CN106222173A - circRNA MNCR核苷酸、含有该核苷酸的药物组合物及其用途 - Google Patents

circRNA MNCR核苷酸、含有该核苷酸的药物组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种circRNA MNCR核苷酸及含有circRNA MNCR药物组合物，该药物组合物包括circRNA MNCR核苷酸、辅料、病毒载体或包埋载体，包埋载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体，优选地为脂质体，所述病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种，优选地为腺病毒载体，所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种，优选地为磷酸盐缓冲液，circRNA MNCR病毒载体的感染滴度为1016PFU，circRNA MNCR核苷酸与脂质体质量比为1：1.25；病毒载体或包埋载体与辅料质量比例为1：200。可用于预防和治疗心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病和心衰，阻止心肌纤维化及心肌重构的发生，其药物组合物制备工艺简单，药效明显，使用方便，治疗环境友好。

Description

circRNA MNCR核苷酸、含有该核苷酸的药物组合物及其用途
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种心肌坏死过程中表达的circRNA MNCR核苷酸，以及含有含有该核苷酸的药物组合物，该药物组合物相应的siRNA(circRNA MNCR)能够靶向沉默circRNA MNCR，通过口服或注射用于防治心脏疾病和改善心脏功能，可以阻止心肌纤维化及心肌重构的发生。
背景技术：
心血管疾病是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百多万人死于心血管疾病；随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部近期公布的最新统计结果表明，目前，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，农村为44.8％，城市为41.9％。心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术、方法用于心脏病的诊断、防治。
心肌细胞死亡是许多心血管疾病的细胞学基础。细胞死亡主要包括凋亡和坏死两种形式，过去的观点认为细胞凋亡受信号通路调控，而坏死不受信号通路调控，是一种被动的细胞死亡形式。近年来研究发现细胞坏死(Necroptosis)，是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。细胞坏死信号通路调控，涉及蛋白激酶RIP1和RIP3等分子，同时细胞坏死的调控分子与炎症、神经系统疾病、免疫功能异常密切相关。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大、心力衰竭等，心肌细胞均会发生坏死。然而心肌细胞坏死的信号通路还远未阐明，circRNA在调控心肌细胞坏死过程中的通路也有待进一步研究，所以寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞坏死的circRNA，阐明其作用机理，对于开发以circRNA为策略的心脏疾病的诊断、治疗具有极其重要的意义和应用前景。
circRNA是新近研究发现的一类内源性非编码RNA分子。circRNA是一类特殊的非编码RNA分子，通常由特殊的选择性剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质中。circRNA分子呈封闭环状结构，能够与细胞内源miRNA结合，在细胞中起miRNA海绵(miRNA sponge)的作用，从而调节miRNA的表达行使相应的功能。我们的研究发现心肌细胞发生坏死的时候circRNA MNCR表达显著下调，circRNA MNCR过表达情况下具有抑制心肌细胞坏死的作用，使用相应的siRNA(，即MNCR-siRNA)能够靶向沉默circRNA MNCR，从而促进心肌梗死过程中的心肌细胞坏死问题，最终减轻心肌梗死对心脏造成的伤害。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种含有circRNA MNCR的药物组合物及其预防或治疗心脏疾病的用途。
