CN109833328A - miR-27及其类似物在体外抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了miR‑27或其类似物在抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化中的应用，属于骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化和软骨损伤药物技术领域。miR‑27在抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化中的应用。miR‑27在促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化中的应用。miR‑27在制备治疗软骨损伤药物中的应用。关节软骨受损时，应用miR‑27或其类似物抑制骨髓间充质干细胞向肥大化软骨细胞分化，防止软骨细胞凋亡及后续骨化过程发生，使其维持和稳定软骨细胞正常的生理功能，促进关节软骨损伤的再生修复。

Description

miR-27及其类似物在体外抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨 细胞分化中的应用

技术领域

本发明属于软骨损伤药物技术领域，具体涉及miR-27及其类似物在制备抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化的药物中的应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells)是典型的、具有多分化潜能的成体干细胞。众多的研究结果显示：骨髓间充质干细胞在体外诱导条件及在体内软骨损伤微环境中有效分化为软骨细胞，通过骨髓穿刺的方法能够从患者骨中如髂骨抽取一定量的骨髓，在体外分离扩增骨髓间充质干细胞，用于自身软骨损伤修复，且无免疫排斥等风险，被学术界认为是在软骨再生修复中极具应用前景的自体种子细胞。然而，骨髓间充质干细胞在软骨细胞分化上有自己的分化缺点：骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化经过类似胚胎期软骨内骨化过程，分化形成的软骨细胞具有生长板肥大软骨细胞特点，表达X型胶原和MMP13，容易发生骨化，严重影响再生软骨修复效果。因此，抑制骨髓间充质干细胞向肥大化软骨细胞分化，防止软骨细胞凋亡及后续骨化过程发生，使其维持和稳定软骨细胞正常的生理功能，是应用骨髓间充质干细胞的软骨损伤修复中遇到的瓶颈问题。

microRNA(miR)是细胞内产生的、长度约为20～24个核苷酸的非编码小RNA。miR通过与多种靶mRNA的3′非编码区(3′UTR)结合阻遏转录后蛋白质翻译的方式抑制并调控多种靶基因的蛋白表达，调节多种信号通路，改变细胞增殖和分化在内的各种细胞特性。近年诸多研究结果显示：通过上述作用机制可有效抑制与软骨分化相关的转录因子或调控蛋白的翻译，miRs也参与软骨细胞增殖分化、骨髓间充质干细胞分化，软骨细胞以及软骨发生退行性病变等生理和病理过程中，与其他调控因子协同发挥生物学作用，例如miR-29可以有效促进骨髓间充质干细胞向肥大化的软骨细胞分化，而抑制miR-29b表达可降低骨髓间充质干细胞来源的软骨细胞的肥大化分化。

miR-27家族包括miR-27a和miR-27b，它们分别来源于不同的染色体，miR-27a来源于19号染色体，miR-27b来源于13号染色体。miR-27a和miR-27b的成熟体间只有一个核苷酸不同，但两者5’端与靶基因3’端相结合发挥关键作用的种子区域碱基序列完全相同，两者虽在不同的细胞中表达有所差异，但它们有相同的靶基因且基本一样的生物学功能。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于关节软骨受损时，应用miR-27及其类似物抑制骨髓间充质干细胞向肥大化软骨细胞分化，防止软骨细胞凋亡及后续骨化过程发生，使其维持和稳定软骨细胞正常的生理功能，促进关节软骨损伤的再生修复，提供miR-27及其类似物在制备抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化的药物中的应用。

本发明提供了miR-27及其类似物在体外抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化中的应用；

所述miR-27包括miR-27a和/或miR-27b；所述miR-27a或miR-27b为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的miRNA；

所述miR-27的类似物为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的siRNA或shRNA。

本发明提供了miR-27及其类似物在体外促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化中的应用；

所述miR-27包括miR-27a和/或miR-27b；所述miR-27a或miR-27b为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的miRNA；

所述miR-27的类似物为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的siRNA或shRNA。

本发明提供了miR-27及其类似物在制备软骨损伤修复的药物中的应用；

所述miR-27包括miR-27a和/或miR-27b；所述miR-27a或miR-27b为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的miRNA；

