CN114262372B - 一种调控细胞成骨分化的转录因子及成骨分化细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种调控细胞成骨分化的转录因子及成骨分化细胞，转录因子为Zfp260，细胞为Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞，成骨分化细胞的方法包括以下步骤：S1、筛选Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞作为骨分化细胞；S2、将步骤S1筛选的骨分化细胞植入支持载体的内部；S3、在所述支持载体的内部培养骨分化细胞，最终形成骨骼；综上所述，本发明提供了促进骨分化、再生的因子和方法。

Description

一种调控细胞成骨分化的转录因子及成骨分化细胞

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是一种调控细胞成骨分化的转录因子及成骨分化细胞。

背景技术

牙缺失是影响人类健康和生活质量的口腔疾病。世界卫生组织曾发表观点认为，健康的牙齿数目是判定人类健康标准的重要指标，即“8020”，也就是，80岁拥有20颗健康牙齿。种植牙是临床上治疗牙缺失的最常用、有效的方法。但是，种植牙需要与人体进行较好的适应、匹配，并且在种植后的使用过程中需要维持较好的稳定性。因此，对种植牙的材质等有较高的要求。

比如，上颌后牙缺失后，上颌窦的形态和窦底牙槽骨会发生一系列的病理生理变化，导致骨量缺失。而上颌窦底提升术是目前临床上解决上颌后牙区骨量不足最常用的治疗方法。其手术原理为：使用提升外科器械抬起上颌窦内衬的施耐德膜，创造一个稳定的成骨空间，从而在上颌窦内形成新生骨，用于临床的牙种植修复治疗，扩大了种植治疗的适应证。大量实验及临床研究结果显示，该术式在没有发生骨损伤的条件下，可在植入或不植入骨替代材料的情况下，在上颌窦底区域产生良好的新骨形成，这与身体其他部位的骨再生情况不同，其成骨机制似乎不是医学传统概念的膜下成骨，或软骨成骨，提示该区域可能存在特殊的成骨机制或功能细胞种类，上颌窦内新骨形成机制一直是医学领域研究的热点与难点问题之一。

最近，有研究者建立小鼠上颌窦底提升模型(maxillary sinus floor lifting,MSFL)，并可观察到显著的新骨形成，表明在不同物种中MSFL均能诱导局部新生骨组织形成。但通过大量临床患者的锥形束CT(cone beam CT,CBCT)测量结果中发现，MSFL诱导的骨再生过程不同于传统的长骨再生修复过程，后者涉及由骨损伤引起的膜内成骨或软骨内成骨，但MSFL不涉及骨损伤。传统的骨再生依赖于成骨祖细胞的激活。例如，Ctsk+骨膜间充质细胞为传统骨折后骨再生与修复提供了祖细胞。然而，上颌窦被一层呼吸粘膜，即施耐德膜所覆盖，其特征是缺乏典型的骨膜结构。上颌窦底提升术后上颌窦内成骨机制尚不清楚。如何促进上颌窦底提升术后上颌窦内骨再生是临床中面临的重要问题。

综上所述，现有技术还缺少促进骨分化、再生的因子和方法。

发明内容

本发明提供了调控细胞成骨分化的转录因子及成骨分化细胞以及相关的应用及方法。对进一步研究骨骼发育、再生、和相关疾病，特别是颅颌面骨组织发育、再生和颅颌面部疾病的认知有重要意义。

为达此目的，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种调控细胞成骨分化的转录因子，所述转录因子为Zfp260。

Zfp260基因编码锌指蛋白家族转录因子，定位于第7染色体，其首次由BlottièreL等于1999年鉴定出其基因定位。数年后，Zfp260首次报道于心血管领域的研究。2011年和2017年分别报道了Zfp260作为重要的内皮素1(ET-1)信号的下游效应分子，提示其可能是心肌肥厚早起阶段的介导因子；Zfp260通过激活MMP9的启动子而介导促进心室纤维化的作用。本发明首次发现了Zfp260在调控细胞成骨分化中的应用。

本发明的第二个方面，提供了一种调控细胞成骨分化的生物制剂，所述生物制剂包括可表达转录因子Zfp260的基因或可表达转录因子Zfp260的质粒、重组载体、转基因细胞系、基因工程菌。

本发明的第三个方面，提供了一种成骨分化细胞，所述细胞为Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞。