为了实现上述目的，本发明涉及的circRNA MNCR核苷酸序列如下列SEQ ID NO:1所示：SEQ ID NO:1：
GGAGAAAGGATCCTGGGCTATGCTGAGGAGCCCTGCTATCTCTGGTTTGTCATGGAGTACTGTGAAGGTGGAGACCTCAATCAGTATGTCCTGTCCCGGAGACCTGACCCAGCCACCAACAAAAGTTTCATGCTACAGCTTACAAGCGCCATTGCCTTCCTGCATAAAAACCACATCGTGCACAGGGACCTAAAGCCAGACAACATCCTGATCACAGAGCGGTCTGGCACCCCCATCCTCAAGGTGGCAGACTTTGGACTGAGCAAGGTCTGTGCAGGGCTGGCACCCCGAGGCAAAGAGGGCAATCAAGATAACAAAAATGTGAATGTGAATAAATACTGGCTGTCCTCAGCTTGTGGCTCAGACTTCTACATGGCTCCCGAAGTCTGGGAGGGACACTATACAGCCAAGGCGGACATCTTTGCTCTGGGCATTATCATCTGGGCAATGATAGAAAGAATTACCTTTATTGACTCTGAAACCAAGAAGGAGCTCCTGGGGACCTACATTAAGCAAGGGACTGAGATCGTCCCTGTTGGTGAGGCGCTGCTAGAAAACCCAAAGATGGAGTTGCATATCCCCCAGAAACGTAGGACTTCCATGTCTGAGGGGGTCAAGCAGCTCTTGAAAGACATGTTAGCTGCTAACCCACAGGACCGACCTGATGCTTTTGAACTTGAAACCCGAATGGACCAGGTCACATGTGCTGCTTAAACTCCAGGGCTGAACGTCTTGGGTGTTTTTAAACTAG。
本发明涉及的含有circRNA MNCR药物组合物，包括circRNA MNCR核苷酸、辅料、病毒载体或包埋载体，包埋载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体，优选地为脂质体，所述病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种，优选地为腺病毒载体，所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种，优选地为磷酸盐缓冲液，circRNA MNCR病毒载体的感染滴度为1016PFU，circRNA MNCR核苷酸与脂质体质量比为1：1.25；病毒载体或包埋载体与辅料质量比例为1：200。
本发明circRNA MNCR腺病毒载体的根据如下方法构建，其重组病毒的制备以小鼠基因组为模板，PCR扩增得到circRNA MNCR序列，亚克隆连入Ambion公司的pSilencerAdeno1.0-CMV腺病毒载体系统，根据文献所述方法，构建circRNA MNCR过表达病毒；所述PCR的引物序列为：上游引物：5'-GGATCCTGGGCTATGCTGAGGAGCCC-3'，下游引物：5'-CTAGTTTAAAAACACCCAAGACGTTC-3'。
本发明涉及的含有circRNA MNCR的药物组合物剂型为口服制剂、注射制剂、片剂、干粉剂型中的一种或多种，优选的为注射用水针剂。
本发明涉及的含有circRNA MNCR的药物组合物，通过口服或注射用于预防和治疗心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病和心衰。
本发明设计的药物组合物与现有技术相比，其在心脏中高表达，H2O2诱导或心肌缺血损伤过程中circRNA MNCR表达显著下调，circRNA MNCR的下调能诱导心肌细胞坏死的发生；circRNA MNCR在缺血再灌注动物模型的心肌组织中表达下调，过表达circRNA MNCR的心脏特异性转基因小鼠，可以抵抗心肌缺血再灌注损伤，心肌梗死面积减少，心功能显著改善。通过将circRNA MNCR药物组合从冠状动脉注射入小鼠心脏，发现心肌缺血损伤程度明显被抑制，动物模型证明circRNA MNCR对缺血性心脏病具有治疗作用，将circRNA MNCR与载体包装形成药物分子，通过口服或注射用于防治心脏疾病和改善心脏功能，阻止心肌纤维化及心肌重构的发生；其药物组合物制备工艺简单，药效明显，使用方便，治疗环境友好。
附图说明：
图1为H2O2诱导的心肌细胞坏死过程中circRNA MNCR表达水平变化的结果示意图，其中MNCR levels：MNCR-siRNA表达水平；Control：对照组；H2O2：过氧化氢处理组。
