CN116270708A - LncRNA DCRT的制药用途及其治疗心血管疾病的药物、筛选方法和制备方法 - Google Patents

LncRNA DCRT的制药用途及其治疗心血管疾病的药物、筛选方法和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明“LncRNA DCRT的制药用途及其治疗心血管疾病的药物、筛选方法和制备方法”属于生物医药领域。本发明提供SEQ ID NO.1的lncRNA DCRT的制药用途。本发明还进一步提供以lncRNA DCRT为靶点的治疗心血管疾病的新药。基于lncRNA DCRT，本发明还提供治疗扩张型心肌病药物的筛选方法和制备方法。本发明通过动物实验证实上调lncRNA DCRT具有改善胸主动脉缩窄术诱导的心脏扩张模型中心功能受损，心肌细胞心肌细胞面积病理性增加的作用。

Description

LncRNA DCRT的制药用途及其治疗心血管疾病的药物、筛选方 法和制备方法
技术领域
本发明属于心血管疾病的制药领域，具体涉及LncRNA DCRT的制药用途及其治疗心血管疾病的药物、筛选方法和制备方法。
背景技术
心力衰竭是各种心脏结构或功能性疾病导致心室充盈及(或)射血能力受损而引起的一组复杂综合征，在世界范围内显著增加住院和死亡的风险。尽管随着科学研究和治疗方法的进步，治疗心力衰竭仍然是一个难题。扩张型心肌病是心衰最常见的病因之一，它被定义为在无冠状动脉疾病或与左心室损害程度成比例的异常负荷条件下左心室收缩功能障碍和扩张。扩张型心肌病是不同的心血管疾病发展到终末阶段的临床综合征，其预后不良，死亡率高，是威胁人类健康和导致医疗负担增加的最主要病因之一，尽管最近治疗取得了进展，但大量扩张型心肌病患者仍会发生心律失常、心衰和心源性猝死。扩张型心肌病在导致心力衰竭的各种心血管疾病中排在第三位，而且是心脏移植手术的首要病因。
对于扩张型心肌病的发病机制，涉及基因的基因突变占病例的35％。内分泌异常，药物和毒药，以及感染因素都是获得性扩张型心肌病的原因。重要的是，线粒体功能异常在扩张型心肌病的发病过程中起着至关重要的作用。线粒体是真核细胞的“动力源”，是一种高度动态的细胞器，对需要高能量的细胞，如心肌细胞，尤为重要。线粒体每天提供大量的三磷酸腺苷，通过氧化磷酸化维持心脏功能。编码线粒体蛋白的基因突变往往导致氧化磷酸化异常，不仅导致ATP缺乏，还导致ROS产生增加，以及抗氧化防御系统的改变，最终可能促进扩张型心肌病的发展。因此，维持心肌细胞中线粒体功能正常可以作为治疗心力衰竭的新靶点。
长链非编码RNA是近年来新发现的一类核苷酸序列大于200nt，具有重要调控基因表达作用的非编码RNA。近期，越来越多的研究发现lncRNA在多种心血管疾病中发挥着重要作用，包括心肌代谢、心肌肥厚、心脏传导系统和心脏发育等等。阐明lncRNA功能的分子机制是该领域的一大挑战。近年来，越来越多的研究表明，lncRNA参与疾病过程中基因表达各种过程，包括转录调控、转录后调控和表观调控等等。LncRNA功能可以通过顺式(cis)作用，也可以通过反式(trans)作用去调节下游靶点基因的表达水平。不同亚细胞结构定位的lncRNA其作用机制是不同的。LncRNA的胞浆胞核的定位有助于我们确定lncRNA的作用方式。细胞核中定位的lncRNA可能通过多种机制影响基因的转录，包括表观修饰，与转录因子的相互作用，以及影响mRNA加工或输出。细胞质中分布的lncRNA的作用方式主要包括：影响mRNA的稳定性，影响翻译起始，充当竞争内源性RNA，或影响翻译后修饰等等。由于lncRNA在种属之间缺乏保守性，虽然很多研究报道了长链非编码RNA在小鼠模型中功能与作用机制，但人们对它们在人类心脏中的作用知之甚少。
目前尚未发现lncRNA DCRT与心血管疾病之间关联的报道。
发明内容
本发明人根据本领域客观存在的问题和不足，偶然发现了lncRNA DCRT与扩张型心肌病发生机制之间的关系，并进一步进行分子实验，开发出一种以lncRNA DCRT为药物靶点的抗扩张型心肌病药物，同时进行动物实验验证其效果，发现以lncRNA DCRT为药物作用靶点、且上调表达DCRT的分子能显著改善扩张型心肌病时的心功能受损和心肌细胞面积病理性增加。
本发明的技术方案如下：
序列如SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT的制药用途。
所述lncRNA DCRT的反向互补序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述药指治疗心血管疾病的药。
所述心血管疾病为扩张型心肌病。
一种治疗心血管疾病的药物，其特征在于，其药效活性成分以序列如SEQ IDNO.1所示的lncRNA DCRT为药物靶点。
所述药效活性成分包括：调控lncRNA DCRT表达的物质。
所述调控指正调控；
优选地，所述调控lncRNA DCRT表达的物质选自：由上调表达或过表达lncRNADCRT的引物、上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体、上调表达或过表达lncRNADCRT的转化体组成的组；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物包括：正引物：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′，