本发明观察到大部分小鼠施耐德膜中同时具有间充质特性及骨向分化潜能的Ctsk阳性细胞可能来源于Krt14阳性细胞，即局部间充质来源于上皮细胞的转分化。上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)广泛发生于胚胎发育、创伤后修复、肿瘤形成和远端转移等过程。在小鼠中的发育谱系示踪研究表明，在皮肤、食管、唾液腺及小肠等组织中，Krt14+细胞谱系特异性分布于上皮区域，与基底膜下方结缔组织间形成明显的分界。本发明首次发现并证明：在一定的生理环境下，上皮细胞在颅颌面外胚间叶来源的骨组织稳态及新骨形成中发挥重要作用。同时，在进一步探究原理时，本发明首次阐明保守转录因子Zfp260的上调在上颌窦底提升区域成骨中起重要作用，具体是Zfp260调控Krt14阳性细胞向Krt14/Ctsk双阳细胞变化及Krt14/Ctsk双阳细胞向Ctsk阳性细胞转化的两个节点。

本发明的第四个方面，提供了本发明的调控细胞成骨分化的转录因子、生物制剂、细胞在成骨分化的调控中的应用，所述的调控包括正调控和负调控，正调控是指转录因子Zfp260，和/或，可表达转录因子Zfp260的生物制剂，和/或，Krt14阳性细胞和/或Krt14/Ctsk双阳性细胞上调，促进成骨分化和组织再生；负调控是指转录因子Zfp2604，和/或，编码转录因子Zfp260的生物制剂，和/或，Krt14阳性细胞和/或Krt14/Ctsk双阳性细胞下调，抑制成骨分化和组织再生。

本发明的第五个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有有效量的本发明的调控细胞成骨分化的转录因子的促进剂，和/或，调控细胞成骨分化的生物制剂的促进剂，和/或，骨分化细胞的促进剂。

优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

优选的，骨分化细胞的促进剂/诱导剂包括TGFb1。

优选的，所述转录因子为Zfp260。

优选的，所述生物制剂包括可表达转录因子Zfp260的基因或可表达转录因子Zfp260的质粒、重组载体、转基因细胞系、基因工程菌。

优选的，所述细胞为Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞。

本发明的第六个方面，提供了本发明所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗骨相关疾病，或，形成再生骨或牙中的应用。

优选的，所述疾病包括但不限于骨质疏松症、骨骼发育迟缓症、颅颌面部疾病。

本发明的第七个方面，提供了一种获得和应用本发明的成骨分化细胞的方法，包括以下步骤：

S1、筛选Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞作为骨分化细胞；

S2、将步骤S1筛选的骨分化细胞植入支持载体的内部；

S3、在所述支持载体的内部培养骨分化细胞，最终形成骨骼。

优选的，步骤S1包括：在分化诱导剂的存在下培养全能干细胞，生成含有Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集团，从所述分化诱导处理后的细胞集团中筛选Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞。

优选的，步骤S1包括：通过流式细胞筛选获得Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞。

优选的，所述骨骼用于制造牙齿、假体。

与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：

1、本发明首次发现了上皮间充质细胞分化为成骨细胞，并提供了可以分化为具有间充质特性及骨向分化潜能的Ctsk阳性细胞的Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞。此外，本发明还提供了Krt14阳性细胞或Krt14/Ctsk双阳性细胞的相关应用及方法，为骨骼发育、再生和相关疾病提供了新的解决途径。

2、本发明首次提出Zfp260在调控细胞成骨分化中的应用，并深入研究和总结了其调控原理包括：1)Zfp260调控Krt14阳性细胞向Krt14/Ctsk双阳细胞变化及Krt14/Ctsk双阳细胞向Ctsk阳性细胞转化的两个节点；2)Zfp260可以直接启动成骨相关转录因子Runx2，Sox4及EMT转化相关的转录因子Snai2的转录。

附图说明

为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。

显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。

图1为本发明实施例1的种植体的结构示意图；

图2为本发明实施例1的小鼠植入手术过程示意图；

图3为本发明实施例2的时序分析和WGCNA分析结果示意图；

图4为本发明实施例3的测序数据分析结果示意图；

图5为本发明实施例4的Op-1群与OLCs进行差异基因计算的结果示意图；

图6为本发明实施例4的基因表达分布图和小提琴图；

图7为本发明实施例5的人的上颌窦黏膜样本的结果示意图；

图8为本发明实施例5的小鼠呼吸黏膜样本的结果示意图；

图9为本发明实施例5的MSFL术后第6天的结果示意图；

图10为本发明实施例6的RNA-seq结果示意图；

图11为本发明实施例6的PCA聚类分析结果示意图；

图12为本发明实施例7的两个节点的转录因子比较的结果示意图；

图13为本发明实施例7的3种细胞进行多色荧光染色的结果示意图；

图14为本发明实施例8的qRT-PCR的结果示意图；

图15为本发明实施例8的Western Blot的结果示意图；

图16为本发明实施例8的细胞株骨向诱导分化结果示意图；

图17为本发明实施例8的细胞株转录组测序结果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例中所提供的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明中的术语“转录因子”是指是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

