CN115961025B - 一种环状rna在制备与心肌肥厚相关的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种环状RNA在制备与心肌肥厚相关的产品中的应用，该环状RNA是通过对心肌肥厚模型小鼠测序发现的，它在心肌肥厚发生发展过程中起着关键作用。

Description

一种环状RNA在制备与心肌肥厚相关的产品中的应用
本发明是申请号为202010615319.0、申请日为2020年06月30日、发明名称为“与心肌肥厚相关的环状RNA、表达载体及其制备方法”的分案申请。
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种环状RNA在制备与心肌肥厚相关的产品中的应用。
背景技术
心血管疾病是人类健康的重大威胁，近年来的发病率越来越高(Molkentin JD,LuJR,Antos CL,et al.A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiachypertrophy.Cell1998；93:215-28)。其中，心肌肥厚是心血管疾病中最常见的病理过程，它会导致心肌细胞异常肥大、室间隔肥厚且不对称、心室内心腔变小或心室充盈受限(Rockman HA,Koch WJ,Lefkowitz RJ.Seven-transmembrane-spanning receptors andheart function.Nature.2002；415:206-12；Everett AD,Tufro-McReddie A,Fisher A,etal.Angiotensin receptor regulates cardiac hypertrophy and transforming growthfactor-beta 1expression.Hypertension.1994；23:587-92)。
CircRNAs是非编码RNA(ncRNAs)中的一种，最初是在1976年通过电子显微镜在病毒中发现的(Sanger HL,Klotz G,Riesner D,et al.Viroids are single-strandedcovalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.Proc Natl Acad Sci USA.1976；73(11):3852-6.)，几十年来一直被忽视。最近的几年里，随着RNA测序和生物信息学分析的发展，人们对circRNA的兴趣大大增加，并在很多生物体内均已发现了circRNAs的存在，其丰度约占细胞总mRNA的2-4％(SzaboL,Salzman J.Detecting circular RNAs:bioinformatic and experimentalchallenges.Nat Rev Genet.2016；17(11):679-92)。最近还发现circRNA在衰老、胰岛素分泌、动脉粥样硬化性血管疾病、癌症和心脏肥大中都有着不可忽视的作用(Qu S,Zhong Y,Shang R,et al.The emerging landscape of circular RNA in life processes.RNABiol.2017；14(8):992-9)。人们通过对来自人类、小鼠和大鼠的心脏，还有人胚胎干细胞来源的心肌细胞核糖体衰竭RNA进行了全基因组分析和详细的circRNAs注释(Khan MA,Reckman YJ,Aufiero S,et al.RBM20 Regulates Circular RNAProduction From theTitin Gene.Circ Res.2016；119(9):996-1003；Werfel S,Nothjunge S,Schwarzmayr T,et al.Characterization of circular RNAs in human,mouse and rat hearts.J MolCell Cardiol.2016；98:103-7；Tan WL,Lim BT,Anene-Nzelu CG,et al.Alandscape ofcircular RNA expression in the human heart.Cardiovasc Res.2017；113(3):298-309)，发现了很多在心脏稳定表达的circRNAs(Werfel S,Nothjunge S,Schwarzmayr T,etal.Characterization of circular RNAs in human,mouse and rat hearts.J Mol CellCardiol.2016；98:103-7；Tan WL,Lim BT,Anene-Nzelu CG,et al.A landscape ofcircular RNA expression in the human heart.Cardiovasc Res.2017；113(3):298-309)，但其功能和机制仍不是十分清楚。
结合以往的研究来看，相对于其他的非编码RNA(micRNA、lncRNA等)，虽然circRNA的研究刚刚开始，但是它有很多优越性，在多种疾病中都发挥着重要作用。其中circRNAs与心肌肥厚相关的研究仍停留在初级阶段，因此探究circRNAs为心肌肥厚找到新的治疗靶点有着重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种环状RNA在制备与心肌肥厚相关的产品中的应用，该环状RNA是通过对心肌肥厚模型小鼠测序发现的，它在心肌肥厚发生发展过程中起着关键作用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种环状RNA在制备与心肌肥厚相关的产品中的应用，所述环状RNA位于Chr153256629-53282092位置处，序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述心肌肥厚包括AngII诱导的心肌肥厚。
更优选地，所述与心肌肥厚相关的产品通过过表达上述环状RNA降低AngII诱导的心肌肥厚进展。
优选地，所述与心肌肥厚相关的产品包括：包含上述环状RNA的重组表达载体。
