CN110684805B - 神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用及制备方法，所述神经导向因子Sema的基因序列为SEQ ID NO:1所示序列的全部、与SEQ ID NO:1所示序列类似的序列或者SEQ ID NO:1所示序列的变体。本发明提供的方法制备的药物作用于人体后会以慢病毒为载体诱导机体自身目标组织高表达sema多肽，能长期使患者局部高表达sema 3a蛋白，作用持续且高效。

Description

神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎 药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(OA)是指以软骨丢失及伴有关节周围骨反应为特点的一种滑膜关节病，又称骨关节病、退行性骨关节病、肥大性或增生性关节炎等，是全球范围内最常见的风湿性疾病。骨关节炎是由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。骨关节炎是中老年人群中最常见的关节疾病，调查研究显示，60岁以上的人群中患病率可达50％，75岁以上人群中则达80％，该病致残率高达53％，调查显示，骨关节炎已成为老年人致残头号杀手。

骨关节炎病症大多起病隐袭，进展缓慢，受累关节可间断出现轻中度钝痛，且所述病症可因过度活动、气候变化等原因诱发或加重，严重者症状体征明显且持续不缓解，甚至出现关节畸形、功能障碍。

骨关节炎的治疗目的是减轻症状，延缓关节结构改变，维持关节功能，提高生活质量。2000年ACR制定的OA治疗指南以及欧洲风湿病学会联盟(EULAR)对膝OA治疗的建议基本都是三个方面，即非药物治疗、药物治疗、手术治疗。其中，在药物治疗中非甾体抗炎药(NSAIDs)是一类化学结构不同的具有抗炎、止痛、解热等功能的非类固醇药物，常用于骨关节炎的治疗。值得注意的是，一些试验观察到某些NSAIDs抑制软骨合成，加速软骨退化，此外，口服非甾体抗炎药经常会导致胃肠道问题(尤其是对于老年患者)，长期使用通常伴有肾脏、肝脏和其他功能异常。除了NSAIDs，类固醇类药物由于可迅速改善症状而经常应用于骨关节炎治疗，但频繁使用类固醇药物可能损害关节，所以应慎重考虑类固醇注射治疗。其次，使用透明质酸注射液关节腔内注射，即粘弹性补充疗法在治疗骨关节炎病症中越来越普遍，在中国销售的阿尔治关节腔内注射制剂含鸡冠花来源的透明质酸钠，平均分子量为800,000道尔顿。其虽然具有缓解疼痛、抗炎特性、改善关节活动度、暂无严重药物不良反应等效应，但却无法抑制骨关节炎进程且仅对早期骨关节炎有效。

Semaphorin蛋白家族是一类以半胱氨酸富集区域为特征的一组分泌型或膜相关的蛋白家族,最初作为影响神经发育的神经轴突导向因子而被发现，Semaphorin是一大类分泌型或跨膜型糖蛋白分子，参与机体多项重要生理过程的调节，包括调控神经系统的轴突发育、血管形成、骨分化、心血管发育等。根据其组成特点将其分为8型，其中有部分家族蛋白分子参与免疫功能的调节从而将其命名为Immune Semaphorin，如Semaphorin 4D(Sema4D，又名CD100)、Semaphorin 3A(Sema3A)、和Semaphorin 7A(Sema7A)等。其中，Sema3A最早被发现，也是最经典的Sema家族成员之一，可调控和引导神经轴突的生长。近年来研究发现Sema3A除发挥神经轴突导向作用外，还与细胞迁移、肿瘤生长、血管生成、骨代谢及免疫调节等多种机体的病理生理现象密切相关。

非专利文献“Semaphorin 3A在类风湿关节炎患者血清及外周血单个核细胞中的表达及意义”中提到Semaphorin3A(Sema3A)在类风湿关节炎(RA)患者外周血及血清中的表达水平，探讨Sema3A在RA发病机制中的作用。结果显示RA患者血清Sema3A水平显著高于健康人，且血清Sema3A水平与血小板计数、ESR、IgM、类风湿因子、HRF-IgG呈正相关。