本发明中的术语“基因”是指基因(遗传因子)是具有遗传效应的DNA片段(部分病毒如烟草花叶病毒、HIV的遗传物质是RNA)。基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息。环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。因此，基因具有双重属性：物质性(存在方式)和信息性(根本属性)。带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现。组成简单生命最少要265到350个基因。

本发明中的术语“质粒”是指存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。

本发明中的术语“重组载体”是指能够插入外源性DNA序列，并进行自主复制的一段DNA序列。

本发明中的术语“转基因细胞系”是指通过转基因技术诱导的细胞系。

本发明中的术语“基因工程菌”是指是指将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌。如大肠杆菌。基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。除DNA重组技术外，基因工程还包括基因的表达技术、基因的突变技术、基因的导入技术等。

本发明中的术语“全能干细胞”是指能够分化发育成为各种组织器官的细胞，其全能性很强。全能干细胞是指受精卵到卵裂期32细胞前的所有细胞。全能干细胞是指具有无限分化潜能，能分化成所有组织和器官的干细胞。具有形成完整个体分化潜能。胚胎干细胞就属于这一种。胚胎干细胞在进一步的分化中，可形成各种组织干细胞，又称多能干细胞，多能干细胞也叫PSC(Pluripotent stem cell)，它具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。

本发明中的术语“细胞集团”是指多个相同或相似的细胞的聚集体。

还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。

下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1小鼠上颌窦腔提升(MSFL)模型的建立

实验材料：8周龄雄性C57BL/6J小鼠

实验方法：

1.1、将多只8周龄雄性C57BL/6J小鼠麻醉后，将小鼠固定于鼠台上；

1.2、消毒小鼠鼻中部对应的表皮，备皮；备皮后，再次使用75％乙醇消毒术区皮肤；

1.3、用11号刀片沿矢状向切开鼻中部皮肤，切口长8-10mm，充分暴露鼻骨中部骨面；

1.4、用车针预备植入位点，钻穿局部骨皮质，并用生理盐水检验局部鼻黏膜的完整性；

1.5、确认黏膜完整后，植入如图1所述的种植体(威高集团生产、微型种植体)；

1.6、在植入区上方覆盖合适大小的聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene,PTFE)不可吸

收膜，并用5-0缝线间断缝合。手术示意图如图2所示，其手术步骤依次为图2中的A、B、C、D。

实施例2获取MSFL后的组织并进行硬组织空间转录组测序hard tissuegeographical position sequencing(htGeo-seq)及硬组织空间转录组定量聚合酶链式反应hard tissue geographical quantitative polymerase chain reaction(htGeo-qPCR)检测

实验材料：将实施例1的上颌窦底提升术后的小鼠，分别于术后3、6、9、14天获取上颌窦底提升后的组织，即为组织样本。

实验方法：

2.1、将组织样本在4℃下，用混合溶液处理48h。其中，混合溶液包含如下溶剂：2％甲酸、5M NaCl、100mM RVC处理，50mM柠檬酸钠，20％去离子甲酰胺，20％硫酸铵，0.1M2-(N-吗啉基)乙烷磺酸钠盐，无Rnase ddH2O；

2.2、将浸泡后的组织样本中的硬组织用无Rnase水冲洗，用30％蔗糖脱水，制备15μm厚的冰冻切片；

2.3、通过激光显微切割(laser capture microdissection,LCM)获得靶区组织样本。用TRIzol法提取组织样本中的RNA，糖原(工作浓度：20μg/ml)辅助沉淀。使用Trio RNA-Seq建库试剂盒(Nugen,0357-32)对获得的微量RNA进行文库构建，步骤为①用DNase I去除体系中残余DNA；②用逆转录酶进行cDNA一链合成与二链合成；③单引物等温扩增；④打断及末端修复；⑤加接头，接头上含有测序引物互补结合的片段序列，通过和测序引物结合来对目的片段进行测序；⑥文库一轮扩增；⑦探针互补配对去除核糖体rRNA；⑧文库二轮扩增；⑨Illumina测序：文库质检合格后，将不同文库按有效浓度及目标下机数据量需求进行Illumina测序。使用Agilent 2100芯片进行文库大小分布峰图质检，并判定有无接头污染，由此完成了硬组织总RNA文库构建。