优选地，所述重组表达载体为过表达上述环状RNA的腺病毒载体。
更优选地，所述腺病毒载体为ADV-M12。
优选地，所述重组表达载体的制备方法包括：
1)利用PCR钓取的方法，或全基因合成的方法得到目的基因，PCR所用引物的序列包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；
2)将目的基因与目的载体分别进行酶切并纯化；
3)将纯化的酶切产物进行定向连接；
4)将连接产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行酶切鉴定，证明目的基因已经定向连入目的载体，再对阳性克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的目的基因重组表达载体。
优选地，步骤1)包括：
1-1)将所有引物分别溶解并取等量混合，配制成oligo mix；
1-2)用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物；
1-3)以第一轮的PCR产物为模板、序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：17的引物进行第二轮PCR反应，获得单一的目的基因条带。
更优选地，第一轮PCR反应的反应体系为：
oligo mix 2μl
10×Pfu Buffer(+Mg2+) 3μl
dNTP 0.6μl
DMSO 1.2μl
ddH2O 23μl
Pfu DNA polymerase 0.2μl
总体积 30μl
；
反应条件为：
更优选地，第二轮PCR反应的反应体系为：
反应条件为：
优选地，步骤2)中，采用EcoRI和BamHI将目的基因与目的载体分别进行酶切。
优选地，步骤3)中，采用T4 DNA ligase将纯化的酶切产物进行定向连接。
本发明的有益效果如下：
我们通过横主动脉缩窄术(TAC)建立小鼠心肌肥厚模型，假手术组为对照，对两组小鼠进行circRNA高通量测序，发现这段基因在TAC组小鼠中的表达只有对照组的0.4，并经过提组织RNA，通过荧光定量PCR发现，该基因片段在TAC组小鼠中的表达，确实较对照组下调了；接着我们过表达该环状RNA chr153256629-53282092，再进行AngII诱导后，发现过表达chr1组的心肌肥厚标志物、心肌肥厚表面积均比AngII组低，从而证实过表达Chr1后可以明显降低AngII诱导的小鼠心肌肥厚进展。
附图说明
图1为本发明实施例构建Chr1 53256629-53282092过表达腺病毒载体的实验流程图。
图2为本发明实施例重组质粒测序的基因合成报告单。
图3为本发明实施例重组质粒测序结果与目的基因序列对比图谱。
图4为本发明实施例qPCR分析心肌细胞中心肌肥厚标志物的表达结果a.肥厚标志物SEARCA-2a的表达；b.肥厚标志物β-MHC的表达；c.肥厚标志物BNP的表达；d.肥厚标志物ACTA-1的表达；*：P＜0.05；**：P＜0.01。
图5为本发明实施例激光共聚焦显微镜下拍摄的心肌细胞，A、B、C、D是DyLight 59染的胞质，E、F、G、H是用DAPI染的细胞核，I、J、K、L是Merged后的图像，其中A、E、I是control组，B、F、J是CHACR+AngII1μM组，C、G、K是AngII 1μM组；D、H、L是NC+AngII 1μM组。
图6是本发明实施例经过image J分析测量的各组心肌细胞的平均面积的统计图；*：P＜0.05。
具体实施方式
下面将结合附图更详细地描述本发明的示例性实施方式。需要说明的是，提供该实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域技术人员，可以以各种形式实现本发明，而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例
本发明具体实施的过程如下：
一、Chr1 53256629-53282092过表达腺病毒载体构建
从含有目的基因的质粒克隆模板中，利用PCR方法钓取目的基因，若没有模板则利用全基因合成的方法得到目的基因。将目的基因与目的载体分别进行酶切。纯化酶切产物后进行连接，将连接产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行酶切鉴定，证明目的基因已经定向连入目的载体。再对阳性克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的目的基因表达质粒载体。将构建好的重组载体进行超纯抽提，流程如图1所示。具体包括：
1、用PCR方法得到序列片段
1.1oligo设计，Chr1 53256629-53282092基因(序列见SEQ ID NO：1)上下游引物，分别
加上EcoRI和BamHI及保护碱基，用于载体的亚克隆，oligo序列如下：
表1.Oligo引物序列表
引物由苏州吉玛基因股份有限公司合成。
1.2将oligo溶解成50μM，将oligo分别取相同体积至一1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix。
1.3用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，PCR体系如下：
表2.第一轮PCR反应体系
oligo mix 2μl
10×Pfu Buffer(+Mg2+) 3μl
dNTP 0.6μl
DMSO 1.2μl
ddH2O 23μl
Pfu DNA polymerase 0.2μl
总体积 30μl
循环条件：
表3.第一轮PCR反应条件
1.4用oligo-1和oligo-16进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物，PCR体系如下：
表4.第二轮PCR反应体系
第一轮PCR产物 1μl
10×Pfu Buffer(+Mg2+) 5μl
dNTP 1μl
DMSO 2μl
Y5004-1 1μl
Y5004-16 1μl
ddH2O 39μl
Pfu DNA polymerase 0.3μl
总体积 50.3μl
循环条件：
表5.第二轮PCR反应条件
