CN101380477A

CN101380477A - CR-1 siRNA在治疗AngII诱导心肌肥大中的应用

Info

Publication number: CN101380477A
Application number: CNA2008101688278A
Authority: CN
Inventors: 王以光; 戴文建; 赫卫清; 孔维佳
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2008-09-28
Filing date: 2008-09-28
Publication date: 2009-03-11

Abstract

本发明涉及CR－1 siRNA在治疗AngII诱导心肌肥大中的应用，实验研究证明，CR－1siRNA－能够抑制Ang II诱导的小鼠心肌肥厚，削弱心室扩张程度和心室壁厚度，抑制心肌肥厚的标志性蛋白ANF、β－MHC基因的表达，并抑制心肌纤维化，为有效的新型心肌肥大治疗药物。

Description

CR-1 siRNA在治疗AngII诱导心肌肥大中的应用

技术领域：

本发明涉及与疾病相关因子-短干扰核糖核酸在基因治疗中的应用，具体而言，涉及人细胞生成调节因子-短干扰核糖核酸CR-1 siRNA在心肌肥大治疗中的应用。

背景技术：

心肌肥厚是心脏为适应各种刺激而产生的心肌细胞体积增大及重量增加。其病理变化包括心肌细胞肥大、心肌间质细胞增殖以及心脏细胞外基质改建等多方面的改变，即心肌重构。心肌肥厚时，心肌细胞蛋白合成增加、体积增大、直径增宽或长度增加，肌节数量增多并伴有纤维组织增生。传统观点认为，成熟心肌细胞终止分化，丧失有丝分裂能力，不能进入细胞周期。然而，目前有证据显示，在心脏发育及病理过程中，存在心肌细胞的凋亡和增殖两种过程，以维持心脏功能的稳态水平。

临床上造成心肌肥厚的疾病有许多，如常见的原发性或继发性高血压、心肌梗死、瓣膜病、先天性心脏病等。虽然早期心肌肥厚有利于维持正常的心功能，但由于心肌肥厚本身也可增加心肌耗氧量，降低心肌顺应性，故长时间会导致心力衰竭，增加猝死发生率。研究表明，诱导心肌肥厚的因素主要有以下方面：

1、机械张力：这是血液动力学超负荷导致心肌肥厚的始发因素[Yamazaki T.CellSignal，1998，10(10)：693-8.]。机械张力一方面直接刺激细胞生长，另一方面可刺激心肌组织产生各种内分泌因子，如肾素一血管紧张素系统(renin-angiotensin-system，RAS)成分，儿茶酚胺类，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)，一氧化氮(nitric oxide，NO)合成系统和细胞因子如白介素lb(interlukin-lb，IL-lb)，心肌肥厚因子(cardiotrophin-1，CT-1)等。这些因素均由心肌组织自身合成与表达，且表达量在心肌肥厚发生前后有所变化。经对遗传性高血压大鼠和4种心肌肥厚模型的研究证明，心血管局部组织产生的RAS对心肌肥厚发生起主要作用，而与循环RAS无明显依赖关系[Pelouch V.Cardiovasc DrugTher.1997.11(2)：177-85.]、[Schlaich MP.J Hypertens，1998，11(11Pt1)：1394-404.]、[Simko F.Physiol Res，1999，48(1)：1-8.]。

研究还表明，心脏局部许多成分直接诱导或介入心肌肥厚的发生发展过程，而且这些成分之间也是紧密联系的。如RAS和NO合成系统之间通过血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)和缓激肽相互影响，而ACE决定着血管紧张素的最终产生，同时通过缓激肽来调节NO的产生，活化的缓激肽可刺激一氧化氮合酶的(nitric oxide synthase，NOs)活性。

