WO2013129620A1

WO2013129620A1 - 骨量を増加させるための組成物

Info

Publication number: WO2013129620A1
Application number: PCT/JP2013/055555
Authority: WO
Inventors: 高柳　広; 友紀中島; 幹人林
Original assignee: 国立大学法人東京医科歯科大学
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2013-02-28
Publication date: 2013-09-06

Abstract

　骨芽系細胞から発現しているセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）は、骨吸収の阻害と骨形成の促進とを同時に行うことによって、強い骨保護作用を発揮していることを見出した。さらに、Ｓｅｍａ３Ａを全身投与（静脈注射）することにより、又は骨損傷部に局所投与することにより、投与対象の骨量を増加させることができることも明らかにした。

Description

骨量を増加させるための組成物

　本発明は、骨量を増加させるための組成物に関し、より詳しくは、セマフォリン３Ａを有効成分として含有する骨量を増加させるための組成物に関する。

　高齢化社会に伴い、骨折、骨粗しょう症、関節リウマチ、腰背痛等の骨疾患の患者が増加している。骨組織では、骨形成を担う骨芽細胞と、骨吸収を担う破骨細胞とが協調して働き、骨形成と骨吸収とをバランス良く行うことによって、骨の恒常性、ひいては骨組織の機能は維持されている。骨の恒常性は、カルシウム調節ホルモンを介した内分泌系によって主に維持されていると長年にわたり考えられていたが、免疫系及び神経系の制御に関与する因子によって維持されていることが、最近明らかにされつつある（非特許文献１～２）。また、この骨の恒常性が、老化や卵巣機能の低下等の要因によって崩れ、骨形成が低下したり、あるいは骨吸収が異常亢進すると、骨量（骨密度）が低減して、様々な骨疾患が生じる（非特許文献３～４）。かかる骨疾患として、骨折、骨欠損、骨粗しょう症、骨軟化症、骨減少症、腰背痛、骨ページェット病、硬直性脊椎炎、関節リウマチ、変形性関節症、初期／転移性骨腫瘍、歯周病、インプラント歯周炎等が知られている。特に高齢者が骨疾患を患うと、日常生活に必要なレベルの運動ですら困難となったり、場合によっては、そのまま寝たきりになる危険性もある。そのため、高齢化が進む現代社会において、骨疾患を予防・治療することには重要な意義がある。

　現在、骨疾患の治療剤として、活性型ビタミンＤ３剤、ビスホスホネート剤、カルシトニン製剤、エストラジオール含有のホルモン製剤、ビタミンＫ２剤、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）製剤等が一般に用いられている。また、副作用がより少なく、より効果的な治療剤として、エストラジオール誘導体、活性型ビタミンＤ３誘導体、ビスホスホネート誘導体などの開発が行われている（特許文献１）。

　しかし、ビタミンＤ３は血中のカルシウム濃度を高める作用を有しており、エストラジオールやビスホスホネートは骨吸収の阻害作用を有しているが、いずれも骨芽細胞による骨形成を直接促進する作用はない。一方、ＰＴＨは骨形成を促進するが、骨吸収に対してはあまり影響を及ぼさない。また、骨吸収と骨形成とはカップリング因子（ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）を介して連携しているため（非特許文献５～６）、エストラジオールやビスホスホネート等の抗骨吸収剤を長期間使用すると、しばし適切な骨形成が抑制されることになり、結果として低品質の骨が蓄積されることになる（非特許文献６～９）。

　従って、真に効果的な骨疾患の予防・治療薬並びに方法の開発を可能とすべく、骨の恒常性を維持するメカニズムを詳細に解明し、骨吸収を抑制しつつ、骨形成を促進することが可能な分子を同定することが急務とされていた。しかしながら、このような分子の同定はなされておらず、骨吸収と骨形成とを同調して制御することができる骨疾患の予防・治療薬等の提供には至っていなかった。

　一方、軸索誘導分子は、神経系の外側で広く発現しており、そこで細胞遊走、免疫応答、組織発達及び血管形成等を制御していることが明らかにされつつある（非特許文献１０～１１）。また、最近の研究成果から、骨格系を含む、様々な生体のシステムにおいて、軸索誘導分子は重要な役割を担っていることが示唆されている（非特許文献１２～１４）。軸索誘導分子の１種であるセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）タンパク質は、分泌タンパク質であり、膜タンパク質　Ｎｒｐ１（ニューロピリン１）及びＰｌｅｘｉｎ－Ａ１（プレキシンＡ１）と複合体を形成し、様々なシグナルを伝達することが知られている。神経系においては、神経軸策の方向性を決定する神経ガイダンス因子として機能することが明らかになっており（非特許文献１５～１６）、また、免疫系においては、樹状細胞等の遊走を抑制する因子、Ｔ細胞の活性化を抑制する因子として、Ｓｅｍａ３Ａは機能することも知られている（特許文献２）。さらに、骨に関しては、Ｓｅｍａ３Ａノックアウトマウスにおいて、硬骨及び軟骨の形成の異常が観察されている（非特許文献１７）。また、Ｓｅｍａ３ＡのｍＲＮＡは骨芽細胞で発現しているのに対し、破骨細胞では発現していないことが確認されている（非特許文献１８）。しかしながら、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質が、骨芽細胞及び破骨細胞において、どのような作用を発揮しているのかは明らかになっていなかった。

特表２００５－５０９６２９号公報国際公開２０１１／０５５５５０号

Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７年、７巻、２９２～３０４ページＥｌｅｆｔｅｒｉｏｕ，Ｆ．、Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、２００８年、４７３巻、２３１～２３６ページＳｅｅｍａｎ，Ｅ．ら、Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ、２００６年、３５４巻、２２５０～２２６１ページＴｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ、２００３年、４巻、６３８～６４９ページＭａｒｔｉｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ、２００５年、１１巻、７６～８１ページＬｅｗｉｅｃｋｉ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２０１１年、７巻、６３１～６３８ページＲａｃｈｎｅｒ，Ｔ．Ｄ．ら、Ｌａｎｃｅｔ、２０１１年、３７７巻、１２７６～１２８７ページＲｅｉｄ，Ｉ．Ｒ．ら、Ｊ　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ　Ｒｅｓ、２０１０年、２５巻、２２５６～２２６５ページＯｄｖｉｎａ，Ｃ．Ｖ．ら、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ、２００５年、９０巻、１２９４～１３０１ページＢ．Ｊ．Ｄｉｃｋｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、２９８巻、１９５９～１９６４ページＡ．Ｂ．Ｈｕｂｅｒら、Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００３年、２６巻、５０９～５６３ページＮｅｇｉｓｈｉ－Ｋｏｇａ，Ｔ．ら、Ｎａｔ　Ｍｅｄ、２０１１年、１７巻、１４７３～１４８０ページＴａｋｅｇａｈａｒａ，Ｎ．ら、Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、２００６年、８巻、６１５～６２２ページＭａｔｓｕｏ，Ｋ．ら、Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、２００８年、４７３巻、２０１～２０９ページＬｕｏ，Ｙ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９３年、７５巻、２１７～２７ページＴｒａｎ，Ｔ．Ｓ．ら、Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ、２００７年、２３巻、２６３～２９２ページＯｄｅｄ　Ｂｅｈａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年、３８３巻、５２５～５２８ページＣ．Ｇｏｍｅｚ、ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ　ＤＹＮＡＭＩＣＳ、２００５年、２３４巻、３９３～４０３ページ

　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、骨吸収を抑制しつつ、骨形成を促進することにより、骨量を増加させることを可能とする組成物を提供することを目的とする。

　破骨細胞は、単球／マクロファージ前駆細胞に由来し、それらの分化は、骨芽細胞、軟骨細胞及び骨細胞を含む、破骨細胞分化の主たる要因となるＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ－κＢ（ＮＦκＢ）ｌｉｇａｎｄ、ＮＦκＢ活性化受容体リガンド）を発現する間葉系細胞によって制御されている。また、骨芽細胞は、ＲＡＮＫＬに対する可溶性デコイ　オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；Ｏｐｇ）を産生することによって、ＲＡＮＫＬの機能と拮抗することが知られている。

　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｏｐｇ欠損頭蓋冠細胞の馴化培地に、破骨細胞の形成を阻害する因子が含まれていることを見出し、そして、その因子の一つが、軸索誘導分子セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）であることも見出した。

　また、本発明者らは、Ｓｅｍａ３Ａとニューロピリン－１（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１；Ｎｒｐ１）との結合は、ＩＴＡＭ及びＲｈｏＡシグナル伝達系を阻害することにより、ＲＡＮＫＬによって誘導される破骨細胞分化を阻害することも明らかにした（図１及び２　参照）。さらに、その一方で、このＳｅｍａ３ＡとＮｒｐ１との結合は、古典的Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達系を介して、骨芽細胞を刺激し、脂肪細胞分化を阻害することも見出した（図１及び３　参照）。

　また、かかるＳｅｍａ３Ａの破骨細胞分化に対する阻害効果及び骨芽細胞分化に対する促進効果は、マウスのみならず、ヒトにおいても保存されていることを確認し、さらに、Ｓｅｍａ３Ａの血中濃度は成長（老化）に伴い減少すること、並びに閉経後は増加することも明らかにした。

　そして、Ｓｅｍａ３Ａを静脈投与することによって、生体内の骨量は増加し、骨再生は促進されること、また、Ｓｅｍａ３Ａを骨損傷部位に局所投与することによっても、該損傷部位において骨吸収を阻害しつつ、骨形成を促進できることを見出した。さらに、骨粗しょう症モデル動物においても、Ｓｅｍａ３Ａを投与することによって、骨量等が増加することも見出し、本発明を完成するに至った。

　本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）　セマフォリン３Ａを有効成分として含有する、骨量を増加するための組成物。
（２）　セマフォリン３Ａを有効成分として含有する、骨量の低減を伴う疾患を治療又は予防するための組成物。
（３）　セマフォリン３Ａを対象に投与し、対象の骨量を増加させる方法。
（４）　セマフォリン３Ａを対象に投与し、対象における骨量の低減を伴う疾患を治療又は予防するための方法。
（５）　骨量を増加させる活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｎｒｐ１タンパク質に試験化合物を接触させる工程、
（ｂ）Ｎｒｐ１タンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、
を含む方法。
（６）　骨量を増加させる活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、さらに
（ｃ）前記工程（ｂ）において選択された化合物を、破骨細胞分化系に接触させ、破骨細胞分化を検出し、該分化を抑制する化合物を選択する工程、及び/又は、
（ｄ）前記工程（ｂ）において選択された化合物を、骨芽細胞分化系に接触させ、骨芽細胞分化又は脂肪細胞分化を検出し、骨芽細胞分化を促進する化合物又は脂肪細胞分化を抑制する化合物を選択する工程
を含む、（５）に記載の方法。