第一轮PCR可得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物，再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带。
1.5 PCR反应完成后，利用Agarose电泳并切胶回收基因片段。
2、Chr1 53256629-53282092基因克隆到载体ADV-M12中
2.1用EcoRI和BamHI对Chr1 53256629-53282092基因片段进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：
表6.Chr1 53256629-53282092片段的酶切反应体系
10×Buffer 5μl
Chr1 53256629-53282092 42μl
EcoRI 1.5μl
BamHI 1.5μl
总体积 50μl
2.2用EcoRI和BamHI对载体ADV-M12进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：
表7.载体ADV-M12的酶切反应体系
10×Buffer 5μl
ADV-M12 5μg
EcoRI 1.5μl
BamHI 1.5μl
ddH2O 补足50μl
2.3电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收Chr1 53256629-53282092基因片段和载体ADV-M12。
2.4用T4 DNA ligase连接双酶切得到的Chr1 53256629-53282092基因片段和线性化的载体，22℃连接2小时，连接体系如下：
表8.目的基因片段与载体连接反应体系
T4 DNA ligase buffer 2μl
ADV-M12 2μl
Chr1 53256629-53282092 5μl
T4 DNA ligase 1μl
ddH2O 10μl
总体积 20μl
2.5感受态细胞的制备(氯化钙法)
2.5.1从37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。
2.5.2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。
2.5.3于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
2.5.4倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
2.5.5以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
2.5.6于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
2.5.7倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
2.5.8每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2(含20％甘油)重悬每份细胞沉淀。
2.5.9将细胞分装成小份(100μl/支)，放于-70℃冻存。
(感受态细胞制备参考：分子克隆实验指南第二版55页)
2.6将连接产物转化感受态细胞
2.6.1从-70℃中取出感受态细胞(E.coli DH5α)，将装有感受态细胞的离心管冰上放置4分钟，待感受态细胞解冻后，加入10μl连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置30分钟。
2.6.2将离心管放到预加温到42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置90秒，不要摇动离心管。
2.6.3快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟。
2.6.4向每支离心管加入800μl LB培养基(不含抗生素)，然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45分钟使细菌复苏。
2.6.5取200μl培育后的细胞均匀涂布于含50μg/mlAmpicillin LB平板上。
2.6.6等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。
2.7从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆
2.7.1从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml(含50μg/mlAmpicillin)
LB培养基的试管中。
2.7.2将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250转/分钟，培养16小时。
2.7.3将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒。
3、重组质粒测序验证并大量抽提
3.1取200μl阳性克隆对应的菌液送测序，基因合成报告单见图2，并将剩余的菌液用甘油保存。
3.2将测序结果与目的基因序列进行比对，见图3，正解无误后，用保存的甘油菌液接菌LB培养基，进行大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒。至此，载体构建实验完成。
二、原代心肌细胞培养并转染
1、采集心脏
取出生1～2d的SPF级C57BL/6雄性乳鼠。在生物安全柜中放置一个套着保鲜膜的泡沫盒，用1mL针头将乳鼠固定在泡沫盒上，喷75％的酒精消毒小鼠表面皮肤，将小鼠上腹部皮肤用平头镊牵起，然后使用眼科剪剪开该处皮肤，左手将皮肤往后撕开并固定，右手换无菌剪头弯镊逐步挑开胸壁，并夹出心脏置于DMEM培养基中，重复上述步骤。
2、消化
用无菌平头镊挤压乳鼠心脏，让心腔内的血排出，用无菌尖头弯镊配合去除心底部、心外膜的结缔组织后，置于1.5mL无菌EP管中，用PBS反复冲洗后用眼科剪剪碎，再加入1mL消化酶，37℃温箱中孵育消化15分钟左右。显微镜下，看到心肌细胞从组织中脱落后，1200rpm离心3min后加入完全培养基使得消化终止，随后重悬沉淀。当有较大块的组织未能消化完全时，可再次使用消化酶消化重复以上步骤。