图2为circRNA MNCR被抑制后circRNA MNCR表达水平变化的结果示意图，其中MNCR levels：MNCR-siRNA表达水平；MNCR-sc：MNCR-siRNA的乱序对照，MNCR-siRNA：设计的能够抑制circRNA MNCR的siRNA片段。
图3为circRNA MNCR被抑制后H2O2诱导的心肌细胞坏死增加的结果示意图，其中PIpositive cells(％)：碘化丙啶(PI)染色为阳性的细胞占总细胞的百分比；Myosinpositive cells(％)：肌球蛋白染色为阳性的细胞占总细胞的百分比；saline：生理盐水，为对照组；MNCR-sc：MNCR-siRNA的乱序对照，MNCR-siRNA：设计的能够抑制circRNA MNCR的siRNA片段。
图4为心肌细胞过表达circRNA MNCR抑制心肌细胞损伤结果示意图，其中MNCRlevels：MNCR-siRNA表达水平；H2O2：过氧化氢处理组。MNCR-con：MNCR腺病毒对照；MNCR：腺病毒处理组。PI positive cells(％)：碘化丙啶(PI)染色为阳性的细胞占总细胞的百分比。
图5为在心肌有效过表达circRNA MNCR结果示意图，其中MNCR levels：MNCR-siRNA表达水平；Sham：假手术组，为I/R组的阴性对照；I/R：ischaemia/reperfusion，指对小鼠进行缺血再灌手术；MNCR-con：MNCR腺病毒对照；MNCR：腺病毒处理组。
图6为心肌过表达circRNA MNCR抑制心肌缺血再灌损伤结果示意图，其中Myosinpositive cells(％)：肌球蛋白染色为阳性的细胞占总细胞的百分比；INF/LV(％):梗死区面积占左心室面积的百分比；Sham：假手术组，为I/R组的阴性对照；I/R：ischaemia/reperfusion，指对小鼠进行缺血再灌手术；MNCR-con：MNCR腺病毒对照；MNCR：腺病毒处理组。
具体实施方式：
下面结合附图并通过实施例对本发明进一步说明，实验小鼠C57和大鼠均购自北京医科大学。
以下各实施例中涉及的材料、实验方法和操作工艺，包括circRNA(具体指circRNAMNCR)过表达，原代心肌细胞培养，细胞转染，心脏缺血再灌手术步骤，Evans blue/TTC双染和TUNEL检测均参见以下文献：1.Wang JX,Jiao JQ,Li Q,Long B,Wang K,Liu JP,Li YR,Li PF.Mir-499regulates mitochondrial dynamics by targeting calcineurin anddynamin-related protein-1.Nature medicine.2011；17:71-78；2.Wang K,Liu CY,ZhangXJ,Feng C,Zhou LY,Zhao Y,Li PF.Mir-361-regulated prohibitin inhibitsmitochondrial fission and apoptosis and protects heart from ischemiainjury.Cell death and differentiation.2015；22:1058-1068；3.Memczak S,Jens M,Elefsinioti A,Torti F,Krueger J,Rybak A,Maier L,Mackowiak SD,Gregersen LH,Munschauer M,Loewer A,Ziebold U,Landthaler M,Kocks C,le Noble F,RajewskyN.Circular rnas are a large class of animal rnas with regulatorypotency.Nature.2013；495:333-338。
实施例1：H2O2诱导的心肌细胞坏死过程中circRNA MNCR表达
本实施例使用心肌细胞坏死实验模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞(大鼠乳鼠购自北京医科大学，大鼠品系为Wistar大鼠，大鼠乳鼠原代心肌细胞的制备可参见以下文献：Tan WQ,Wang K,Lv DY,Li PF.Foxo3a inhibitscardiomyocyte hypertrophy through transactivating catalase.The Journal ofbiological chemistry.2008；283:29730-29739)，500uM H2O2处理大鼠乳鼠原代心肌细胞，同时设置没有采用500uM H2O2处理大鼠乳鼠原代心肌细胞的对照实验(Control组)，实验后均提取RNA，实时荧光定量PCR技术检测circRNA MNCR的表达水平。图中1为H2O2处理原代心肌细胞后circRNA MNCR表达水平的试验结果示意图，通过与Control组对比发现H2O2诱导的心肌细胞坏死过程中circRNA MNCR的表达显著下调。