　本発明によれば、骨吸収を抑制しつつ、骨形成を促進することにより、骨量を増加させることが可能となる。

セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）による骨リモデリングの制御のメカニズムを示す概略図である。すなわち、骨芽細胞系細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）より産生されたＳｅｍａ３Ａは、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）を介して、脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）分化を抑制する一方で骨芽細胞分化を促進する。また、骨芽細胞系細胞より産生されたＳｅｍａ３Ａは、Ｎｒｐ１を介して、破骨前駆細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ）から破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）への分化を抑制する。しかしながら、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬシグナル伝達系において、ＮＦ－κＢが活性化され、Ｎｒｐ１の発現が抑制されてしまうと、Ｓｅｍａ３Ａにより破骨細胞分化は抑制されない。従って、Ｓｅｍａ３Ａのかかる制御機能により、骨リモデリングの骨形成段階においては、骨芽細胞による大々的な骨の形成が促進される一方で、破骨細胞の骨形成部位への移動、並びに新たに形成された骨の再吸収が抑制されることになる。また、このようなＳｅｍａ３Ａの強い抗破骨細胞分化機能は、ＲＡＮＫＬシグナル伝達により制御されているＮｒｐ１の発現を通して厳重に制御されていることを示す概略図である。Ｓｅｍａ３Ａによる破骨細胞分化の制御のメカニズムを示す概略図である。すなわち、破骨細胞分化においては、セマフォリン６Ｃ，６Ｄ（Ｓｅｍａ６Ｃ，６Ｄ）等のリガンドに応答して、プレキシン－Ａ１（Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１）－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２複合体が形成される。そして、ＩＴＡＭシグナルが活性化され、ＰＬＣγを介してＣａ^２＋シグナルも活性化されることにより、破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）分化に必須であるＮＦＡＴｃ１の発現が誘導される。しかし、Ｓｅｍａ３Ａ及びＮｒｐ１の存在下では、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２複合体の形成が阻害されることにより、破骨細胞分化は抑制される。さらに、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１－Ｎｒｐ１－Ｓｅｍａ３Ａ複合体の形成によって、ＲｈｏＡの活性化が阻害されることにより、破骨前駆細胞の遊走も抑制されることになる。また、ＲＡＮＫＬ刺激後では、Ｓｅｍａ３Ａが存在していても、該刺激によってＮｒｐ１の発現は低減されてしまうため、Ｓｅｍａ６Ｃ，６Ｄ－Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２複合体が形成されることにより、ＰＬＣγ等を介して、破骨細胞分化は促進されることになることを示す概略図である。Ｓｅｍａ３Ａによる骨芽細胞分化の制御のメカニズムを示す概略図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａは、ＦＡＲＰ２によるＲａｃの活性化（Ｒａｃ－ＧＤＰからＲａｃ－ＧＴＰへの変換）を介して、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を刺激する。そして、βカテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）の核内蓄積が促進されることにより、脂肪細胞分化（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）が抑制される一方で、骨芽細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）分化は促進されることを示す概略図である。頭蓋冠細胞馴化培地において、Ｓｅｍａ３Ａを同定した過程を示す図である。すなわち、破骨細胞分化における、野生型（ＷＴ）又はＯｐｇ欠損（Ｔｎｆｒｓｆ１１ｂ^－／－）頭蓋冠細胞によって馴化された培地による影響を示すグラフである。縦軸は、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）陽性の多核破骨細胞（ＭＮＣ）の数を示す。頭蓋冠細胞馴化培地において、Ｓｅｍａ３Ａを同定した過程を示す図である。すなわち、ＭｏｎｏＱ５／５０陰イオン交換クロマトグラフィーによるＯｐｇ欠損頭蓋冠細胞馴化培地の分画、各画分（Ｆｒａｃｔｉｏｎ）による破骨細胞分化（黒の棒）への影響、並びに各画分における吸光度（波長：２８０ｎｍ）及び塩化ナトリウム濃度を示すグラフである。縦軸は、ＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞の数を示す。頭蓋冠細胞馴化培地において、Ｓｅｍａ３Ａを同定した過程を示す図である。すなわち、図５に示した画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ（Ｆｒ．））３、９又は１５にて処理して培養した破骨細胞にＴＲＡＰ染色を施して観察した結果を示す顕微鏡写真である。頭蓋冠細胞馴化培地において、Ｓｅｍａ３Ａを同定した過程を示す図である。すなわち、リン酸ナトリウム（１０ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）及び０．２５～１．００Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ（Ｍ））の破骨細胞分化への影響を示すグラフである。縦軸は、ＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞の数を示し、「ＮＤ」は未定（ｎｏｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）であることを示す。頭蓋冠細胞馴化培地において、Ｓｅｍａ３Ａを同定した過程を示す図である。すなわち、図５に示した画分８を展開したＳＤＳ－ＰＡＧＥをＣＢＢにて染色した結果を示す写真である。破骨細胞分化を阻害する因子として、Ｓｅｍａ３Ａを同定した過程を示す図である。すなわち、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いたウェスタンブロットにより、クロマトグラフィーにより分画した頭蓋冠細胞馴化培地（Ｆｒａｃｔｉｏｎ）における、Ｓｅｍａ３Ａを検出した結果を示す写真である。「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍｏｕｓｅ　Ｓｅｍａ３Ａ－Ｆｃ」は、対照として組換えマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質（リコンビナントマウスＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃ）を展開したレーンであることを示し、矢印は、Ｓｅｍａ３Ａの活性型を示す。破骨細胞分化を阻害する因子として、Ｓｅｍａ３Ａを同定した過程を示す図である。すなわち、破骨細胞分化における、可溶性Ｎｒｐ1（ｓＮｒｐ１）及び図９に示した画分９（Ｆｒ．９）の添加による影響を示すグラフである。なお、図１０～１２において、縦軸は、ＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞の数を示す。破骨細胞分化を阻害する因子として、Ｓｅｍａ３Ａを同定した過程を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ処理によるＲＡＮＫＬ刺激前の破骨細胞分化への用量依存的な影響を示すグラフである。破骨細胞分化を阻害する因子として、Ｓｅｍａ３Ａを同定した過程を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ処理によるＲＡＮＫＬ刺激後の破骨細胞分化への影響を示すグラフである。骨芽系細胞におけるＳｅｍａ３Ａの発現を示す図である。すなわち、骨芽細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）及び破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）への分化過程での、頭蓋冠細胞及びＢＭＭｓ（骨髄由来の単球／マクロファージ前駆細胞）各々におけるＳｅｍａ３Ａの発現を、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって分析した結果を示すグラフである。横軸は各分化の誘導を開始してからの日数を示す。なお、図１３及び１５の縦軸はＳｅｍａ３Ａの相対的な発現量を示す。骨芽系細胞におけるＳｅｍａ３Ａの発現を示す図である。すなわち、脛骨の骨梁（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ　ｂｏｎｅ）及び皮質骨（Ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｂｏｎｅ）におけるＳｅｍａ３Ａ発現を免疫組織化学により分析した結果を示す顕微鏡写真である。上部パネルは、骨の組織をコントロールＩｇＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＩｇＧ）にて染色した結果を示し、下部パネルは、骨の組織を抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（Ａｎｔｉ－Ｓｅｍａ３Ａ）にて染色した結果を示す。なお、立方形の骨芽細胞（ｃｕｂｏｉｄａｌ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）及び骨表面細胞（ｌｉｎｉｎｇ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）において、Ｓｅｍａ３Ａは強く発現している。また、破骨細胞はＴＲＡＰ陽性細胞（赤く染色されている細胞）として検出されている。骨芽系細胞におけるＳｅｍａ３Ａの発現を示す図である。すなわち、長骨より単離された骨芽細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）及び骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）におけるＳｅｍａ３ａ　ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。骨芽系細胞におけるＳｅｍａ３Ａの発現を示す図である。すなわち、１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３及びＰＧＥ_２処理した頭蓋冠細胞におけるセマフォリンファミリーメンバーのｍＲＮＡの発現をジーンチップにより分析した結果を示すグラフである。縦軸は各遺伝子発現の強度（シグナル強度の差の平均値）を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスは、重度の低骨量表現型であることを示す図である。ａは、マイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）により得られた、１０週齢のＳｅｍａ３ａ^－／－マウス及びそれら野生型産仔（ＷＴ）の大腿骨の画像である。ｂは、μＣＴ分析によって得られた、骨量（体積あたりの骨量（％））を示すグラフである。ｃは、μＣＴ分析によって得られた、骨梁パラメーター（骨梁数（ｍｍ^－１））を示すグラフである。なお、ｂ及びｃにおいて、黒の棒はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスについての結果を示し、白の棒は野生型（ＷＴ）マウスについての結果を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスは、重度の低骨量表現型であることを示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス及びそれらの野生型産仔（ＷＴ）の脛骨近位部をＴＲＡＰ染色にて分析した結果を示す顕微鏡写真である。ｂは、骨形態学的分析による破骨細胞パラメーターの測定値（１ｍｍあたりの骨表面における破骨細胞数）を示すグラフである。ｃは、骨形態学的分析による破骨細胞パラメーターの測定値（骨表面において破骨細胞が占める割合（％））を示すグラフである。ｄは、骨形態学的分析による破骨細胞パラメーターの測定値（骨表面において骨吸収面が占める割合（％））を示すグラフである。なお、ｂ、ｃ及びｄにおいて、黒の棒はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスについての結果を示し、白の棒は野生型（ＷＴ）マウスについての結果を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスは、重度の低骨量表現型であることを示す図である。ａは、１０週齢のＳｅｍａ３ａ^－／－マウス及びそれらの野生型産仔の大腿骨における骨梁幅をμＣＴにより分析した結果を示すグラフである。ｂは、１０週齢のＳｅｍａ３ａ^－／－マウス及びそれらの野生型産仔の大腿骨における骨梁間隔をμＣＴにより分析した結果を示すグラフである。なお、ａ及びｂにおいて、黒の棒はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスについての結果を示し、白の棒は野生型（ＷＴ）マウスについての結果を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスは、重度の低骨量表現型であることを示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス及びそれらの野生型産仔（ＷＴ）の脛骨近位部をフォン－コッサ（ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ）染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。ｂは、３２週齢の野生型（ＷＴ）及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスのレントゲン写真である。なお、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスにおいては、脊椎のひどい湾曲が認められた。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスは、重度の低骨量表現型であることを示す図である。ａは、野生型（ＷＴ）及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスにおいて、骨髄由来の破骨前駆細胞の数をフローサイトメトリーにより分析した結果を示す、ドット－プロット図である。ｂは、野生型（ＷＴ）及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスにおいて、骨髄由来の破骨前駆細胞の数をフローサイトメトリーにより分析した結果を示す、グラフである。なお、ｂにおいて、黒の棒はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスについての結果を示し、白の棒は野生型（ＷＴ）マウスについての結果を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の細胞における破骨細胞分化を分析した結果を示す図である。ａは、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の頭蓋冠細胞（Ｃａｌｖａｒｉａｌ　ｃｅｌｌ）との共培養による、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの骨髄細胞（Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌ）から破骨細胞への分化（４日目）について、ＴＲＡＰ染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。ｂは、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の頭蓋冠細胞（Ｃａｌｖａｒｉａｌ　ｃｅｌｌ）との共培養による、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの骨髄細胞（Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌ）から破骨細胞への分化（４日目）について、ＴＲＡＰ染色により分析した結果を示すグラフである。なお、ｂにおいて、縦軸は、ＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞の数を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の細胞における破骨細胞分化を分析した結果を示す図である。ａは、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の頭蓋冠細胞（Ｃａｌｖａｒｉａｌ　ｃｅｌｌ）と６日間共培養した、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの骨髄細胞（Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌ）から破骨細胞への分化について、ＴＲＡＰ染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。ｂは、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の頭蓋冠細胞（Ｃａｌｖａｒｉａｌ　ｃｅｌｌ）と６日間共培養した、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの骨髄細胞（Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌ）から破骨細胞への分化について、ＴＲＡＰ染色により分析した結果を示すグラフである。なお、ｂにおいて、縦軸は、ＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞の数を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の細胞における破骨細胞分化を分析した結果を示す図である。すなわち、ＲＡＮＫＬ及びＭ－ＣＳＦにより刺激した野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスのＢＭＭｓにおける破骨細胞分化を示すグラフである。なお、縦軸はＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞の数を示す。黒の棒はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスについての結果を示し、白の棒は野生型（ＷＴ）マウスについての結果を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスの頭蓋冠細胞における、ＲＡＮＫＬ及びＯｐｇの発現量を分析した結果を示す図である。ａは、１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３及びＰＧＥ_２処理した野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの頭蓋冠細胞におけるＴｎｆｓｆ１１遺伝子（ＲＡＮＫＬをコードする遺伝子）の発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。ｂは、１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３及びＰＧＥ_２処理した野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの頭蓋冠細胞におけるＴｎｆｒｓｆ１１ｂ遺伝子（Ｏｐｇをコードする遺伝子）の発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。なお、ａ及びｂにおいて、縦軸は、各遺伝子の相対的な発現量を示す。ｃは、野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスにおける可溶性ＲＡＮＫＬの血清レベルを示すグラフである。ｄは、野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスにおけるＯｐｇの血清レベルを示すグラフである。なお、ａ～ｄにおいて、黒の棒はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスについての結果を示し、白の棒は野生型（ＷＴ）マウスについての結果を示す。Ｎｒｐ１と破骨細胞分化との関係を分析した結果を示す図である。すなわち、ＲＡＮＫＬ刺激前後のＢＭＭｓにおける、Ｎｒｐ１及びクラスＡプレキシン（Ｐｌｘｎａ１～４）のｍＲＮＡ発現をジーンチップ及びウェスタンブロットにより分析した結果を各々示すグラフ及び写真である。グラフの縦軸は各遺伝子発現の強度（シグナル強度の差の平均値）を示す。Ｎｒｐ１と破骨細胞分化との関係を分析した結果を示す図である。ａは、ＲＡＮＫＬ刺激後、Ｓｅｍａ３Ａ存在下又は非存在下において、レトロウィルス（ｐＭＸｓ）によりＮｒｐ１を異所的に発現させた際の、破骨細胞分化への影響を示すグラフである。ｂは、ＲＡＮＫＬ刺激前、Ｓｅｍａ３Ａ存在下又は非存在下において、ｓｈＲＮＡ（ｐＳＩＲＥＮ）によりＮｒｐ１をノックダウンさせた際の、破骨細胞分化への影響を示すグラフである。なお、ａ及びｂにおいて、黒の棒はＳｅｍａ３Ａ存在下の結果を示し、白の棒はＳｅｍａ３Ａ非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示す。ｃは、ＲＡＮＫＬ刺激前のＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}細胞又は野生型細胞（ＷＴ）における、Ｓｅｍａ３Ａ処理による影響を示すグラフである。なお、ａ～ｃにおいて、縦軸はＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞の数を示す。Ｎｒｐ１と破骨細胞分化との関係を分析した結果を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ処理した野生型（ＷＴ）又はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}ＢＭＭｓからの破骨細胞分化を示す写真である。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、Ｓｅｍａ３Ａ非処理の結果を示す。Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスは、重度の低骨量表現型であることを示す図である。ａは、１０週齢のＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウス及びそれらの野生型産仔の大腿骨をμＣＴにより分析した結果を示す画像である。ｂは、μＣＴ分析によって得られた、骨量（体積あたりの骨量（％））を示すグラフである。ｃは、μＣＴ分析によって得られた、骨梁パラメーター（骨梁数（ｍｍ^－１））を示すグラフである。なお、ｂ及びｃにおいて、グレーの棒はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスについての結果を示し、白の棒は野生型（ＷＴ）マウスについての結果を示す。Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスは、重度の低骨量表現型であることを示す図である。ａは、Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウス及びそれらの野生型産仔の脛骨近位部をＴＲＡＰ染色にて分析した結果を示す顕微鏡写真である。ｂは、骨形態学的分析による破骨細胞パラメーターの測定値（１ｍｍあたりの骨表面における破骨細胞数）を示すグラフである。ｃは、骨形態学的分析による破骨細胞パラメーターの測定値（骨表面において破骨細胞が占める割合（％））を示すグラフである。ｄは、骨形態学的分析による破骨細胞パラメーターの測定値（骨表面において骨吸収面が占める割合（％））を示すグラフである。