CN106544315A - 一种脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法。本发明仅使用慢病毒载体携带一个重编程基因转染体细胞，并且使用含有小分子化合物和天然植物有机溶剂提取物的诱导培养基能够简单、高效地诱导脂肪间充质干细胞成可分化成三胚层的诱导性多能干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及将脂肪间充质干细胞转变成为多能干细胞，属于生物与新医药技术领域。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为骨、软骨、脂肪、神经、肝和内皮细胞等，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可做为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。脂肪间充质干细胞是脂肪组织中一类多能性干细胞。由于脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小。
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是通过在分化的体细胞中表达特定的几个转录因子，以诱导体细胞的重编程而获得的可以不断自我更新的且具有多向分化潜能的细胞。由于iPSCs既可避免免疫排斥，又不涉及伦理道德问题，因此具有广泛且重要的的临床应用价值。到目前为止，iPSCs可以由多种前体细胞获得，其中包含脐带来源的间充质干细胞,但以脂肪做为间充质干细胞来源具有它独特的优势。首先，脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stromal cells, ADSCs)是很容易通过吸脂手术而大量获得，其本身具有多向分化潜能。其次，以Yamanaka经典四因子(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc)组合进行重编程，ADSCs获得iPSCs的比例相对较高，可以达到0.5%；以Oct4/Sox2/Klf4因子组合重编程时，ADSCs的重编程效率可以达到0.1%。ADSCs是具有一定多能性的，而这种多能性能够推动重编程过程，表现在其更高的诱导效率以及需要更少的重编程因子。我们用仅含一个基因的逆转录病毒载体辅以含有几个化学重编程小分子化合物的培养基就能够相对高效率诱导出多能干细胞也证明了具有干性的细胞更容易被诱导重编程为多能干细胞。再次，我们从脂肪间充质干细胞诱导而来的多能干细胞具有更高的安全性。传统的iPSCs细胞是通过逆转录病毒载体(pMXs)携带Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc四个重编程因子以诱导其重编程，但是这种方法得到的iPSCs细胞存在安全性的问题。原因是c-Myc因子存在潜在的致癌作用，整合的外源因子可能致使体细胞转化为肿瘤细胞。减少转化逆转录病毒载体携带的因子可以提高iPSCs的安全性。最后，将脂肪来源的间充质干细胞转变成为多能干细胞的应用前景非常广泛。将脂肪间充质干细胞转变成为多能干细胞在组织工程、再生医学、获得病人特异性的多能干细胞、肿瘤治疗等人医学临床应用，以及畜牧产业、转基因动物等方面具有巨大应用潜能。
发明内容
本发明人尝试寻找一种简单、高效诱导脂肪间充质干细胞重编程为iPSCs的方法，以用于开发在实践中具有高的安全性和生产效率的细胞治疗产品。结果，本发明人发现当仅使用逆转录病毒载体携带Oct4基因，并在诱导脂肪间充质干细胞重编程培养基中加入巴豆种子乙醚提取物以及抑制组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化和抑制丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)等信号通路的小分子化合物，能够使用脂肪间充质干细胞安全且高效的诱导出多能干细胞，从而完成了本发明。本发明中使用的诱导培养基包含616452(1~20μM), LY-364947(5~15μM), 5-AzadC(1~50μM), VPA(0~2mM),Kenpaullone(0~15μM)。
本发明的目的是提供用于诱导脂肪间充质干细胞重编程为iPSCs的一种诱导方法，该方法主要包括只使用逆转录病毒载体携带Oct4基因，并且在培养基中添加的几种小分子化合物和巴豆乙醚提纯物。