反引物：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体指连接了上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物的扩增产物的表达载体；
优选地，所述表达载体选自：pAAV载体；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体为转化有上述重组表达载体的宿主；
优选地，所述宿主选自重组腺相关病毒或细胞；
优选地，所述药物还包括：药用辅料；
优选地，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
一种治疗心血管疾病的药物的制备方法，其特征在于，将上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质作为所述药物的药效活性成分；lncRNA DCRT的序列如SEQ ID NO.1。
将上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质和药用辅料混合制成所述药物；
优选地，所述上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质选自：由上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物、上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体、上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体组成的组；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物包括：正引物：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′，
反引物：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体指连接了上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物的扩增产物的表达载体；
优选地，所述表达载体选自：pAAV载体；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体为转化有上述重组表达载体的宿主；
优选地，所述宿主选自重组腺相关病毒或细胞；
优选地，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
一种治疗心血管疾病的药物的筛选方法，包括：筛选以lncRNA DCRT作为作用靶点的候选物质；lncRNA DCRT的序列如SEQ ID NO.1。
所述的一种治疗心血管疾病的药物的筛选方法还包括：从候选物质中进一步筛选调控lncRNA DCRT表达的物质作为药物的药效活性成分；
优选地，所述调控指正调控；
优选地，调控lncRNA DCRT表达的物质选自：上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质选自：由上调表达或过表达lncRNADCRT的引物、上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体、上调表达或过表达lncRNADCRT的转化体组成的组；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物包括：正引物：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′，
反引物：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体指连接了上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物的扩增产物的表达载体；
优选地，所述表达载体选自：pAAV载体；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体为转化有上述重组表达载体的宿主；
优选地，所述宿主选自重组腺相关病毒或细胞；
优选地，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
本发明提供用于治疗扩张型心肌病的药物，所述药物的药效成分以lncRNA DCRT为药物靶点，且通过上调表达所述lncRNA DCRT起到所述治疗扩张型心肌病的药效。
本发明的进一步设置为：所述药效成分包括包含上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质，所述lncRNA DCRT的序列如SEQ ID NO.1所示。
通过采用上述技术方案，药物的药效成分包含上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质，从而起到增加lncRNA DCRT表达水平，进一步治疗的作用。
本发明的进一步设置为：还包括药学上可接受的辅料。
通过采用上述技术方案，本领域技术人员可根据客观需求，将本发明的抗扩张型心肌病药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料，制成各类剂型，便于销售或推广。
本发明的进一步设置为：还包括用于缓冲、和/或合成、和/或纯化所述lncRNADCRT的试剂。