なお、ｂ～ｄにおいて、グレーの棒はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスについての結果を示し、白の棒は野生型（ＷＴ）マウスについての結果を示す。Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスは、重度の低骨量表現型であることを示す図である。ａは、１０週齢のＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウス及びそれらの野生型産仔の大腿骨における骨梁幅をμＣＴにより分析した結果を示すグラフである。ｂは、１０週齢のＳｅｍａ３ａ^－／－マウス及びそれらの野生型産仔の大腿骨における骨梁間隔をμＣＴにより分析した結果を示すグラフである。なお、a及びｂにおいて、グレーの棒はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスについての結果を示し、白の棒は野生型（ＷＴ）マウスについての結果を示す。ｃは、Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウス及びそれらの野生型産仔（ＷＴ）の脛骨近位部をフォン－コッサ（ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ）染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。ＢＭＭｓにおけるＮｒｐ１発現に対するＮＦ－κＢの阻害効果を示す図である。ａは、ＲＡＮＫＬにより刺激したＢＭＭｓにおける、ＮＦ－κＢのＮｒｐ１　ｍＲＮＡ発現への影響を示すグラフである。「ＮＦ－κＢ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」及び「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＮＦ－κＢ阻害剤存在下及び非存在下における結果を各々示す。ｂは、野生型細胞（ＷＴ）及びＮＦＡＴｃ１欠損細胞（ＮＦＡＴｃ１^－／－）の破骨細胞分化におけるＮｒｐ１遺伝子の発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示すグラフである。ｃは、野生型細胞（ＷＴ）及びｃ－Ｆｏｓ欠損細胞（Ｆｏｓ^－／－）の破骨細胞分化におけるＮｒｐ１遺伝子の発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示すグラフである。なお、ａ～ｃにおいて、縦軸はＮｒｐ１遺伝子の相対的な発現量を示し、横軸はＲＡＮＫＬにて刺激してからの時間を示す。ＮＦ－κＢのＮｒｐ１発現への阻害作用の機序を分析した結果を示す図である。ａにおいて、上部はマウスＮｒｐ１プロモーター領域における推定上のＮＦ－κＢ結合部位を示し、下部はＥＣＲブラウザーにより分析して得られた、マウス及びヒトＮｒｐ１遺伝子座において進化上保存されている領域を示す概略図である。赤で示した領域（０～約＋３．３ｋｂの領域）はインテグリン領域を示し、緑で示した領域（０ｋｂ付近及び＋０．２ｋｂ付近の領域）はトランスポゾン及び単一リピートを示し、黄色で示した領域（約－０．４～０ｋｂの領域）はＵＴＲｓを示し、青で示した領域（－０．４ｋｂ付近の領域）はコーディングエクソンを示し、サーモン色で示した領域（約－１．６～約－０．４ｋｂの領域）はイントロン領域を示す。ｂは、ＲＡＮＫＬ処理したＢＭＭｓにおけるＮｒｐ１プロモーターへのＮＦ－κＢ　ｐ６５及びｐ５０の結合（リクルート）についてＣｈＩＰアッセイにより分析した結果を示す写真である。ｃは、ＲＡＮＫＬ処理したＢＭＭｓにおけるＮｒｐ１プロモーターへのＮＦ－κＢ　ｐ６５及びｐ５０の結合量をＣｈＩＰアッセイにより分析したグラフである。縦軸は、ｐ６５又はｐ５０に結合した相対的なクロマチン量（％）を示す。なお、ｂ及びｃに記載の「ｒｅｇｉｏｎ１～３」は、ａに記載のマウスＮｒｐ１プロモーター領域における推定上のＮＦ－κＢ結合部位に対応する。ＮＦ－κＢのＮｒｐ１発現への阻害作用の機序を分析した結果を示す図である。ａは、Ｎｒｐ１－Ｌｕｃのレポーター活性におけるＮＦＡＴｃ１、ｃ－Ｆｏｓ、ｐ５０及び／又はｐ６０の影響を示すグラフである。縦軸は、相対的なルシフェラーゼ活性を示す。ｂは、ＲＡＮＫＬ非存在下、レトロウィルス（ｐＭＸｓ）によるｐ５０及び／又はｐ６５の発現のＮｒｐ１タンパク質発現への影響を、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の存在下又は非存在下にて調べた結果を示す写真である。ｃは、ＲＡＮＫＬ刺激後のＢＭＭｓにおけるＮｒｐ１　ｍＲＮＡ発現へのＴＳＡの影響を示すグラフである。縦軸は、相対的なＮｒｐ１遺伝子の発現量を示す。破骨細胞分化におけるＳｅｍａ３Ａ－Ｎｒｐ１シグナル伝達による阻害効果を分析した結果を示す図である。ａは、２日間ＲＡＮＫＬにて処理したＢＭＭｓにおける破骨細胞遺伝子の発現に対する、Ｓｅｍａ３Ａ処理の影響を示すグラフである。縦軸は、各遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示す。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａ存在下又は非存在下における、ＲＡＮＫＬ及びＭ－ＣＳＦによって刺激したＢＭＭｓの細胞増殖率を示すグラフである。縦軸は、相対的なＢｒｄＵ取り込み量を示す。ｃは、Ｓｅｍａ３Ａ又はスタウロスポリン（ＳＴＳ）により処理したＢＭＭｓにおけるアポトーシス細胞の割合（％）を示す。縦軸は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を示す。なお、ａ及びｂにおいて、白の棒はＳｅｍａ３Ａ非存在下における結果を示し、黒の棒はＳｅｍａ３Ａ存在下における結果を示す。破骨細胞分化におけるＳｅｍａ３Ａ－Ｎｒｐ１シグナル伝達による阻害効果を分析した結果を示す図である。すなわち、ＲＡＮＫＬ刺激後のＢＭＭｓにおいて、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＩＫＫｓのリン酸化へのＳｅｍａ３Ａの影響を示す写真である。Ｓｅｍａ３Ａ処理によるＰｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２複合体及びＰｌｅｘｉｎ－Ａ１－Ｎｒｐ１複合への影響を調べた結果を示す図である。ａは、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１とＴＲＥＭ２との相互作用に対する、Ｎｒｐ１発現の影響を免疫沈降により分析した結果を示す写真である。すなわち、Ｎｒｐ１の非存在下又は存在下にて、抗ＦＬＡＧ抗体にてＰｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＦＬＡＧを免疫沈降（ＩＰ）した際に、ＴＲＥＭ２－Ｖ５が共沈してきたかどうかを分析した結果を示す写真である。ｂは、ＲＡＮＫＬ処理したＢＭＭｓにおける、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１とＮｒｐ１との複合体形成又はＰｌｅｘｉｎ－Ａ１とＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２との複合体形成へのＳｅｍａ３Ａによる影響を、抗Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１抗体を用いた免疫沈降にて分析した結果を示す写真である。ＲＡＮＫＬ刺激したＢＭＭｓにおけるＮｒｐ１の発現量のＳｅｍａ３Ａ処理による影響を調べた結果を示す図である。すなわち、ＲＡＮＫＬ刺激したＢＭＭｓ細胞表面及び細胞内におけるＮｒｐ１タンパク質発現レベルへのＳｅｍａ３Ａ処理による影響を、抗Ｎｒｐ１抗体を用いたフローサイトメトリーにより分析した結果を示すヒストグラムである。なお、「Ｎｏｎ－ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ」は細胞膜透過処理していない細胞の結果を示し、「ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅｄ」は細胞膜透過処理を施した細胞の結果を示す。「Ｃｏｎｔｒｏｌ／ａｎｔｉ－Ｎｒｐ１」及び「Ｓｅｍａ３Ａ／ａｎｔｉ－Ｎｒｐ１」は、Ｓｅｍａ３Ａ非存在下及び存在下における細胞を抗Ｎｒｐ１抗体を用いたフローサイトメトリーにより分析した結果を各々示し、「Ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ」は、アイソタイプコントロールを用いたフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。ＲＡＮＫＬ刺激したＢＭＭｓにおけるＮｒｐ１の発現量のＳｅｍａ３Ａ処理による影響を調べた結果を示す図である。ａは、ＲＡＮＫＬ刺激したＢＭＭｓ細胞表面のＮｒｐ１タンパク質発現レベルへのＳｅｍａ３Ａ処理による影響を、抗Ｎｒｐ１抗体を用いたフローサイトメトリーにより分析した結果を示すグラフである。ｂは、ＲＡＮＫＬ刺激したＢＭＭｓ細胞内のＮｒｐ１タンパク質発現レベルへのＳｅｍａ３Ａ処理による影響を、抗Ｎｒｐ１抗体を用いたフローサイトメトリーにより分析した結果を示すグラフである。なお、「Ｎｏｎ－ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ」は細胞膜透過処理していない細胞の結果を示し、「ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅｄ」は細胞膜透過処理を施した細胞の結果を示す。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」及び「Ｓｅｍａ３Ａ」は、Ｓｅｍａ３Ａ非存在下及び存在下における細胞を抗Ｎｒｐ１抗体を用いたフローサイトメトリーにより分析した結果を各々示す。また、縦軸は、相対的なＮｒｐ１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＲＡＮＫＬ刺激したＢＭＭｓにおけるＮｒｐ１の発現量のＳｅｍａ３Ａ処理による影響を調べた結果を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ存在下又は非存在下において、ＲＡＮＫＬ刺激後のＢＭＭｓにおけるＮｒｐ１遺伝子の発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。白の棒はＳｅｍａ３Ａ非存在下における結果を示し、黒の棒はＳｅｍａ３Ａ存在下における結果を示す。また、縦軸はＮｒｐ１遺伝子の相対的な発現量を示す。Ｓｅｍａ３Ａにより阻害されるシグナル伝達を分析した結果を示す図である。ａは、ＢＭＭｓにおいて、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＰＬＣγ２のリン酸化（ｐ－ＰＬＣγ２）へのＳｅｍａ３Ａによる影響をウェスタンブロットにより分析した結果を示す写真である。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａ非存在下における、ＲＡＮＫＬ刺激後のＢＭＭｓにおける細胞内カルシウム濃度の振動変化を示すグラフである。ｃは、Ｓｅｍａ３Ａ存在下における、ＲＡＮＫＬ刺激後のＢＭＭｓにおける細胞内カルシウム濃度の振動変化を示すグラフである。Ｓｅｍａ３Ａにより阻害されるシグナル伝達を分析した結果を示す図である。ａは、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の頭蓋冠細胞（Ｃａｌｖａｒｉａｌ　ｃｅｌｌ）との共培養による、野生型（ＷＴ）又はＴｙｒｏｂｐ^－／－マウスの骨髄細胞（Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌ）から破骨細胞への分化（６日目）を示すグラフである。縦軸はＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞の数を示す。ｂは、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－由来の頭蓋冠細胞（Ｃａｌｖａｒｉａｌ　ｃｅｌｌ）との６日間の共培養による、野生型（ＷＴ）又はＴｙｒｏｂｐ^－／－骨髄細胞（Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌ）からの破骨細胞への分化を示す写真である。ＢＭＭｓの遊走に対するＳｅｍａ３Ａによる影響を分析した結果を示す図である。aは、野生型マウス（ＷＴ）又はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウス由来のＢＭＭｓの、Ｍ－ＣＳＦにより誘導される遊走に対するＳｅｍａ３Ａによる影響をトランスウェルアッセイにより分析した結果を示すグラフである。横軸は、メンブレン下部及びチャンバー（Ｌｏｗｅｒ　ｃｈａｍｂｅｒ）に遊走した細胞数の相対比を示す。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＳｅｍａ３Ａ非処理の結果を示す。ｂは、Ｍ－ＣＳＦにて刺激したＢＭＭｓにおけるＲｈｏＡ活性化に対するＳｅｍａ３Ａの影響を示すグラフである。縦軸は、活性型ＲｈｏＡにおける倍率変化（Ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）を示す。ｃは、Ｍ－ＣＳＦにて刺激したＢＭＭｓにおけるＲａｃ活性化に対するＳｅｍａ３Ａの影響を示すグラフである。縦軸は、活性型Ｒａｃにおける倍率変化（Ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスにおいて、骨芽細胞分化は低減しており、脂肪細胞分化は増強していることを示す図である。ａは、野生型マウス（ＷＴ）、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの脛骨近位部をトルイジンブルーにて染色した結果（左側の３パネル）及び新骨の形成をカルセイン二重染色による分析した結果（右側の３パネル）を示す写真である。ｂは、野生型（ＷＴ）、Ｓｅｍａ３ａ^-／-及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ-}マウスの脛骨近位部をトルイジンブルー染色した結果を示す顕微鏡写真である。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスにおいて、骨芽細胞分化は低減しており、脂肪細胞分化は増強していることを示す図である。ａは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスをμＣＴ分析することにより、得られた単位組織体積あたりの骨梁のミネラル濃度を示すグラフである。ｂは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスをμＣＴ分析することにより、得られた骨梁におけるミネラル密度を示すグラフである。ｃは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスをμＣＴ分析することにより、得られた皮質骨におけるミネラル密度を示すグラフである。なお、ａ～ｃにおいて、白の棒は野生型マウスの結果を示し、黒の棒はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの結果を示す。ｄは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスをμＣＴ分析することにより、得られた単位組織体積あたりの骨梁のミネラル濃度を示すグラフである。ｅは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスをμＣＴ分析することにより、得られた骨梁におけるミネラル密度を示すグラフである。ｆは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスをμＣＴ分析することにより、得られた皮質骨におけるミネラル密度を示すグラフである。なお、ｄ～ｆにおいて、白の棒は野生型マウスの結果を示し、グレーの棒はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの結果を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスにおいて、骨芽細胞分化は低減しており、脂肪細胞分化は増強していることを示す図である。ａは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスを組織形態計測分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、骨表面における骨芽細胞が占める割合を示す。ｂは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスを組織形態計測分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、単位骨表面あたりの骨形成速度を示す。ｃは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスを組織形態計測分析により測定し、得られた脂肪細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、単位組織領域あたりの脂肪細胞数を示す。ｄは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスを組織形態計測分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、骨表面における骨芽細胞が占める割合を示す。ｅは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスを組織形態計測分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、単位骨表面あたりの骨形成速度を示す。ｆは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスを組織形態計測分析により測定し、得られた脂肪細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、単位組織領域あたりの脂肪細胞数を示す。なお、ａ～ｃにおいて、白の棒は野生型マウスの結果を示し、黒の棒はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの結果を示す。また、ｄ～ｆにおいて、白の棒は野生型マウスの結果を示し、グレーの棒はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの結果を示す。Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスにおいて、骨芽細胞分化は低減しており、脂肪細胞分化は増強していることを示す図である。ａは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスを組織学的分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、骨体積における類骨体積を示す。ｂは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスを組織学的分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、類骨の厚さを示す。ｃは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスを組織学的分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、骨表面における石灰化面の割合を示す。ｄは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスを組織学的分析により測定し、得られた脂肪細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、単位組織体積における脂肪体積の割合を示す。ｅは、野生型マウス及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの、体重あたりの精巣上体白色脂肪組織（ＷＡＴ）の重量を示す。ｆは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスを組織学的分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、骨体積における類骨体積を示す。ｇは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスを組織学的分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、類骨の厚さを示す。ｈは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスを組織学的分析により測定し、得られた骨芽細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、骨表面における石灰化面の割合を示す。ｉは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスを組織学的分析により測定し、得られた脂肪細胞のパラメーターを示すグラフである。縦軸は、単位組織体積における脂肪体積の割合を示す。ｊは、野生型マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの、体重あたりの精巣上体白色脂肪組織（ＷＡＴ）の重量を示す。なお、ａ～ｅにおいて、白の棒は野生型マウスの結果を示し、黒の棒はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの結果を示す。また、ｆ～ｊにおいて、白の棒は野生型マウスの結果を示し、グレーの棒はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの結果を示す。Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は促進され、脂肪細胞分化は抑制されることを示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、骨芽細胞分化培地にて培養した野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの頭蓋冠細胞をＡＬＰ染色した結果を示す写真である。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、骨芽細胞分化培地にて培養した野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの頭蓋冠細胞をＡＬＰ染色した結果を示すグラフである。ｃは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、骨芽細胞分化培地にて培養した野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの頭蓋冠細胞における骨結節形成を示す写真である。ｄは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、骨芽細胞分化培地にて培養した野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの頭蓋冠細胞における骨結節形成を示すグラフである。なお、ｂの縦軸は相対的なＡＬＰ活性値を示す。また、ｄの縦軸は単位面積あたりの骨結節数を示す。Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は促進され、脂肪細胞分化は抑制されることを示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、骨芽細胞分化培地にて培養した野生型（ＷＴ）又はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの頭蓋冠細胞をＡＬＰ染色した結果を示す写真である。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、骨芽細胞分化培地にて培養した野生型（ＷＴ）又はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの頭蓋冠細胞をＡＬＰ染色した結果を示すグラフである。ｃは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、骨芽細胞分化培地にて培養した野生型又はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの頭蓋冠細胞における骨結節形成を示す写真である。