本发明的另一目的是提供通过上述诱导方法生产的iPSCs。
本发明的又一目的是提供用于细胞治疗的组合物，该组合物为包含iPSCs。
通过本发明的以下详细描述、权利要求书和附图，可更清楚的理解本发明的其它目的和优势。
技术方案
根据本发明的实施方式，提供了用于脂肪间充质干细胞诱导重编程为iPSCs的诱导方法，提供了培养基组合物中小分子名称和工作浓度，以及包含的巴豆种子乙醚提取物。
本发明人尝试寻找高效的诱导出iPSCs的方法，以用于开发在实践中具有更高的安全性和生产效率的细胞治疗产品，而不会产生关于破坏胚胎的伦理问题。结果，本发明人发现当巴豆种子乙醚提取物（天然药物的有机提取物）加入到细胞诱导重编程培养基中时，能够诱导iPSCs更高效率地产生。
巴豆，(学名：Croton tiglium)为大戟科巴豆属植物巴豆树的干燥成熟果实，其根及叶亦供药用。巴豆树为常绿乔木，高6～10米。中医药上以果实入药，性热，味辛，功能破积、逐水、涌吐痰涎，有助于治寒结便秘、腹水肿胀、寒邪食积所致的胸腹胀满急痛、大便不通、泄泻痢疾、水肿腹大、痰饮喘满、喉风喉痹、痈疽、恶疮疥癣。有小毒，须慎用。产于浙江南部、福建、江西、湖南、广东、海南、广西、贵州、四川和云南等省区。
在使用乙醚等有机溶剂进行提取的情况中，优选以50v/v%-80v/v%的量进行提取。
本文所用的术语“胚胎干细胞”是指从囊胚(受精后的早期发育阶段)的内细胞团中分离和培养的具有多能性的细胞。本文所用的术语“多能干细胞”是指具有多能性的干细胞，该干细胞能够分化为构成机体的所有三种胚层，即内胚层、中胚层和外胚层。
本文所用的术语“分化(differentiation)”是指在细胞生长期间通过分裂和增殖使细胞在结构或功能方面变得更特化的过程，即活体的细胞、组织等在形状或功能方面发生改变以履行给定任务的过程。
本文所用的术语“细胞治疗产品”是用于以通过分离、培养和具体操作从人中制备的细胞和组织进行治疗、诊断和预防的药品，是指用于通过一系列动作(例如，通过体外增殖或选择同种异体细胞或异种细胞或者通过其它方式改变细胞的生物学性质)进行治疗、诊断和预防以恢复细胞或组织的功能的药品。根据细胞的分化程度，将细胞治疗产品大体上分为体细胞治疗产品和干细胞治疗产品。本发明特别涉及干细胞治疗产品。
本发明的ADSCs是来源于哺乳动物的脂肪组织。取脂肪组织，用含青霉素、链霉素的PBS反复清洗，眼科剪剪碎至糊状，移入培养瓶，加入Ⅰ型胶原酶， 37 ℃恒温水浴锅内振荡消化。此时液面分为3 层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的胶原酶层。离心，弃上清，加完全培养液(含胎牛血清、PS、DMEM-F12培养基)吹打细胞沉淀，细胞筛过滤，于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度条件下培养。24 h后首次换液，生长至70%~80%融合时， 用胰蛋白酶与EDTA消化传代，将获得的脂肪间充质干细胞体外持续传代培养。
本发明中使用的培养基均已市售，Dulbecco改良的Eagle培养基DMEM-F12(Gibco, New York, USA)以及其它商品化人工生产的培养基均可以作为本发明的培养基组合物中所包含的基础培养基；FBS (Gibco, USA), 1% PS (100 U/mL青霉素, 50 U/mL链霉素); 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶(Sigma, New York, USA);恒温水浴锅(环凯，China); 倒置相差显微镜及成像系统(Olympus, Japan)。
另外，本发明的培养基可进一步含有营养成分混合物。营养成分混合物(包含常用于细胞培养中的多种氨基酸、维生素、矿物盐等的混合物)可通过将氨基酸、维生素、矿物盐等混合来制备，或者可使用商业化制备的营养成分混合物。
本发明的ADSCs-derived iPSCs具有与胚胎干细胞相同的分化能力，并具有与胚胎干细胞几乎相同的细胞形状。根据本发明的实施方式，依据胚胎干细胞特异性的基因（Nanog、Oct4、Sox-2）和蛋白（SSEA4）阳性以及蛋白（SSEA1）阴性，鉴定诱导得到的iPSCs具有胚胎干细胞的特性，但是对端粒酶活性的测定实验证明ADSCs-derived iPSCs不具有全能性，只具有多能性（图2-3，图5，图7）。
根据本发明的实施方式，当使用本发明的含有巴豆种子乙醚提取物的培养基组合物时，iPSCs胚胎状球体大约在诱导8~15天形成（图4）。