所述miR-27的类似物为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的siRNA或shRNA。

优选的，所述miR-27a包括miR-27a-3P；所述miR-27a-3P的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述miR-27b包括miR-27b-3P；所述miR-27b-3P的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

优选的，所述miR-27-3P或miR-27-3P的类似物的存在形式包括以下两种形式：

(1)miR-27a-3P或miR-27b-3P的类似物的前体或成熟体；

(2)携带miR-27a-3P或miR-27b-3P的类似物的载体；所述载体包括外泌体、质粒、慢病毒或腺病毒或逆转录病毒载体。

优选的，miR-27a-3P的前体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

优选的，miR-27b-3P的前体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。

优选的，所述促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，包括以下步骤：

a.携带miR-27或其类似物的慢病毒转染骨髓间充质干细胞，获得高表达富含miR-27或其类似物的骨髓间充质干细胞；

b.对4.5×10⁵个/ml以上细胞浓度的高表达富含miR-27或其类似物的骨髓间充质干细胞进行沉淀或单层培养诱导，得到软骨细胞或软骨团块。

本发明提供的miR-27在抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化中的应用。在本发明实施例中，以骨髓间充质干细胞中表达的miR-27b-3P为研究对象进行了miR-27b-3P抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化的研究并获得了相关数据。由于microRNA的5′端与靶基因3′端相结合的结合区域碱基序列miR-27b-3P和miR-27a-3P的5′端核苷酸序列相同，因此推断miR-27a-3P也有与miR-27b-3P一样的功能，本发明中所提到的miR-27b-3P功能涵盖了miR-27a-3P的作用。同时，也包括了含有5′端与靶基因3′端相结合相结合发挥关键作用的种子区域核苷酸碱基序列UGACACUU或GACACUU的人工合成的核苷酸片段。实验证明，在骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞过程中人为的提高骨髓间充质干细胞的miR-27水平，能有效抑制软骨细胞的早期肥大化和骨化，促进软骨损伤修复效果，维持和稳定软骨细胞正常的生理功能。应用骨髓间充质干细胞中高表达miR-27的方法，有效抑制骨髓间充质干细胞软骨分化过程中肥大化，促使骨髓间充质干细胞源性软骨细胞保持成熟期软骨细胞状态；应用此细胞构建组织工程软骨或直接植入软骨损伤部位，防止再生修复的软骨组织早期骨化，使再生修复的软骨更趋于正常关节软骨的物理和生物学功能，显著提高软骨损伤修复效果。

附图说明

图1为纯化后的骨髓间充质干细胞不同时期形态图，其中图1-A为纯化后的骨髓间充质干细胞细胞形态；图1-B为纯化后的骨髓间充质干细胞成骨诱导；图1-C为纯化后的骨髓间充质干细胞成脂诱导；相差显微镜观察(200倍)；

图2为流式细胞术骨髓间充质干细胞的标志物CD44，CD90，CD105表达鉴定；

图3为qRT-PCR检测骨髓间充质干细胞分化过程中miR-27b-3P的表达；

图4为采用不同染料对骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞染色图，其中图4-A为骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞HE染色；图4-B为骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞阿利新蓝染色；图4-C为骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞番红O染色；

图5为分化过程中软骨标志物基因的qRT-PCR鉴定；

图6为qRT-PCR检测慢病毒转染骨髓间充质干细胞过表达miR-27b-3P后诱导为软骨细胞过程中miR-27b-3P的表达变化，其中，图6-A为qRT-PCR检测慢病毒转染后7d时miR-27b-3P的表达量；图6-B为qRT-PCR检测慢病毒转染后14d时miR-27b-3P的表达量；

图7-1为Western bolt检测过表达miR-27b-3P的骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导后14d时软骨标志物的蛋白表达；图7-2为western blot结果定量分析结果；

图8为实验组(miR-27b-3P)与两组对照组(Scramble和NC)的软骨损伤模型图片及染色结果图片，其中，图8-A、图8-B和图8-C为实验组与两组对照组的软骨损伤模型关节修复大体观，图8-D、图8-E和图8-F为实验组与两组对照组的软骨细胞的HE染色；图8-G、图8-H和图8-I为实验组与两组对照组的软骨细胞的甲苯胺蓝染色。