非专利文献“骨改建中潜在的作用靶点-信号素Sema3A的研究进展”中研究证明Sema3A具有促进成骨细胞生成以及同时抑制破骨细胞生成的功能，且骨折愈合与神经纤维长入骨痂密切相关，神经生长导向因子Sema3A可通过调控感觉神经纤维长入调节骨量代谢。

专利文献“一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法”公开了一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法。所述发明构建了含有Sema3A基因序列的重组质粒，通过将Sema3A重组质粒和辅助包装质粒转染进入293T细胞获得Sema3A慢病毒载体，慢病毒载体在polybrene的协助下将Sema3A基因导入脂肪干细胞，显著地促进了脂肪干细胞的成骨分化，同时也抑制了脂肪干细胞向成脂方向的分化，导入Sema3A基因可以更好地将脂肪干细胞应用于促进骨缺损愈合和种植体骨结合。

虽然现有技术公开了Sema3A用于治疗骨相关疾病的应用，但是仅是针对骨的治疗，而未涉及软骨，本发明着重于关节软骨的治疗。本发明提供一种神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用，及神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体的构建方法。依本发明提供的方法制备的药物作用于人体后会以慢病毒为载体诱导机体自身目标组织高表达sema多肽，能长期使患者局部高表达sema 3a蛋白，作用持续且高效。

发明内容

第一方面，本发明提供一种神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用，所述神经导向因子Sema的基因序列为SEQ ID NO:1所示序列的全部、与SEQ ID NO:1所示序列类似的序列或者SEQ ID NO:1所示序列的变体。

优选的，所述与SEQ ID NO:1所示序列类似的序列包括：(1)与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性程度的序列；(2)与SEQ ID NO:1所示序列的差异不超过5、4、3、2或1个碱基的序列。

