CN115976019A - 铁死亡相关的circRNA及其应用和药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种铁死亡相关的circRNA及其应用和药物,涉及生物技术制药的技术领域。该铁死亡相关的circRNA核苷酸序列如Seq_1所示,是一种能够调控心肌细胞铁死亡的心脏特异性表达的circRNA,其与心肌细胞铁死亡过程相关,过表达该circRNA能够抑制心肌细胞铁死亡,缓解了现有技术中缺少环状核酸在心肌细胞铁死亡中发挥作用的相关技术的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术制药技术领域,尤其是涉及一种铁死亡相关的circRNA及其应用和药物。
背景技术
在世界范围内心血管疾病是威胁人类健康的头号杀手。心血管疾病每年导致4100万人死亡。最常见的心脏疾病是冠心病由冠状动脉粥样硬化导致。在2009年,冠心病占据心脏疾病的64%。心肌肥大极大增加了心梗风险并且最终导致心梗。世界卫生组织《2014年全球非传染性疾病状况》报告称,心血管疾病的死亡率应降低25%。根据国家卫生部近期公布的最新统计结果表明,我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8%,估计全国患病人数1.6亿多,由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等相关心脏疾病的病人达几千万。到目前,关于心脏疾病的发病以及进展机制尚不完全清楚,心脏病的预防、诊断和治疗以及预后都难以达到令人满意的效果,亟待开发新的技术和方法用于心脏疾病的预防、诊断和治疗。
随着现代基因测序手段的发展,发现了一种新的内源性环状核酸。研究发现环状核酸对于维持心脏正常生理功能具有非常重要的意义。环状核酸的异常表达与多种心脏病的发生相关。许多研究表明环状核酸对于维持心脏正常生理功能具有重要作用,异常表达的环状核酸通常与多种心脏疾病的发生相关。因此,将环状核酸作为心脏疾病治疗靶点,开发相关药物应用于临床治疗具有非常广阔的前景。环形核酸通过多种机制发挥调节功能,主要包括海绵化miRNA、结合蛋白质、参与蛋白质接头的形成以及翻译成多肽。由于环状核酸广泛的调节作用,以及在病理情况下表达情况的不同,因此可以通过检测环状核酸作为诊断疾病的依据。也可以设计针对环状核酸的药物进而应用于临床治疗。
铁死亡是一种新型程序性细胞死亡方式,主要表现为铁超载和氧化还原状态失衡。铁死亡目前被发现与多种疾病的发生发展相关,包括神经退行性疾病、肿瘤、色素沉着病等等。并且研究发现在心梗小鼠血清中非血红素铁含量增加、细胞氧化还原状态失衡,这些都暗示心梗过程中有铁死亡发生。在心肌损伤或者心脏病理状态下,心肌细胞发生铁死亡。但受限于终末分化的心肌细胞缺乏再生能力,心肌细胞的死亡是诱发心脏病的重要机理。目前还未有研究揭示环状核酸在心肌细胞铁死亡中发挥作用,寻找心脏中特异性表达的、参与心肌细胞铁死亡的环状核酸,并阐明其作用机制,将在诊断和治疗方面具有极其中重要的意义和广阔的前景。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提一种铁死亡相关的circRNA,该circRNA与心肌细胞铁死亡相关,缓解了现有技术中缺少环状核酸在心肌细胞铁死亡中发挥作用的相关技术的问题。
本发明的第二目的在于提一种上述铁死亡相关的circRNA或其相关的生物材料的应用。
本发明的第三目的在于提一种用于预防或治疗心脏相关疾病的药物,可以对包括心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化等疾病起到治疗或预防作用。
为解决上述技术问题,本发明特采用如下技术方案:
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种铁死亡相关的circRNA,其核苷酸序列如Seq_1所示。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了上述circRNA在作为标志物中的应用,所述标志物为心肌细胞铁死亡的标志物,或心肌损伤的标志物。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了一种生物材料,该生物材料包括核酸、载体或宿主细胞;