具体实施方式

本发明提供了miR-27及其类似物在体外抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化或体外促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化中的应用；

所述miR-27包括miR-27a和/或miR-27b；所述miR-27a或miR-27b为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的miRNA；

所述miR-27的类似物为包含5′端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的siRNA或shRNA。

在本发明中，所述miR-27a优选包括miR-27a-3P；所述miR-27a-3P的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示(5’-uucacaguggcuaaguuccgc-3’)。所述miR-27b优选包括miR-27b-3P；所述miR-27b-3P(MIMAT0000419，http://www.mirbase.org)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示(5’-uucacaguggcuaaguucugc-3’)。所述miR-27a-3P和miR-27b-3P的核苷酸序列的来源优选委托基因合成公司合成获得。

所述miR-27a-3P的(MI0000085，http://www.mirbase.org)前体的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID No.3所示(5’-cugaggagcagggcuuagcugcuugugagcaggguccacaccaagucguguucacaguggcuaaguuccgccccccag-3’)。

所述miR-27b-3P(MI0000440，http://www.mirbase.org)的前体的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID No.4所(5’-accucucuaacaaggugcagagcuuagcugauuggugaacagugauugguuuccgcuuuguucacaguggcuaaguucugcaccugaagagaaggug-3’)。

在本发明中，所述miR-27a-3P或miR-27b-3P的存在形式优选包括以下两种形式：(1)miR-27a-3P或miR-27b-3P前体或成熟体；(2)携带miR-27a-3P或miR-27b-3P基因的载体；所述载体优选包括外泌体、质粒、慢病毒或腺病毒或逆转录病毒等本领域常见的载体。携带miR-27b-3P的慢病毒的购买途径为上海吉凯基因科技有限公司。携带miR-27b-3P的慢病毒优选购自上海的吉凯基因。

在本发明中，所述体外促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，优选包括以下步骤：

a.携带miR-27b的慢病毒转染骨髓间充质干细胞，获得高表达或富含miR-27b的骨髓间充质干细胞；

b.对4.5×10⁵个/ml以上细胞浓度的高表达miR-27b的骨髓间充质干细胞进行沉淀或培养诱导，得到软骨细胞或软骨团块。

在本发明中，所述促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的方法优选在体外条件下进行。所述携带miR-27b的慢病毒优选按照MOI指数为50添加入细胞培养液中作为转染液(根据所包装的病毒批次不同，MOI指数有所变动，范围25～100)。所述骨髓间充质干细胞的转染时机优选为细胞培养汇合达到70％时进行。所述骨髓间充质干细胞的初始培养浓度优选为1.5×10⁵～2.5×10⁵个/孔。转染24h后优选将所述转染液替换为正常的细胞培养基，继续培养2d。转染后3d采用倒置荧光显微镜下观察荧光表达，荧光qRT-PCR检测到miR-27b的表达水平。本发明实施例中，经过慢病毒转染，携带miR-27b-3P的慢病毒转染组较空白对照组相比，miR-27b-3P高表达为2～4倍，说明获得高表达miR-27b-3P的骨髓间充质干细胞。

在本发明中，所述高表达miR-27b的骨髓间充质干细胞的密度优选为5.0×10⁵个/ml。所述沉淀诱导的方法优选为将高表达miR-27b的骨髓间充质干细胞与软骨细胞诱导液混合，离心，沉淀细胞，每2d更换软骨细胞诱导液，沉淀细胞持续3周，得到软骨细胞团块。所述软骨细胞诱导液优选以高糖DMEM培养液为基础，还包含以下含量的组分：体积浓度1％ITS、10ng/ml TGF-β3、100nmol/L地塞米松、40mg/ml脯氨酸和25mg/ml抗坏血酸。所述ITS为100×浓度的细胞培养添加物(Cyagen，中国)，包括胰岛素、人转铁蛋白和亚硒酸。

所述离心的转速优选为1500rpm。验证软骨细胞团块属于软骨细胞的方法优选采用qRT-PCR检测软骨细胞团块中含有软骨标记物基因COLII、COL X和SOX9，说明属于分化为软骨细胞团块。