2、心肌细胞膜上的信号开关：从细胞和分子水平上看，心肌细胞肥大的过程主要包括三个环节：细胞外的刺激信号、细胞内的信号转导和细胞核内基因转录的活化。不同致肥大刺激信号可诱导特异性的心肌肥厚，主要取决于它们启动的信号转导途径。胞内的信号转导通路是胞外刺激与核内基因活化的耦联环节。心肌细胞肥大本质的分子机制是致肥大刺激信号诱导核内基因表达的改变。然而不同的刺激信号诱导的心肌肥大具有不同的分子表型。在心肌肥大中可能存在三种跨膜信号装置起到信号开关的作用：(1)G蛋白耦联的受体；(2)具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体；(3)可利用胞质非受体酪氨酸激酶的细胞因子受体，它们均可活化细胞内重要的信号通路。此外，离子通路、牵拉敏感的transducer、整合素超家族等，也参与开启细胞内的信号通路。G蛋白耦联受体是目前最大的超家族，如AngII的AT1受体，内皮素-1(ET-1)的ETA受体及去甲肾上腺素(NE)、苯肾上腺素(PE)等的受体都是G蛋白耦联受体。与受体耦联的G蛋白由Gα、Gβ、Gγ三个亚单位组成。当配基与受体结合后，可活化胞内的GTP酶，使Gα与GDP分离而活化，产生多种第二信使如：cAMP、1，4，5一三磷酸肌醇(IP₃。)、二酯酰甘油(DAG)、磷脂酸(PA)等，启动下游的信号转导途径。除了转化生长因子和胰岛素样生长因子II外，大多数生长因子如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)的受体，均为跨膜的受体酪氨酸激酶。当配基与受体结合后导致受体的二聚体化，引起胞内酪氨酸残基自我磷酸化而增强酶活性，对其下游效应蛋白进行磷酸化，从而启动下游的信号转导途径。此外，还有一种非酪氨酸激酶受体，与胞内的非酪氨酸激酶如JAK结合后活化。JAK可直接活化STAT，STAT可转位入核内，调节核内基因的表达、心肌肥厚及与之相关基因的表达。

3、心肌肥厚与基因变化：心肌肥厚过程中，参与的基因很多，这也是心肌肥厚机制研究很难取得突破的重要原因之一。但是，人们一直都在寻找导致心肌肥厚变化的关键性基因。本实验室研究发现，新基因人细胞生成调节因子CR-1与心肌肥厚有密切的关系，经血管紧张素II诱导的心肌细胞肥厚的心肌组织中，CR-1的表达均有明显增加。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵袭的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrand RNA，dsRNA)导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene siliencing，PTGS)范畴。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物，真菌，无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，只是机制也更为复杂。KR Zinn等实验研究发现，从尾静脉注射^99mTc-标记的腺病毒载体后，心脏中的表达就较高。

Carolina F.M.Z.等通过应用腺病毒介导的siRNA-FAK，成功地抑制了压力过负荷导致的心肌肥厚，他们发现，在心肌细胞和成纤维细胞中，FAK均能够被“沉默”，故认为：心肌细胞和非心肌细胞对基因沉默一样敏感，在一定范围内增大药物的剂量，可以增加药物的作用效果。M Iwatate等通过实验发现，腺病毒载体在心脏的表达可达56.4±14.5％。

CR-1基因是成肌纤维生成的一种调节基因。成肌纤维的生成与一类特殊的成纤维细胞有关，它们具有收缩性，能合成和降解细胞外基质，并具有分泌细胞因子、生长因子和炎性介质等功能。人类成心肌(纤维)细胞是心脏肥厚和心力衰竭相关心肌纤维化的根源。后者受多种因素的调控，如Myostatin负调控细胞的增值。大量研究认为，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，尤其是血管紧张素II(Ang II)和醛固酮(ALD)参与心肌纤维化的形成。

本发明所说的CR-1，是由本实验室综合采用cDNA选择、EST定位、基因组DNA序列分析、PCR反应以及克隆末端延展等技术，以两个EST序列(AX014823)(AX013073)出发合成引物，从人骨骼肌cDNA文库中克隆得到编码为142个氨基酸蛋白的基因。研究证明，该基因主要表达于人体骨骼肌组织，也在心脏、肝脏、以及肾组织中存在，并和参与肌肉收缩的肌球蛋白重链myomesin 1(skelemin)、肌球蛋白调节轻链、肌肉纹状肌M带复合酶系的(-烯醇化酶等基因具有相互作用。提示，CR-1基因可在肌肉细胞重构和收缩单元中发挥重要的调控作用。研究还证明，CR-1与含有Ras亚家族GTP酶蛋白存在相互作用，通过控制胞膜受体与信号途径之间的联系，可调节细胞增殖与分化。此项研究内容已申请“与细胞重构、传导及凋亡相关的CR-1基因”的发明专利，并于2005年11月9日批准授权(专利号：ZL02153656.2)。