实施例2：MNCR-siRNA靶向沉默circRNA MNCR
本实施例使用原代培养的心肌细胞为模型，原代心肌细胞转染MNCR-siRNA腺病毒，同时设置转染MNCR-sc腺病毒的阴性对照组，以及没有转染的空白组，24h后，均提取三组实验中原代心肌细胞的RNA，实时荧光定量PCR技术检测circRNA MNCR的表达水平,如图2所示MNCR-siRNA可以靶向沉默circRNA MNCR，即MNCR-siRNA能够有效降低心肌细胞中circRNA MNCR的表达水平。
实施例3：抑制circRNA MNCR表达可促进心肌细胞坏死
本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型，原代心肌细胞转染MNCR-siRNA，同时转染MNCR-sc随机序列作为对照组，以及没有转染的空白组，24小时后，三组实验同时使用H2O2诱导处理细胞12小时，然后使用碘化丙啶(PI)染色标记坏死心肌细胞，DAPI染色标记心肌细胞的细胞核，计算发生坏死的细胞数占心肌细胞数目的百分比，检测心肌细胞坏死。图3a为三组实验中坏死的细胞数占心肌细胞数目的百分比，从图中可以得出circRNA MNCR被抑制后H2O2诱导的心肌细胞坏死增加。图3b使用肌动蛋白(myosin)抗体注射检测circRNAMNCR被干扰沉默之后，myosin阳性的细胞数目增多，表明发生坏死的心肌细胞数目增多。结果显示MNCR-siRNA抑制circRNA MNCR可以显著促进H2O2诱导的心肌细胞坏死。
实施例4：过表达circRNA MNCR抑制心肌细胞坏死的实验
本实施例中含circRNA MNCR药物组合物包括circRNA MNCR核苷酸、腺病毒载体和磷酸盐缓冲液，circRNA MNCR病毒载体的感染滴度为1016PFU，所述circRNA MNCR腺病毒载体的根据如下方法构建：PCR扩增得到circRNA MNCR序列，亚克隆连入Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统，根据文献所述方法，构建circRNA MNCR过表达病毒；所述PCR的引物序列为：上游引物：5'-GGATCCTGGGCTATGCTGAGGAGCCC-3'，下游引物：5'-CTAGTTTAAAAACACCCAAGACGTTC-3'。
本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型。原代心肌细胞转染circRNA MNCR药物组合物，同时设置转染MNCR-con药物组合物作为阴性对照组，24小时后，使用H2O2诱导处理细胞12小时，实验后均提取RNA，实时荧光定量PCR技术检测circRNA MNCR的表达水平，同时使用碘化丙啶(PI)染色标记坏死心肌细胞，DAPI染色标记心肌细胞的细胞核，计算发生坏死的细胞数占心肌细胞数目的百分比，检测心肌细胞坏死情况，图4为不同实验组(从左到右依次为空白实验组、H2O2诱导处理实验组、转染MNCR-con药物组合物实验组和转染circRNA MNCR药物组合物实验组)中心肌细胞的circRNA MNCR表达水平(4a)以及心肌细胞坏死百分比(4b)，如图4a所示circRNA MNCR药物组合物能够有效增加circRNA MNCR的表达水平；如图4b所示过表达circRNA MNCR可以显著抑制H2O2诱导的心肌细胞坏死。
实施例5：心肌缺血损伤动物模型中有效过表达心肌细胞circRNA MNCR实验检测
本实施例以C57小鼠为实验对象，按照如下方法注射circRNA MNCR药物组合物及MNCR-con药物组合物为阴性对照组，并以假手术处理小鼠为对照组，以C57小鼠为野生型。小鼠称重并麻醉，仰卧位固定，剪毛并用碘酒消毒手术区；颈部正中切开气管并插管，连动物呼吸机进行正压通气，在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉,开胸,小心提起心包并剪开，充分暴露心脏；将200μL药物组合物悬液经26号导管从心尖进入动脉根部，注射时同时夹闭主动脉及肺动脉，持续夹闭20秒；监测5min，待心脏恢复窦律后，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔；等小鼠清醒后，脱离呼吸机，放回笼中，心电图监测整个手术过程；注射3天后进行心脏缺血再灌注手术，具体操作如下：小鼠麻醉后，背位固定于实验用木板上，并进行心电图监测，颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