2.4、进行htGeo-seq及htGeo-q PCR检测

对构建的RNA文库进行加权共表达网络分析(weighted gene co-expressionnetwork analysis,WGCNA)通过筛选并分析术后各时间点的特征模块，进一步筛选各特征模块中的特征基因，通过蛋白互作网络分析(protein protein interaction network,PPInetwork)，筛选各模块的核心基因。Mfuzz进行时序表达聚类分析。利用欧氏距离的双向层次聚类热图分析5个时间点转录本的关联度。Cytoscape 3.7.1用于分析蛋白质互作网络。

实验结果：如图3所示，时序分析和WGCNA分析结果显示术前、术后3、6、9、14天特征性基因被分为6个不同模块。通过GO-BP分析和KEGG富集分析，结果显示术前施耐德膜组织的转录本在GO-BP主要富集在纤毛形态发生，在KEGG主要富集在细胞代谢通路。术后第3天样本转录本表征为免疫反应及细胞增殖，累及PI3K-Akt信号通路上。在术后第6天在细胞增殖同时，开始富集至新骨再生的相关分子生物学过程，累及Wnt等关键成骨相关信号通路。术后第9、14天几乎完全富集在成骨过程和成骨相关信号通路上。以上结果说明本发明中所构建的小鼠上颌窦提升模型激活了成骨相关转录程序。

实施例3单细胞RNA测序(single cell RNA-sequencing,scRNA-seq)及分析

实验材料：实施例1获取的上颌窦底提升术后的小鼠上颌窦内膜和新形成组织

实验方法：

3.1、使用来自10x Genomics的Chromium Next GEM Single cell 3'Kit v3.1制备单细胞RNA seq文库将上颌窦底提升术后的小鼠上颌窦内膜和新形成组织解剖和消化后，收集单个活细胞，并将其重新悬浮在含有0.04％BSA的PBS中，最终浓度为500-1200个细胞/ml，由Rigel S2细胞计数器(Countstar)测定；

3.2、在液滴中捕获10,000个细胞，生成纳升级乳胶凝胶珠(GEMs)，然后在C1000触摸式热循环仪(Bio-Rad)中反向转录GEMs，在53℃下编程45分钟，在85℃下编程5分钟，并在4℃下保持，在反转录和细胞条形码后，破乳，用含有DynaBeads和SPRIselect试剂(ThermoFisher Scientific)的清洁混合物分离和纯化cDNA，然后进行PCR扩增；

3.3、然后用扩增的cDNA构建3'基因表达文库，并用Illumina NovaSeq 6000测序仪对单细胞RNA文库进行测序；

3.4、使用Cell Rangertoolkit version 3.1(10x Genomics)汇总原始数据，过滤低质量reads，与参考小鼠基因组比对后分配Barcode，生成唯一的分子标识符(UMI)矩阵。应用Seurat(version 4.0.2)分析RNA文库。对原始数据进行质量控制(quality control,qc),过滤低质量样本。进一步量化每个细胞的基因数量和UMI计数，并保持高质量的细胞，阈值为500-120000UMIs,400-8000个基因，线粒体基因计数低于10％，以确保大多数异质细胞类型被纳入下游分析。使用Scrublet算法筛除黏连细胞。采用离散度法检测了前20个高变基因(highly variable genes,HVG)。对可变基因矩阵进行主成分分析(principalcompartment analysis,PCA)和UMAP降维聚类分析，并将前50个成分用于下游分析。运用典型相关分析矫正批次效应。应用Leiden算法根据特征基因表达情况对细胞进行聚类。构建UMAP图以可视化降维聚类结果。