本发明的iPSCs具有在体外、体内分化为内胚层、中胚层和外胚层的多能性（图6）。
因此，本发明得到的iPSCs也可以作为有效的细胞治疗产品。本发明得到的iPSCs可以通过注射的方式经由腹膜内或胸内注射、皮下注射、静脉内或动脉给予等。然而由于iPSCs的细胞移植治疗与移植细胞种类和分化程度有关。所以，本发明不涉及细胞移植方式和移植形态内容。
可将本发明所述的iPSCs用于细胞治疗的组合物应用于神经系统疾病（奥兹海默症）、内分泌系统疾病等病症的治疗。
优势与创新点
本发明提供了含有巴豆种子乙醚提取物，重编程相关小分子化合物的用于诱导iPSCs的诱导重编程培养基组合物。
另外，本发明使用逆转录病毒载体仅携带Oct4基因，并且使用添加5种小分子化合物和巴豆种子乙醚提取物的培养基，是一种创新的诱导方法。
使用本发明所述的培养基组合物可以从易得的脂肪来源的间充质干细胞高效地生产诱导性多能干细胞，并且希望可以将生产的多能干细胞用作细胞治疗产品，因为该多能干细胞能够分化成多种细胞。
附图说明
图1 表明诱导脂肪来源的间充质干细胞重编程为多能干细胞的诱导过程；
图2 表明本发明中采用的脂肪来源的间充质干细胞表面表达间充质干细胞特异性抗原；
图3 表明通过特异性蛋白质表达，证实了根据本发明的方法诱导出的细胞为多能干细胞；
图4 表明本发明中所述的诱导方法在8-15d可以诱导出类似于胚胎的细胞集落；
图5 表明根据本发明的方法诱导出的多能干细胞的基因表达与胚胎干细胞类似；
图6 表明根据本发明的方法诱导出的多能干细胞具有在体内分化为三胚层的能力。
图7 表明根据本发明的方法诱导出的多能干细胞具有有限的分化潜能。
具体实施方式
本发明公开了一种脂肪间充质干细胞来源的诱导性多能干细胞以及相关的诱导方法，以下对本发明的特定部分进行了详细的描述。对于具有本领域普通知识的人员而言，这些具体描述仅为期望的实施方式，并且本发明的范围并不限于这些实施方式。因此，本发明的实质范围应被解释为由所附的权利要求及其等同物限定。
实施例1 巴豆种子乙醚提取物的制备
(1)取巴豆种子30 g，粉碎，过80目筛，加入50~80%浓度的乙醚30 mL，密塞，充分摇匀，放置24 h，时时振摇；
(2)残渣再加入50~80%浓度乙醚30 mL，重复处理一次，合并滤液；
(3)常温挥去乙醚，得油状物与乙醚溶液的混合液3.0 mL，即得含巴豆种子生药量为10g/mL的样品。
实施例2 从人体脂肪组织及其培养物中分离间充质干细胞
（1）取脂肪组织约200 mg，用含2% PS 1×PBS反复清洗，用眼科剪将脂肪组织剪碎至糊状；
（2）移入培养瓶，加入2倍体积的0.1% Ⅰ型胶原酶，37 ℃恒温水浴锅内振荡消化60min，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪 细胞层，中间为脂肪组织层，下层为含单个核心的胶原每层；
（3）1,500 r/min 离心10 min， 弃上清，加完全培养基（1 % PS+10 % FBS+DMEM/F12）吹打细胞沉淀，200目细胞筛过滤，于37 ℃、5 % CO2饱和湿度条件下培养；
（4）24 h后首次换液，生长至70 %~80 %融合时，用胰酶消化传代，获得的细胞可在体外传代培养至10代以上。
实施例3 脂肪来源的间充质干细胞诱导为多能过干细胞
(1)取对数生长期的脂肪来源间充质干细胞，5×105个/孔铺于六孔板中，待细胞贴壁，融合率达到70 %~80 %时，用已经包装好的逆转录病毒质粒（pMXs-OCT4）感染细胞；
(2)3 d后更换培养基，将含有逆转录病毒的培养液更换成正常的细胞培养液，评估感染效率；
(3)1 d后，更换正常培养基为含有616452(5μM), LY-364947(10μM), 5-AzadC(25μM),VPA(1mM), Kenpaullone(10μM)和含10 mg/mL 巴豆种子生药量的70%乙醚溶液提取物化学诱导重编程培养基；
(4)每3 d换液，观察细胞状态；
(5)15 d左右出现多能干细胞集落后，更换培养基为胚胎干细胞培养基并添加1,000U/mL 白血病抑制因子（LIF, Millipore）。
(6)培养至多能干细胞可传代时，将大细胞集落稍微吹散成小细胞集落，进行传代或冻存。
实施例4 蛋白表达分析