管；在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2mm处进针，进针深度0.5mm；以6/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定10min后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)，以ST段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5h以上作为结扎成功的标志，缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注；以ST段下降为标志，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔，再灌注24h用伊文氏蓝双染测定心肌梗死面积。图5a为假手术对照组以及经心肌缺血再灌注损伤后不同时间(0h,12h，24h)下心肌细胞中circRNA MNCR的表达水平，可以得出经心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞中circRNAMNCR的表达水平随时间逐渐降低；图5b从左到右依次为假手术实验组、心肌缺血再灌注处理实验组、转染MNCR-con药物组合物后心肌缺血再灌注实验组和转染circRNA MNCR药物组合物后心肌缺血再灌注实验组中心肌细胞的circRNA MNCR表达水平,结果显示：在心肌细胞中过表达circRNA MNCR后缺血再灌损伤模型中circRNA MNCR的表达量回升,进而说明我们的方法能够有效在心肌中过表达circRNA MNCR，过表达circRNA MNCR对心肌细胞具有保护作用。
实施例6：心肌细胞过表达circRNA MNCR抑制心肌缺血损伤实验验证
本实施例方法同实施例5，小鼠经冠状动脉注射circRNA MNCR药物组合物可显著抑制心肌缺血再灌注损伤。图6不同实验组(从左到右依次为假手术实验组、心肌缺血再灌注处理实验组、转染MNCR-con药物组合物后心肌缺血再灌注实验组和转染circRNA MNCR药物组合物后心肌缺血再灌注实验组)中球蛋白染色阳性的细胞百分比(6a)和心肌梗死面积(6b),对比可以发现缺血再灌损伤模型中过表达circRNA MNCR可以使肌球蛋白染色阳性的细胞数目降低,可以使心肌梗死面积降低，进而说明过表达circRNA MNCR对心肌细胞具有保护作用。其中，INF/LV表示梗死区面积/左心室面积，本实施例涉及的心梗面积按如下方法计算：左心室面积(left ventricle，LV)为蓝色、红色和白色面积之和；梗死区面积(infarct area，INF)为白色面积，心梗面积(INF/LV，％)＝(梗死区面积/左心室面积)×100％。
序列表
SEQ ID NO:1：
GGAGAAAGGA TCCTGGGCTA TGCTGAGGAG CCCTGCTATC TCTGGTTTGT CATGGAGTAC 60
TGTGAAGGTG GAGACCTCAA TCAGTATGTC CTGTCCCGGA GACCTGACCC AGCCACCAAC 120
AAAAGTTTCA TGCTACAGCT TACAAGCGCC ATTGCCTTCC TGCATAAAAA CCACATCGTG 180
CACAGGGACC TAAAGCCAGA CAACATCCTG ATCACAGAGC GGTCTGGCAC CCCCATCCTC 240
AAGGTGGCAG ACTTTGGACT GAGCAAGGTC TGTGCAGGGC TGGCACCCCG AGGCAAAGAG 300
GGCAATCAAG ATAACAAAAA TGTGAATGTG AATAAATACT GGCTGTCCTC AGCTTGTGGC 360
TCAGACTTCT ACATGGCTCC CGAAGTCTGG GAGGGACACT ATACAGCCAA GGCGGACATC 420
TTTGCTCTGG GCATTATCAT CTGGGCAATG ATAGAAAGAA TTACCTTTAT TGACTCTGAA 480
ACCAAGAAGG AGCTCCTGGG GACCTACATT AAGCAAGGGA CTGAGATCGT CCCTGTTGGT 540
GAGGCGCTGC TAGAAAACCC AAAGATGGAG TTGCATATCC CCCAGAAACG TAGGACTTCC 600
ATGTCTGAGG GGGTCAAGCA GCTCTTGAAA GACATGTTAG CTGCTAACCC ACAGGACCGA 660