3、纯化
将上述得到的细胞种板于60mm皿中培养1.5h，待心肌成纤维细胞基本上全部贴壁而心肌细胞尚未贴壁时，可以通过差时贴壁去除成纤维细胞，取培养基置于15mL离心管中，并用PBS清洗培养皿，将残留的部分心肌细胞洗出来，置于离心管中，1200rpm再次离心5min，弃掉上清。
4、贴壁培养
以上沉淀加入完全培养基(含0.1μmol/mL Brdu)使得细胞重悬，然后均匀种于培养皿中，培养24h后去除培养基，用PBS清洗两遍(原代细胞，组织残留碎片很多，多洗一次)，再加入完全培养基，待细胞形态、搏动良好，可以开始用于实验。
5、细胞分组
主要分组情况可见下表：
表9.细胞分组情况表
第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 换液 换液 饥饿处理 换液 换液 提细胞
肥厚组 换液 换液 饥饿处理 换液加AngII 换液 提细胞
CHACR组 加CHACR过表达病毒 换液 饥饿处理 换液加AngII 换液 提细胞
注：“CHACR”为本申请中Chr1 53256629-53282092的暂用名。
对照组(control组)：
正常培养的心肌细胞，未经干预；
肥厚组：
i AngII 1μM组：心肌细胞培养48h后，加入AngII 1μM诱导48h；
ii CHACR+AngII 1μM组：加入0.01μlCHACR过表达腺病毒，24h后换液，再过24h加入AngII 1μM培养48h；
iii NC+AngII 1μM组：加入0.01μl空载腺病毒，24h后换液，再过24h加入AngII 1μM培养48h。
6、检测
6.1将上面分组处理好的心肌细胞，予直接加trizol裂解后，提细胞总RNA，然后测RNA浓度，定量逆转录成cDNA，以GAPDH为内参，qPCR检测心肌细胞中ANP、BNP、β-MHC、SERCA-2a等心肌肥厚标志物的表达。
6.2免疫荧光染色后(抗体是在心肌细胞膜上表达的)，予激光共聚焦下拍照，通过image j分析图片，每组选十个视野，算出心肌细胞平均表面积。
三、结果及分析
1、通过qPCR检测发现，AngII诱导的肥厚模型细胞的心肌肥厚标志物(SEARCA-2a/β-MHC/BNP/ACTA-1)明显高于对照组，说明肥厚心肌细胞模型造模是成功的，但过表达CHACR后AngII诱导肥厚标志物的升高则被降低，如图4所示。结果证明CHACR能抑制AngII诱导的心肌细胞肥大。
2、除了通过qPCR检测细胞肥厚标志物的变化，我们接着通过免疫荧光分析心肌细胞肥厚后表面积的变化来进行验证。实验分组同上，通过激光共聚焦显微镜采图分析测量心肌细胞的平均表面积，结果发现与对照组相比，CHACR过表达后心肌细胞的表面积明显减小，表明CHACR可以明显抑制AngII诱导的心肌细胞肥大。如图5和6所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或增减替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种包含环状RNA的重组表达载体在制备治疗AngII诱导的心肌肥厚的产品中的应用，所述环状RNA位于Chr1：53256629-53282092位置处，序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组表达载体为过表达所述环状RNA的腺病毒载体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗AngII诱导的心肌肥厚的产品通过过表达所述环状RNA降低AngII诱导的心肌肥厚进展。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述腺病毒载体为ADV-M12。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体的制备方法包括：
1)利用PCR钓取的方法，或全基因合成的方法得到目的基因，PCR所用引物的序列包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；
2)将目的基因与目的载体分别进行酶切并纯化；
3)将纯化的酶切产物进行定向连接；
4)将连接产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行酶切鉴定，证明目的基因已经定向连入目的载体，再对阳性克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的目的基因重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1)包括：
1-1)将所有引物分别溶解并取等量混合，配制成oligo mix；
1-2)用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物；
1-3)以第一轮的PCR产物为模板、序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：17的引物进行第二轮PCR反应，获得单一的目的基因条带。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，第一轮PCR反应的反应体系为：
oligo mix 2μl 10×Pfu Buffer(+Mg2+) 3μl dNTP 0.6μl DMSO 1.2μl ddH2O 23μl Pfu DNA polymerase 0.2μl 总体积 30μl
；
反应条件为：
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，第二轮PCR反应的反应体系为：
第一轮PCR产物 1μl 10×Pfu Buffer(+Mg2+) 5μl dNTP 1μl DMSO 2μl SEQ ID NO：2序列的引物 1μl SEQ ID NO：17序列的引物 1μl ddH2O 39μl Pfu DNA polymerase 0.3μl 总体积 50.3μl
；
反应条件为：
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