所述SEQ ID NO:1所示序列的变体是指与SEQ ID NO:1的差异包括取代、缺失和/或插入一个或多个碱基的序列。

优选的，本发明中神经导向因子Sema的基因序列为SEQ ID NO:1所示序列的全部，具体如下：

GCCACCATGGGCTGGTTTACCGGAATCGCCTGCCTGTTCTGGGGCGTGCTGCTGACAGCTAGGGCTAACTACGCTAACGGAAAGAACAACGTGCCCCGCCTGAAGCTGTCCTACAAGGAGATGCTGGAGTCTAACAACGTGATCACCTTTAACGGCCTGGCCAACAGCTCCTCTTACCACACATTCCTGCTGGATGAGGAGCGGTCTCGCCTGTACGTGGGAGCTAAGGACCACATCTTTAGCTTCAACCTGGTGAACATCAAGGATTTCCAGAAGATCGTGTGGCCTGTGAGCTACACCAGGAGAGATGAGTGCAAGTGGGCCGGCAAGGACATCCTGAAGGAGTGTGCCAACTTTATCAAGGTGCTGGAGGCTTACAACCAGACCCACCTGTACGCCTGCGGCACAGGAGCTTTCCACCCCATCTGTACCTACATCGAAGTGGGCCACCACCCTGAGGATAACATCTTTAAGCTGCAGGACTCCCACTTCGAGAACGGCAGGGGAAAGTCTCCATACGATCCCAAGCTGCTGACCGCCAGCCTGCTGATCGACGGCGAGCTGTACTCCGGAACAGCCGCTGACTTCATGGGCAGGGACTTTGCTATCTTCAGAACCCTGGGACACCACCACCCTATCAGAACAGAGCAGCACGATTCCCGGTGGCTGAACGACCCACGCTTCATCAGCGCCCACCTGATCCCAGAGTCCGACAACCCCGAGGACGATAAGGTGTACTTCTTTTTCCGGGAGAACGCTATCGATGGCGAGCACTCTGGAAAGGCCACCCACGCTAGGATCGGCCAGATCTGCAAGAACGACTTTGGCGGACACAGATCCCTGGTGAACAAGTGGACCACATTCCTGAAGGCTAGGCTGATCTGTTCTGTGCCAGGACCTAACGGAATCGACACACACTTTGATGAGCTGCAGGACGTGTTCCTGATGAACAGCAAGGACCCTAAGAACCCAATCGTGTACGGCGTGTTTACCACAAGCTCCAACATCTTCAAGGGCAGCGCCGTGTGCATGTACTCTATGAGCGACGTGCGGCGCGTGTTCCTGGGACCATACGCTCACCGCGATGGACCTAACTACCAGTGGGTGCCATACCAGGGCAGGGTGCCATACCCCAGACCTGGAACCTGTCCCTCTAAGACATTTGGCGGATTCGATAGCACCAAGGACCTGCCAGACGATGTGATCACATTTGCCAGAAGCCACCCCGCTATGTACAACCCCGTGTTCCCTATCAACAACCGGCCTATCATGATCAAGACCGACGTGAACTACCAGTTTACACAGATCGTGGTGGATAGGGTGGACGCCGAGGATGGCCAGTACGATGTGATGTTCATCGGCACCGACGTGGGAACAGTGCTGAAGGTGGTGTCCGTGCCCAAGGAGACCTGGCACGATCTGGAGGAGGTGCTGCTGGAGGAGATGACAGTGTTTCGCGAGCCTACCACAATCAGCGCCATGGAGCTGTCCACCAAGCAGCAGCAGCTGTACATCGGCTCTACAGCCGGAGTGGCTCAGCTGCCACTGCACAGGTGCGACATCTACGGCAAGGCCTGTGCTGAGTGCTGTCTGGCTCGCGATCCCTACTGCGCTTGGGACGGATCTAGCTGTAGCAGGTACTTCCCTACCGCCAAGAGGAGAACACGGCGCCAGGATATCAGAAACGGCGACCCACTGACCCACTGCTCCGATCTGCAGCACCACGACAACCACCACGGCCCCTCTCTGGAGGAGCGCATCATCTACGGAGTGGAGAACTCCTCTACATTTCTGGAGTGTTCCCCCAAGTCTCAGAGGGCCCTGGTGTACTGGCAGTTCCAGAGGAGAAACGAGGATCGGAAGGAGGAGATCCGCATGGGCGACCACATCATCAGGACCGAGCAGGGACTGCTGCTGAGATCTCTGCAGAAGAAGGACAGCGGCAACTACCTGTGCCACGCTGTGGAGCACGGATTCATGCAGACCCTGCTGAAGGTGACCCTGGAAGTGATCGACACAGAGCACCTGGAGGAGCTGCTGCACAAGGACGATGACGGCGATGGAAGCAAGATCAAGGAGATGAGCTCCTCTATGACCCCTTCCCAGAAAGTGTGGTACCGGGACTTTATGCAGCTGATCAACCACCCAAACCTGAACACAATGGATGAGTTCTGTGAGCAAGTGTGGAAGAGGGACAGAAAGCAGCGGCGCCAGAGACCTGGACACTCTCAGGGAAGCTCCAACAAGTGGAAGCACATGCAGGAGAGCAAGAAGGGCCGGAACAGGAGAACCCACGAGTTCGAGAGGGCTCCACGCTCCGTGTGA

本发明所述的慢病毒载体是在HIV的基础上改造而来，其结构和功能的特点已被广泛应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以将外源基因有效地整合到宿主基因组上实现长时间的稳定表达。

第二方面，本发明提供一种神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)质粒线性化，将质粒采用酶切法获得线性化质粒片段；

(2)将Sema 3a基因整合到质粒中；

(3)293T细胞的接种；

(4)转染293T细胞；

(5)慢病毒收获及浓缩；

(6)慢病毒滴度测定。

本发明优选实施例制备的病毒滴度为1×10⁹TU/ml。

优选的，所述神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体的构建方法，具体包括：(1)将质粒采用Bbs1切除shRNA片段，获得线性化质粒片段；(2)在T4-DNA连接酶作用下实现质粒与目的Sema 3a基因的连接；(3)将293T细胞接种到培养皿中，控制转染时细胞密度为70-80％；(4)将质粒DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体，与293T细胞共培养进行转染；(5)重组慢病毒进行纯化浓缩，滴度测定。

第三方面，本发明提供一种基于神经导向因子Sema基因与慢病毒重组载体的药物，所述药物制备原料包括神经导向因子Sema基因与慢病毒重组载体体积份数为1-2份，溶剂体积份数为8-9份。