本发明的还提供一种用于治疗扩张型心肌病的药物，药物药效成分对下调表达lncRNA DCRT的序列的物质，具有降解或抑制作用。
本发明还提供一种抗扩张型心肌病药物的筛选方法，检测待选物质是否能上调表达lncRNA DCRT。
本发明还提供一种可上调表达lncRNA DCRT的物质在制备抗扩张型心肌病药物方面的用途。
本发明还提供一种lncRNA DCRT的全长序列片段在制备治疗扩张型心肌病药物方面的用途，lncRNA DCRT的全长序列片段如SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一方面提供了可上调表达所述lncRNA DCRT的物质在制备抗扩张型心肌病药物方面的用途。任何规模的出于商业目的将上述各物质装入标有抗扩张型心肌病用途的商品包装内的行为均落入本发明请求保护的范围。
本发明的有益效果是：
本发明原创性地发现了扩张型心肌病患者心脏组织中高度保守的lncRNA DCRT，lncRNA DCRT主要定位于心肌细胞胞核中，而且在扩张型心肌病患者的心肌细胞中显著降低。之后，通过动物实验证实上调lncRNA DCRT具有改善胸主动脉缩窄术诱导的心脏扩张模型中心功能受损，心肌细胞面积病理性增加的作用。
为了实现扩张型心肌病的治疗目的，本发明将lncRNA DCRT用于动物实验，在动物实验中证实了用lncRNA DCRT的合成物可明显改善胸主动脉缩窄诱导的心功能受损和心肌细胞收缩力障碍，达到辅助治疗扩张型心肌病的目的。因此，本发明基于上述发现和结果，提供一种以lncRNA DCRT为治疗靶点的用于临床扩张型心肌病治疗的药物。
本发明基于lncRNA DCRT的碱基序列，设计了表达lncRNA DCRT的序列并进行合成。用lncRNA DCRT合成物可明显改善胸主动脉缩窄诱导的心功能受损，心肌细胞收缩力障碍和钙离子失稳态。从而显示lncRNA DCRT具有潜在改善扩张型心肌病的作用。
本发明通过实验发现，扩张型心肌病患者心脏组织的lncRNA DCRT表达降低(图1A)，而且lncRNA DCRT主要在扩张型心肌病患者的心肌细胞中显著降低。体内实验发现，通过增加lncRNA DCRT全长的合成物可明显改善胸主动脉缩窄诱导的心功能受损和心肌细胞面积病理性增加，达到辅助治疗扩张型心肌病的目的。
附图说明
图1A是本发明的实验例1中扩张型心肌病病人和对照人群心脏组织中lncRNADCRT的总表达量，发现lncRNA DCRT在患者样本中含量下降；其中纵坐标“Relative DCRTLevel”指lncRNA DCRT的相对表达量，横坐标的Normal指对照人群，DCM指扩张型心肌病病人。
图1B从上至下3行照片系本发明的实验例1中人群心脏组织中lncRNA DCRT分别在心肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞中的表达情况。其中，cTNT是心肌细胞的特异性标志物，指心肌细胞染色；Col1a1是成纤维细胞的特异性标志物，指成纤维细胞染色；CD31是成内皮细胞的特异性标志物，指内皮细胞染色；DAPI指细胞核DAPI染色结果图；Merge指同一行的前面3张图的合并图。
cTNT、Col1a1、CD31的表达检测方法，DAPI染色操作可参照“LncRNA ZNF593-ASAlleviates Contractile Dysfunction in Dilated Cardiomyopathy”一文记载的方法和步骤。
图2是本发明的实验例2中检测lncRNA DCRT对扩张型心肌病的治疗作用；其中，图2A的左图的纵坐标指射血分数，右图的纵坐标指缩短分数，左右两图的横坐标的GFP指仅过表达绿色荧光蛋白的阴性对照小鼠，mDCRT指过表达lncRNA DCRT的小鼠；Sham指假手术组小鼠，TAC指主动脉弓缩窄(TAC)疾病模型小鼠；
过表达GFP的操作、Sham小鼠的构建方法、主动脉弓缩窄(TAC)疾病模型小鼠的构建方法可参照“LncRNA ZNF593-AS Alleviates Contractile Dysfunction in DilatedCardiomyopathy”一文记载的方法和步骤。
图2B的左图的纵坐标指左室压力最大上升速率(dp/dtmax)，右图的纵坐标指左心室舒张期压力下降最大变化速率(dp/dtmin)，左右两图的横坐标的GFP指仅过表达绿色荧光蛋白的阴性对照小鼠，mDCRT指过表达lncRNA DCRT的小鼠；Sham指假手术组小鼠，TAC指主动脉弓缩窄(TAC)疾病模型小鼠；
图2C是本发明实验例2在小鼠心脏中高表达lncRNA DCRT后小鼠心肌细胞面积的检测结果图；其中，左图为WGA染色结果图，右图为心肌细胞面积的柱形图；左图的mDCRT指过表达lncRNA DCRT的小鼠；Sham指假手术组小鼠，TAC指主动脉弓缩窄(TAC)疾病模型小鼠；右图的纵坐标指心肌细胞面积，横坐标的GFP指仅过表达绿色荧光蛋白的阴性对照小鼠，mDCRT指过表达lncRNA DCRT的小鼠。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
仪器设备
Figure BDA0004076292590000071
ND-1000核酸分析仪
ABI 9700PCR仪
ABI 7900HT荧光实时定量PCR仪
Beckman X-15R低温高速离心机
试剂与耗材
TRIZOL购自Invitrogen公司；
逆转录试剂盒购自Thermofisher公司；
SYBR Green购自Thermofisher公司；