本发明提供了miR-27及其类似物在制备治疗软骨损伤药物中的应用；

所述miR-27包括miR-27a和/或miR-27b；所述miR-27a为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU的miRNA；所述miR-27b为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU的miRNA；所述miR-27a的类似物为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的siRNA或shRNA。

在本发明中，所述miR-27b和miR-27a的核苷酸序列同上述描述，在此不做赘述。所述miR-27b和miR-27a的核苷酸序列的来源优选委托基因合成公司合成获得。所述miR-27及其类似物的存在形式同上。

在本发明中，采用所述药物治疗软骨损伤的方法，优选包括以下步骤：

将上述方案中制备的软骨细胞团块移植入SD大鼠膝关节软骨损伤模型，移植后4周软骨损伤得到修复。在移植前，所述SD大鼠膝关节软骨损伤模型优选用免疫抑制剂环孢菌素A注射，注射7d后再移植。

下面结合实施例对本发明提供的miR-27在制备抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化的药物中的应用。进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

人骨髓间充质干细胞原代分离及纯化培养：

吉大一院血液科提供的受检者经诊断无血液病的骨髓液5ml加入离心管中，向离心管中加入20ml PBS缓冲液(pH值7.4)后在1500rpm的条件下离心5min，常温离心沉淀2次。吸弃上清，去除抗凝剂。离心沉淀后加入10ml培养液(含10％FBS、10ng/ml bFGF的DME/F12)，再放入10mm的粘附细胞培养皿中，在5％CO₂，37℃的孵箱中培养48h后更换培养液。待换液2次后，用PBS缓冲液洗去红细胞，在显微镜下观察骨髓间充质干细胞(如图1-A)。当细胞融合至90％时传代，传代到P4时，以2×10⁵个/孔铺于2个6孔板，分别在不同孔板中经过成脂诱导液(DMEM培养液，200μmol/ml吲哚美辛，0.5mmol/ml IBMX，10μg/ml胰岛素，1μmol/ml地塞米松)及成骨诱导液(高糖DMEM培养液为基础培养基，10％FBS，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，10mol/L地塞米松，50mg/L抗坏血酸)培养诱导分化及鉴定(如图1)。所述诱导分化的方法具体如下：当细胞融合至90％时将原有的诱导液吸弃，分别在不同孔板中加入已配制好的诱导液，在5％CO₂，37℃的孵箱中培养，每3d更换一次培养液，培养至3周后进行特殊染色。进行成脂诱导的孔板将诱导液吸弃后，PBS洗2次，加入油红O染液，相差显微镜下可观察到细胞内有红色圆形脂滴形成(如图1-B)。进行成骨诱导的孔板将诱导液吸弃后，PBS缓冲液洗涤2次，加入茜素红染液，相差显微镜下可观察到有红色钙结节形成(如图1-C)。经流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞特异标志物CD44、CD90和CD105表达纯度为90％以上，最终获高纯度骨髓间充质干细胞(如图2)。

实施例2

向软骨细胞诱导及qRT-PCR鉴定

将实施例1制备的第4代骨髓间充质干细胞以5×10⁵个/ml密度悬浮在0.5ml软骨细胞诱导液(高糖DMEM培养液，1％ITS，10ng/ml TGF-β3,100nM地塞米松，40mg/ml脯氨酸，25mg/ml抗坏血酸)移入15ml离心管，1500rpm离心沉淀细胞，进行高密度细胞沉淀诱导，每2d更换诱导液，3周时，用4％多聚甲醛固定细胞团块，石蜡包埋后进行HE、阿利新蓝染色和番红O染色。软骨诱导第7d，第14d，和21d时分别取形成的软骨球。

为miR-27b-3P的qRT-PCR鉴定，软骨诱导第7d，第14d分别取形成的软骨球，提取总RNA进行miR-27b-3P表达情况鉴定。

提取总RNA经反转录得到cDNA，以cDNA为模板分别进行qRT-PCR检测软骨标记物COLII、COL X、SOX9鉴定。

表1软骨标记物COLII、COL X和SOX9的引物序列一览表

qRT-PCR检测体系如下：

反应条件如下：

结果表明，随软骨诱导时间延长，miR-27b-3p的表达水平显著下调(如图3)。骨髓间充质干细胞诱导成的软骨球经HE染色(图4-A)阿利新兰染色(图4-B)及番红O染色(图4-C)，清晰可见软骨组织结构及均匀分布的细胞外基质。证实由骨髓间充质干细胞成球培养的方法成功诱导其向软骨方向分化。软骨细胞标志物COLII和SOX9的基因表达随诱导时间的延长其表达水平提高，肥大化软骨细胞标志物COL X在诱导7d时表达，随时间延长显著增加，而正常软骨细胞中不表达COL X(图5)。