所述溶剂选自PBS(磷酸缓冲盐溶液)或D-PBS(杜氏磷酸缓冲液)，pH值为7.2-7.4。

优选的，在本发明中所述溶剂选自pH值为7.4。

本发明的有益效果为：现有的治疗技术手段仅能缓解骨关节炎症状，而目前FDA及中国均仍还没有批准用于预防或减缓疾病进展的药物，本发明提供的一种基于神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体的药物制剂能预防和减缓骨关节炎进展。另外，以慢病毒为载体诱导机体自身目标组织高表达sema3a多肽，作用持续高效，长期使患者局部高表达sema3a多肽。

附图说明

图1Sema 3a基因慢病毒重组载体的药物小鼠热板实验散点图

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所述的Sema 3a基因慢病毒重组载体制备中使用的试剂盒等由湖北武汉枢密脑科学技术有限公司提供。

制备例1Sema 3a基因慢病毒重组载体的制备

1.质粒线性化

将质粒采用Bbs1切除shRNA片段，获得线性化质粒片段。

2.将Sema 3a基因整合到质粒中

将线性化质粒片段与目的基因Sema 3a基因序列混合，在T4-DNA连接酶作用下实现质粒与目的基因的连接。

3. 293T细胞培养

293T细胞衍生自常用的HEK293细胞系。HEK293细胞是用剪切过的5型腺病毒DNA转化人胚肾细胞得到的细胞系。在此基础上，转化了SV40T抗原的细胞称为293T细胞，它的生长速度更快，代谢更旺盛。

3.1 293T细胞复苏

1)预热培养基；

2)从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。用70％酒精擦拭消毒后，移至超净工作台；

3)吸出细胞悬液加入3ml培养基中，再加入5ml培养基稀释，轻柔吹散；

4)1000rpm，3min离心收集细胞；

5)适量培养基重悬细胞接种。

3.2 293T细胞传代(10cm皿为例)

1)弃去旧培养液，加入10ml灭菌PBS，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS；

2)加入1ml胰酶消化液，消化1-2min直到细胞变圆开始脱落；

3)加入2ml完全培养基终止消化，并将皿底细胞吹打成单细胞；

4)按需要离心重悬计数接种，或混匀细胞直接分到新的培养瓶中，继续培养。

3.3 293T细胞冻存

1)取培养2～3天生长旺盛的细胞，根据传代步骤将细胞消化并吹打成单细胞；

2)1000rpm，3min离心收集细胞；

3)加入适量PBS重悬细胞，计数；

4)1000rpm，3min离心收集细胞；

5)用冻存培养基再悬浮细胞至2×10 6～5×10 6个/ml，然后分装细胞悬液到2ml冻存管，1ml/管；

6)将小管置于程序降温盒然后将盒子放入-80℃冷冻过夜，第二天转移冻存细胞的小管到液氮中长期保存。

4. 293T细胞转染

4.1 293T细胞的接种

1)将细胞接种到10cm皿中，控制第二天转染时细胞密度为70-80％；

2)注意：状态良好的293T是病毒包装的保证。确保所用的细胞没有传代20次以上。

4.2转染293T细胞

3)转染前1h取出培养皿，去除原有培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基；

4)制备转染试剂和质粒的复合物

a.将待转染的质粒32μg(包装质粒：穿梭质粒＝1:1)溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min；

b.将转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min；

c.将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使质粒DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。

5)取出培养皿，将以上配好的质粒DNA-转染试剂混合物加入其中；

6)转染后换液，6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10ml新鲜完全培养基培养。

5.慢病毒收获及浓缩

5.1收获病毒上清

1)收集转染后48、72h的293T细胞上清液，分装入50ml离心管中。3500rpm室温离心10min，除去细胞和大的碎片；

2)以0.45μm滤膜过滤上清液于超速离心管中；

5.2超速离心浓缩病毒

3)30,000rpm，4℃离心2h，可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀；

4)弃上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，去除未弃干净的上清。每管根据沉淀量添加DPBS，80μl～120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀过夜；