ｄは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、骨芽細胞分化培地にて培養した野生型又はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの頭蓋冠細胞における骨結節形成を示すグラフである。なお、ｂの縦軸は相対的なＡＬＰ活性値を示す。また、ｄの縦軸は単位面積あたりの骨結節数を示す。Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は促進され、脂肪細胞分化は抑制されることを示す図である。ａは、野生型（ＷＴ）及びＳｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞の細胞増殖率を示すグラフである。ｂは、野生型（ＷＴ）及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}頭蓋冠細胞の細胞増殖率を示すグラフである。なお、ａ及びｂの縦軸は、相対的なＢｒｄＵ取り込み量を示す。ｃは、野生型（ＷＴ）及びＳｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞のアポトーシス細胞の割合（％）を示すグラフである。ｄは、野生型（ＷＴ）及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}頭蓋冠細胞のアポトーシス細胞の割合（％）を示すグラフである。なお、ａ及びｃにおいて、黒の棒は、Ｓｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞における結果を示し、白の棒は野生型頭蓋冠細胞における結果を示す。ｃ及びｄの縦軸は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を示す。Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は促進され、脂肪細胞分化は抑制されることを示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、脂肪細胞分化培地にて培養した野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの骨髄間葉系細胞における脂肪細胞分化を示す写真である。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、脂肪細胞分化培地にて培養した野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－マウスの骨髄間葉系細胞における脂肪細胞分化を示すグラフである。黒の棒は、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスにおける結果を示し、白の棒は野生型マウスにおける結果を示す。なお、ｂの縦軸は、単位面積あたりのオイルレッドＯ陽性細胞の数を示す。Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は促進され、脂肪細胞分化は抑制されることを示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、脂肪細胞分化培地にて培養した野生型（ＷＴ）又はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの骨髄間葉系細胞における脂肪細胞分化を示す写真である。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて、脂肪細胞分化培地にて培養した野生型又はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスの骨髄間葉系細胞における脂肪細胞分化を示すグラフである。グレーの棒は、Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスにおける結果を示し、白の棒は野生型マウスにおける結果を示す。なお、ｂの縦軸は、単位面積あたりのオイルレッドＯ陽性細胞の数を示す。Ｓｅｍａ３Ａ欠損により影響を受ける遺伝子発現並びにシグナル伝達を示す図である。ａは、野生型及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスにおける、骨芽細胞遺伝子のｍＲＮＡ発現を示すグラフである。ｂは、野生型及びＳｅｍａ３ａ^－／－マウスにおける、脂肪細胞遺伝子のｍＲＮＡ発現を示すグラフである。ｃは、野生型（ＷＴ）及びＳｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞におけるＭｓｘ２、Ｍａｆ、Ｔａｚ、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２及びＣｅｂｐｂ発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析した結果を示すグラフである。なお、ａ～ｃにおいて、黒の棒は、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスにおける結果を示し、白の棒は野生型マウス（ＷＴ）における結果を示す。また、縦軸は、各遺伝子の相対的なｍＲＮＡの発現量を示す。Ｓｅｍａ３Ａ欠損により影響を受ける遺伝子発現並びにシグナル伝達を示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞のＰＰＡＲシグナル伝達において、ＧＳＥＡ分析によって有意に濃縮された遺伝子セットを示す濃縮プロットである。ｂは、野生型頭蓋冠細胞のＷｎｔシグナル伝達において、ＧＳＥＡ分析によって有意に濃縮された遺伝子セットを示す濃縮プロットである。古典的Ｗｎｔシグナル伝達を介し、Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は制御されることを示す図である。すなわち、野生型（ＷＴ）及びＳｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞において、βカテニンの転写標的遺伝子のｍＲＮＡ発現をジーンチップにより分析した結果を示すグラフである。黒の棒は、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスにおける結果を示し、白の棒は野生型マウスにおける結果を示す。縦軸は、各遺伝子の相対的なｍＲＮＡの発現量を示す。古典的Ｗｎｔシグナル伝達を介し、Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は制御されることを示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下にてＷｎｔ３ａにより刺激した、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞の核内のβカテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）のレベルを分析した結果を示す写真である。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下にてＷｎｔ３ａにより刺激した、野生型（ＷＴ）又はＳｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞の核内のβカテニンのレベルを分析した結果を示すグラフである。縦軸は、核内のβカテニンのレベルを、デンシトメトリーにより定量し、ヒストンＨ１（Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ１）のレベルにて標準化した結果を示す。古典的Ｗｎｔシグナル伝達を介し、Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は制御されることを示す図である。ａは、Ｗｎｔ３ａにて処理した野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞内のＲａｃ活性化に対するＳｅｍａ３Ａ処理の影響を示すグラフである。縦軸は、活性型Ｒａｃにおける倍率変化（Ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）を示す。ｂは、Ｗｎｔ３ａにて処理した野生型又はＳｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞内のＲｈｏＡ活性化に対するＳｅｍａ３Ａ処理の影響を示すグラフである。縦軸は、活性型ＲｈｏＡにおける倍率変化を示す。古典的Ｗｎｔシグナル伝達を介し、Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は制御されることを示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて骨芽細胞分化培地にて培養した頭蓋冠細胞における、レトロウィルス（ｐＭＸ－ΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２）によるΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２過剰発現の骨芽細胞分化への影響を示すグラフである。縦軸は、相対的なＡＬＰ活性値を示す。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にて骨芽細胞分化培地にて培養した頭蓋冠細胞における、レトロウィルス（ｐＭＸ－ΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２）によるΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２過剰発現の骨結節形成への影響を示すグラフである。縦軸は、単位面積あたりの骨結節数を示す。古典的Ｗｎｔシグナル伝達を介し、Ｓｅｍａ３Ａによって骨芽細胞分化は制御されることを示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下にてＷｎｔ３ａ処理した頭蓋冠細胞における、レトロウィルス（ｐＭＸ－ΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２）によるΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２過剰発現のβカテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）の核内局在への影響を示す写真である。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下にてＷｎｔ３ａ処理した頭蓋冠細胞における、レトロウィルス（ｐＭＸ－ΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２）によるΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２過剰発現の、βカテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）核内局在への影響を示す写真である。縦軸は、核内のβカテニンのレベルを、デンシトメトリーにより定量し、ヒストンＨ１（Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ１）のレベルにて標準化した結果を示す。Ｓｅｍａ３Ａ投与による骨量増加効果を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した９週齢の野生型マウスの大腿骨をμＣＴによって分析した結果を示す画像である。Ｓｅｍａ３Ａ投与による骨量増加効果を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した９週齢の野生型マウスの大腿骨をμＣＴによって分析した結果を示すグラフである。ａは、μＣＴ分析によって得られた、体積あたりの骨量（％）を示すグラフである。ｂは、μＣＴ分析によって得られた、単位組織体積あたりの骨梁のミネラル濃度（ｍｇ　ｍｍ^－３）を示すグラフである。ｃは、μＣＴ分析によって得られた、骨梁間隔（μｍ）を示すグラフである。ｄは、μＣＴ分析によって得られた、骨髄腔体積（ｍｍ^３）を示すグラフである。ｅは、μＣＴ分析によって得られた、骨梁幅（μｍ）を示すグラフである。ｆは、μＣＴ分析によって得られた、骨梁数（ｍｍ^－１）を示すグラフである。Ｓｅｍａ３Ａ投与による骨量増加効果を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）によって処理した野生型マウスの脛骨近位部を組織学的分析した結果を示す顕微鏡写真である。左から１番目の２パネルはＴＲＡＰ染色の結果を示し、２～３番目の４パネルはトルイジンブルー染色の結果を示し、４番目の２パネルはカルセイン二重ラベリングの結果を示す。Ｓｅｍａ３Ａ投与による骨量増加効果を示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）によって処理した野生型マウスを、骨形態計測分析することにより得られた破骨細胞による骨吸収のパラメーター（１ｍｍあたりの骨表面における破骨細胞数）を示すグラフである。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）によって処理した野生型マウスを、骨形態計測分析することにより得られた破骨細胞による骨吸収のパラメーター（骨表面において骨吸収面が占める割合（％））を示すグラフである。ｃは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）によって処理した野生型マウスを、骨形態計測分析することにより得られた骨芽細胞による骨形成のパラメーター（骨表面において骨芽細胞が占める割合（％））を示すグラフである。ｄは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）によって処理した野生型マウスを、骨形態計測分析することにより得られた骨芽細胞による骨形成のパラメーター（単位骨表面あたりの骨形成速度（ｍｍ^３・ｍｍ^－２・ｙ^－１））を示すグラフである。Ｓｅｍａ３Ａ投与による骨量増加効果を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウスの脛骨近位部をフォン－コッサ（ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ）染色した結果を示す写真である。Ｓｅｍａ３Ａ投与による骨量増加効果を示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウスを骨形態学的に分析することにより得られた破骨細胞のパラメーター（骨表面において破骨細胞が占める割合（％））を示すグラフである。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウスを骨形態学的に分析することにより得られた骨体積における類骨体積（％）を示すグラフである。ｃは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウスを骨形態学的に分析することにより得られた、骨表面において類骨表面が占める割合（％）を示すグラフである。ｄは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウスを骨形態学的に分析することにより得られた、類骨の厚さ（μｍ）を示すグラフである。ｅは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウスを骨形態学的に分析することにより得られた、骨表面における石灰化面の割合（％）を示すグラフである。Ｓｅｍａ３Ａ投与による骨量増加効果を示す図である。ａは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウスにおける骨髄由来の破骨前駆細胞をフローサイトメトリーにより分析した結果を示すドット－プロット図である。ｂは、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウスの骨髄における破骨前駆細胞の割合（％）をフローサイトメトリーにより分析した結果を示すグラフである。黒の棒は、Ｓｅｍａ３Ａ処理マウスの結果を示し、白の棒は生理食塩水処理マウスの結果を示す。Ｓｅｍａ３Ａ投与による骨量増加効果を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウス由来の骨髄細胞をコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）アッセイにより分析した結果を示す写真である。Ｓｅｍａ３Ａ投与による骨量増加効果を示す図である。すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ又は生理食塩水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）により処理した野生型マウス由来の骨髄間葉系細胞から脂肪細胞への分化を示す写真である。Ｓｅｍａ３Ａ局所投与による骨量増加効果を示す図である。ａは、ドリルによって穴を開けた大腿の皮質骨における骨再生をμＣＴにより分析した結果を示す写真である。ａにおいて、「Ｓｅｍａ３Ａ」はＳｅｍａ３Ａ処理マウスの結果を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は生理食塩水処理マウスの結果を示す。ｂ～ｅは、ドリルによって穴を開けた大腿の皮質骨における骨再生をμＣＴにより分析した結果を示すグラフである。ｂの縦軸は、体積あたりの骨量（％）を示す。ｃの縦軸は、骨梁数（ｍｍ^－１）を示す。ｄの縦軸は、骨梁間隔（μｍ）を示す。ｅの縦軸は、単位組織体積あたりの骨梁のミネラル濃度（ｍｇ　ｍｍ^－３）を示す。また、ｂ～ｅにおいて、黒の棒はＳｅｍａ３Ａ処理マウスの結果を示し、白の棒は生理食塩水処理マウスの結果を示す。Ｓｅｍａ３Ａ局所投与による骨量増加効果を示す図である。ａは、ＴＲＡＰ／ヘマトキシリン染色した大腿骨損傷部位を組織形態計測的に分析した結果を示す写真である。「ＣＢ」は皮質骨を示す。ｂ及びｃは、ＴＲＡＰ／ヘマトキシリン染色した大腿骨損傷部位を組織形態計測的に分析した結果を示すグラフである。ｂの縦軸は、骨表面において骨芽細胞が占める割合（％）を示す。ｃの縦軸は、骨表面において破骨細胞が占める割合（％）を示す。「Ｓｅｍａ３Ａ」はＳｅｍａ３Ａ処理マウスの結果を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は生理食塩水処理マウスの結果を示す。卵巣摘出により生じる骨量減少に対する、Ｓｅｍａ３Ａ投与の影響を示す図である。すなわち、偽手術マウス（Ｓｈａｍ）、卵巣摘出マウス（ＯＶＸ）及びＳｅｍａ３Ａを投与した卵巣摘出マウス（ＯＶＸ＋Ｓｅｍａ３Ａ）の大腿骨をμＣＴにより分析した結果を示す画像である。卵巣摘出により生じる骨量減少に対する、Ｓｅｍａ３Ａ投与の影響を示す図である。すなわち、偽手術マウス（Ｓｈａｍ）、卵巣摘出マウス（ＯＶＸ）及びＳｅｍａ３Ａを投与した卵巣摘出マウス（ＯＶＸ＋Ｓｅｍａ３Ａ）の大腿骨をμＣＴにより分析した結果を示すグラフである。ａは、μＣＴ分析によって得られた、体積あたりの骨量（％）を示すグラフである。ｂは、μＣＴ分析によって得られた、骨梁間隔（μｍ）を示すグラフである。ｃは、μＣＴ分析によって得られた、骨梁幅（μｍ）を示すグラフである。ｄは、μＣＴ分析によって得られた、単位組織体積あたりの骨梁のミネラル濃度（ｍｇ　ｍｍ^－３）を示すグラフである。ｅは、μＣＴ分析によって得られた、骨髄腔体積（ｍｍ^３）を示すグラフである。ｆは、μＣＴ分析によって得られた、骨梁数（ｍｍ^－１）を示すグラフである。卵巣摘出により生じる骨量減少に対する、Ｓｅｍａ３Ａ投与の影響を示す図である。すなわち、偽手術マウス（Ｓｈａｍ）、卵巣摘出マウス（ＯＶＸ）及びＳｅｍａ３Ａを投与した卵巣摘出マウス（ＯＶＸ＋Ｓｅｍａ３Ａ）の脛骨近位部を組織学的分析した結果を示す顕微鏡写真である。左から１番目の３パネルはＴＲＡＰ染色の結果を示し、２番目の３パネルはトルイジンブルー染色の結果を示し、３番目の３パネルはカルセイン二重ラベリングの結果を示す。卵巣摘出により生じる骨量減少に対する、Ｓｅｍａ３Ａ投与の影響を示す図である。すなわち、偽手術マウス（Ｓｈａｍ）、卵巣摘出マウス（ＯＶＸ）及びＳｅｍａ３Ａを投与した卵巣摘出マウス（ＯＶＸ＋Ｓｅｍａ３Ａ）の脛骨近位部を組織学的分析した結果を示すグラフである。ａは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた破骨細胞による骨吸収のパラメーター（１ｍｍあたりの骨表面における破骨細胞数）を示すグラフである。ｂは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた破骨細胞による骨吸収のパラメーター（骨表面において骨吸収面が占める割合（％））を示すグラフである。ｃは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた破骨細胞による骨吸収のパラメーター（骨表面において破骨細胞が占める割合（％））を示すグラフである。ｄは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた、骨芽細胞による骨形成のパラメーター（骨表面において類骨表面が占める割合（％））を示すグラフである。ｅは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた、骨芽細胞による骨形成のパラメーター（骨体積における類骨体積（％））を示すグラフである。ｆは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた、骨芽細胞による骨形成のパラメーター（骨表面において骨芽細胞が占める割合（％））を示すグラフである。ｇは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた、骨芽細胞による骨形成のパラメーター（単位骨表面あたりの骨形成速度（ｍｍ^３・ｃｍ^－２・ｙ^－１））を示すグラフである。ｈは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた、骨芽細胞による骨形成のパラメーター（類骨の厚さ（μｍ））を示すグラフである。ｉは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた、骨芽細胞による骨形成のパラメーター（骨石灰化速度（μｍ　ｄａｙ^－１））を示すグラフである。ｊは、前記３種のマウスを骨形態計測分析することにより得られた、骨芽細胞による骨形成のパラメーター（骨表面における石灰化面の割合（％））を示すグラフである。ヒト破骨細胞への分化に対する、Ｓｅｍａ３Ａ処理による影響を示す図である。ａは、ヒトＳｅｍａ３Ａの存在下（Ｓｅｍａ３Ａ）又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるヒト破骨細胞への分化を、ＴＲＡＰ染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。ｂは、ヒトＳｅｍａ３Ａの存在下（Ｓｅｍａ３Ａ）又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるヒト破骨細胞への分化を、ＴＲＡＰ染色により分析した結果を示すグラフである。縦軸は、ＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞の数を示す。ヒト骨芽細胞への分化に対する、Ｓｅｍａ３Ａ処理による影響を示す図である。ａは、ヒトＳｅｍａ３Ａの存在下（Ｓｅｍａ３Ａ）又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるヒト間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を、ＡＬＰ染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。ｂは、ヒトＳｅｍａ３Ａの存在下（Ｓｅｍａ３Ａ）又は非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるヒト間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を、ＡＬＰ染色により分析した結果を示すグラフである。縦軸は、相対的なＡＬＰ活性値を示す。老化及び閉経後（ＯＶＸ）における、Ｓｅｍａ３Ａの血清濃度を示す図である。ａは、４週齢（４　ｗｅｅｋｓ）、１０週齢（１０　ｗｅｅｋｓ）及び４６～５２週齢（４６－５２　ｗｅｅｋｓ）の野生型マウスのＳｅｍａ３Ａの血清濃度(ｎｇ　ｍｌ^－１）を示すグラフである。「ＮＤ」は、未定（ｎｏｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）であることを示す。ｂは、偽手術マウス（Ｓｈａｍ）及び卵巣摘出マウス（ＯＶＸ）のＳｅｍａ３Ａの血清濃度(ｎｇ　ｍｌ^－１）を示すグラフである。