实施例3

携带miR-27b-3P的慢病毒转染骨髓间充质干细胞及qRT-PCR鉴定

将上述以2×10⁵个/孔接种在六孔板的骨髓间充质干细胞培养至24h，待汇合达到约70％时，用携带miR-27b-3P的慢病毒(吉凯基因，上海)进行转染。将慢病毒(MOI指数为50)分别加入到正常培养基中，分为miR-27b-3P组、Scramble组和NC组，混匀后放于37℃，5％CO₂培养箱孵育过夜。24h后含有慢病毒的培养液更换成正常培养液。转染3d后，倒置荧光显微镜下观察荧光表达，荧光定量PCR检测(Gene Copoeia，中国)检测。

应用miRNAs的qRT-PCR检测试剂盒(Gene Copoeia,美国)检测目标基因。

反应体系

反应条件

结果表明，miR-27b-3P的表达水平与对照组相比，经过慢病毒转染，7d时miR-27b-3P组较NC组相比，miR-27b-3P高表达为2倍(如图6-A)。经过成球培养14d，软骨球中miR-27b-3P的表达水平与对照组相比，miR-27b-3P可维持高表达为4倍左右(如图6-B)。由此可知，方法最终获得高表达miR-27b-3P的骨髓间充质干细胞。

实施例4

收集按实施例3诱导方法诱导培养获得的软骨小球，进行Western blot蛋白鉴定：

(1)总蛋白的提取：弃掉细胞培养基，用预冷PBS洗5min×3次，加入300～350μlRIPA裂解液(RIPA裂解液：PMSF＝100：1)(鼎国，中国)将细胞覆盖完全，并置于冰上裂解30min，期间不断摇晃以充分裂解细胞，然后细胞刮刮取裂解后的细胞，移至EP管12000g，4℃，离心15min。取上清弃沉淀，分装，-80℃保存备用。

(2)蛋白浓度的测定BCA试剂盒(碧云天，中国)测蛋白浓度，具体操作步骤如下：将标准蛋白稀释至终浓度为0.5mg/ml；根据样品的数量，工作液按A：B＝50：1的比例配好；标准曲线孔按照标准蛋白0，1，2，4，8，12，16，20μl的体积加到96孔板中，用PBS补齐到20μl；实验组各加2μl样品，用PBS补齐至20μl；各孔加入200μl工作液，37℃孵育30min；测量波长为562nm时的吸光度并绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。

(3)Western blot步骤：

①制样：根据浓度将总蛋白质量调到30ug并与5×loading buffer混合，在沸水中煮5min，立即转移到冰上冷却，离心，上样前混合均匀。剩余样品可置于-20℃冰箱保存。

②电泳：按5％浓缩胶、10％分离胶浓度制胶，上样。电泳条件为浓缩胶80V约30min，分离胶120V约60min。

③转膜：将PVDF膜浸泡在甲醇溶液中活化约15s，转膜条件为100V，约60min。

④封闭：膜置于5％脱脂牛奶的封闭液中，置于摇床，室温1h。

⑤孵育一抗：1％脱脂奶粉的PBST作为抗体稀释液，按照各抗体说明书按比例稀释抗体，4℃摇床孵育过夜。

⑥洗膜：PBST洗膜，5min×3次。

⑦孵育二抗：1％脱脂奶粉的PBST作为抗体稀释液，按照二抗说明书稀释抗体。COLII抗体(Abcam，美国)，SOX9抗体(Sigma，德国)。

⑧洗膜：PBST洗膜，5min×3次，PBS洗10min。

⑨显色：使用ECL化学发光试剂盒(全式金，中国)，按照说明进行显色。

⑩用成像分析仪检测，拍照记录。

Western bolt定量分析结果表明(如图7)，经过慢病毒转染诱导培养14d时形成的软骨小球中，miR-27b-3P组较NC组相比，miR-27b-3P组软骨标记物COLII和SOX9的蛋白表达显著上调。