在第一轮无监管聚类后，根据标志基因表达情况标记每个细胞集团，将所得总细胞分为软骨细胞、成骨细胞系(osteolineage cells,OLCs)、周细胞、神经祖细胞(neuralprogenitor cells,NPCs)、中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞(epithelial cells,EPs)、T细胞、支持细胞(sustentacular cells,Sus)、水平基底细胞(horizontal basal cells,HBC)、未成熟的嗅觉感觉神经元(immature olfactory sensory neuron,iOSN)以及成熟的嗅觉感觉神经元(mature olfactory sensory neuron,mOSN)。为了保证得到OLCs数据质量，重新从过滤表达矩阵开始进行了第二轮无监管聚类。为了检测OLCs中特定聚类中的DEG，使用CCA2方法对原始计数矩阵进行归一化，该方法使用正则化负二项模型对UMI计数进行建模，以消除测序深度的变化，同时基于相似丰度的基因池化信息调整方差。然后用Limma包检测DEG。

实验结果：步骤3.4的测序数据分析结果如图4所示，收集术前局部施耐德膜组织及术后3、6、9、14天的提升区域新生组织进行单细胞测序，共获得63527个细胞，行UMAP聚类后，将细胞分为12个亚群。将所有时间的成骨细胞谱系细胞(osteolineage cells,OLCs)合并后共得到19723个细胞。将所有时间点的OLCs细胞进一步根据成骨指标基因的丰度，将OLCs进一步分为9个亚群。其中，拟时序分析显示了前成骨细胞(osteoprogenitor cell,Op)Op-1与OLCs类似的分化轨迹。RNA速率分析也得到了类似的结果。

实施例4差异基因Krt14

实验材料：实施例1的上颌窦底提升术小鼠模型的术前局部黏膜，及术后3、6、9、14天的提升区域新生组织。

实验方法：

4.1、将实施例1的上颌窦底提升术小鼠模型的术前局部黏膜，及术后3、6、9、14天的提升区域新生组织按照实施例3的方法分离单细胞；

4.2、将步骤4.1分离的单细胞进行全基因组测序(scRNA-seq)。

4.3、根据测序结果，计算差异基因、绘制基因表达分布图和小提琴图。

4.4、将测试结果进行GSEA分析。

实验结果：

如图5所示，将Op-1群与OLCs进行差异基因计算，得到差异基因Krt14，主要分布于Op-1和水平基底细胞(horizontal basal cells,HBC)细胞群。GSEA分析表明，在Op-1亚群中的Krt14+细胞具有形成细胞外基质、上皮间充质转化特性及矿化的趋势，而在HBC群中，Krt14+细胞主要展现其上皮特性。

如图6所示，基因表达分布图和小提琴图表明Op-1中的Krt14+细胞不再展现上皮特征，其转录本提示其具备充分的骨向分化潜能。Op-1亚群中Krt14+细胞高表达Ctsk和Vim基因。

实施例5Krt14+Ctsk+细胞

实验样本：人的上颌窦黏膜样本，小鼠窦腔黏膜样本

实验方法及结果：

5.1、通过免疫荧光验证了Krt14+Ctsk+细胞的存在及定位。

5.2、观察人的上颌窦黏膜样本。如图7所示，样本中可以看到Krt14强阳及Krt14弱阳两种细胞，Krt14强阳细胞主要分布于施耐德膜的基底部，及血管及腺体周，这些细胞呈Ctsk阴性。Krt14弱阳性细胞主要散在分布于中间结缔组织层，这些细胞与Ctsk和Vimentin信号共定位。

5.3、观察小鼠呼吸黏膜样本。如图8所示，样本中可以看到Krt14强阳信号主要分布于呼吸黏膜的中间层及表层，在近骨面层及骨膜样层中，其表达逐渐减弱，而Ctsk的信号出现显著增强，Krt14+Ctsk+细胞主要分布于近骨面层及骨膜样层中。

5.4、小鼠呼吸黏膜样本进行流式细胞术。结果发现：在小鼠窦腔黏膜中，Krt14-Ctsk+细胞(似骨膜间充质细胞)占比约0.033％，而Krt14+Ctsk+细胞的占比则达到了0.045％。Krt14+Ctsk+细胞存在空间上的级联分布，并以Krt14lowCtsk+的形式分布于新生区域中。

5.5、观察MSFL术后第6天。结果如图9所示，Krt14+Ctsk+细胞占比从术前的0.045％上调至0.93％，同时Krt14-Ctsk+细胞占比从术前的0.033％上调至34％。MSFL术后第14天，Krt14+Ctsk+细胞占比从术后第6天的0.93％降为0.61％，同时Krt14-Ctsk+细胞占比从术后第6天的34％继续上调至63.9％。以上结果提示，Krt14+Ctsk+细胞及Krt14-Ctsk+细胞参与到MSFL的成骨过程中。

