CN113750240A - miR-140-5p抑制物在制备人骨髓间充质干细胞分化的促进药物中的应用 - Google Patents
miR-140-5p抑制物在制备人骨髓间充质干细胞分化的促进药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了miR‑140‑5p抑制物在制备人骨髓间充质干细胞分化的促进药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明采用miRNA抑制物或类似物对miR‑140‑5p的表达进行下调或上调，以miR‑NC作为对照，将携带有miR‑140‑5p抑制物或类似物和对照miR‑NC的慢病毒分别感染人骨髓间充质干细胞后进行筛选，得到稳定低表达或高表达和正常表达miR‑140‑5p的人骨髓间充质干细胞系，体外分化培养，观察不同种情况下成骨分化情况。结果显示，miR‑140‑5p在体外能抑制人骨髓间充质干细胞向成骨分化（P<0.05），低表达miR‑140‑5p能明显促进人骨髓间充质干细胞向成骨分化（P<0.05）。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及miR-140-5p抑制物在制备人骨髓间充质干细胞向成骨分化的促进药物中的应用。
背景技术
骨缺损是临床骨科最常见的疾病之一，主要原因有创伤、骨肿瘤切除和感染等，这些原因造成的骨缺损都是比较大的。尽管随着相关的医疗科技迅速发展，但是骨缺损的修复仍然是世界范围内临床上面临的需要解决的重大课题之一。目前临床治疗骨缺损的常用方法是移植，包括自体骨移植和同种异体骨移植，但是这种骨替代物移植，存在诸多问题，比如供体不足、移植后的排斥、移位、感染或囊肿等，极大地限制了临床治疗。因此，寻找新的临床可应用的骨修复方法，来应对这些挑战显得尤为重要。随着组织工程学技术的发展，其在骨缺损修复方面取得了巨大的成就，为骨缺损修复提供了一种极有前景的治疗方案。组织工程技术主要有三大要素，包括干细胞、生长因子和支架材料。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）是骨组织工程中研究最广泛的干细胞之一。BMSCs具有自我克隆增殖能力，并具有向脂肪细胞、骨或软骨细胞、神经细胞等方向分化的潜能，可以通过不 同的诱导方法，促进BMSCs分化成软骨、成骨细胞等，以便用于骨缺损疾病的治疗。但其定向成骨分化的调控仍是研究的热点与难点，也是限制其在临床应用上的关键点之一。
微小RNA（micro RNAs, miRNAs）是包含约1825个核普酸的非编码单链小分子RNA，调节基因转录后的表达。它们分布广泛，在组织和所有体液中均有分布，包括血浆、血清、尿液、唾液以及脑脊液等。其稳定性高，在血液中和脑脊液中通过脂质体或脂蛋白运输，很少被降解。几乎参与全身所有的生理过程，包括神经元的发生、学习、记忆过程，从而与中枢神经系统退行性疾病有着密切的关联。
因此，若能找到影响人骨髓间充质干细胞向成骨分化的关键microRNA，则可能成为骨组织工程的新靶点，为骨缺损的临床治疗带来突破。
发明内容
本发明的目的是提供miR-140-5p抑制物在制备人骨髓间充质干细胞向成骨分化的促进药物中的应用。
miR-140-5p是miRNAs家族成员之一，最新的研究表明，miR-140-5p参与了细胞的增殖分化过程。以往的研究证明miR-140-5p能抑制人BMSCs向成骨细胞分化，从而推测miR-140-5p抑制物能够促进人骨髓间充质干细胞向成骨分化。
所述miR-140-5p的核苷酸序列为：5’-CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG-3’（SEQ IDNO.1）。
本发明采用miRNA抑制物或类似物对miR-140-5p的表达进行下调或上调，以miR-NC作为对照，将携带有miR-140-5p抑制物或类似物和对照miR-NC的慢病毒分别感染人骨髓间充质干细胞后进行筛选，得到稳定低表达或高表达和正常表达miR-140-5p的人骨髓间充质干细胞系，体外分化培养，观察不同种情况下成骨分化情况。结果显示，miR-140-5p在体外能抑制人骨髓间充质干细胞向成骨分化（P<0.05），低表达miR-140-5p能明显促进人骨髓间充质干细胞向成骨分化（P<0.05）。
附图说明
图1为分化培养后茜素红染色检测结果。其中：A为茜素红染色结果，Control组、Mimic NC组、Inhibitor NC组细胞中可见明显红色的矿化结节。与Control组、Mimic NC组、Inhibitor NC组比较，Mimic组细胞红色的矿化结节明显减少，Inhibitor组细胞红色的矿化结节明显增多。B为提取茜素红检测OD值统计结果，Control组、Mimic NC组、InhibitorNC组三组间OD值比较差异无统计学意义。与Control组、Mimic NC组、Inhibitor NC组比较，Mimic组OD值明显减少，Inhibitor组OD值明显增加，组间比较差异有统计学意义。（* VS.Control组，P＜0.05; # VS. Mimic NC组，P＜0.05; @ VS. Inhibitor NC组，P＜0.05; &VS. Mimic组，P＜0.05）。