　＜本発明の骨量を増加させるための組成物＞
　後述の実施例において示す通り、本発明者らによって、骨芽細胞系細胞から発現しているセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）は、骨吸収の抑制と骨形成の促進とを同時に行うことによって、強い骨保護作用を発揮していることが明らかになった（図１～３参照）。さらに、Ｓｅｍａ３Ａを全身投与（静脈注射）しても、骨損傷部に局所投与しても、対象の骨量を増加させることができることも明らかになった。

　従って、本発明は、セマフォリン３Ａを有効成分として含有する組成物を提供するものであり、該組成物を利用することによって、骨吸収を抑制しつつ、骨形成を促進することにより、骨量を増加させることができる。

　また、後述の実施例が更に示す通り、セマフォリン３Ａを投与することによって、単位組織体積あたりのミネラル量（骨塩量）は上昇するため、本発明の組成物は、高い骨塩量、ひいては質の高い骨を維持することができるため、骨量増加作用のみならず、骨質改善作用も有する。

　本発明の組成物の有効成分であるセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）は、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）と結合し、Ｎｒｐ１及びクラスＡプレキシン（Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ）と複合体を形成することにより、破骨細胞分化を抑制しつつ、骨芽細胞分化を促進できるものであればよい。典型的には、ヒトＳｅｍａ３Ａは、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿００６０７１．１で特定されるタンパク質又はＵｎｉｐｒｏｔ　ＩＤ：Ｑ１４５６３で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿００６０８０．２で特定されるＤＮＡ）である。マウスＳｅｍａ３Ａは、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿０３３１７８．２で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿００９１５２．２で特定されるＤＮＡ）又はＵｎｉｐｒｏｔ　ＩＤ：Ｏ０８６６５．２で特定されるタンパク質である。

　また、「セマフォリン３Ａ」は、前述の典型例として示した野生型である必要はなく、前述の通り、Ｎｒｐ１と結合することにより、破骨細胞分化を抑制しつつ、骨芽細胞分化を促進できるものであればよく、アミノ酸が置換、欠失、挿入された変異体であってもよく、修飾が施された修飾体であってもよい。ここで、ヒトＳｅｍａ３Ａとその変異体、並びにそれらの修飾体を総称してヒト由来Ｓｅｍａ３Ａといい、マウスＳｅｍａ３Ａとその変異体、並びにそれらの修飾体を総称してマウス由来Ｓｅｍａ３Ａという。なお、かかる変異体及び修飾体が、破骨細胞分化を抑制しつつ、骨芽細胞分化を促進できるかどうかは、後述のスクリーニング方法を利用することにより、判定することができる。

　セマフォリン３Ａタンパク質の変異体としては、ＮＰ＿００６０７１．１、Ｑ１４５６３、ＮＰ＿０３３１７８．２又はＯ０８６６５．２で特定されるタンパク質において、もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「複数」とは、通常、５００アミノ酸以内、好ましくは１００アミノ酸以内、より好ましくは５０アミノ酸以内、特に好ましくは１０個アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。また、アミノ酸の置換は、通常保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。

　セマフォリン３Ａタンパク質の変異体に関し、ＮＰ＿００６０７１．１で特定されるタンパク質において１位のメチオニン～２１位のアスパラギンからなるポリペプチド及びＮＰ＿０３３１７８．２で特定されるタンパク質において１位のメチオニン～２０位のアラニンからなるポリペプチドは、これらタンパク質が細胞から分泌される際に機能するシグナル配列であるため、欠失していてもよい。

　また、後述の実施例において用いた組換えマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムス社製　組換えマウスセマフォリン３Ａ　Ｆｃキメラ　カタログ番号：５９２６－Ｓ３）の例にならって、ＮＰ＿０３３１７８．２で特定されるタンパク質においては、安定性の向上等に寄与するという観点から、１位のメチオニン～２０位のアラニンからなるポリペプチドの欠失、５５２位のアミノ酸がアスパラギンからリシンに置換、５５４位のアミノ酸がアルギニンからアラニンに置換、５５５位のアミノ酸がアルギニンからアラニンに置換、６１８位のアミノ酸がアルギニンからアラニンに置換、６１９位のアミノ酸がリシンからアラニンに置換、６４２位のアミノ酸がリシンからアラニンに置換、６４３位のアミノ酸がリシンからアラニンに置換及び７４８位のトリプトファン～７７２位のバリンからなるポリペプチドの欠失からなる群から選択される少なくとも１の変異を有していることが好ましく、前記全ての変異を有していることがより好ましい。

　さらに、後述の実施例において用いた組換えヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムス社製　組換えヒトセマフォリン３Ａ　Ｆｃキメラ　カタログ番号：１２５０－Ｓ３）の例にならって、ＮＰ＿００６０７１．１で特定されるタンパク質においても、安定性の向上等に寄与するという観点から、１位のメチオニン～２５位のグリシンからなるポリペプチドの欠失、５５２位のアミノ酸がアルギニンからアラニンに置換及び５５５位のアミノ酸がアルギニンからアラニンに置換からなる群から選択される少なくとも１の変異を有していることが好ましく、前記全ての変異を有していることがより好ましい。

　また、セマフォリン３Ａタンパク質の変異体としては、ＮＭ＿００６０８０．２又はＮＭ＿００９１５２．２で特定されるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするポリペプチドが挙げられる。高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。

　さらに、セマフォリン３Ａタンパク質の変異体としては、ＮＰ＿００６０７１．１、Ｑ１４５６３、ＮＰ＿０３３１７８．２又はＯ０８６６５．２で特定されるタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列の相同性は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）を利用し、そのプログラムのデフォルトパラメーターを用いて決定することができる。