实施例6Krt14+Ctsk+细胞具有骨向分化的潜力

实验材料：H11LSL-ZsGreen-RSR-Tdtomato小鼠、CtskcreER小鼠、Krt14dreER小鼠

实验方法：

6.1应用H11LSL-ZsGreen-RSR-Tdtomato小鼠、CtskcreER小鼠、Krt14dreER小鼠构建CtskcreER-ZsGreen；Krt14dreER-Tdtomato双示踪小鼠。在MSFL术后第2天向所构建的Ctsk、Krt14双示踪小鼠体内连续3天注射他莫昔芬(tamoxifen,TAM)，

6.2、在术后第6天收取样本，流式分选后分别获得Krt14+Ctsk-，Krt14+Ctsk+及Krt14-Ctsk+细胞培养并按照实施例3的方法制备RNA-seq文库。

实验结果：

如图10所示，RNA-seq结果显示，Krt14+Ctsk+细胞的矿化相关细胞外基质转录水平接近Krt14-Ctsk+细胞，而Sp7,Bglap等成骨细胞标志物表达水平较低，提示其转录本与成骨祖细胞更加相似。

如图11所示，PCA聚类分析结果表明，该细胞与Krt14-Ctsk+细胞在降维聚类位置上更加接近。分选后矿化诱导的结果显示，Krt14+Ctsk-细胞无法正常诱导出钙化结节，而Krt14+Ctsk+及Krt14-Ctsk+细胞均可成功诱导，进一步证明Krt14+Ctsk+细胞具有骨向分化的潜能。假设在Krt14+Ctsk-向Krt14+Ctsk+细胞变化的过程中主要发生了上皮间充质转化及骨向分化，而在Krt14+Ctsk+向Krt14-Ctsk+细胞转化的过程中主要表现为骨向分化特性的成熟。

实施例7Zfp260调控Krt14+Ctsk+细胞

实验方法及结果：

7.1、比对Krt14+细胞向Krt14+Ctsk+细胞变化及Krt14+Ctsk+向Ctsk+细胞转化的两个节点的转录因子。将上述两组比较后的上调转录因子取交集后获得10个转录因子，分别为：Plagl1,Mef2a,Irx5,Mef2c,Zfp260,Runx2,Satb2,Vdr,Pax3,Zfp354c。结果如图12所示，其中，Zfp260在Krt14+细胞向Krt14+Ctsk+细胞变化及Krt14+Ctsk+向Ctsk+细胞转化的两个节点，其转录水平均表现为显著上升。

7.2、对分选后的Krt14+Ctsk-细胞、Krt14+Ctsk+细胞和Krt14-Ctsk+细胞进行多色荧光染色。结果如图13所示，本发明进一步发现Snai2随细胞标志物的改变在表达水平上并未展现显著差异，而Zfp260、Vimentin和Runx2展现出从Krt14+Ctsk-细胞向Krt14-Ctsk+细胞转变逐级上调的趋势。

实施例8Zfp260调控MC3T3-E1细胞系

1)干扰Zfp260的MC3T3-E1细胞系的建立

实验材料：

引物：根据NCBI数据库报道的小鼠Zfp260(NM_011981.4)全长基因编码序列(CDS)，根据CDS设计干扰RNA(shRNA)引物，引物如下表1所示。

表1 Zfp260-shRNA引物序列

干扰慢病毒载体：pLV-shRNA，酶切位点选择：BamHI、EcoRI，元件顺序：

U6-MCS-PGK-mCherry-2A-Puro。

实验方法：

1.1)干扰载体构建：首先合成干扰序列的单链DNA oligo，退火配对引物，将退火引物与EcoRI、BamHI双酶切后的慢病毒干扰线性载体通过T4连接酶体系连接后，将连接产物转入细菌感受态细胞，PCR鉴出阳性重组子并测序验证，测序结果经比对确认正确的克隆即为构建成功的携带目的基因干扰RNA的慢病毒载体；

1.2)待MC3T3-E1前成骨细胞生长至汇合度达70％-80％时，弃去培养基，用无菌PBS洗涤细胞3次，胰酶消化后用完全培养基中和，300g离心5min后弃上清；

