CN108096269A

CN108096269A - LncRNA的应用及应用其的药物

Info

Publication number: CN108096269A
Application number: CN201810013104.4A
Authority: CN
Inventors: 王昆; 李培峰; 周露玙
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2018-06-01

Abstract

本发明提供了一种LncRNA的应用及应用其的药物，涉及医药生物技术领域，本发明提供的LncRNA具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，通过实验发现在发生细胞死亡的心肌细胞和心脏组织中表达显著下调，对心肌梗死和心肌纤维化具有保护作用。因此，通过过表达LncRNA能够起到预防和/或治疗心脏疾病的目的。本发明还提供了一种包括上述LncRNA的药物，该药物通过过表达LncRNA，能够起到预防和/或治疗心脏疾病的作用。同时，该药物治疗效果明显，应用范围广，使用环境友好。

Description

LncRNA的应用及应用其的药物

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，尤其是涉及一种LncRNA的应用及应用其的药物。

背景技术

心血管疾病是全球人类死亡的头号原因，每年死于心血管疾病的死亡人数比任何其他原因死亡的人数还多。2015年大约有1770万人死于心血管疾病，占全球死亡人数的31％。在2015年，非传染性疾病共导致1700万人过早死亡(70岁以下)，其中37％由心血管疾病引起。随着人类生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据近期公布的最新统计结果表明，18岁及以上居民高血压患病率为18.8％，估计全国患病人数1.6亿多，由此造成的心肌肥大、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，需要进行早期发现和管理，急需开发新的药物用于心脏病的诊断和防治。

细胞自噬是细胞内自然存在的一种破坏性的机制，可以分解细胞内不必要或功能失调蛋白组件。自噬使细胞组分有序降解和再循环，在自噬过程中，细胞形成自噬体。自噬体最终与溶酶体融合，内容物被降解回收。自噬形式主要包括三种：巨自噬，微自噬和分子伴侣介导的自噬。在疾病中，一方面自噬被认为是对压力的适应性反应，能够促进存活，而另一方面，它也参与细胞死亡。在自噬性细胞死亡过程中，细胞质出现大规模空泡化。在动物发育过程，以及组织病变，或是用化学治疗剂或其它有毒化合物处理的哺乳动物细胞时，均出现自噬性细胞死亡。许多研究已经显示在某些实验条件下，细胞发生自噬依赖性细胞死亡。在心肌细胞中，也有研究发现存在自噬性细胞死亡。

长链非编码RNA(long non-codingRNAs，LncRNA)为长于200个核苷酸的，通常不翻译成蛋白质的转录本。近年来越来越多的证据表明，LncRNA在组织稳态和病理生理状态的调节中起重要作用。除了小的非编码RNAs(如microRNAs)外，LncRNAs也会干扰不同阶段的基因表达和信号通路。在急性心肌梗塞和心力衰竭过程中，LncRNA，如Novlnc6、Mhrt，参与调控信号通路。同时也有一些LncRNA参与调控心肌细胞的肥大，线粒体功能和细胞凋亡。此外在内皮表达的LncRNA(例如，MALAT1和Tie-1-AS)可以调节血管生长和功能。通过对心脏中LncRNA的表达研究，可以加深对心脏疾病的分子机制的了解，并为开发以LncRNA为策略的心脏疾病的诊断和治疗药物提供依据，有及其重要的意义和应用前景。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供LncRNA在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用，以缓解现有技术中存在的缺乏对心肌细胞肥大能够产生调控作用的LncRNA的技术问题。

本发明的第二个目的在于提供一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，包含上述的LncRNA，以缓解现有技术中存在的心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果的技术问题。

本发明提供了LncRNA在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用，所述LncRNA含有SEQ ID NO.1所示的序列。

进一步地，所述心脏疾病包括肥厚型心肌病、心肌纤维化、冠心病、心肌梗死或心力衰竭。

进一步地，所述产品为药物。

另外，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，所述药物包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA。

进一步地，所述药物包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组质粒和/或重组病毒，优选为具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒。

