间充质干细胞;
Ctrl-miR为miR-210未做任何处理的细胞;
OE-miR为将复制缺陷的编码人类miR-210前体的慢病毒导入细胞构建成miR-210过表达的细胞;
KD-miR为将复制缺陷的编码人类miR-210抑制蛋白的慢病毒导入细胞构建成miR-210敲低的细胞;
+为加入药物;-为不加药物。
结果表明:复制缺陷型慢病毒编码miR-210的前体及抑制剂分别导入到细胞中成功建立miR-210的过表达(OE)和敲除(KD)体系(图32)。之后研究发现OE miR-210并不影响细胞的存活,而KD则会降低细胞的存活能力,用LPS/H2O2分别刺激OE和KD细胞发现LPS/H2O2能够显著降低细胞的存活能力,且经LPS/H2O2刺激后的KD细胞其存活能力比只用LPS/H2O2单独刺激的存活能力还要低(图33);同时检测经LPS/H2O2刺激后的OE和KD细胞的凋亡情况发现,OE和KD miR-210均能促进细胞凋亡,经LPS/H2O2刺激后OE和KD细胞的凋亡情况也显著增加,且经LPS/H2O2刺激后的KD细胞其凋亡能力比只用LPS/H2O2单独刺激的凋亡能力还要高(图34);另外对经LPS/H2O2刺激及加入ZD后的OE和KD细胞中miR-210的表达情况分析发现,ZD能够下调由于OE miR-210使胞内miR-210表达的上调;相反,ZD能够上调由于KD miR-210使胞内miR-210表达的显著下调(图35);鉴于这一现象,我们检测了经LPS/H2O2刺激及加入ZD后KD细胞的存活能力及凋亡情况,发现加入ZD后能够促进细胞存活(图36)并降低细胞凋亡(图37)。说明ZD能够维持miR-210一个相对较高的表达水平以促进细胞正常存活。
实施例14
肝组织切片HE染色观察;实时定量PCR测定人源基因与宿主基因组之间的比率,以定量移植入小鼠肝脏中的人源细胞量。
分组情况为:Control为不作处理的正常脂肪间充质干细胞;
Gal/LPS和GL皆表示同时用Gal和LPS共同腹腔注射小鼠;
Vehicle-hADMSCs为向健康小鼠体内尾静脉注射人类脂肪间充质干细胞(不做任何处理、加入ZD处理和敲低miR-210后加入ZD处理);
Gal/LPS+hADMSCs和GL-MSC为先向小鼠体内腹腔注射Gal和LPS后,尾静脉注射不做任何处理的hADMSCs;
Gal/LPS+ZD-hADMSCs和GL-ZD-MSC为先向小鼠体内腹腔注射Gal和LPS后,尾静脉注射经ZD处理的hADMSCs;
Gal/LPS+KD-miR-ZD-hADMSCs和GL-KD-ZD-MSC为先向小鼠体内腹腔注射Gal和LPS后,尾静脉注射经ZD处理的预先敲低miR-210的hADMSCs;
v-MSC、v-ZD-MSC和v-KD-ZD-MSC分别为向健康小鼠体内尾静脉注射不做任何处理、加入ZD处理和敲低miR-210后加入ZD处理的脂肪间充质干细胞。
Gal的注射量为600mg/kg;LPS的注射量为8μg/kg;干细胞的注射量为2×106个(以生理盐水悬浮);ZD处理量为0.5μM;Gal和LPS均购自于美国Sigma-Aldrich公司。
结果表明:单独注射干细胞并不会影响小鼠的存活情况,而注射Gal/LPS则会加大小鼠的死亡率,在注射了Gal/LPS后注射干细胞这能够救活部分小鼠,注射Gal/LPS后注射经ZD处理的干细胞能够救活更多的小鼠,但是注射了Gal/LPS后注射经ZD处理的KD干细胞则会降低存活小鼠数,但是其存活数比只注射Gal/LPS的小鼠存活数要多(图38);
对小鼠肝组织切片染色观察发现,注射Gal/LPS后能够明显增强组织细胞发生炎性及坏死的情况,之后注射干细胞能够缓解损伤,且注射经ZD处理后的干细胞其缓解损伤的效果最好,而注射经ZD处理后的KD miR-210干细胞对组织细胞损伤的缓解能力比注射未经处理和经ZD处理的干细胞都要差(图39、40)。
实时定量PCR测定了人源基因与宿主基因组之间的比率,发现只注射干细胞虽然使宿主体内人源细胞有所增加但是没有显著变化;在注射Gal/LPS后再注射干细胞,能够显著增加宿主体内人源细胞,然而注射经ZD处理的干细胞宿主体内人源细胞增加的更明显;而相比于注射Gal/LPS后再注射其他干细胞,注射经ZD处理的KD miR-210干细胞能够抑制宿主体内人源细胞相比于注射Gal/LPS后再注射其他干细胞(图41)。说明干细胞移植能显著治疗肝脏损伤,ZD能够加强干细胞的治疗效果。
实施例15
分组情况同实施例14,用PCNA免疫组化染色检测供体干细胞增殖情况;TUNEL法检测供体干细胞凋亡情况;SGPT和SGOT试剂组分别检测ALT和AST的酶水平;采用ELISA酶联免疫技术分别检测小鼠肝中TNF-α和IL-6的量;
结果表明:在注射经ZD处理后的干细胞小鼠产PCNA+细胞最多,而注射经ZD处理后的KD miR-210干细胞小鼠产PCNA+细胞最少(图42),注射经ZD处理后的干细胞小鼠发生凋亡的细胞量最少,而注射经ZD处理后的KD miR-210干细胞小鼠发生凋亡的细胞量最多(图43);说明ZD能够促进供体干细胞增殖,并抑制其凋亡,而敲低miR-210后的结果则相反;