1.3)用含10％FBS、1％双抗的α-MEM完全培养基重悬离心后的细胞团块，以2.5×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，贴壁过夜后，更换新鲜的完全培养基，根据其感染复数(multiplicity of infection,MOI)确定病毒使用量，加入病毒，继续培养12h后更换完全培养基。干扰慢病毒感染72h后，使用10μg/mL的嘌呤霉素进行抗性筛选，7d后未经转染的细胞死亡，获得稳定干扰或过表达的多克隆细胞株，获得荧光显微镜下可见EGFP表达，并挑选出稳定表达的单克隆，使用2ug/mL的嘌呤霉素持续培养，隔天换液。

2)过表达Zfp260的MC3T3-E1细胞系的建立

实验材料：

引物：根据NCBI数据库报道的小鼠Zfp260(NM_011981.4)全长基因编码序列(CDS)，根据CDS设计过表达引物(Zfp260-OE)。引物如下表2所示。

表2 Zfp260过表达引物序列

过表达病毒载体：pCDH，酶切位点选择：EcoRI、NotI，元件顺序：CMV-MCS-EF1a-GFP-Puro实验方法

2.1)过表达载体构建：以Zfp260-OE-F和R引物从小鼠cDNA中经PCR扩增Zfp260基因的编码区序列，产物经1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化后，利用无缝克隆法，将插入片段与纯化回收后经EcoRI和NotI双酶切的pCDH线性化载体进行同源重组反应，后将反应后产物转入感受态细胞，PCR筛选筛选阳性质粒，送测序验证并比对。

2.2)待MC3T3-E1前成骨细胞生长至汇合度达70％-80％时，弃去培养基，用无菌PBS洗涤细胞3次，胰酶消化后用完全培养基中和，300g离心5min后弃上清。

2.3)用含10％FBS、1％双抗的α-MEM完全培养基重悬离心后的细胞团块，以2.5×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，贴壁过夜后，更换新鲜的完全培养基，根据其感染复数(multiplicity of infection,MOI)确定病毒使用量，加入病毒，继续培养12h后更换完全培养基。病毒感染72h后，使用10μg/mL的嘌呤霉素进行抗性筛选，7d后未经转染的细胞死亡，获得稳定干扰或过表达的多克隆细胞株，获得荧光显微镜下可见EGFP表达，并挑选出稳定表达的单克隆，使用2ug/mL的嘌呤霉素持续培养，隔天换液。

3)MC3T3-E1细胞系成骨诱导中Zfp260的表达水平

3.1)待MC3T3-E1前成骨细胞生长至汇合度达70％-80％时，弃去培养基，用无菌PBS洗涤细胞3次，胰酶消化后用完全培养基中和，300g离心5min后弃上清。

3.2)用完全培养基按4×10⁵个/孔的密度将细胞接种于六孔板中，每孔加入2mL完全培养基。

3.3)于37℃、体积分数5％CO₂细胞培养箱中培养，至细胞融合度达到80％-90％时，吸去培养基，向六孔板中加入2mL小鼠成骨诱导分化完全培养基。成骨诱导分化培养基配方为：α-MEM+10％FBS+1％双抗+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+0.1μmol/L地塞米松+50mg/LVitC。

3.4)每3天更换成骨诱导分化完全培养基，使用时需提前预热至37℃。

3.5)染色：诱导7d与21d后，视细胞形态变化及生长情况，PBS冲洗后，每孔加入1ml4％多聚甲醛固定液室温固定15min。弃去固定液，PBS冲洗3次，诱导7天后的细胞，每孔加入1ml碱性磷酸酶染液，4℃避光染色30min，弃去染液，加入PBS润洗3次后更换新鲜PBS，显微镜下拍照；诱导21天后的细胞，每孔加入1ml茜素红染色液，室温染色20min后弃去茜素红染液，加入PBS润洗3次后更换新鲜PBS，显微镜下拍照。

3.6)qRT-PCR：诱导7、14、21天后，检测Zfp260的mRNA转录水平，并与未诱导组进行对比。结果如图14所示，在骨向诱导分化的刺激下，Zfp260的转录水平相比于对照组显著上调，且稳定维持于较高水平，差异具有统计学意义。

3.7)Western Blot：诱导7、14、21天后，检测Zfp260的蛋白表达水平，并与未诱导组进行对比。结果如图15所示，在骨向诱导分化的刺激下，Zfp260的翻译水平相比于对照组显著上调，且稳定维持于较高水平，差异具有统计学意义。