进一步地，所述具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒的制备方法包括：

将具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的序列连入腺病毒载体系统，构建得到所述具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒。

进一步地，以小鼠基因组为模板，PCR扩增得到所述具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的序列。

进一步地，所述PCR的扩增引物为具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的下游引物。

进一步地，所述药物还包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。

进一步地，所述药物中具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒的病毒滴度为10^14-18PFU。

本发明提供的LncRNA具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，通过实验发现在发生细胞死亡的心肌细胞和心脏组织中表达显著下调，对心肌梗死和心肌纤维化具有保护作用，在细胞水平通过感染LncRNA发现，它能够抑制刺激因子所诱导的心肌细胞死亡；在动物水平通过注射外源LncRNA腺病毒能够改善缺血再灌注I/R模型的心脏功能。因此，通过过表达LncRNA能够起到预防和/或治疗心脏疾病的目的。本发明还提供了一种包括上述LncRNA的药物，该药物通过过表达LncRNA，能够起到预防和/或治疗心脏疾病的作用。同时，该药物治疗效果明显，应用范围广，使用环境友好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为本发明实施例2提供的经过氧化氢诱导的心肌细胞死亡过程中LncRNA表达水平的变化的结果图；

图1B为本发明实施例3提供的诱导大鼠I/R模型中不同时间点LncRNA表达水平的变化的结果图；

图2A为本发明实施例4提供的转染LncRNA腺病毒的原代心肌细胞在经过过氧化氢处理后检测LC3自噬小泡的免疫荧光图；

图2B为本发明实施例4提供的转染LncRNA腺病毒的原代心肌细胞在经过过氧化氢处理后，检测出现LC3自噬小泡荧光信号的细胞数量统计图；

图3A为本发明实施例5提供的小鼠静脉注射LncRNA腺病毒后缺血再灌注损伤病理模型的损伤指标检测结果中心肌细胞死亡率的结果图；

图3B为本发明实施例5提供的小鼠静脉注射LncRNA腺病毒后缺血再灌注损伤病理模型的损伤指标检测结果中心肌梗死面积的结果图；

图4A为本发明实施例5提供的小鼠静脉注射LncRNA腺病毒后缺血再灌注损伤病理模型的损伤指标检测结果中左室舒张期内径变化的结果图；

图4B为本发明实施例5提供的小鼠静脉注射LncRNA腺病毒后缺血再灌注损伤病理模型的损伤指标检测结果中射血分数变化的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了LncRNA在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用，其中，LncRNA的序列如下(SEQ ID NO.1)：

5’-TCGTGAATTTTGTCAGTTTTGTGATATCCTGTTTCGCCTTCACTCCTGCAAATGTGTTATCTGGAATACAAGAAATTATATTTACCATTTTAAAGGTCTCCCAGAATTGAGTGTGCAGTAGCAGAAACTGCCCATCCCACTATAACGTAAAAAAGTGTTCTTACAGGTAATTTACATCCTAATAAAGGGGACGTACACAACCCGAACTGACTCTAAAGCATTTAGTATGGTGAGAGTATTGGGACGCTTGTGCAAACTTAAACACAGAGAGTGAAACCAAACATTAAAGAAGAGTATCCATCTACCCAACTCAGACCTGCGTGAACTATCCACTGGTAAAGTGGGAACTGTTTAAATGGGGAAGACAGGAGAGATCGAAACGTATGCAAATCAATGCAAAAATAGATCTTAGCTCAGTTGTGACTTGGTGCCTCTTAAATGAATGGAAGAGTTGAAAAACTGCCTCTTCACCTGAAGAAATTAGCTATTTTATCAGCAATACTGCTTTGGAAAGTTTTGTGTATACTGTTTTATAACAAAGCCAGGGGCCTTCTGCAAGTTCCGGCTGTTTTTCAGTTTATTTCCTGACCAGTTAAACTTACCT-3’。