EasyPure Plasmid MiniPrep Kit质粒提取试剂盒购自北京全式金公司。
生物材料的来源
扩张型心肌病患者外周血来自2012-2018年武汉同济医院住院患者，均签署了知情同意书；
C57BL/6来自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
第1组实施例、本发明lncRNA DCRT的制药用途
本组实施例提供序列如SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT的制药用途。
在一些实施例中，所述lncRNA DCRT的反向互补序列如SEQ ID NO.2。
在具体的实施例中，所述药指治疗心血管疾病的药。
在更具体的实施例中，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
本发明首次揭示SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT的制药用途，本领域技术人员可根据本发明披露的内容获得教导与启发，将SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT用于制药。任何药用目的或商业目的地合成、扩增、制备、生产、使用、表达、分泌、富集、扩繁、销售、许诺销售、进口、出口SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT的行为均落入本发明的保护范围。
所述药不仅限于治疗心血管疾病。本领域技术人员可根据本发明披露的内容获得教导与启发，将SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT制药后治疗心血管疾病以外的其他疾病。任何将SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT用作药物靶点用于治疗任何疾病的行为均落入本发明的保护范围。
第2组实施例、本发明治疗心血管疾病的药物
本组实施例提供一种治疗心血管疾病的药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述药物的药效活性成分以序列如SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT为药物靶点。
在具体的实施例中，所述的一种治疗心血管疾病的药物包括：药效活性成分，其特征在于，所述药效活性成分包括：调控lncRNA DCRT表达的物质。
在一些实施例中，所述调控指正调控；
优选地，所述调控lncRNA DCRT表达的物质选自：由上调表达或过表达lncRNADCRT的引物、上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体、上调表达或过表达lncRNADCRT的转化体组成的组；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物包括：
正引物：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′，
反引物：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体指连接了上述引物的扩增产物的表达载体；
在具体的实施例中，所述表达载体选自：pAAV载体；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体为转化有上述重组表达载体的宿主；
在具体的实施例中，所述宿主选自重组腺相关病毒或细胞；
优选地，所述药物还包括：药用辅料；
优选地，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
本组更具体的实施例提供了一种用于治疗扩张型心肌病的药物，在该组实施例中，都具有如下特征：所述治疗扩张型心肌病的药物的药效成分以lncRNA DCRT为药物靶点，且通过上调表达所述lncRNA DCRT起到所述治疗扩张型心肌病的药效。本发明通过实验发现lncRNA DCRT的序列高度保守，扩张型心肌病患者lncRNA DCRT含量明显低于对照组，主要心肌细胞中的lncRNA DCRT明显下降。之后，通过动物实验证实上调lncRNA DCRT具有改善胸主动脉缩窄术诱导的心脏扩张模型中心功能受损，心肌细胞收缩力降低的作用，达到辅助治疗扩张型心肌病的目的。
在进一步的实施例中，所述药物的药效成分包括上调表达所述lncRNA DCRT的物质；或者药物的药效成分，对下调表达所述lncRNA DCRT的物质，起到降解或抑制作用lncRNA DCRT做为动物体内外源获得的一段RNA，可以通过分子生物学手段使其表达上调其水平进而起到治疗作用，也可采用其它手段，例如某些化学分子，抑制其降解，也可同样达到上调其水平的目的。
在优选的实施例中，所述药物的药效成分包含lncRNA DCRT的序列全长片段，从而起到增加其表达水平，进一步治疗的作用。
在另一些实施例中，所述药物还包括药学上可接受的辅料，和/或，用于缓冲、合成、和/或纯化所述lncRNA DCRT序列片段的试剂。本领域技术人员可根据客观需求，将本发明的抗扩张型心肌病药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料，制成各类剂型，便于销售或推广。