5)按要求分装病毒，-80℃冰箱保存。

6.慢病毒滴度测定

利用慢病毒感染细胞后，病毒基因组DNA会整合到宿主细胞的基因组上，并使整合的外源DNA得到稳定的遗传，提取宿主细胞基因组DNA，通过qPCR的方法测定慢病毒在宿主细胞上的拷贝数来确定慢病毒的滴度。

1)感染前一天，按每孔1×10⁵个细胞接种24孔板；

2)分别取病毒10μl，1μl，0.1μl加入到各一个细胞培养孔中，不加Polybrene。病毒可以先稀释，再加入；

3)感染24h后，换液继续培养；

4)72-96h后弃细胞上清。将细胞收集下来，抽提293T细胞基因组；

5)以得到的基因组为模板，定量其中的内参基因或病毒序列WPRE；

6)绘制标准曲线。注意：标准曲线的扩增效率要求在0.9-1.1之间，并且R 2>0.990，否则PCR扩增数据及标准品拷贝数与Ct值之间的线性关系不真实，需要检测引物特异性及重新稀释标准品。

7)计算慢病毒滴度TU/ml

慢病毒滴度(TU/ml)＝(q-PCRcopies/ul×M×gDNA稀释倍数)×1000ml/感染细胞病毒体积μl。

注：M为gDNA提取后洗脱体积，1000表示病毒单位由ul转化为ml。

本发明实施例制备的病毒滴度为1×10⁹TU/ml。

本发明提供的慢病毒是自身失活型(SIV)，整合入靶细胞后，不会产生完整长度的RNA，仅仅具有携带目的基因的功能，即感染目的细胞后不再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。

实施例1 Sema 3a基因慢病毒重组载体的药物的制备

将制备例1制备的Sema 3a基因慢病毒重组载体溶液100μL溶于900μL pH＝7.4的PBS溶液中制备成药液。

实施例2 Sema 3a基因慢病毒重组载体的药物的制备

将制备例1制备的Sema 3a基因慢病毒重组载体溶液100μL溶于900μL pH＝7.4的D-PBS溶液中制备成药液。

效果例Sema 3a基因慢病毒重组载体药物的治疗效果

1、试验目的：以C57小鼠为模型，评价本发明制备的Sema 3a基因慢病毒重组载体药物对小鼠关节炎模型的治疗效果。

2、试验过程如下：

①膝关节炎模型建立：

动物：8周龄C57小鼠30只，随机分为3组，右腿ACLT：前十字交叉韧带切断术造模。

实验器材及试剂：动物实验用手术器械(眼科剪、镊子等)，动物实验板，1％戊巴比妥钠，碘伏，生理盐水，75％酒精，纱布。实验原理：模拟创伤性膝关节炎。

实验步骤：按0.3-0.6ml/100g的剂量对小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，安抚小鼠后放回笼位，待其失去知觉后(刺激足底无反应)，将小鼠前后脚固定在实验平板上，右腿不固定，在右腿膝关节处碘伏消毒后，小心剪开并暴露出关节处，于髌韧带下方找到前十字交叉韧带，用剪刀剪断，碘伏消毒，仔细处理伤口流血较多位置，缝合伤口，术后将小鼠放置在保温台上，待其苏醒后放回笼位。

②膝关节炎治疗

待①所述模型长至12周龄，以实施例1和2制备的药液为实验组1和组2，分别给两组小鼠右腿膝关节处注射5μL药液进行治疗，第3组在相同位置注射等量生理盐水进行空白对照，治疗结束后再次对小鼠进行热板实验。

③实验结果如下表所示：

表1 Sema 3a基因慢病毒重组载体药物对膝关节炎治疗效果

根据上表数据可以看出，本发明制备的Sema 3a基因慢病毒重组载体药物与空白对照组相比对小鼠膝关节炎的治疗效果明显。实施例1制备的药液溶剂为PBS，实施例2制备的药液溶剂为D-PBS，通过对比两组药物对小鼠膝关节炎的治疗效果可以发现，PBS和D-PBS作为溶剂配制的药物对小鼠膝关节炎的治疗效果没有显著差异。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2325