关于根据本发明的方法诱导出的多能干细胞，使用针对如下蛋白的抗体通过免疫化学染色对胚胎干细胞特异性的蛋白OCT4、SOX2和阶段性胚胎抗原4（SSEA4）的表达进行分析。作为染色的过程，将细胞用4 %多聚甲醛固定，用1×PBS洗涤，并用1 % BSA 溶液封闭。然后，用针对OCT4、SOX2、SSEA4和SSEA1的一抗进行处理，4 ℃封闭过夜。1×PBS洗涤，孵育带有荧光素的二抗，37℃ 孵育40min。再次洗涤后，使用共聚焦显微镜对蛋白表达进行分析，并将结果展示于图3中。
实施例5 多能干细胞的基因比较分析
（1）使用巴氏吸管，将集落从实施例3中制备的多能干细胞吸出，然后使用Trizol（Invitrogen）分离总RNA。使用RT-PCR第一步链式反应，合成cDNA；
（2）使用OCT4、SOX-2、Nanog、c-Myc的引物对cDNA进行PCR鉴定；
（3）并使用琼脂凝胶电泳对PCR结果进行分析，比较本发明所述方法得到的多能干细胞与胚胎干细胞基因表达的区别。
根据图5，按本发明方法诱导脂肪间充质干细胞得到的多能干细胞的基因表达与胚胎干细胞基因表达相似，与阴性对照组的其它体细胞类型有区别。
实施例6 检测多能干细胞的分化潜能
为了检测本发明所述方法得到的多能干细胞的分化潜能，本发明人还进行了TRAP-PCR银染法（江莱生物，中国）检测端粒酶活性，以及多能干细胞体内三胚层分化的实验（图6,7）。根据图7，在注射由本发明的方法生产的诱导性多能干细胞的方法形成肉眼可见的畸胎瘤。具体而言，在组织学上证明了形成畸胎瘤，该畸胎瘤能够分化成来源于外胚层的神经组织、来源于中胚层的肌肉组织、以及来源于内胚层的柱状上皮组织等。实验可证实，由本发明的诱导方法诱导的细胞具有与体内的胚胎干细胞实质上相似的多能性，即可以分化为外胚层、中胚层和内胚层的多能性。但是图6的端粒酶活性指出，根据本发明方法的多能干细胞不具有完整的分化潜能。
Claims (8)
1.一种脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，在诱导脂肪间充质干细胞重编程培养基中加入巴豆种子乙醚提取物以及抑制组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化和抑制丝裂原激活的蛋白激酶等信号通路的小分子培养基组合物。
2.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，诱导多能干细胞的培养基包含1~20μM的616452, 5~15μM的LY-364947, 1~50μM 的5-AzadC, 0~2mM 的VPA, 0~15μM 的Kenpaullone几种小分子化合物，以及10mg/mL巴豆种子50~80%乙醚溶液提取物。
3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，诱导重编程过程是按照以下步骤来制备的：
(1)分离并培养原代脂肪来源的间充质干细胞；
对间充质干细进行细胞表面抗原鉴定；
(2）用携带OCT4基因的pMXs逆转录病毒载体转染脂肪来源的间充质干细胞；
(3)更换培养基为含有小分子化合物和巴豆种子乙醚提取物的化学诱导重编程培养基；
(4)鉴定诱导得到的诱导性多能干细胞；
(5)培养、传代所述诱导性多能干细胞以及提供诱导性多能干细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，所述人类脂肪间充质干细胞细胞表面抗原呈现CD73、 CD90和CD105阳性，CD45阴性。
5.根据权利要求1-3任一项所述的脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，其中所述诱导性多能干细胞表达Sox2、Oct4、Nanog和SSEA4，不呈现SSEA1。
6.根据权利要求1-3任一项所述的脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，其中所述的诱导性多能干细胞能够分化成肝细胞、血管内皮细胞和定型内胚层细胞。
7.根据权利要求1-3任一项所述的脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，所述诱导多能性干细胞分化得到的细胞类型为外胚层的神经组织、中胚层的肌肉组织、以及内胚层的柱状上皮组织。
8.根据权利要求1-3任一项所述的脂肪间充质干细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，步骤(4) 诱导得到的iPSCs可以作为细胞治疗产品。
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