所述核酸含有编码上述铁死亡相关的circRNA的片段;
所述载体包括所述核酸;
所述宿主细胞被所述载体转化;
优选地,所述载体包括腺病毒载体。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了上述circRNA,或上述生物材料在制备用于预防或治疗心脏相关疾病的药物中的应用。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了一种用于预防或治疗心脏相关疾病的药物,该药物包含上述circRNA,或上述生物材料;以及,药学上任选的辅料。
优选地,所述药物包含上述腺病毒载体,和辅料;
优选地,所述腺病毒载体的感染滴度为1016PFU;
优选地,所述药物中还包含递送制剂,所述药物中的核酸成分和所述递送制剂组成脂质体或脂质纳米颗粒;所述核酸成分包括上述circRNA,或上述核酸或载体;
优选地,所述递送制剂包括胆固醇和PEG-脂质;或,所述递送制剂包括PEG脂质、结构脂质、可电离脂质和辅助脂质;
优选地,所述药物中所述核酸成分的含量为0.8~1.5μg;
优选地,所述药物中所述核酸成分和递送制剂的比为1:2.5。
优选地,所述辅料包括缓冲液、生理盐水和保护剂中的一种或多种;
优选地,所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液;
优选地,所述磷酸盐缓冲液的pH为6.0~8.0;
优选地,所述保护剂选自甘露醇和蔗糖中的至少一种;
优选地,所述药物中的脂质体或脂质纳米颗粒与辅料的质量比为1:200。
优选地,所述心脏相关疾病包括心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化;
优选地,药物的剂型包括口服制剂和注射制剂;
优选地,所述口服制剂包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、吸入剂、口服溶液剂或口服混悬剂;
优选地,所述注射制剂包括干粉剂,优选为冻干粉剂。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的铁死亡相关的circRNA核苷酸序列如Seq_1所示,本发明提供的circRNA是一种能够调控心肌细胞铁死亡的心脏特异性表达的circRNA,命名为FEACR。本发明通过实验发现,FEACR与心肌细胞铁死亡过程相关,FEACR在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞铁死亡过程中表达显著下调,通过转染和注射FEACR能够增加FEACR的表达水平,抑制心肌细胞铁死亡、心肌缺血损伤和心肌梗死面积减少,因此FEACR具有抑制心肌细胞铁死亡的功能,过表达FEACR能够减轻心肌梗死过程中心肌细胞铁死亡的问题,最终减轻心梗对心脏造成的伤害。
基于上述序列如Seq_1所示的铁死亡相关的FEACR的生物学功能,本发明还提供了和其相关的生物材料,以及包含上述FEACR或和其相关的生物材料在制备药物中的应用,以及,还提供了一种用于预防或治疗心脏相关疾病的药物。上述各技术方案全部是基于序列如Seq_1所示的铁死亡相关的circRNA的发明构思,因此得到的和其相关的生物材料或药物均具有铁死亡相关的circRNA的生物学功能,并且将其制备成为药物用于心脏相关疾病的防治和治疗,与现有技术相比,其选用的原料科学合理,制备工艺简单,药物作用明显,使用范围广,使用安全可靠,应用环境友好。上述药物适应的心脏相关疾病可涉及心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注损伤、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化等心脏相关疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为脂质纳米的结构示意图;
图2A为实施例1中原代心肌细胞的存活率;
图2B为实施例1中原代心肌细胞内MDA含量;
图3A为实施例2中心肌细胞缺氧复氧处理的心肌细胞铁死亡过程中FEACR表达水平的变化图;