在具体的实施例中，所药物学上可接受的辅料或药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
本领域技术人员可根据实际生产需要，结合药品领域生产工艺的常规技术手段或基本常识(例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，对药用辅料进行常规选择或调整，进而制成不同的剂型、不同存储条件、不同保质期的药物，这对于本领域技术人员而言无技术障碍，是可以并容易做到的。
本领域技术人员可对上述辅料进行选择和调配，并将本发明的lncRNA DCRT和/或调控lncRNA DCRT表达的物质制成不同的剂型，例如例如粉剂、片剂、口服液、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、凝胶剂、膏剂、汤剂、丸剂、喷剂、吸入剂、雾化剂、注射剂等。
第3组实施例、本发明药物的制备方法
本组实施例提供一种治疗心血管疾病的药物的制备方法，其特征在于，将上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质作为所述药物的药效活性成分；lncRNA DCRT的序列如SEQID NO.1。
在具体的实施例中，将上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质和药用辅料混合制成所述药物；
优选地，所述上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质选自：由上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物、上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体、上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体组成的组；
在优选的实施例中，上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物包括：
正引物：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′，
反引物：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体指连接了上述引物的扩增产物的表达载体；
在具体的实施例中，所述表达载体选自：pAAV载体；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体为转化有上述重组表达载体的宿主；
在具体的实施例中，所述宿主选自重组腺相关病毒或细胞；
优选地，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
本发明提供了可上调表达所述lncRNA DCRT的物质在制备抗扩张型心肌病药物方面的用途。任何规模的出于商业目的将上述各物质装入标有抗扩张型心肌病用途的商品包装内的行为均落入本发明请求保护的范围。
本发明提供一种抗扩张型心肌病药物的制备方法，包括：将可上调表达所述lncRNA DCRT的物质作为所述抗扩张型心肌病药物的活性成分。
本组实施例的具体实验操作步骤如下述的实验例2所示。
第4组实施例、本发明药物的筛选方法
本组实施例提供一种治疗心血管疾病的药物的筛选方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述筛选方法包括：筛选以lncRNA DCRT作为作用靶点的候选物质；lncRNA DCRT的序列如SEQ ID NO.1。
在进一步的实施例中，所述的一种治疗心血管疾病的药物的筛选方法，还包括：从候选物质中进一步筛选调控lncRNA DCRT表达的物质作为药物的药效活性成分；
优选地，所述调控指正调控；
优选地，调控lncRNA DCRT表达的物质选自：上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质选自：由上调表达或过表达lncRNADCRT的引物、上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体、上调表达或过表达lncRNADCRT的转化体组成的组；
在优选的实施例中，上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物包括：
正引物：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′，
反引物：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体指连接了上述引物的扩增产物的表达载体；
在具体的实施例中，所述表达载体选自：pAAV载体；
优选地，上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体为转化有上述重组表达载体的宿主；
在具体的实施例中，所述宿主选自重组腺相关病毒或细胞。
优选地，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
本组最具体的实施例提供一种抗扩张型心肌病药物的筛选方法，检测待选物质是否能上调表达lncRNA DCRT，并筛选出能对lncRNA DCRT的表达起促进作用的物质。
本组实施例的具体实验操作步骤可参看实验例2。