本发明提供的LncRNA通过实验发现在发生细胞死亡的心肌细胞和心脏组织中表达显著下调，对心肌梗死和心肌纤维化具有保护作用，在细胞水平通过感染LncRNA发现，它能够抑制刺激因子所诱导的心肌细胞死亡；在动物水平通过注射外源LncRNA腺病毒能够改善缺血再灌注I/R模型的心脏功能。因此，通过过表达LncRNA能够起到预防和/或治疗心脏疾病的目的。

其中，本发明中涉及的LncRNA可以为：与SEQ ID NO.1所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.1所示序列的序列，或者SEQ ID NO.1所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.1所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.1所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.1所示序列完全相同的序列。

在一个优选的实施方式中，心脏疾病包括肥厚型心肌病、心肌纤维化、冠心病、心肌梗死或心力衰竭。

在一个优选的实施方式中，产品为药物。

另外，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，包括具有如SEQID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA。

本发明提供的药物通过过表达LncRNA，能够起到预防和/或治疗心脏疾病的作用。同时，该药物治疗效果明显，应用范围广，使用环境友好。

在一个优选的实施方式中，药物包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组质粒和/或重组病毒，优选为具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒。

在一个优选的实施方式中，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒的制备方法包括：

将具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的序列连入腺病毒载体系统，构建得到具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒。

其中，腺病毒载体系统使用Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV系统。

在一个优选的实施方式中，以小鼠基因组为模板，PCR扩增得到所述具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的序列。

在一个优选的实施方式中，PCR的扩增引物如下表所示：

在一个优选的实施方式中，药物还包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。

优选地，水溶性填充剂包括甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种。

优选地，pH调节剂为酸、碱或盐；其中，酸选自枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸或盐酸中的一种或多种；碱选自氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化铵中的一种或多种；盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵盐中的一种或多种。

优选地，稳定剂为EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000和十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷中的一种或多种；渗透压调节剂为氯化钠或氯化钾。

优选地，本发明提供的药物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针剂、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

在一个优选的实施方式中，药物中具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒的病毒滴度为10^14-18PFU，例如可以为，但不限于10¹⁴PFU、10¹⁵PFU、10¹⁶PFU、10¹⁷PFU或10¹⁸PFU，优选为10¹⁶PFU。

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作出进一步阐述。

实施例1

LncRNA过表达腺病毒载体及阴性对照腺病毒构建，本实施例以小鼠基因组为模板，PCR扩增得到LncRNA序列，亚克隆连入Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV系统，构建LncRNA过表达腺病毒。其中，LncRNA序列如下列SEQ ID NO.1所示：

所述PCR的引物序列为：

上游引物：5'-TCGTGAATTTTGTCAGTTTTGTGATATCC-3'(SEQ ID NO.2)，

下游引物：5'-AGGTAAGTTTAACTGGTCAGGAAATAAAC-3'(SEQ ID NO.3)。

按照公司说明书步骤，将PacⅠ线性化的该载体与线性化的腺病毒骨架(Adenovirus LacZ Backbone)共转染HEK-293细胞，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度；将空载体和腺病毒骨架按照上述步骤共转染HEK-293细胞，包装阴性对照腺病毒。

将上述所得的过表达LncRNA的重组体腺病毒磷酸盐缓冲液稀释为感染滴度1×10¹⁶PFU/mL，按1mL量无菌分装，即得LncRNA过表达腺病毒。

实施例2

在过氧化氢刺激下LncRNA表达水平变化的检测，采用已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞(大鼠乳鼠购自北京医科大学，大鼠品系为Wistar，大鼠乳鼠原代心肌细胞的制备可参见以下文献：W.-Q.Tan,etal,Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophythrough Transactivating Catalase J Biol Chem.2008October 31；283(44):29730-29739)，对心肌细胞用过氧化氢进行处理，在培养的不同时间，提取细胞的总RNA，实时荧光定量PCR技术检测LncRNA的表达水平。结果如图1A所示，图1A中纵坐标表示以未处理的大鼠原代心肌细胞中LncRNA的表达水平为基准，在过氧化氢处理过程中大鼠原代心肌细胞中LncRNA的表达水平。从结果图中可以看出LncRNA表达水平在过氧化氢处理6小时即有显著的下降。