综上所述，矿化诱导后，Zfp260的转录及蛋白表达丰度较对照组显著升高，提示该分子可能参与前成骨细胞的成骨向分化调控。

4)干扰或过表达Zfp260稳转株骨向诱导分化能力变化

4.1)对LV-GFP(仅含有绿色荧光蛋白的慢病毒的过表达对照组)、LV-Zfp260OE(过表达Zfp260株)、LV-shNC(干扰Zfp260株)和LV-shZfp260(干扰组对照)四组MC3T3-E1稳转细胞株进行矿化诱导，方法同3.3；

4.2)于诱导第7天，取出培养孔板，弃去原培养液，1xPBS洗3次，4％PFA室温固定15min，进行碱性磷酸酶染色；

4.3)于诱导第14天，取出培养孔板，弃去原培养液，1xPBS洗3次，4％PFA室温固定15min，进行茜素红染色。

4.4)结果如图16显示，矿化诱导第7天时，LV-Zfp260OE组相对于LV-GFP组的碱性磷酸酶活性显著升高，而LV-shZfp260组则相对LV-shNC组出现了显著的降低；在诱导第14天时，LV-Zfp260OE组相对于LV-GFP组产生了更多的矿化基质，而相对于LV-shNC组，LV-shZfp260的矿化基质则出现明显减少。

以上结果表明，过表达Zfp260显著增强了前成骨细胞的成熟分化和细胞外基质矿化水平，而干扰Zfp260的表达和翻译后，该成骨向分化过程和形成胞外钙结节进程均被显著抑制，表明Zfp260具有正向促进骨基质形成及矿化的作用。

5)过表达或干扰Zfp260后MC3T3-E1的mRNA测序

提取过LV-GFP(表达达对照组)、LV-Zfp260(过表达Zfp260组)、sh-NC组(干扰对照组)及LV-shZfp260(Zfp260干扰组)的RNA，并进行mRNA建库、测序。mRNA建库和测序简单流程：①每个待建库样本投入1.5ug的总RNA；②利用携带polyT的mRNA捕获磁珠捕获总RNA中的mRNA；③进行mRNA的洗脱、片段化及随机引物的结合；④进行一链合成、二链合成；⑤加入体系1.8×体积的AmpureXP磁珠，进行纯化；⑥末端修复，接头连接；⑦根据PE150的测序方案进行磁珠纯化和双轮分选，筛选出300-450bp的文库片段；⑧PCR扩增文库，并用1×磁珠进行纯化；⑨illumina PE150平台测序。

为了明确Zfp260的下游信号调控通路和靶分子，对上述细胞株进行转录组测序。测序结果如图17所示，分别对Zfp260过表达及干扰后的细胞系进行转录组测序，将过表达后上调及下调的基因取交集，共获得359个基因。将上述基因进行GO-BP富集分析，发现基因主要富集在细胞粘附、矿化、神经系统发育和成骨细胞分化等生物学过程。选取359个基因中的转录因子，共获得25个转录因子，将上述转录因子根据生物学功能进行分类，发现调控multicellular organism development的转录因子有10个，以Snai2为代表；调控skeletalsystem development/ossification的转录因子有8个，以Runx2,Aff3和Sox4为代表。根据TPM结果，发现上述转录因子随Zfp260的表达水平均表现出显著的丰度随动差异。可以说明，Zfp260促进细胞外基质形成及矿化的正向功能。

在上述说明书的描述过程中：

术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。

最后应说明的是：

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；

尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。

Claims (6)

1.调控细胞成骨分化的转录因子Zfp260在体外成骨分化的调控中的应用，其特征在于，所述的调控包括正调控和负调控，正调控是指转录因子Zfp260，和/或，可表达转录因子Zfp260的生物制剂上调，促进成骨分化和组织再生；负调控是指转录因子Zfp2604，和/或，编码转录因子Zfp260的生物制剂下调，抑制成骨分化和组织再生。

2.一种在体外获得和应用成骨分化细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、筛选Krt14/Ctsk双阳性细胞作为骨分化细胞；

S2、在体外培养骨分化细胞，最终形成骨骼。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1包括：在分化诱导剂的存在下培养全能干细胞，生成含有Krt14/Ctsk双阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集团，从所述分化诱导处理后的细胞集团中筛选Krt14/Ctsk双阳性细胞。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1包括：通过流式细胞筛选获得Krt14/Ctsk双阳性细胞。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述骨骼用于制造假体。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述假体为假牙。

Images