实验例1、扩张型心肌病患者心肌组织的lncRNA DCRT检测
收集14例扩张型心肌病患者和7例健康心脏移植供者心脏组织，保存于-80℃冰箱。取每50mg心脏中加入1ml TRIZOL(Invitrogen公司)，研磨，提取RNA。使用
Figure BDA0004076292590000122
ND-1000检测RNA质量。
结果显示：扩张型心肌病患者心脏组织中的lncRNA DCRT表达下降(图1A)；在心脏组织中lncRNA DCRT主要位于心肌细胞胞核中(图1B)。
实验例2、检测lncRNA DCRT对扩张型心肌病的治疗作用
1.过表达lncRNA DCRT转化体的包装与纯化
本实验例需包装携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的病毒rAAV-GFP(阴性对照)和携带lncRNA DCRT的病毒rAAV-DCRT(上调DCRT)2种病毒；lncRNADCRT的反向互补序列如SEQ ID NO.2所示，在寡核苷酸单链分别添加了Hind III和Not I粘端末端后交上海生工生物工程技术服务有限公司合成。退火形成双链，体系如下：
Figure BDA0004076292590000121
Figure BDA0004076292590000131
将体系混匀离心后，在PCR仪上进行退火反应，程序为：95℃2分钟，每90秒下降1℃，降至25℃，4℃备用。
A.pAAV载体酶切
Figure BDA0004076292590000132
将体系混匀离心后，在37℃反应2个小时。
B.割胶回收纯化
把酶切产物加入1％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外下切下含目的片段的凝胶块，使用凝胶回收试剂盒纯化核酸片段，步骤如下：
a)凝胶块称重，根据凝胶块重量加入适当体积的GSB溶液，55℃水浴10分钟，期间上下颠倒混合液体3次，直至凝胶完全溶解；
b)液体冷却至室温后加入离心柱中，静置1分钟，以10000g离心1分钟，弃收集管中的液体；
c)650ul WB溶液，以10000g离心1分钟，弃收集管中的液体；
d)以10000g离心2分钟，把离心柱放入一个新的EP管中，开盖静置10分钟；
e)在离心柱中央加入50ul 65℃预热的EB，静置1分钟，以10000g离心1分钟，洗脱液为纯化后的核酸溶液。
C.目的片段与载体连接
Figure BDA0004076292590000133
Figure BDA0004076292590000141
将体系(10ul)混匀离心后16℃连接过夜。
D.感受态转化
T1感受态细菌从-80℃冰箱中拿出，置于冰上化冻30分钟，将上述连接产物加入感受态中，冰上静置30分钟，42℃水浴锅中热激45s，冰浴5分钟，加入200ul不含抗生素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH 7.4)，置于37℃摇床上以100转/分震摇1小时。将菌液涂在含100ug/ml氨苄青霉素的固体LB(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L)培养平皿上，放入37℃培养箱中培养过夜。挑选长出的单克隆菌落至含氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增，将菌液送武汉天一辉远生物科技有限公司测序，将测序正确的菌株扩增及保种。
质粒提取
将构建好的pAAV-DCRT菌液、pAAV-GFP菌液、pXX9菌液和phelper菌液在含100ug/ml氨苄青霉素的TB培养基(胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，K2HPO4·3H2O 16.43g/L，KH2PO4 2.31g/L，0.4％甘油)中扩增14-16小时，使用天根生化科技有限公司的无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，具体步骤如下：
a)菌液以8000g室温离心3分钟收集细菌，去除上清，加入新的菌液，通过反复离心将菌体收集在离心管底，把上清吸除干净；
b)加入适量P1溶液(先加入RNase A)，使用吸管和振荡器完全重悬细菌沉淀；
c)加入适量P2溶液，立即上下颠倒7次，室温静置5分钟；
d)加入适量P4溶液，立即上下颠倒几次至溶液内出现絮状沉淀，室温静置10分钟，以8228g室温离心15分钟，上清用过滤器CS1过滤至干净的离心管中；
e)按1:0.3体积比加入异丙醇，混匀后转移10ml至吸附柱CP6(先用平衡液BL处理)中，以8228g室温离心2分钟，弃收集管中的废液，将剩余溶液重复过柱；
f)加入PW漂洗液(先加入乙醇)10ml，以8228g室温离心2分钟，弃收集管中的废液；
g)重复步骤f；
h)加入3ml无水乙醇，以8228g室温离心2分钟，弃收集管中的废液；
i)以8228g室温离心5分钟，把吸附柱放置在一个干净的收集管中，开盖静置15分钟；
j)向吸附柱中加入1ml洗脱缓冲液TB，室温静置5分钟，以8228g室温离心2分钟，再次以0.5ml TB洗脱吸附柱，洗脱液转移至EP管中，使用NanoDrop2000检测质粒的浓度和纯度。
E.病毒包装
本实验采用三质粒钙磷共转染法在HEK 293T细胞中包装病毒。HEK 293T传代至直径为15cm的细胞培养皿中，待细胞长至85％左右更换完全培养基，按以下顺序依次加入各试剂配制质粒转染液(每个培养皿)