实施例5

体内关节软骨损伤模型修复

按实施例3诱导上述细胞得到诱导培养14d的软骨小球，收集各组形成的软骨小球，移植入先注射免疫抑制剂环孢菌素A处理7d后的SD大鼠膝关节软骨损伤模型的关节损伤处。移植后4周时，处死动物、取膝关节，用4％福尔马林固定后进行脱钙，用HE染色和甲苯胺蓝染色。

图8-A、图8-B和图8-C为实验组与两组对照组的膝关节修复大体观，图8-D、图8-E和图8-F为实验组与两组对照组的软骨细胞的HE染色；图8-G、图8-H和图8-I为实验组与两组对照组的软骨细胞的甲苯胺蓝染色。

图8-A、图8-B和图8-C为实验组与两组对照组的软骨损伤模型，肉眼可见miR-27b-3P过表达组软骨表面更为光滑，有较好的修复效果，图8-D、图8-E和图8-F为实验组与两组对照组的软骨细胞的HE染色，清晰可见软骨组织结构，miR-27b-3P组血管浸润少且损伤边界不明显；图8-G、图8-H和图8-I为实验组与两组对照组的软骨细胞的甲苯胺蓝染色，miR-27b-3P组软骨基质分泌的最为丰富。由此可见，与对照相比，miR-27b-3P过表达的骨髓间充质干细胞诱导软骨细胞对软骨损伤有显著的修复效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> miR-27及其类似物在体外抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uucacagugg cuaaguuccg c 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uucacagugg cuaaguucug c 21

<210> 3

<211> 78

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cugaggagca gggcuuagcu gcuugugagc aggguccaca ccaagucgug uucacagugg 60

cuaaguuccg ccccccag 78

<210> 4

<211> 97

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accucucuaa caaggugcag agcuuagcug auuggugaac agugauuggu uuccgcuuug 60

uucacagugg cuaaguucug caccugaaga gaaggug 97

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggagcag caagagcaa 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtcgccgta gctgaagtg 19

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttctaaagt gcactccggg acca 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accatggagt gatgcaccat caga 24

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgctgaagg gctacgactg ga 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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Claims (8)

1.miR-27及其类似物在体外抑制骨髓间充质干细胞向肥大软骨细胞分化中的应用；

所述miR-27包括miR-27a和/或miR-27b；所述miR-27a或miR-27b为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的miRNA；

所述miR-27的类似物为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的siRNA或shRNA。

2.miR-27及其类似物在体外促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化中的应用；

所述miR-27包括miR-27a和/或miR-27b；所述miR-27a或miR-27b为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的miRNA；

所述miR-27的类似物为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的siRNA或shRNA。

3.miR-27及其类似物在制备软骨损伤修复的药物中的应用；

所述miR-27包括miR-27a和/或miR-27b；所述miR-27a或miR-27b为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的miRNA；

所述miR-27的类似物为包含5’端特定核苷酸序列UGACACUU或GACACUU的siRNA或shRNA。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述miR-27a包括miR-27a-3P；所述miR-27a-3P的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述miR-27b包括miR-27b-3P；所述miR-27b-3P的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-27a-3P或miR-27b-3P的类似物的存在形式包括以下两种形式：

(1)miR-27a-3P或miR-27b-3P的前体或成熟体；

(2)携带miR-27a-3P或miR-27b-3P的类似物的载体；所述载体包括外泌体、质粒、慢病毒或腺病毒或逆转录病毒载体。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，miR-27a-3P的前体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，miR-27b-3P的前体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，包括以下步骤：

a.携带miR-27或其类似物的慢病毒转染骨髓间充质干细胞，获得高表达富含miR-27或其类似物的骨髓间充质干细胞；

b.对4.5×10⁵个/ml以上富含高表达miR-27或其类似物的骨髓间充质干细胞进行沉淀培养或单层培养诱导，得到软骨细胞或软骨团块。