图3B为实施例2中心肌缺血再灌注损伤的心肌细胞铁死亡过程中FEACR表达水平的变化图;
图4A为实施例3中心肌细胞的存活率;
图4B为实施例3细胞内MDA含量;
图5A为实施4中心肌缺血损伤面积的结果示意图;
图5B为实施4中心脏功能结果统计图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种circRNA,其名称为novel_circRNA_0008180,简称为FEACR,是一种铁死亡相关的环状核酸(ferroptosis-associatedcircRNA),其核苷酸序列如Seq_1所示。
本发明提供的FEACR是一种能够调控心肌细胞铁死亡的心脏特异性表达的FEACR。本发明通过实验发现,经缺氧复氧处理的原代心肌细胞,相比于对照组FEACR表达量减少;结扎小鼠冠状动脉45分钟建立缺血模型,解除结扎再灌注3小时后FEACR表达量显著下调,说明FEACR在心肌细胞铁死亡过程中发挥作用。
并且,使原代心肌细胞过表达FEACR,再经缺氧复氧处理,发现FEACR能减少缺氧复氧导致的MDA含量的增加,降低缺氧复氧诱导的细胞死亡。在小鼠模型中过表达FEACR,发现具有保护心脏的功能。
综上,本发明发现FEACR与心肌细胞铁死亡过程相关,FEACR在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞铁死亡过程中表达显著下调,通过转染和注射FEACR能够增加FEACR的表达水平,抑制心肌细胞铁死亡、心肌缺血损伤,以及减少心肌梗死面积,因此FEACR具有抑制心肌细胞铁死亡的功能,过表达FEACR能够减轻心肌梗死过程中心肌细胞铁死亡的问题,最终减轻心梗对心脏造成的伤害。
基于上述发现,机体中FEACR的表达量与心肌细胞铁死亡过程相关,因此本发明还提供了上述铁死亡相关的FEACR在作为心肌细胞铁死亡的标志物或作为心肌损伤的标志物中的应用,通过机体中FEACR的表达量来反映机体的心肌细胞铁死亡或心肌损伤程度。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了一种生物材料,所述生物材料包括核酸、载体或宿主细胞。
核酸:所述核酸含有编码本发明提供的FEACR的片段。所述的“核酸”指的是含有编码FEACR的片段的任何长度的核苷酸的聚合物形式,核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。所述核酸的实例例如可以为但不限于为表达盒,表达盒中除去编码FEACR的片段外,还可以含有本领域任何可接受的功能片段,例如可以为但不限于为标记基因,例如抗性基因或编码荧光标记的基因片段;启动子、终止子、非编码区或增强子等;编码FEACR的DNA,除去编码FEACR的片段外,DNA两端还可以含有酶切位点和/或保护碱基部分。
载体:包括如上所述的核酸,所述载体还可以包括编码其他组成元件的部分,例如可以为但不限于为编码调控序列或标记基因等。载体例如可以为但不限于为病毒载体、原核载体、真核载体或昆虫载体;所述载体用于复制编码FEACR的核酸,或在宿主中表达FEACR。
宿主细胞:所述宿主细胞转化有上述载体,以使上述载体实现克隆编码FEACR的核酸,或表达FEACR。
在一些优选的实施方式中,所述生物材料为表达FEACR的腺病毒表达载体,本发明实验发现,使用腺病毒表达载体过表达FEACR,能够实现FEACR在宿主中的有效过表达,保护宿主细胞,例如原代心肌细胞,由缺氧复氧造成的损伤;在小鼠体内使用腺病毒载体过表达FEACR,发现能够有效实现FEACR对心脏的保护功能,减少心脏缺血再灌注造成的损伤。
基于上述FEACR与心肌细胞铁死亡过程相关和过表达FEACR能够抑制心肌细胞铁死亡的功能,本发明还提供了上述FEACR或上述生物材料在制备预防或治疗心脏相关疾病的药物中的应用,心脏相关疾病的实例包括但不限于心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化。