本发明所说的人细胞生成调节因子-短干扰核糖核酸CR-1siRNA在治疗心肌肥大中的应用，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。

本发明的目的在于，为Ang II诱导的心肌肥厚疾病探索一条新的治疗途径。

发明内容：

本发明提供的的CR-1siRNA在治疗AngII诱导心肌肥大中的应用，包含以下的基本步骤：CR-1siRNA腺病毒重组载体的构建；小鼠Ang II诱导心肌肥大模型的复制；CR-1siRNA—腺病毒重组载体导入小鼠；导入后小鼠心脏形态变化的超声波检测；心肌肥厚的分子标记基因心钠肽(ANF)及β-肌球蛋白重链蛋白(MHC)等表达水平变化的检测。

实验研究证明，CR-1siRNA—能够抑制AngII诱导的小鼠心肌肥厚，削弱心室扩张程度和心室壁厚度，抑制心肌肥厚的标志性蛋白ANF、β-MHC基因的表达，并抑制心肌纤维化，有望开发成为临床有效的新型心肌肥大治疗药物。

附图说明：

图1CR-1siRNA腺病毒重组载体构建流程

图2AngII诱导小鼠模型中CR-1的RT-PCR检测

其中：1-未处理对照；2-AngII处理后；M-DNA Marker III。

图3AngII诱导小鼠模型中CR-1的Western blot检测

其中：1-未处理对照；2-AngII处理后。

图4CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后的CR-1基因RT-PCR检测

其中：M-DNA markerIII；1-AngII处理非导入对照组；2-AngII处理载体导入对照组；3-AngII处理导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；4-PBS处理并导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；5-PBS处理非导入对照组；6.—PBS处理载体导入对照组；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内标171bp。

图5CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后的CR-1基因Western blot检测

其中：1-PBS处理非导入对照组；2-PBS处理载体导入对照组；；3-PBS并导入CR-1s iRNA腺病毒重组载体；4-AngII处理并导入CR-1s iRNA腺病毒重组载体；5-Ang II处理非导入；6.-AngII处理载体导入对照组；肌动蛋白(Actin)为内标。

图6CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后心肌肥大分子标记ANF基因RT-PCR检测

其中：1-PBS处理非导入对照组；2-PBS处理载体导入对照组；3-PBS处理并导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；4-AngII处理并导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；5-AngII处理非导入组；6—AngII处理载体导入对照组。M—Marker；ANF为405bp；对照GAPDH内标为171bp。

图7CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后心肌纤维化分子标记基因CollagenIII的RT-PCR检测

其中：1-PBS处理非导入组对照；2-PBS处理载体导入对照组；3-PBS处理并导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；4-AngII处理并导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；5-Ang II处理非导入组；6.—AngII处理载体导入对照组；M—Marker；CollagenIII为282bp；对照GAPDH为171bp。

图8CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后心肌肥大分子标记基因myosin的Western blot检测

其中：1.-PBS处理非导入组对照；2-PBS处理载体导入对照组；3-PBS处理并导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；4-Angll处理并导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；5-Angll处理非导入组Ang；6.-Angll处理载体导入对照组；肌动蛋白(Actin)为内标。

图9CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后心肌肥大分子标记基因ANF的Western blot检测

其中：1-PBS处理非导入组对照；2-PBS处理载体导入对照组；3-PBS处理并导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；4-Angll处理并导入CR-1siRNA腺病毒重组载体；5-Angll处理非导入组Ang；6.-Angll处理载体导入对照组；肌动蛋白(Actin)为内标。

实施方案：

以下给出一些实施例，目的仅在于帮助本领域技术人员更好地了解本发明，而不是对本发明的任何限制。

<实施例1>CR-1siRNA腺病毒重组载体的构建

本实验使用具有H1启动子，可在哺乳动物细胞中高效表达shRNA的载体pSilencer3.0-H1(Ambion公司)。根据CR-1的cDNA序列(AF417001)，设计合成针对靶点序列AACAAGGCTTCTCATAACAGG的正反双链DNA寡核苷酸片段，