　また、セマフォリン３Ａタンパク質に付加されるタンパク質としては、前述の通り、セマフォリン３Ａタンパク質とＮｒｐ１との結合、並びに該結合によって誘導される破骨細胞分化の抑制及び骨芽細胞分化の促進が維持されていればよく、セマフォリン３Ａタンパク質のＮ末及びＣ末のいずれか一方又は両方に直接又は間接的に付加されるものであってもよい。かかるタンパク質としては、抗体のＩｇＧ部分、血清アルブミン部分、レポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ）、精製用タグタンパク質（例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ）等が挙げられる。これらの中では、安定性を向上させるという観点から、抗体のＩｇＧ部分が好ましく、抗体のＩｇＧ部分がセマフォリン３Ａタンパク質のＣ末に付加されることがより好ましい。また、かかるタンパク質をセマフォリン３Ａタンパク質に間接的に付加させる際には、任意のアミノ酸配列からなるリンカー（例えば、ＩＥＧＲＭＤＰというアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＤＩＥＧＲＭＤというアミノ酸配列からなるポリペプチド）を利用することができる。

　抗体のＩｇＧ部分としてＦｃ部分を用いてもよい。ヒトＩｇＧ１重鎖（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１９８２年、１０巻、４０７１～４０７９ページ　参照）又は当技術分野で公知の他の任意のＦｃ配列（例えば、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３及びＩｇＧ－４を含む他のＩｇＧクラス又は他の免疫グロブリン）から選ぶことができ、適宜Ｆｃ部分を改変してもよい。Ｆｃ部分の使用としては、例えば、ヒトＩｇＧ１の１００位のプロリン～３３０位のリシンからなるポリペプチド、マウスＩｇＧ２Ａの９８位のグルタミン酸～３３０位のリシンからなるポリペプチドが挙げられる。さらに、Ｆｃ配列部分にあって抗体において機能を発揮する部位を改変してもよい。例えば、Ｆｃ配列のジスルフィド架橋の形成を妨げるために、システイン残基を欠失させたり、又は他のアミノ酸で置換することが可能である。特にヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を用いる場合は、１０３位のシステインをアラニン、セリン又は他のアミノ酸残基で置換したり或いは欠失したりすることが可能である。また、Ｆｃ部分のＮ末側である９９位から１０３位までを欠失させてもよい。Ｆｃ受容体結合部位及び補体結合部位を除去する変異を導入してもよい。特にヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を用いる場合は、該当する部位のアミノ酸残基として、１１８位ロイシン、２０１位グルタミン酸、２０３位及び２０５位のリシンを挙げることができ、例えばそれらを１１８位グルタミン酸、２０１位アラニン、２０３位及び２０５位をアラニンに置換することが可能である。また、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）部位を除去するために変異を導入してもよい。例えば、ＩｇＧ１内のＡＤＣＣ部位に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９２年、２９巻、５号、６３３～６３９ページを参照して、当業者であれば適宜変異を導入することができる。

　セマフォリン３Ａタンパク質の修飾体としては、前述の通り、Ｎｒｐ１と結合することにより、破骨細胞分化を抑制しつつ、骨芽細胞分化を促進できるものであればよく、転写後修飾、又は非タンパク質ポリマー修飾が挙げられる。かかる転写後修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン結合、糖化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化又はポリペプチド側鎖の付加若しくは疎水基の付加が挙げられる。また、かかる非タンパク質ポリマー修飾としては、ポリエチレングルコール、ポリプロピレングリコール及びポリオキシアルキレンのうちの少なくともいずれか一のポリマーとの共有結合が挙げられる。これら修飾の中において、体内動態の最適化、免疫原性の低下、血液循環性の向上の観点から、非タンパク質ポリマー修飾であることが好ましく、ポリエチレングルコール修飾（ＰＥＧ化）であることがより好ましい、また、当業者であれば、非タンパク質ポリマーの分子量、構造（直鎖状、分岐状）等は、前記観点に基づき、適宜設計・変更することができる。

　本発明において「セマフォリン３Ａを含有する」とは、セマフォリン３Ａタンパク質を含有することのみならず、セマフォリン３Ａタンパク質をコードする遺伝子を含有することをも意味する。また、セマフォリン３Ａタンパク質をコードするＤＮＡを含有する場合において、該遺伝子は生体内でセマフォリン３Ａタンパク質を発現させることが可能なベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ、ウィルスベクター）等に挿入されていることが望ましい。

本発明にかかるセマフォリン３Ａタンパク質をコードするＤＮＡは、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素処理、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法等の遺伝子増幅技術や組換え技術を利用して調製することも可能である。そして、このようにして調製したＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、本発明にかかるセマフォリン３Ａタンパク質を調製することができる。さらに、形質転換体に発現させたセマフォリン３Ａタンパク質は、公知の方法により精製することができ、例えば、セマフォリン３Ａタンパク質を特異的に認識する抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー精製法が挙げられる。また、形質転換体に発現させたセマフォリン３Ａタンパク質を精製する公知の方法としては、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ等を付加した融合タンパク質の形で合成し、金属キレート樹脂、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより精製することができる。さらに、かかる融合タンパク質からセマフォリン３Ａタンパク質を分離するには、例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ等で切断する方法が挙げられる。

　本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。

　本発明の骨量を増加させるための組成物は、骨吸収を抑制しつつ、骨形成を促進することにより、骨量を増加させることができるため、骨量（骨密度）の低減を伴う疾患、例えば、骨折、骨欠損、骨粗しょう症、骨軟化症、骨減少症、腰背痛、骨ページェット病、硬直性脊椎炎、関節リウマチ、変形性関節症、初期／転移性骨腫瘍、歯周病、インプラント歯周炎等の治療若しくは予防のために投与される医薬組成物、又はインプラント治療に際して歯槽骨の再建を目的とし、投与される医薬組成物として、また、骨量向上のために（上記疾患の予防を含む）、日常的に摂取される飲食品として好適に用いることができる。

　本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経口的又は非経口的に使用することができる。

　これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調節剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。また、骨との親和性が高い、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β－リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物、又はポリ乳酸－ポリエチレングリコール等も好適に用いることができる。

　本発明の骨量を増加させるための組成物を医薬組成物として用いる場合には、骨量の低減を伴う疾患の治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。

　本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。

　本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。本発明の骨量を増加させるための組成物を飲食品として利用する場合には、骨量増加のために有効な１種若しくは２種以上の成分を添加してもよい。また、骨量の増加以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。

　本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。

　本発明の組成物の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与、骨損傷部位への直接投与（局所投与）が挙げられる。

　本発明の骨量を増加させるための組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状（骨量の低減を伴う疾患の種類、程度等）、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品等）等に応じて、適宜選択されるが、本発明の骨量を増加させるための組成物中のセマフォリン３Ａの投与量又は摂取量は、好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、１日あたりの投与又は摂取の回数としても、特に制限はなく、前記のような様々な要因を考慮して、適宜選択することができる。

　本発明は、このように、本発明の骨量を増加させるための組成物を対象に投与又は摂取させることを特徴とする、対象の骨量を増加させる方法を提供するものである。また、本発明の骨量を増加させるための組成物を対象に投与することを特徴とする、対象における骨量（骨密度）の低減を伴う疾患の治療又は予防の方法を提供するものである。さらに、本発明は、セマフォリン３Ａを対象に投与し、対象の骨量を増加させる方法を提供するものである。また、本発明は、セマフォリン３Ａを対象に投与し、対象における骨量の低減を伴う疾患を治療又は予防するための方法を提供するものである。

　本発明の骨量を増加させるための組成物の製品（医薬品、飲食品、試薬）又はその説明書は、骨量を増加させるために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。骨量を増加させるために用いられる旨の表示においては、本発明の骨量を増加させるための組成物を投与又は摂取することにより骨量が増加する機序についての情報を含むことができる。機序としては、例えば、セマフォリン３ＡがＮｒｐ１及びクラスＡプレキシン（Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ）と複合体を形成することにより、破骨細胞分化を抑制しつつ、骨芽細胞分化を促進することに関する情報が挙げられる。また、骨量を増加させるために用いられる旨の表示においては、骨量の低減を伴う疾患の治療又は予防のために用いられること、に関する情報を含むことができる。

　以上、本発明の骨量を増加させるための組成物の好適な実施形態について説明したが、本発明は、別の態様の組成物も提供することができる。すなわち、後述の実施例において示す通り、セマフォリン３Ａ－Ｎｒｐ１シグナル伝達を活性化することにより、破骨細胞分化を抑制しつつ、骨芽細胞分化を促進できることが、本発明者らによって見出された。従って、Ｎｒｐ１アゴニストを有効成分として含有する、骨量を増加させるための組成物を、本発明は提供することができる。

　本発明にかかる「Ｎｒｐ１アゴニスト」としては、Ｎｒｐ１タンパク質に結合することにより、前記シグナル伝達を活性化することにできる物質であればよく、例えば、前記セマフォリン３Ａ以外に、抗Ｎｒｐ１タンパク質アゴニスト抗体が挙げられる。

　本発明にかかる「Ｎｒｐ１タンパク質」としては、セマフォリン３Ａと結合することにより、破骨細胞分化を抑制しつつ、骨芽細胞分化を促進できるものであればよく、典型的には、ヒトＮｒｐ１タンパク質は、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿００３８６４．４（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿００３８７３．５で特定されるＤＮＡがコードするタンパク質）である。マウスＮｒｐ１タンパク質は、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿０３２７６３．１で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿００８７３７．１で特定されるＤＮＡがコードするタンパク質）である。

　本発明にかかる「抗Ｎｒｐ１タンパク質アゴニスト抗体」としては、Ｎｒｐ１タンパク質、又はＮｒｐ１タンパク質の部分ペプチドに特異的に結合することにより、前記シグナル伝達を活性化することにできる抗体であればよく、後述の＜本発明のスクリーニング方法＞を利用して調製することができる。また、本発明にかかる「抗Ｎｒｐ１タンパク質アゴニスト抗体」としては、Ｎｒｐ１アゴニストとして機能するセマフォリン３Ａの結合部位に特異的に結合する抗体であることが好ましい。「セマフォリン３Ａの結合部位」としては、ヒトＮｒｐ１タンパク質においては、例えば、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿００３８６４．４で特定されるタンパク質の２３位のアルギニン～８５７位のイソロイシンからなるポリペプチド（好ましくは、２３位のアルギニン～５８９位のスレオニンからなるポリペプチド）が挙げられる。

　なお、本発明において、「抗体」とは、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体であれば、抗原で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。

　また、本発明における「抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びこれら抗体の機能的断片であってもよい。さらに、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗原を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。

　＜本発明の骨量を減少させるための組成物＞
　後述の実施例において示す、可溶性Ｎｒｐ1による破骨細胞分化の抑制、並びにＳｅｍａ３ａ^－／－マウス、Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウス、及びこれらマウスに由来する細胞の表現型等から明らかな通り、セマフォリン３Ａ－Ｎｒｐ１シグナル伝達を抑制することにより、破骨細胞分化を促進しつつ、骨芽細胞分化を抑制できる。従って、本発明は、Ｎｒｐ１アンタゴニストを有効成分として含有する、骨量を減少させるための組成物も提供することができる。

　本発明にかかる「Ｎｒｐ１アンタゴニスト」としては、セマフォリン３Ａ又はＮｒｐ１タンパク質に結合することにより、前記シグナル伝達を抑制することにできる物質であればよく、例えば、抗セマフォリン３Ａアンタゴニスト抗体、抗Ｎｒｐ１タンパク質アンタゴニスト抗体、可溶性Ｎｒｐ1が挙げられる。

　本発明にかかる「抗セマフォリン３Ａアンタゴニスト抗体」としては、セマフォリン３Ａタンパク質、又はセマフォリン３Ａタンパク質の部分ペプチドに特異的に結合することにより、前記シグナル伝達を抑制することにできる抗体であればよいが、Ｎｒｐ１の結合部位に特異的に結合する抗体であることが好ましい。「Ｎｒｐ１の結合部位」としては、ヒトセマフォリン３Ａタンパク質においては、例えば、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿００６０７１．１で特定されるタンパク質の２６位のリシン～５１８位のアスパラギン酸からなるポリペプチド（好ましくは、５７位のチロシン～４９０位のセリンからなるポリペプチド、より好ましくは３６３位のアスパラギン～３８１位のシステイン）が挙げられる。

　本発明にかかる「抗Ｎｒｐ１タンパク質アンタゴニスト抗体」としては、Ｎｒｐ１タンパク質、又はＮｒｐ１タンパク質の部分ペプチドに特異的に結合することにより、前記シグナル伝達を抑制することにできる抗体であればよいが、Ｎｒｐ１アゴニストとして機能するセマフォリン３Ａの結合部位に特異的に結合する抗体であることが好ましい。「セマフォリン３Ａの結合部位」としては、ヒトＮｒｐ１タンパク質においては、例えば、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿００３８６４．４で特定されるタンパク質の２３位のアルギニン～８５７位のイソロイシンからなるポリペプチド（好ましくは、２３位のアルギニン～５８９位のスレオニンからなるポリペプチド、２６５位のロイシン～８５７位のイソロイシンからなるポリペプチド）が挙げられる。