上述的应用的实例例如可以为但不限于为:FEACR作为预防或治疗心脏相关疾病的药物的主要或辅助活性成分;上述生物材料作为预防或治疗心脏相关疾病的药物中的主要或辅助活性成分的原料或前体,例如转化有克隆载体的宿主细胞作为FEACR或其前体的制备原料,用于实现克隆编码FEACR的核酸的增殖;或,能够表达FEACR的载体作为预防或治疗心脏相关疾病的药物中提供FEACR的前体物质,以实现在目标机体中过表达FEACR,例如上述腺病毒载体。
基于上述发明构思,本发明还提供了一种用于预防或治疗心脏相关疾病的药物,所述药物包含上述FEACR,FEACR直接作为所述用于心脏相关疾病的药物的主要或辅助活性物质;或包含上述生物材料中的核酸或载体,上述核酸或载体为用于心脏相关疾病的药物中FEACR的来源物质。
本发明提供的用于预防或治疗心脏相关疾病的药物中,心脏相关疾病包括心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化。所述药物中除去直接或间接的提供FEACR物质外,还包括药学上任选的辅料。其中“任选的”指的是所述药物中可以包括也可以不包括辅料,并且,只要是本领域可接受的用于药物制备的辅料,本领域技术人员可以根据本领域众所周知,且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明和标准文件等中记载的方法来进行,本发明对此不做限制。
辅料的实例例如可以为但不限于为溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、抗结块剂、矫味剂、抑菌剂、助悬剂、包衣剂、成膜剂、芳香剂、增黏剂、抗黏着剂、抗氧剂、抗氧增效剂、螯合剂、pH调节剂、吸附剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保护剂、保湿剂、柔软剂、吸收剂、稀释剂、释放调节剂、压敏胶黏剂、硬化剂、空心胶囊、基质和药物载体材料中的一种或多种。
本领域技术人员可以根据目标剂型选择合适的辅料,本发明提供的用于预防或治疗心脏相关疾病的药物的剂型包括但不限于口服制剂和注射制剂;口服制剂的实例例如可以为但不限于为胶囊剂、片剂、颗粒剂、吸入剂、口服溶液剂或口服混悬剂。所述注射制剂包括干粉剂,优选为冻干粉剂。
在一些可选地实施方式中,所述用于预防或治疗心脏相关疾病的药物以上述腺病毒载体作为药物中的活性成分,经实验证实,腺病毒载体能够实现在宿主中过表达FEACR,从而实现FEACR的抑制心肌细胞铁死亡、心肌缺血损伤和心肌梗死面积减少的功能。在该实施方式中,所述药物中腺病毒载体的感染滴度优选为1016PFU。
在另一个可选地实施方式中,所述用于预防或治疗心脏相关疾病的药物中的核酸成分由递送制剂递送。所述药物中的核酸成分包括FEACR,或上述生物材料中的核酸或载体。所述核酸成分可选地和所述递送制剂组成脂质体或脂质纳米颗粒。所述递送制剂可选择为本领域可接受的用于制备脂质体或脂质纳米颗粒的脂质成分或辅助成分,本发明不做限制;所述脂质体或所述脂质纳米颗粒的制备方法可以根据本领域众所周知,且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明和标准文件等中记载的方法来进行,本发明对此不做限制。
在该实施方式中,一个可选地实施例为:所述递送制剂包括胆固醇和PEG-脂质,该递送制剂与核酸成分构成脂质体或脂质纳米颗粒。以上述成分作为递送制剂,优选按照如下方法制备递送系统:将胆固醇和PEG-脂质在无水乙醇中真空旋转蒸发形成均匀脂质膜,再加入核酸成分震荡、水化、超声,制备得到递送系统。
在该实施方式中,另一个可选地实施例为:所述递送制剂包括PEG脂质、结构脂质、可电离脂质和辅助脂质,该递送制剂与核酸成分构成脂质纳米颗粒。以上述成分作为递送制剂,优选按照如下方法制备递送系统:在pH5.0的醋酸缓冲液中,以2.5:1的比例(递送制剂:核酸成分)将结构脂质、可电离脂质、辅助脂质和PEG脂质与核酸成分混合;使用pH为7.5的Tris-Cl中和,加入蔗糖作为低温保护剂,最终溶液无菌过滤。将组成的递送系统分装,冷冻保存在-70℃,直至进一步使用。该实施方式中制备得到的脂质纳米颗粒的结构示意图如图1所示。其中,结构脂质优选棕榈酸甘油酯;可电离脂质优选SM102;辅助脂质优选DSPC。
在所述药物以脂质体或脂质纳米颗粒作为药物的活性成分的实施方式中,药物中的核酸成分优选含量为0.8~1.5μg,例如可以为但不限于为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5μg。所述药物中核酸和递送制剂的比优选为1:2.5。