注射干细胞能显著降低小鼠体内AST(谷草转氨酶)和ALT(谷丙转氨酶)水平,而在注射GL后注射经ZD处理的干细胞小鼠血液中AST和ALT水平最低,而注射经ZD处理后的KDmiR-210干细胞小鼠血液中AST和ALT水平明显比注射未经处理和经ZD处理的干细胞小鼠中AST和ALT水平要高(图44、45);
注射干细胞能显著降低小鼠体内TNF-α和IL-6水平,而在注射GL后注射经ZD处理的干细胞小鼠血液中TNF-α和IL-6水平最低,而注射经ZD处理后的KD miR-210干细胞小鼠血液中TNF-α和IL-6水平明显比注射未经处理和经ZD处理的干细胞小鼠中TNF-α和IL-6水平要高(图46、47);
最后,注射干细胞能显著增加小鼠体内EGF(表皮生长因子)和OSM(肿瘤抑制素)的表达水平,而在注射GL后注射经ZD处理的干细胞小鼠血液中EGF和OSM水平最高,而注射经ZD处理后的KD miR-210干细胞小鼠血液中EGF和OSM水平明显比注射未经处理和经ZD处理的干细胞小鼠中EGF和OSM水平要低(图48、49)。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (13)
1.枸杞红素在制备抑制脂肪间充质干细胞凋亡因子活性和/或炎症因子表达的制剂中的应用,
所述凋亡因子为caspase3、Caspase7和/或Caspase8;所述炎症因子为TNFα和/或IL-6。
2.枸杞红素在制备提高脂肪间充质干细胞还原能力的制剂中的应用,
所述提高脂肪间充质干细胞还原能力包括下调干细胞ROS信号表达、提高脂肪间充质干细胞GSH/GSSG比率、促进脂肪间充质干细胞CAT和/或SOD1表达。
3.枸杞红素在制备脂肪间充质干细胞PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路的抑制剂中的应用,
所述脂肪间充质干细胞PKC/Raf-1/MAPK/NF-κB通路抑制包括抑制脂肪间充质干细胞内PKC、NF-κB和/或Elk1的表达、抑制脂肪间充质干细胞内Raf-1和/或MAPK家族成员的激活。
4.枸杞红素在制备脂肪间充质干细胞miR-210表达调节剂中的应用。
5.枸杞红素在制备提高脂肪间充质干细胞抗逆性的制剂中的应用,
所述抗逆性包括:抵抗LPS和H2O2联合作用、抵抗PKC抑制剂作用、抵抗MEK/MAPK抑制剂的作用、抵抗ROS诱导剂的作用、抵抗miR-210的作用、和/或抵抗ISCU抑制剂的作用。
6.一种提高脂肪间充质干细胞抗逆性的方法,其特征在于,使脂肪间充质干细胞与枸杞红素混合后孵育。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述脂肪间充质干细胞的密度为4×105cell/mL;枸杞红素的浓度为0.5μmol/L。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述孵育的温度为37℃,孵育的时间为2h。
9.枸杞红素在制备提高脂肪间充质干细胞移植效率的制剂中的应用。
10.一种脂肪间充质干细胞制剂,其特征在于,包括脂肪间充质干细胞;所述脂肪间充质干细胞经过枸杞红素处理。
11.根据权利要求10所述的脂肪间充质干细胞制剂,其特征在于,所述脂肪间充质干细胞的密度为4×106cell/mL。
12.权利要求10或11所述的脂肪间充质干细胞制剂在制备治疗急性肝衰竭的产品中的应用。
13.一种治疗急性肝衰竭的产品,其特征在于,包括权利要求10或11所述的脂肪间充质干细胞制剂。
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DE102010027180A1 (de) * | 2010-07-14 | 2011-05-26 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Nicht-therapeutische Verwendung zum Stammzellenschutz |
CN102202659A (zh) * | 2008-11-03 | 2011-09-28 | 朱利亚尼股份公司 | 具有针对胱天蛋白酶-3的特异性抗凋亡活性的化合物和包含这些化合物的组合物的治疗、食物或化妆品用途 |
CN102481011A (zh) * | 2009-09-02 | 2012-05-30 | 奥米尼埃克蒂夫健康科技有限公司 | 含有黄斑色素的叶黄素组合物及其制备方法 |
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US20080124318A1 (en) * | 2006-11-28 | 2008-05-29 | Jerold Lisson | Algae supplement and treatment method |
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2016
- 2016-06-12 CN CN201610409828.1A patent/CN105969725B/zh active Active
Patent Citations (3)
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