5′-GATCCCGCAAGGCTTCTCATAACAGGTTCAAGAGACCTGTTATGAGAAGCCTTG

TTTTTTGGAAA-3′

5′-AGCTTTTCCAAAAAACAAGGCTTCTCATAACAGGTCTCTTGAACCTGTTATGAG

AAGCCTTGCGG-3′

两条DNA片段经退火后，通过BamHI和HindIII位点连接入pSilencer3.0-H1载体，构建pSilencer3.0-H1-CR-1siRNA重组载体；从中以EcoRI/HindIII酶切得到的H1-CR-1siRNA(0.16kb)片段与pShuttle-Basic穿梭载体(诺赛基因公司)相连，获得pShuttle-Basic-H1-CR-1siRNA重组穿梭质粒，然后再从后者用I-CeuI/I-SceI双酶切将H1-CR-1siRNA片段连入pAdxsi腺病毒载体(Vectorbiolab公司)，得到pAdxsi-H1-H1-CR-1siRNA腺病毒重组载体(图1)。

<实施例2>小鼠AngII诱导心肌肥大模型的复制

取18只清洁级8周大的C57BL/6小鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所)，进入实验室后第三天被随机分为A、B、C三组，每组6只。然后随机选A组进行手术。用2.5％三溴乙醇(14uL/g)麻醉小鼠后，经背部皮下置入预装AngII(2.5mg/(kg.d))的微型泵(Alzet公司Model2002)实验组，而另外B组用预装溶媒体(PBS)的微型泵处理作为对照，另设C组为非置泵组对照。超声波(阿洛卡超声仪SSD-5500，7.5MHz探头)检测小鼠心肌形态变化，反转录聚合链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)检测CR-1基因的表达(表一)、(图2，3)。结果表明，AngII处理的小鼠与PBS和非置泵组对照比较，心肌形态有明显的肥大症状。RT—PCR(图2)和Western blot(图3)检测也表明CR-1基因表达增强。本发明成功地复制了AngII诱导的小鼠心肌肥大模型，为下一步“沉默”CR-1基因表达以减除小鼠心肌肥大打下了基础。

表一小鼠AngII诱导后心肌超声波检测结果

HW/BW心脏重量/体重；LVEDD左心室舒张末期直径；LVESD左心室收缩末期直径；PWT左心室后壁厚度；IVSD室间隔厚度.

^**P<0.01

<实施例3>CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型

取36只清洁级8周大的C57BL/6小鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所)，进入实验室后第三天被随机分为A、B和C三个系列，每个系列分为三个实验组，每组6只小鼠。系列和实验分组情况见表二。

表二 CR-1siRNA腺病毒重组载体导入AngII处理小鼠实验分组情况

小鼠背部置泵后第二天3，6，9组，分别经尾静脉注射siRNA-CR1(2 X 10⁹pfu/μl，200μl/d)，2，5，8组注入腺病毒载体对照(2 X 10⁹pfu/μl，200μl/d)，共导入13天。

<实施例4>CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后的超声波检测

CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠后第14天，用阿洛卡超声仪SSD-5500，7.5MHz探头置于左胸部，获得经过左心室最大直径的M型超声图象，根据美国心电图协会标准测量左心室收缩和舒张期最大直径和心室间隔及左心室后壁的厚度(表三)。结果表明，AngII处理明显增强小鼠心肌肥大的表现，而CR-1siRNA的导入可显著减弱AngII诱导小鼠心肌肥厚的症状。

表三 CR-1siRNA腺病毒重组载体导入AngII处理小鼠A心肌超声波检测结果

^*P<0.05在AngII处理实验系列中，CR-1siRNA-与非导入和载体导入对照的比较；

**P<0.01AngII处理系列与非置泵和PBS处理对照系列的比较。

<实施例5>CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后的CR-1基因RT-PCR表达的检测

为了证明CR-1siRNA的导入显著减弱AngII诱导小鼠心肌肥厚的症状确实与“沉默“CR-1基因的表达相关，本实施例采用RT-PCR和Western blot技术，检测了实施例3中所述AngII处理实验组CR—1基因的表达情况。由于非置泵对照和PBS对照组实际结果基本相符，故本实施例中仅列出CR-1siRNA实验组与PBS对照组的实验比较结果。