实施例3

小鼠I/R模型中LncRNA表达水平的检测，本实施例对C57小鼠进行冠状动脉左前降支结扎后进行再灌注，诱导I/R模型。在如图1B所示的再灌注时间点检测LncRNA的表达水平，发现随着再灌注时间延长，LncRNA表达水平逐渐下降。

实施例4

LncRNA能够在细胞水平上抑制过氧化氢所诱导的心肌细胞死亡，本实施例对原代心肌细胞感染LncRNA腺病毒后，用过氧化氢对心肌细胞进行处理，处理之后，使用免疫荧光的方法对心肌细胞进行LC3自噬小泡的检测，如图2A和图2B所示，从图2A中可以看出，过表达LncRNA能够减少过氧化氢处理的心肌细胞内的自噬小泡荧光信号，从图2B中可以看出，过表达LncRNA能够减少过氧化氢处理后的发生自噬性死亡的心肌细胞数量，实验结果证明LncRNA能够有效的抑制过氧化氢所诱导的心肌细胞自噬。

实施例5

注射LncRNA腺病毒能改善I/R所导致的心肌损伤，本实施例对小鼠冠状动脉左前降支结扎后进行再灌注，诱导I/R模型。过表达LncRNA可以明显减弱I/R所导致的心肌损伤，包括降低心肌细胞死亡率(如图3A所示)及心肌梗死面积(如图3B所示)，并且左室舒张期内径减少(如图4A所示)，射血分数提高(如图4B所示)，以上指标均说明心功能得到改善。此外向小鼠注射LncRNA的阴性对照β-gal并不能改善I/R导致的心肌损伤。实验结果证实，LncRNA能够在整体水平改善I/R诱导的心肌梗死。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> LncRNA的应用及应用其的药物

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 604

<212> DNA

<213> 智人种（Homo sapiens）

<400> 1

tcgtgaattt tgtcagtttt gtgatatcct gtttcgcctt cactcctgca aatgtgttat 60

ctggaataca agaaattata tttaccattt taaaggtctc ccagaattga gtgtgcagta 120

gcagaaactg cccatcccac tataacgtaa aaaagtgttc ttacaggtaa tttacatcct 180

aataaagggg acgtacacaa cccgaactga ctctaaagca tttagtatgg tgagagtatt 240

gggacgcttg tgcaaactta aacacagaga gtgaaaccaa acattaaaga agagtatcca 300

tctacccaac tcagacctgc gtgaactatc cactggtaaa gtgggaactg tttaaatggg 360

gaagacagga gagatcgaaa cgtatgcaaa tcaatgcaaa aatagatctt agctcagttg 420

tgacttggtg cctcttaaat gaatggaaga gttgaaaaac tgcctcttca cctgaagaaa 480

ttagctattt tatcagcaat actgctttgg aaagttttgt gtatactgtt ttataacaaa 540

gccaggggcc ttctgcaagt tccggctgtt tttcagttta tttcctgacc agttaaactt 600

acct 604

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgtgaattt tgtcagtttt gtgatatcc 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggtaagttt aactggtcag gaaataaac 29

Claims

1.LncRNA在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用，所述LncRNA含有SEQID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心脏疾病包括肥厚型心肌病、心肌纤维化、冠心病、心肌梗死或心力衰竭。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为药物。

4.一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，其特征在于，所述药物包括具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的LncRNA。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组质粒和/或重组病毒，优选为具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒的制备方法包括：

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，以小鼠基因组为模板，PCR扩增得到所述具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的序列。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述PCR的扩增引物为具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的下游引物。

9.根据权利要求4-8任一项所述的药物，其特征在于，所述药物还包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。

10.根据权利要求5-8任一项所述的药物，其特征在于，所述药物中具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的LncRNA的重组病毒的病毒滴度为10^14-18PFU。