在上述以腺病毒载体作为药物的活性成分,或者含有递送制剂的实施方式中,药物的辅料优选包括缓冲液、生理盐水和保护剂中的一种或多种;其中缓冲液包括磷酸盐缓冲液,更优选为pH为6.0~8.0的磷酸盐缓冲液。缓冲液和生理盐水可以分别独立的作为所述药物中活性成分的溶剂,以实现将所述药物作为注射剂型。保护剂选自甘露醇和/或蔗糖,可作为冻干保护剂,以实现将所述药物作为冻干粉剂。在含有递送制剂的实施方式中,所述药物中的脂质体或脂质纳米颗粒与辅料的质量比为1:200。
下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。
以下各实施例中涉及的材料、实验方法和操作工艺,包括原代心肌细胞培养,细胞转染,心脏缺血再灌手术步骤,Evans blue/TTC双染和PI染色以及Evans blue荧光染色检1751096440测均参见以下文献:
[1]Lu-Yu Zhou,et al.The circular RNA ACR attenuates myocardialischemia/reperfusion injury by suppressing autophagy via modulation of thePink1/FAM65B pathway[J].Cell Death Differ.2019,26(7):1299-1315.
[2]Grace J Lee,et al.Mst1 inhibition rescuesβ1-adrenergiccardiomyopathy by reducing myocyte necrosis and non-myocyte apoptosis ratherthan myocyte apoptosis[J].Basic Res Cardiol.2015,110(2):7.
[3]Minghui Gao,et al.Glutaminolysis and Transferrin RegulateFerroptosis[J].Mol Cell.2015,59(2):298-308.
其中所用的试验动物为小鼠,其小鼠品种为C57/BL6,购自济南鹏越生物公司;所用的试剂均为分析纯级试剂,且从市售渠道获得。
下述实施例中使用的过表达FEACR重组腺病毒按照如下方法制备得到:
(1)引物设计:打开Editseq软件输入环状核FEACR序列,搜索穿梭载体HBAD-Adeasy环状核酸环化载体系统上存在的多克隆位点和环状核酸FEACR的均存在的单一酶切位点,序列正反向序列5’端分别引入限制性内切酶KpnI和XhoI的黏性末端。
FEACR-KpnI-F:
CGGGGTACCCATGGCAGGCATTCCAGTAAAG(Seq_2);
FEACR-XhoI-R:
CCGCTCGAGCTGAGTAATGGGCTGATAGCAA(Seq_3);
(2)目的片段FEACR扩增:
表1
95℃ | 5min |
95℃ | 30s |
55℃ | 30s |
72℃ | 30s |
72℃ | 1min |
4℃ | ∞ |
将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中以120V,30min电泳,选取510bp大小的片段回收,获得单一PCR产物。
(3)限制性内切酶酶切载体和目的片段
表2
10×NEB buffer | 4μL |
KpnI | 1μL |
XhoI | 1μL |
FEACR PCR产物 | 30μL |
<![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> | 4μL |
表3
10×NEB buffer | 2μL |
KpnI | 1μL |
XhoI | 1μL |
载体 | 2μg |
<![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> | 补至20μL |
将酶切产物在1%琼脂糖凝胶中以120V,30min电泳,选取510bp左右做产物回收作为目的片段FEACR酶切产物;选取5Kbp大小做产物回收作为载体酶切产物。
(4)连接