　本発明にかかる「可溶性Ｎｒｐ1」としては、Ｎｒｐ１タンパク質の部分ペプチドであって、セマフォリン３Ａに結合することにより、前記シグナル伝達を抑制することにできるポリペプチドであればよく、例えば、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿００３８６４．４で特定されるタンパク質の２３位のアルギニン～８５７位のイソロイシンからなるポリペプチド（好ましくは、２３位のアルギニン～５８９位のスレオニンからなるポリペプチド）が挙げられる。また、前述の「セマフォリン３Ａ」同様に、本発明にかかる「可溶性Ｎｒｐ1」としては、これらポリペプチドのアミノ酸が置換、欠失、挿入された変異体であってもよく、修飾が施された修飾体であってもよい。

　本発明の骨量を減少させるための組成物は、骨吸収を促進しつつ、骨形成を抑制することにより、骨量を減少させることができるため、異所性に骨化が生じる疾患、例えば、ＯＰＬＬ等の脊柱靭帯骨化症や骨棘の治療若しくは予防のために投与される医薬組成物等として好適に用いることができる。

　＜本発明のスクリーニング方法＞
　後述の実施例において示す通り、セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）は、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）と結合し、Ｎｒｐ１及びクラスＡプレキシン（Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ）と複合体を形成することにより、破骨細胞分化を抑制しつつ、骨芽細胞分化を促進できることが、本発明者らによって見出された。従って、かかる知見に基づき、本発明は、下記スクリーニング方法も提供することができる。

　骨量を増加させる活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｎｒｐ１タンパク質に試験化合物を接触させる工程、
（ｂ）Ｎｒｐ１タンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、
を含む方法。

　本発明のスクリーニング方法において使用する試験化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。また、Ｎｒｐ１タンパク質の構造を基に設計された、Ｎｒｐ１タンパク質に結合する構造を有する化合物が挙げられる。

　本発明にかかる「Ｎｒｐ１タンパク質」としては、前述の通りである。また、Ｎｒｐ１タンパク質と試験化合物との接触においては特に制限なく、緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、ＴＢＳ、ＴＢＳ－Ｔ、ＨＥＰＥＳバッファー）中において、Ｎｒｐ１タンパク質と試験化合物とを混合させることにより接触させてもよく、また、Ｎｒｐ１タンパク質が細胞膜表面上に発現している細胞の培養系（培養液等）に試験化合物を添加することにより接触させてもよい。このような細胞の培養系を用いる場合には、ＲＡＮＫＬ非存在下（非発現誘導下）で行うことが望ましい。

　Ｎｒｐ１タンパク質との結合は、インビトロ結合アッセイ、例えば、精製又は細胞抽出液中のＮｒｐ１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、ＧＳＴプルダウンアッセイ、免疫沈降法によって実施することができる。その他、例えば、酵母ツーハイブリッドシステム、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴法を利用した方法等を用いることもできる。

　また、本発明のスクリーニング方法においては、さらにクラスＡプレキシン（Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ）の存在下において、前記工程（ａ）及び（ｂ）を実施することにより、より効率良く、骨量を増加させる活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。かかる方法においては、前記工程（ｂ）として、試験化合物とクラスＡプレキシンとのＮｒｐ１を介した間接的な結合を検出することにより、Ｎｒｐ１タンパク質に結合する活性を有する化合物を選択することができる。クラスＡプレキシンとしては、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１、Ａ２、Ａ３又はＡ４が挙げられる。また、かかる間接的な結合も、前記インビトロ結合アッセイ等を利用することにより当業者であれば検出することができる。

　本発明のスクリーニング方法においては、
　（ｃ－１）　工程（ｂ）において選択された化合物を、破骨細胞分化系に接触させ、破骨細胞分化を検出し、該分化を抑制する化合物を選択する工程、
及び/又は
　（ｃ－２）　工程（ｂ）において選択された化合物を、骨芽細胞分化系に接触させ、骨芽細胞分化又は脂肪細胞分化を検出し、骨芽細胞分化を促進する化合物又は脂肪細胞分化を抑制する化合物を選択する工程
をさらに含む方法であってもよい。

　本発明にかかる工程（ｃ－１）において、破骨細胞分化の検出としては特に制限はなく、例えば、後述の実施例において示す通り、ＴＲＡＰ染色による多核破骨細胞数、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２複合体の量、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＰＬＣγ２のチロシンリン酸化、ＲＡＮＫＬにより誘導されるカルシウム振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）、ＢＭＭｓの遊走、ＲｈｏＡの活性化の検出を利用することができる。そして、工程（ｂ）において選択された化合物を接触させていない場合に比べて、工程（ｂ）において選択された化合物を接触した場合に検出された多核破骨細胞数等が低減されていれば、該化合物を、破骨細胞分化を抑制する化合物として選択することができる。

　また、本発明にかかる工程（ｃ－２）において、骨芽細胞分化又は脂肪細胞分化の検出としては特に制限はなく、例えば、後述の実施例において示す通り、骨芽細胞遺伝子の発現量、βカテニン転写標的遺伝子の発現量、βカテニンの核内蓄積量、ＦＡＲＰ２によるＲａｃの活性化の検出を利用することができる。そして、工程（ｂ）において選択された化合物を接触させていない場合に比べて、工程（ｂ）において選択された化合物を接触した場合に検出された骨芽細胞遺伝子の発現量等が亢進されていれば、該化合物を、骨芽細胞分化を促進する化合物又は脂肪細胞分化を抑制する化合物として選択することができる。また、脂肪細胞分化の検出としては、脂肪細胞遺伝子の発現量を検出してもよく、かかる場合、工程（ｂ）において選択された化合物を接触させていない場合に比べて、工程（ｂ）において選択された化合物を接触した場合に検出された該発現量が低減されていれば、該化合物を、脂肪細胞分化を抑制する化合物として選択することができる。

　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、各実施例は、下記材料及び方法を用いて行った。

　＜細胞培養＞
　単培養系での破骨細胞分化において、単球／マクロファージ前駆細胞（ＢＭＭｓ）を得るために、骨髄細胞を１０ｎｇ・ｍｌ^－１　Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて培養した。そして、これら細胞を３日間、５～５０ｎｇ・ｍｌ^－１　ＲＡＮＫＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）及びＭ－ＣＳＦにて培養した。なお、特に記載のない限り、可溶性Ｎｒｐ１（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の存在又は非存在下、頭蓋冠細胞にて馴化した培地を、ＲＡＮＫＬ刺激の１２時間前に添加した。また、Ｓｅｍａ３Ａ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、本明細書において「組換えマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質」とも称する）は、ＲＡＮＫＬ刺激の１２時間前又は１２時間後に添加した。

　インビトロ共培養系において破骨細胞を形成させるために、「Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ら、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、２０１０年、１２０巻、３４５５～３４６５ページ（以下「Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ら、２０１０年」とも称する）」に記載の通り、骨髄細胞及び頭蓋冠細胞を１０ｎＭ　１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３及び１μＭ　ＰＧＥ_２の存在下にて培養した。

　破骨細胞の分化は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）によって評価した。

　ＮＦ－κＢ活性化は、ＮＦ－κＢ活性化阻害剤（６－アミノ－４－（フェノキシフェニルエチルアミノ）キナゾリン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を使用し、阻害した。細胞内カルシウム濃度は、「Ｋｏｇａ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４２８巻、７５８～７６３ページ」の記載に沿って測定した。

　また、インビトロにて骨芽細胞又は脂肪細胞への分化を誘導するため、頭蓋冠又は骨髄由来の細胞を骨芽細胞分化培地（１００ｍＭ　アスコルビン酸、５ｍＭ　βグリセロリン酸及び１０ｎＭ　デキサメタゾン）又は脂肪細胞分化培地（０．５ｍＭ　３－イソブチル－１－メチルキサンチン５μｇ・ｍｌ^－１　インスリン及び１μＭ　デキサメタゾン）にて、非特許文献１２及び「Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ら、２０１０年」の記載に沿って培養した。

　頭蓋冠の骨芽細胞における、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性及びミネラル化結節は非特許文献１２及び「Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ら、２０１０年」の記載に沿って検出した。

　脂肪細胞における脂質の集積は、「Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ら、２０１０年」の記載に沿って、オイルレッドＯ染色によって評価した。

　細胞増殖は、細胞増殖ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて評価した。

　アポトーシス細胞の割合は、メブステインアポトーシスキットダイレクト（ＭＢＬ社製）を用いたＴＵＮＥＬ染色を行って評価した。

　また、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）アッセイを行うため、骨髄細胞を２４ウェルプレートに播種し、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて培養した。そして、１０日目にトルイジンブルーにて細胞を染色した。

　さらに、ＣＦＵ－ＡＬＰ及びＣＦＵ－骨芽細胞（ＣＦＵ－ＯＢ）アッセイを行うため、骨髄細胞を２４ウェルプレートに播種し、上記に通り、骨芽細胞分化培地にて培養した。そして、１０日目にＣＦＵ－ＡＬＰコロニーをＡＬＰにて染色した。次いで、２５日目に、フォン－コッサ（ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ）染色により、ＣＦＵ－ＯＢコロニーを染色し、ミネラル沈着を評価した。

　初代骨芽細胞及び初代破骨細胞は、「Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｎａｔ　Ｍｅｄ、２０１１年、１７巻、１２３１～１２３４ページ（以下、「Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、２０１１年」とも称する）」に記載のＣＡＧ－ＣＡＴ－ＥＧＦＰ／Ｄｍｐ１－Ｃｒｅダブルトランスジェニックマウスの長骨から単離した。

　また、ヒト破骨細胞分化を行うために、健常者から採取した末梢血から、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ－ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いた密度勾配遠心分離法により、ヒト末梢血単核細胞を分離した。そして、分離した細胞（２×１０^５細胞／０．５ｍｌ）を、３０ｎｇ・ｍｌ^－１　Ｍ－ＣＳＦを添加した１０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭにて培養した。また、ＲＡＮＫＬ刺激の１２時間前に、ヒトＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、本明細書において「組換えヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質」とも称する）を添加した。このようにして得られた前破骨細胞を更に、３０ｎｇ・ｍｌ^－１　Ｍ－ＣＳＦ及び６０ｎｇ・ｍｌ^－１　ＲＡＮＫＬを添加した培地にて４日間培養した。なお、培地は1日おきに交換した。また、破骨細胞への分化はＴＲＡＰ染色にて評価した。

　ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ、Ｌｏｎｚａ社製）は製造会社のプロトコールに従って培養した。そして、骨芽細胞分化を誘導するために、ｈＭＳＣｓをｈＭＳＣ間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地（Ｌｏｎｚａ社製）にて、製造会社のプロトコールに従って培養した。

　＜破骨細胞分化阻害因子の精製及び同定＞
　マウス頭蓋冠細胞を１％ウシ胎児血清を添加したαＭＥＭにて静置培養した。そして、培地を７２時間馴化し、非付着細胞及びデブリを除去するため、フィルター処理した。次いで、馴化培地を、硫酸アンモニウム（４０％飽和）沈殿により濃縮した。さらに、得られたペレットを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に懸濁し、ＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて脱塩した。そして、濃縮した馴化培地を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）にて平衡化したＭｏｎｏＱ５／５０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にロードし、ＭｏｎｏＱマトリックスに結合したタンパク質を、０～１００％　１Ｍ　塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）にて勾配溶出することにより、馴化培地を分画した。タンパク質の濃度は、波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。

　馴化培地画分の破骨細胞分化への影響は、インビトロでのＲＡＮＫＬによる破骨細胞分化誘導系に各画分を直接添加することにより調べた。そして、破骨細胞分化を強く阻害した画分中のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社製）に溶解した。次いで、このようにして調製したサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて展開した。そして、タンパク質のバンドをＣＢＢ染色により可視化し、メスにて全てのタンパク質のバンドを各々切り出した。切り出したゲルサンプルの分析は、日本バイオサービス社に委託し、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析）にて行った。次いで、各タンパク質の同定のために、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって得たデータを、ＭＡＳＣＯＴプログラムにて解析した。

　＜免疫組織染色＞
　４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）にて固定した後、４℃にて２週間、骨組織を脱灰させた。そして、脱水させた後、パラフィンに包埋した。次いで、免疫組織染色のために、室温にて２時間、１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．０）により抗原賦活化処理を行った。そして、３％Ｈ_２Ｏ_２／メタノールにてインキュベーションすることにより、内在性ぺルオキシダーゼ活性を不活化した後、切片を抗Ｓｅｍａ３Ａポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と共に、免疫反応促進試薬（Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ，　ＴＯＹＯＢＯ社製）にて、４℃で一晩インキュベーションした。次いで、ＰＢＳにて洗浄した後、メーカーの使用説明書に従って、切片をぺルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ，Ｎｉｃｈｉｒｅｉ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と共にインキュベーションした。そして、このようにして得られたシグナルは、３，３’，４，４’－テトラアミノビフェニル四塩酸塩（ＤＡＢ）及びＨ_２Ｏ_２にて可視化した。また、免疫染色後、ＴＲＡＰ染色を行った。さらに、へマトキシリンを用いて、核の対比染色を行った。

　＜ウェスタンブロット及び免疫沈降アッセイ＞
　細胞溶解液又は培養上清を、下記特異的抗体を用いたウェスタンブロットに供した。
Ｎｒｐ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、β－ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、Ｓｅｍａ３Ａ、ｐ５０、ｐ６５、Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ１（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＪＮＫ、ＪＮＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８、ｐ３８、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＩＫＫα／β、ＩＫＫα、ＩＫＫα/β、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＰＬＣγ２、ＰＬＣγ２（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、β－ｃａｔｅｎｉｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、α－ｔｕｂｕｌｉｎ（ＭＢＬ社製）。