图2为分化培养后Western blot检测结果。其中：A为Western blot显示蛋白条带。B为RUNX2蛋白相对表达量统计结果，Control组、Mimic NC组、Inhibitor NC组三组间RUNX2蛋白表达比较，差异无统计学意义。与Control组、Mimic NC组、Inhibitor NC组比较，Mimic组RUNX2蛋白表达明显减少，Inhibitor组RUNX2蛋白表达明显增加，组间比较差异有统计学意义。（* VS.Control组，P＜0.05; # VS. Mimic NC组，P＜0.05; @ VS. Inhibitor NC组，P＜0.05; & VS.Mimic组，P＜0.05）。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
本实施例的体外人骨髓间充质干细胞向成骨分化实验使用人骨髓间充质干细胞。
本实施例采用miRNA抑制物和类似物对miR-140-5p的表达进行下调或上调，以miR-NC作为对照，将携带有miR-140-5p抑制物和类似物及对照miR-NC的慢病毒分别感染人骨髓间充质干细胞后进行筛选，得到稳定低表达、高表达和正常表达miR-140-5p的人骨髓间充质干细胞系，体外分化培养，观察不同种情况下成骨分化情况。
具体过程如下：
1. 人骨髓间充质干细胞培养和miRNA抑制物、类似物转染
1) 人骨髓间充质干细胞系来自北纳创联生物技术有限公司，培养在5% CO2的37℃培养箱中，培养液为完全培养基DMEM/F12（Gibco公司）。
2) miR-140-5p抑制物、类似物来自赛默飞世尔科技有限公司，细胞转染利用Invitrogen的Lipofectamine RNAiMAX转染试剂，转染步骤按照说明书操作，miRNA抑制物浓度为5 纳摩。
2. 分化培养及成骨分化检测：
1) 分化培养实验：将人骨髓间充质干细胞及转染miRNA抑制物或类似物的人骨髓间充质干细胞以1×105个/mL的密度接种于含有完全培养基的24孔培养板中，置入饱和湿度的37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，待观察到细胞生长融合到50%左右时，更换含有成骨诱导液（地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、10% FBS、1%双抗）的培养基，置入培养箱中继续培养14 d，每3 d换一次液，此为诱导分化组。同时设置空白对照组，一直用完全培养基培养。
2) 茜素红染色检测：取上述诱导分化14 d的细胞，吸掉培养液，加4%多聚甲醛室温下固定30 min，然后用0.01 mol/L PBS冲洗三遍，加入2%茜素红染液染色，室温下孵育染色10 min，然后用0.01 mol/L PBS冲洗三遍。取各组部分细胞在显微镜下观察染色情况。各组余下细胞，通过在室温下用100 mM cetylpyridinium chloride溶液提取茜素红来定量细胞矿化情况，在570 nm处测量提取的茜素红染液的OD值。
3) Western blot检测：①提取细胞总蛋白：取上述各组诱导分化14 d的细胞，培养孔中加入100 μL RIPA裂解液（强）和1 μL的PMSF，超声2次，12000 rpm 4 ℃离心5 min，吸取上清置于干净的EP 管中备用。②提取细胞核蛋白：取上述各组诱导分化14 d的细胞，应用Nuclear Protein Extraction Kit，按操作说明提取细胞核蛋白。③对所提蛋白用RCDCTM Protein Assay Kit进行定量，然后将各组蛋白质浓度稀释为3 μg/μL，分装 冻存于-80℃冰箱中备用。④制备4％的浓缩凝胶、10％分离凝胶，将60 μg总蛋白加入每个泳道进行电泳，然后将其转移到PVDF膜，并用含有5％脱脂乳（10 mM Tris-HCl，pH7.5，150 mM NaCl，0.1％ Tween-20）室温下封闭1 h。然后应用兔抗Wnt1多克隆抗体（1:500）、β-catenin兔抗多克隆抗体（1:500）、RUNX2兔抗多克隆抗体（1:400）、LaminB1兔抗多克隆抗体（1:800）和β-actin小鼠抗单克隆抗体（1:1000）4 ℃条件下孵育过夜。然后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:1000）或HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1:1000），室温孵育1 h。使用MolecularImager ChemiDoc XRS System采集图像并做光密度分析。
3.统计学处理
应用SPSS 21.0数据统计软件对数据进行分析。所得计量资料用均值±标准差表示，组间两两比较采用单因素方差分析。以P＜0.05认为差异有统计学意义。
结果如图1、2所示，与空白对照组和miR-NC组比较，人骨髓间充质干细胞转染miR-140-5p抑制物后，向DCX阳性神经元前体细胞分化数量明显增多，单因素方差分析结果显示，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。* VS.Control group，P＜0.001；# VS. miR-NCgroup，P＜0.001。
序列表
<110> 苏州工业园区星湖医院
<120> miR-140-5p抑制物在制备人骨髓间充质干细胞分化的促进药物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagugguuuu acccuauggu ag 22
Claims (2)
1.miR-140-5p在筛选人骨髓间充质干细胞分化向成骨分化的促进药物中的应用。
2.miR-140-5p抑制物在制备人骨髓间充质干细胞向成骨分化的促进药物中的应用。
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