CCTGATGCTT TTGAACTTGA AACCCGAATG GACCAGGTCA CATGTGCTGC TTAAACTCCA 720
GGGCTGAACG TCTTGGGTGT TTTTAAACTA G 751

Claims (7)

1.一种circRNA MNCR核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如下所示，
GGAGAAAGGATCCTGGGCTATGCTGAGGAGCCCTGCTATCTCTGGTTTGTCATGGAGTACTGTGAAGGTGGAGACCTCAATCAGTATGTCCTGTCCCGGAGACCTGACCCAGCCACCAACAAAAGTTTCATGCTACAGCTTACAAGCGCCATTGCCTTCCTGCATAAAAACCACATCGTGCACAGGGACCTAAAGCCAGACAACATCCTGATCACAGAGCGGTCTGGCACCCCCATCCTCAAGGTGGCAGACTTTGGACTGAGCAAGGTCTGTGCAGGGCTGGCACCCCGAGGCAAAGAGGGCAATCAAGATAACAAAAATGTGAATGTGAATAAATACTGGCTGTCCTCAGCTTGTGGCTCAGACTTCTACATGGCTCCCGAAGTCTGGGAGGGACACTATACAGCCAAGGCGGACATCTTTGCTCTGGGCATTATCATCTGGGCAATGATAGAAAGAATTACCTTTATTGACTCTGAAACCAAGAAGGAGCTCCTGGGGACCTACATTAAGCAAGGGACTGAGATCGTCCCTGTTGGTGAGGCGCTGCTAGAAAACCCAAAGATGGAGTTGCATATCCCCCAGAAACGTAGGACTTCCATGTCTGAGGGGGTCAAGCAGCTCTTGAAAGACATGTTAGCTGCTAACCCACAGGACCGACCTGATGCTTTTGAACTTGAAACCCGAATGGACCAGGTCACATGTGCTGCTTAAACTCCAGGGCTGAACGTCTTGGGTGTTTTTAAACTAG，即SEQ ID NO:1。
2.一种含有权利要求1所述的circRNA MNCR药物组合物，其特征在于，包括circRNAMNCR核苷酸、辅料、病毒载体或包埋载体，包埋载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体，所述病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种，所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的含有circRNA MNCR药物组合物，其特征在于，包埋载体为脂质体，所述病毒载体为腺病毒载体，所述辅料为磷酸盐缓冲液，circRNA MNCR病毒载体的感染滴度为1016PFU，circRNA MNCR核苷酸与脂质体质量比为1：1.25；病毒载体或包埋载体与辅料质量比例为1：200。
4.根据权利要求3所述的含有circRNA MNCR药物组合物，其特征在于，circRNA MNCR腺病毒载体的根据如下方法构建，其重组病毒的制备以小鼠基因组为模板，PCR扩增得到circRNA MNCR序列，亚克隆连入Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统，根据文献所述方法，构建circRNA MNCR过表达病毒；所述PCR的引物序列为：上游引物：5'-GGATCCTGGGCTATGCTGAGGAGCCC-3'，下游引物：5'-CTAGTTTAAAAACACCCAAGACGTTC-3'。
5.根据权利要求4所述的含有circRNA MNCR药物组合物，其特征在于，含有circRNAMNCR的药物组合物剂型为口服制剂、注射制剂、片剂、干粉剂型中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的含有circRNA MNCR药物组合物，其特征在于，含有circRNAMNCR的药物组合物剂型为注射用水针剂。
7.权利要求2-6任一项所述的含有circRNA MNCR药物组合物用于预防和治疗心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病和心衰。
CN201610657972.7A 2016-08-12 2016-08-12 circRNA MNCR在调节心肌细胞坏死和心肌缺血损伤中的作用 Active CN106222173B (zh)

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