小鼠处理：小鼠心脏进行超声波检查后，麻醉，称重记录，后眼球放血处死，摘取心脏，无菌生理盐水洗净血液，心脏称重。-70℃冻存或者抽提总RNA和蛋白。

心脏总RNA的抽提：用普洛麦格的总RNA抽提试剂盒，并按试剂盒说明进行操作，具体步骤如下：将心脏用液氮在无RNA酶碾钵中碾碎成粉末，加入有裂解液的离心管中，轻轻混匀，再加入350ul(RDA？)，轻轻充分混匀，70℃水浴3分钟，12000rpm离心16分钟，将上清移至另一离心管中。加入95％的酒精200ul，混匀，12000rpm离心2分钟。加入DNA酶溶液，放置15分钟后终止反应，12000rpm离心。获得的RNA按Takara试剂盒说明书进行RT-PCR。

CR—1引物设计正链5’-ATTAGAATTCATGGCGGCGGTGGTAGCTGCT-3’

反链5’-ATATAAGCTTTCAGGTCTGTACTCCAGACCCAAC-3’

结果(均为每组6只小鼠的平均值)表明，CR-1siRNA-导入AngII处理小鼠，能明显降低其CR—1基因在转录水平的表达，P<0.01(图4)。

<实施例6>CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后CR-1基因Western blot表达的检测

小鼠(每组6只)心肌细胞在25mmol/LTris-HCL(pH 8.0)，150mmol/L NaCl，50mmol/L β-甘油磷酸，1mmol/L EDTA，10％甘油，1％ Triton X-100，1mmol/L PMSF，0.2mg/mL亮抑肽酶，1mmol/L DTT缓冲液中裂解，12000rpm离心5分钟，上清即为蛋白。按照碧云天公司试剂盒说明书，进行Western blot，以CR-1单克隆抗体为一抗，辣根酶标记山羊抗小鼠为二抗。Western blot表明，CR-1siRNA导入AngII处理小鼠，能明显降低其CR-1基因在蛋白水平的表达，P<0.05(图5)。

<实施例7>CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后与心肌肥大相关分子标记表达的检测

心房钠尿肽(ANF)、肌球蛋白重链(myosin)在心肌肥大细胞中表达中明显升高，而胶原蛋白(Collagen)III基因的表达是心肌纤维化的重要标志。本发明分别以ANF 正链5’-CATCACCCTGGGCTTCTTCCT-3’、反链5’-TGGGCTCCAATCCTGTCAATC-3和Collagenlll 正链5’-ATGCAGCCACCTTGGTCAGTC-3’、反链5’-AGGCCAGGGTCACCATTTCTC-3’为引物，通过RT-PCR检测了CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后，ANF和CollagenIII基因的表达。结果表明，CR-1siRNA腺病毒重组载体导入AngII诱导小鼠后，能明显降低其中ANF和CollagenIII基因在转录水平的表达，P<0.05(图6、7)。

Western blot检测结果也表明，CR-1siRNA腺病毒重组载体导入小鼠AngII诱导心肌肥大模型后，myosin和ANF蛋白表达水平也明显降低，P<0.05(图8、9)。

Claims

1、CR-1 siRNA在制备治疗AngII诱导心肌肥大药物中的应用。

2、如权利要求1所述的应用，其特征是，根据CR-1的cDNA序列(AF417001)，设计合成针对靶点序AACAAGGCTTCTCATAACAGG的正反双链DNA寡核苷酸片段

5’-GATCCCGCAAGGCTTCTCATAACAGGTTCAAGAGACCTGTTATGAGAAGCCTTGTTTTTTGGAAA-3’，

5’-AGCTTTTCCAAAAAACAAGGCTTCTCATAACAGGTCTCTTGAACCTGTTATGAGAAGCCTTGCGG-3’，

选用合适启动子如pSilencer 3.0-H1载体的H1启动子以及合适的酶切位点插入pAdxsi腺病毒载体。