表4
10×T4 DNA ligase buffer | 1μL |
FEACR酶切产物 | 6μL |
载体酶切产物 | 2μL |
T4 DNA ligase | 1μg |
(5)DH5α转化连接产物,涂布到含氨苄抗性的平板,挑单克隆,扩大培养,提质粒测序。
(6)取5μg质粒在含有骨架载体的重组感受态细胞pAD-easy转化,涂布在卡那抗性平板过夜后挑克隆。
(7)酚氯仿法抽提重组质粒DNA。
(8)PacI酶切6μg重组质粒DNA使其线性化,并以酚氯仿法抽提线性化质粒DNA。
(9)以对数生长期的293细胞用钙转法,转染线性化重组质粒DNA,重组腺病毒在7天后收获,液氮反复冻融裂解293细胞,50μLPBS重悬细胞沉淀即为P1代病毒。
(10)利用P1重新感染293细胞扩增腺病毒2代至P3代。
(11)将CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。后续病毒可用于体外和体内实验。
实施例1
心肌细胞缺氧复氧诱导铁死亡过程中细胞的细胞存活率。
本实施例采用心肌细胞铁死亡实验模型,用常规的方法培养小鼠乳鼠原代心肌细胞,实验组预处理Fer-1,对照组预处理DMSO,Control组不做处理。低氧培养箱(氧浓度低于1%)培养18小时,复氧6小时,CCK-8检测细胞存活率。预处理铁死亡抑制剂Fer-1后,缺氧不同时间点后,原代心肌细胞的存活率如图2A所示,CCK-8检测发现Fer-1能显著降低缺氧复氧导致的细胞死亡。预处理铁死亡抑制剂Fer-1后,原代心肌细胞内MDA含量如图2B所示,Fer-1能减少缺氧复氧导致的脂质过氧化产物MDA的增加。
实施例2
心肌细胞缺氧复氧处理及心肌缺血再灌注损伤后降低FEACR的表达。
本实施例采用原代培养的心肌细胞为模型,在缺氧18小时,复氧6小时后,利用实时荧光定量PCR技术检测原代心肌细胞FEACR的表达变化情况。心肌细胞缺氧复氧处理的心肌细胞铁死亡过程中FEACR表达水平的变化如图3A所示,在缺氧复氧之后,FEACR表达量减少相比较与对照组。结扎小鼠冠状动脉45分钟建立缺血模型,随后解除结扎再灌注3小时后,提取心脏缺血区心肌组织,提取总RNA,通过实时荧光定量PCR技术检测FEACR的表达水平,心肌缺血再灌注损伤的心肌细胞铁死亡过程中FEACR表达水平的变化如图3B所示;在缺血45分钟后,心肌缺血组织相比较于假手术组,FEACR表达量显著下调。其中以假手术组作为缺血再灌注对照组,进而证明FEACR在心肌细胞铁死亡过程中发挥作用。
实施例3
表达FEACR抑制缺氧复氧诱导原代心肌细胞铁死亡。
本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型,对原代心肌细胞转染过表达FEACR的腺病毒载体,转染时间为36小时,随后低氧培养箱缺氧18小时,复氧6小时,诱导心肌细胞铁死亡。随后用CCK-8检测细胞死亡情况和检测细胞MDA水平。过表达FEACR后,进行缺氧复氧处理后,心肌细胞的存活率如图4A所示,在转染FEACR后,CCK-8检测细胞存活率发现FEACR能降低缺氧复氧诱导的细胞死亡。过表达FEACR后,进行缺氧复氧处理后,细胞内MDA含量如图4B所示,转染FEACR后,相较于对照组,FEACR能减少缺氧复氧导致的MDA含量的增加。
实施例4
小鼠体内过表达FEACR,抑制缺血再灌注导致的心肌缺血损伤以及保护心脏功能。
本实施例以C57/BL6小鼠为实验对象,每组8只小鼠,将测得的结果用GraphpadPrism统计软件进行统计学分析,按照如下方法在行手术前4天分别注射150μL滴度为1×1010Pfu过表达FEACR重组腺病毒和过表达对照腺病毒。4天后麻醉小鼠,仰卧位固定,剪毛并用碘酒消毒手术区。颈部正中切开气管并插管,连动物呼吸机进行正压通气,在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm,逐层钝性分离皮下组织、肌肉,在小鼠第三肋和第四肋之间开胸,钝性分离心包膜,充分暴露心脏。在肺动脉圆锥和左心耳之间,以左冠状静脉主干为标志,于左心耳根部下方2mm处进针,进针深度0.5mm;以6-0带针缝合线穿过心肌表层,在肺动脉圆椎旁出针;清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。再灌3小时后,利用Evans blue/TTC双染色,检测心梗面积,心肌缺血损伤面积的结果示意图如图5A所示。在手术前分别注射150μL滴度为1×1010Pfu过表达FEACR重组腺病毒和过表达对照腺病毒,3日以后行缺血再灌注手术后用小动物超声成像检测心脏功能,发现过表达FEACR能保护心脏功能,心脏功能结果统计图如图5B所示。