Figure BDA0004076292590000151
*HEBS溶液(NaCl 280mM,HEPES 50mM,Na2HPO4 1.5mM,KCl 10mM,D-葡萄糖12mM,pH 6.80-7.05)
将上述质粒转染液滴入HEK 293T细胞皿中，培养12h后更换含5％胎牛血清的高糖DMEM培养基，继续培养48-60h收取细胞，置于-80℃冰箱保存。
F.病毒纯化
将细胞在-80℃与37℃之间的反复冻融，以8000g离心15分钟，上清转移至干净的圆底离心管中，剩余步骤如下：
a)加入10％液体体积的氯仿，横置于37℃摇床上以200转/分震摇1小时；
b)加入NaCl至终浓度为1mol/L，溶解混匀，以12000g在4℃离心15分钟；
c)将上清转移至干净的圆底离心管中，每100ml液体加入10g PEG8000，剧烈震摇溶解混匀，冰浴1小时；
d)以11000g在4℃离心15分钟，弃上清，用预冷的PBS(2×)溶液吹打溶解沉淀，分装液体至1.5ml EP管中；
e)加入1ug/ml的DNaseI和RnaseA，室温静置1小时；
f)加入等体积的氯仿，震荡混匀后以12000g在4℃离心5分钟，吸取上清转移到干净的EP管中即为纯化后的病毒液。
G.测定病毒滴度
a)取40ul病毒液于干净的EP管中，加入5ul蛋白酶K(20mg/ml)，混匀后置于55℃水浴1小时；
b)加入150ul超纯水和200ul酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，震荡混匀后以12000g在4℃离心10分钟；
c)取上清到干净的EP管中，加入等体积氯仿，震荡混匀后以12000g在4℃离心5分钟，上清即为病毒核酸；
d)实时定量PCR(CMV正反引物)法检测病毒核酸的片段含量即可计算出病毒滴度，引物序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。
3.采用Thermofisher公司SYBR Green对lncRNA DCRT的表达进行real-time PCR检测：
逆转录：
逆转录引物(RT Primer Mix)配置：
Oligo RT Primer 1μl
Random RT Primer 1μl
RNase free H2O 78μl
逆转录反应体系：
RNA template 2μg
RT Primer Mix 4μl
RNase free H2O up to 19μl
以上体系混匀后，瞬时离心，70℃孵育10min后，冰育2min，再加入以下试剂：
2×TS reaction buffer 25μl
TS enzyme 2.5μl
RNase free H2O 3.5μl
逆转录反应程序：
42℃ 60min，70℃ 10min；停止后4℃备用，产物保存于-20℃。
real-time PCR：
反应体系：2×SYBR Green Mix 9μl
RT product 2μl
lncRNA DCRT Forward Primer 2μl
lncRNA DCRT Reverse Primer 2μl
RNase-free H2O 5μl
反应程序：
95℃ 30sec--(95℃ 10sec--60℃ 20sec--70℃ 1sec)×40cycles--MeltingCurve
引物序列：
DCRT Forward Primer：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′(SEQ ID NO.3)
DCRT Reverse Primer：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′(SEQ IDNO.4)。
2.lncRNA DCRT对胸主动脉缩窄术诱导心脏扩张小鼠心功能的保护作用：
在小鼠心脏中高表达lncRNA DCRT后，用超声和心导管检测心脏功能，结果显示：lncRNA DCRT的全长具有改善胸主动脉缩窄术诱导的心脏扩张模型中心功能受损的作用(图2A和B)。图2A显示，用小鼠超声检测发现，lncRNA DCRT的全长具有改善胸主动脉缩窄术诱导的心脏扩张模型中射血分数下降的作用；图2B显示，是用心导管检测发现，lncRNADCRT的全长具有改善胸主动脉缩窄术诱导的心脏扩张模型中心功能受损的作用。
3.lncRNA DCRT对胸主动脉缩窄术诱导心脏扩张小鼠心肌细胞病理性增加的保护作用：
在小鼠心脏中高表达lncRNA DCRT后，检测小鼠心肌细胞面积，结果显示：lncRNADCRT的全长具有改善胸主动脉缩窄术诱导的心肌细胞面积病理性增加的作用。(图2C)。

Claims (10)

1.序列如SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT的制药用途。
2.根据权利要求1所述的序列如SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT的制药用途，其特征在于，所述lncRNA DCRT的反向互补序列如SEQ ID NO.2所示；
和/或，所述药指治疗心血管疾病的药。
3.根据权利要求2所述的序列如SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT的制药用途，其特征在于，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
4.一种治疗心血管疾病的药物，其特征在于，其药效活性成分以序列如SEQ ID NO.1所示的lncRNA DCRT为药物靶点。