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccaccatgg gctggtttac cggaatcgcc tgcctgttct ggggcgtgct gctgacagct 60

agggctaact acgctaacgg aaagaacaac gtgccccgcc tgaagctgtc ctacaaggag 120

atgctggagt ctaacaacgt gatcaccttt aacggcctgg ccaacagctc ctcttaccac 180

acattcctgc tggatgagga gcggtctcgc ctgtacgtgg gagctaagga ccacatcttt 240

agcttcaacc tggtgaacat caaggatttc cagaagatcg tgtggcctgt gagctacacc 300

aggagagatg agtgcaagtg ggccggcaag gacatcctga aggagtgtgc caactttatc 360

aaggtgctgg aggcttacaa ccagacccac ctgtacgcct gcggcacagg agctttccac 420

cccatctgta cctacatcga agtgggccac caccctgagg ataacatctt taagctgcag 480

gactcccact tcgagaacgg caggggaaag tctccatacg atcccaagct gctgaccgcc 540

agcctgctga tcgacggcga gctgtactcc ggaacagccg ctgacttcat gggcagggac 600

tttgctatct tcagaaccct gggacaccac caccctatca gaacagagca gcacgattcc 660

cggtggctga acgacccacg cttcatcagc gcccacctga tcccagagtc cgacaacccc 720

gaggacgata aggtgtactt ctttttccgg gagaacgcta tcgatggcga gcactctgga 780

aaggccaccc acgctaggat cggccagatc tgcaagaacg actttggcgg acacagatcc 840

ctggtgaaca agtggaccac attcctgaag gctaggctga tctgttctgt gccaggacct 900

aacggaatcg acacacactt tgatgagctg caggacgtgt tcctgatgaa cagcaaggac 960

cctaagaacc caatcgtgta cggcgtgttt accacaagct ccaacatctt caagggcagc 1020

gccgtgtgca tgtactctat gagcgacgtg cggcgcgtgt tcctgggacc atacgctcac 1080

cgcgatggac ctaactacca gtgggtgcca taccagggca gggtgccata ccccagacct 1140

ggaacctgtc cctctaagac atttggcgga ttcgatagca ccaaggacct gccagacgat 1200

gtgatcacat ttgccagaag ccaccccgct atgtacaacc ccgtgttccc tatcaacaac 1260

cggcctatca tgatcaagac cgacgtgaac taccagttta cacagatcgt ggtggatagg 1320

gtggacgccg aggatggcca gtacgatgtg atgttcatcg gcaccgacgt gggaacagtg 1380

ctgaaggtgg tgtccgtgcc caaggagacc tggcacgatc tggaggaggt gctgctggag 1440

gagatgacag tgtttcgcga gcctaccaca atcagcgcca tggagctgtc caccaagcag 1500

cagcagctgt acatcggctc tacagccgga gtggctcagc tgccactgca caggtgcgac 1560

atctacggca aggcctgtgc tgagtgctgt ctggctcgcg atccctactg cgcttgggac 1620

ggatctagct gtagcaggta cttccctacc gccaagagga gaacacggcg ccaggatatc 1680

agaaacggcg acccactgac ccactgctcc gatctgcagc accacgacaa ccaccacggc 1740

ccctctctgg aggagcgcat catctacgga gtggagaact cctctacatt tctggagtgt 1800

tcccccaagt ctcagagggc cctggtgtac tggcagttcc agaggagaaa cgaggatcgg 1860

aaggaggaga tccgcatggg cgaccacatc atcaggaccg agcagggact gctgctgaga 1920

tctctgcaga agaaggacag cggcaactac ctgtgccacg ctgtggagca cggattcatg 1980

cagaccctgc tgaaggtgac cctggaagtg atcgacacag agcacctgga ggagctgctg 2040

cacaaggacg atgacggcga tggaagcaag atcaaggaga tgagctcctc tatgacccct 2100

tcccagaaag tgtggtaccg ggactttatg cagctgatca accacccaaa cctgaacaca 2160

atggatgagt tctgtgagca agtgtggaag agggacagaa agcagcggcg ccagagacct 2220

ggacactctc agggaagctc caacaagtgg aagcacatgc aggagagcaa gaagggccgg 2280

aacaggagaa cccacgagtt cgagagggct ccacgctccg tgtga 2325

Claims (1)

1.一种神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用，所述神经导向因子Sema的基因序列为SEQ ID NO:1所示序列的全部。