实施例5
本实施例提供了一种含有环状核酸FEACR的脂质纳米颗粒,按照如下方法制备:称取0.5mg胆固醇和2mgPEG-脂质溶解于1mL无水乙醇中,充分混匀后转移至旋转蒸发瓶,室温50kpa真空旋转蒸发30分钟,形成均匀脂质膜。加入2mL含有0.5μg/μL FEACR环状核酸,剧烈震荡使脂质膜脱落,随后80kpa真空50℃水化30分钟。随后将产物超声,分别依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤。将制备的脂质纳米颗粒转移到棕色瓶,充入氮气,4℃避光保存。
测定按照上述方法制备得到的纳米颗粒的包封率:
RiboGreen是一种用于定量检测溶液中RNA含量的超敏核酸荧光染料,检测下限低至1ng/mL。用Ribogreen法测量游离在纳米颗粒之外的环状核酸FEACR的含量(Wf),取等量脂质纳米颗粒加入0.5%Triton破坏其结构,使得包裹的环状核酸FEACR释放,用Ribogreen法检测溶液中FEACR的含量(Wt)。
包封率=(Wt-Wf)/Wt×100%,测得包封率在82.81±0.59。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.铁死亡相关的circRNA,其特征在于,核苷酸序列如Seq_1所示。
2.权利要求1所述的circRNA在作为标志物中的应用,所述标志物为心肌细胞铁死亡的标志物,或心肌损伤的标志物。
3.生物材料,其特征在于,包括核酸、载体或宿主细胞;
所述核酸含有编码权利要1所述的铁死亡相关的circRNA的片段;
所述载体包括所述核酸;
所述宿主细胞被所述载体转化。
4.根据权利要求3所述的生物材料,其特征在于,所述载体包括腺病毒载体。
5.权利要求1所述的circRNA,或权利要求3或4所述的生物材料在制备用于预防或治疗心脏相关疾病的药物中的应用。
6.用于预防或治疗心脏相关疾病的药物,其特征在于,包含权利要求1所述的circRNA,或权利要求3或4所述的生物材料;以及,药学上任选的辅料。
7.根据权利要求6所述的药物,其特征在于,包含权利要求4中所述的腺病毒载体,和辅料;
优选地,所述腺病毒载体的感染滴度为1016PFU。
8.根据权利要求6所述的药物,其特征在于,所述药物中还包含递送制剂,所述药物中的核酸成分和所述递送制剂组成脂质体或脂质纳米颗粒;所述核酸成分包括权利要求1所述的circRNA,或权利要求3或4中所述的核酸或载体;
优选地,所述递送制剂包括胆固醇和PEG-脂质;或,所述递送制剂包括PEG脂质、结构脂质、可电离脂质和辅助脂质;
优选地,所述药物中所述核酸成分的含量为0.8~1.5μg;
优选地,所述药物中所述核酸成分和递送制剂的比为1:2.5。
9.根据权利要求6-8任一项所述的药物,其特征在于,所述辅料包括缓冲液、生理盐水和保护剂中的一种或多种;
优选地,所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液;
优选地,所述磷酸盐缓冲液的pH为6.0~8.0;
优选地,所述保护剂选自甘露醇和蔗糖中的至少一种;
优选地,所述药物中的脂质体或脂质纳米颗粒与辅料的质量比为1:200。
10.根据权利要求6-8任一项所述的药物,其特征在于,所述心脏相关疾病包括心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化;
优选地,药物的剂型包括口服制剂和注射制剂;
优选地,所述口服制剂包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、吸入剂、口服溶液剂或口服混悬剂;
优选地,所述注射制剂包括干粉剂,优选为冻干粉剂。
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