5.根据权利要求4所述的一种治疗心血管疾病的药物，包括：药效活性成分，其特征在于，所述药效活性成分包括：调控lncRNA DCRT表达的物质。
6.根据权利要求5所述的一种治疗心血管疾病的药物，其特征在于，所述调控指正调控；
和/或，所述调控lncRNA DCRT表达的物质选自：由上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物、上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体、上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体组成的组；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物包括：
正引物：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′，
反引物：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体指连接了上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物的扩增产物的表达载体；
和/或，所述表达载体选自：pAAV载体；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体为转化有上述重组表达载体的宿主；
和/或，所述宿主选自重组腺相关病毒或细胞；
和/或，所述药物还包括：药用辅料；
和/或，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
7.一种治疗心血管疾病的药物的制备方法，其特征在于，将上调表达或过表达lncRNADCRT的物质作为所述药物的药效活性成分；lncRNA DCRT的序列如SEQ ID NO.1。
8.根据权利要求7所述的一种治疗心血管疾病的药物的制备方法，其特征在于，将上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质和药用辅料混合制成所述药物；
和/或，所述上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质选自：由上调表达或过表达lncRNADCRT的引物、上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体、上调表达或过表达lncRNADCRT的转化体组成的组；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物包括：正引物：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′，
反引物：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体指连接了上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物的扩增产物的表达载体；
和/或，所述表达载体选自：pAAV载体；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体为转化有上述重组表达载体的宿主；
和/或，所述宿主选自重组腺相关病毒或细胞；
和/或，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
9.一种治疗心血管疾病的药物的筛选方法，其特征在于，包括：筛选以lncRNA DCRT作为作用靶点的候选物质；lncRNA DCRT的序列如SEQ IDNO.1。
10.根据权利要求9所述的一种治疗心血管疾病的药物的筛选方法，其特征在于，还包括：从候选物质中进一步筛选调控lncRNA DCRT表达的物质作为药物的药效活性成分；
和/或，所述调控指正调控；
和/或，调控lncRNA DCRT表达的物质选自：上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的物质选自：由上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物、上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体、上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体组成的组；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物包括：正引物：5′-AGATCCTCTGCTGATGTCACTTG-3′，
反引物：5′-AAAATGTTCCGCCCCTCC-3′；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的重组表达载体指连接了上调表达或过表达lncRNA DCRT的引物的扩增产物的表达载体；
和/或，所述表达载体选自：pAAV载体；
和/或，上调表达或过表达lncRNA DCRT的转化体为转化有上述重组表达载体的宿主；
和/或，所述宿主选自重组腺相关病毒或细胞；
和/或，所述心血管疾病为扩张型心肌病。
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