　核タンパク質は、核抽出キット（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｆ社製）にて、そのメーカーの使用説明書に沿って調製した。

　免疫沈降アッセイにおいて、先ず、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加した溶解バッファー（１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０　ｉｎ　５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＮａＦ、２ｍＭ　ＰＭＳＦ）にて細胞を溶解した。次いで、このようにして調製した細胞溶解液を、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）又は抗Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と共にインキュベーションし、次いでダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加することにより、免疫沈降を行った。そして、このようにして調製した免疫複合体を電気泳動にて分画し、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体、抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、抗Ｎｒｐ１抗体、抗Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１抗体、抗ＤＡＰ１２抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及び抗ＴＲＥＭ２抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてブロッティングした。

　＜フローサイトメトリー分析＞
　骨髄由来の破骨前駆細胞を分析するために、マウス骨髄細胞の単細胞懸濁液を下記抗体にて染色した。
抗ＣＤ３ε抗体（１４５－２Ｃ１１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗Ｂ２２０抗体（ＲＡ３－６Ｂ２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１１ｂ抗体（Ｍ１／７０，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１１５抗体（ＡＦＳ９８，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１１７抗体（２Ｂ８，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）。

　また、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１５抗体及び抗Ｎｒｐ１抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ＢＭＭｓの細胞内染色を行った。

　そして、フローサイトメトリー分析は、Ｄｉｖａソフトウェアを備えたＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行った。

　＜ＥＬＩＳＡ＞
　血清中の可溶性ＲＡＮＫＬ及びＯｐｇの濃度は、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、そのメーカーの使用説明書に従って導出した。また、血清中のＳｅｍａ３Ａの濃度は、ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）を用い、そのメーカーの使用説明書に従って導出した。

　＜レトロウィルスによる遺伝子導入＞
　Ｎｒｐ１をコードするＤＮＡ断片をｐＭＸｓ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰに挿入することにより、レトロウィルスベクターｐＭＸｓ－Ｎｒｐ１－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰを構築した。

　レトロウィルスベクター　ｐＭＸ－ＦＡＲＰ２－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ及びｐＭＸ－ΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２－ＩＲＥＳ－ＧＦＰの構築は「Ｔａｋｅｇａｈａｒａ，Ｎ．ら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ、２０１０年、２４巻、４７８２～４７９２ページ（以下「Ｔａｋｅｇａｈａｒａ，Ｎ．ら、２０１０年」とも称する）」の記載に沿って行った。

　ｐＳＩＲＥＮ－ＲｅｔｒｏＱ－ＺｓＧｒｅｅｎ－ｓｈＮｒｐ１及びｐＳＩＲＥＮ－ＲｅｔｒｏＱ－ＺｓＧｒｅｅｎ－ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ構築は、ヘアピン配列における下記ＲＮＡ標的領域をＲＮＡｉ－Ｒｅａｄｙ　ｐＳＩＲＥＮ－ＲｅｔｒｏＱ－ＺｓＧｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入することにより行った。
ｓｈＮｒｐ１　センス鎖：
５’－ｇａｔｃｃＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴｇ－３’（配列番号：１）
ｓｈＮｒｐ１　アンチセンス鎖：
５’－ａａｔｔｃＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣＧＧＧＣｇ－３’（配列番号：２）
ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ　センス鎖：
５’－ｇａｔｃｃＧＴＧＣＧＴＴＧＣＴＡＧＴＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＡＣＧＣＧＴｇ－３’（配列番号：３）
ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ　アンチセンス鎖：
５’－ａａｔｔｃＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴＡＣＴＡＧＣＡＡＣＧＣＡＣｇ－３’（配列番号：４）。

　そして、これらレトロウィルスベクターをＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、Ｐｌａｔ－Ｅパッケージング細胞に導入することにより、レトロウィルス上清を得た。

　＜クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ＞
　ＣｈＩＰアッセイは、ＣｈＩＰエクスプレスクロマチン沈降キット（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｆ社製）を用い、そのメーカーの使用説明書に従って行った。

　ＣｈＩＰアッセイにおいて用いた抗体は、抗ｐ５０抗体、抗ｐ６５抗体及びノ―マルウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）である。また、用いたプライマーの配列は下記の通りである。
Ｎｒｐ１領域１
５’－ＣＡＴＡＣＧＴＧＡＣＣＴＴＧＣＧＣＴＣＴ－３’（配列番号：５）
５’－ＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＡ－３’（配列番号：６）
Ｎｒｐ１領域２
５’－ＡＣＣＴＴＡＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴ－３’（配列番号：７）
５’－ＡＴＡＣＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＡＣＧＡＧ－３’（配列番号：８）
Ｎｒｐ１領域３
５’－ＡＴＧＴＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧ－３’（配列番号：９）
５’－ＴＧＣＴＴＣＴＡＣＣＴＴＣＧＧＧＴＧＡＴ－３’（配列番号：１０）。

　＜レポーター遺伝子アッセイ＞
　レポーター遺伝子アッセイにおいて、先ず、マウスＮｒｐ１遺伝子の５’フランク領域の３２５９ｂｐをｐＧＬ３ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてサブクローニングすることにより、レポータープラスミドＮｒｐ１－Ｌｕｃを構築した。次いで、レポータープラスミド及び発現プラスミドを、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）により、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入した。そして、その３６時間後、メーカーの使用説明書に従って、デュアルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を行った。

　＜遊走（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）アッセイ＞
　遊走アッセイにおいて、コンプリート培地に懸濁したＢＭＭｓをトランスウェルユニット（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の上部チャンバーに添加した。また、Ｓｅｍａ３Ａ－Ｆｃ含有又は非含有トランスウェルユニットの下部チャンバー内にインサートを入れた。そして、インキュベーション後、細胞を４％ＰＦＡにて固定し、０．５％トルイジンブルーにて染色した。メンブレン上部の細胞を除去し、メンブレン下部及びチャンバーに遊走した細胞を数えた。

　＜Ｇ－ＬＩＳＡ　低分子量Ｇタンパク質活性化アッセイ＞
　Ｇ－ＬＩＳＡにおいて、ＲｈｏＡ及びＲａｃ　ＧＴＰアーゼの活性化を、Ｇ－ＬＩＳＡ　ＲｈｏＡ及びＲａｃ吸光度に基づくアッセイ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）を用い、それらのメーカーの使用説明書に従って評価した。すなわち、細胞溶解液を調製して、標準化し、次いで、ＲｈｏＡに対する抗体又はＲａｃに対する抗体を添加し、西洋ワサビぺルオキシダーゼ検出試薬と共にインキュベーションした後、分光光度計にてシグナルを検出した。

　＜定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析及びジーンチップ解析＞
　定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析は、非特許文献１２、「Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、２０１１年」、「Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ら、２０１０年」及び「Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ、２０１０年、３９３巻、４３２～４３８ページ(以下「Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．ら、２０１０年」とも称する）」の記載に沿って行った。すなわち、トータルＲＮＡはＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社製）により、その使用説明書に従って抽出した。次いで、ファーストストランドｃＤＮＡは、スーパースクリプト３逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて合成した。そして、定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析は、ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びサイバーグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックス（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて行った。

　ジーンチップによる分析及び遺伝子セット濃縮分析（ｇｅｎｅ　ｓｅｔ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　（ＧＳＥＡ））は「Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、２０１１年」の記載に沿って行った。

　＜マウス及び骨の分析＞
　Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス、Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウス、Ｆｏｓ^－／－マウス、Ｎｆａｔｃ１^－／－マウス、Ｔｎｆｒｓｆ１１ｂ^－／－マウス及びＴｙｒｏｂｐ^－／－マウスは、「Ｇｕ，Ｃ．ら、Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ、２００３年、５巻、４５～５７ページ（以下「Ｇｕ，Ｃ．ら、２００３年」とも称する）」、「Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９７年、１９巻、５１９～５３０ページ」、「Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ，Ａ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、２６６巻、４４３～４４８ページ」、「Ａｓａｇｉｒｉ，Ｍ．ら、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ、２００５年、２０２巻、１２６１～１２６９ページ」、「Ｍｉｚｕｎｏ，ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ、１９９８年、２４７巻、６１０～６１５ページ」及び「Ｋａｉｆｕ，Ｔ．ら、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、２００３年、１１１巻、３２３～３３２ページ」の記載に沿って調製した。なお、全てのマウスは特定病原微生物の非存在下（ＳＰＦ）にて維持した。また、全ての動物実験は、東京医科歯科大学の動物管理使用委員会の承認のもと行った。

　三次元マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）分析及び骨形態計測的分析は、非特許文献１２、「Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、２０１１年」、「Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ら、２０１０年」及び「Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．ら、２０１０年」の記載に沿って行った。

　レントゲン写真は、高分解能軟Ｘ線撮影装置（ＳＯＦＴＥＸ社製）により撮影した。

　＜組換えマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質によるインビボでの処理＞
　５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに１ｍｇ・ｋｇ^－１体重のＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃ又はビークル（溶媒）を毎週静脈注射し、それを４週間続けた。そして、最後の静脈注射から３日経過した後、上述の通り、骨を分析した。

　＜骨再生モデル＞
　骨再生モデルにおいては、「Ｎａｇａｓｈｉｍａ，Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ、２００５年、３６巻、５０２～５１１ページ」に記載の通り、マウスの骨を損傷させた。すなわち、先ず、ペントバルビタールナトリウムを腹腔内に注射することにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを麻酔した。そして、５ｍｍの縦切開を大腿近位部に施し、筋肉を裂くことにより、骨表面を露出させた。次いで、両大腿骨の骨幹の前方部分にドリルにて０．５ｍｍの穴を開けた。また、この術後４日目及び７日目に、Ｓｅｍａ３Ａ－Ｆｃ（０．５ｍｇ・ｋｇ^－１体重）を損傷部位に注入することにより、大腿骨損傷部をＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃによって処理した。そして、術後１４日目にマウスを屠殺し、骨を分析した。

　＜卵巣摘出マウス＞
　９週齢の雌マウスに、卵巣摘出の手術又は偽手術を施した。卵巣摘出マウスには４週間、週に１回、１ｍｇ・ｋｇ^－１体重のＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃ又はビークル（溶媒）を静脈注射した。そして、最後の注射の３日後に、全てのマウスを屠殺し、骨を分析した。

　＜統計的分析＞
　統計的分析は、不対両側のスチューデントｔ検定（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳ．有意でない）により実施した。また、全てのデータは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ（平均値±標準誤差、ｎ＝４以上）として算出した。

　（実施例１）
　＜骨芽細胞における、Ｓｅｍａ３Ａによる抗破骨細胞形成活性の調節＞
　マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）の存在下にて、ＲＡＮＫＬ刺激により誘導される、骨髄由来の単球／マクロファージ前駆細胞（ＢＭＭｓ）から破骨細胞への分化は、骨芽細胞の馴化培地によって阻害される（図４参照）。Ｔｎｆｒｓｆ１１ｂ遺伝子によってコードされているＯｐｇは、この阻害活性に関与していることは確認されている。

　しかしながら、本発明者らは、Ｏｐｇ欠損頭蓋冠細胞の馴化培地は、実質的な抗破骨細胞形成活性を有していることも観察しており（図４参照）、このことから、Ｏｐｇ以外の１以上の複数の可溶性阻害因子が存在していることが示唆された。

　そこで、骨芽細胞によって分泌され、破骨細胞分化を抑制する蛋白質を同定するため、先ず、Ｔｎｆｒｓｆ１１ｂ^－／－頭蓋冠細胞の馴化培地を、陰イオン交換液体クロマトグラフィーにより分画した（図５参照）。そして、破骨細胞分化に対して強い阻害効果を発揮する画分として、高濃度の塩化ナトリウムを含む画分３３～３５以外に、画分８～１０を見出した（図５及び６参照）。なお、イオン交換クロマトグラフィーの溶出液は、破骨細胞分化に対して阻害効果を発揮するため、画分３３～３５における阻害効果は高塩故のことと推測される（図７参照）。

　次に、画分９にはウシ由来のタンパク質のコンタミネーションが認められたため（データには示さず）、画分８～１０において、画分８に着目した。すなわち、画分８におけるタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分画し（図８参照）、次いで、メジャーなバンドを切り出して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。得られた結果を表１に示す。

　また、前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａ中のポリペプチドのアミノ酸配列は下記の通りである。なお、各アミノ酸配列の末尾に付した括弧内の数値は、マウスＳｅｍａ３Ａタンパク質中における各ポリペプチドの位置を表わす。
配列番号：１１
ＤＨＩＦＳＦＮＬＶＮＩＫＤＦＱＫＩＶＷＰＶＳＹＴＲ　（７５～９９位）
配列番号：１２
ＷＡＧＫＤＩＬＫ　（１０５～１１２位）
配列番号：１３
ＬＬＴＡＳＬＬＩＤＧＥＬＹＳＧＴＡＡＤＦＭＧＲ　（１７５～１９７位）
配列番号：１４
ＷＬＮＤＰＲＦＩＳＡＨＬＩＰＥＳＤＮＰＥＤＤＫＶＹＦＦＦＲ　（２２０～２４８位）
配列番号：１５
ＬＩＣＳＶＰＧＰＮＧＩＤＴＨＦＤＥＬＱＤＶＦＬＭＮＳＫ　（２９１～３１７位）
配列番号：１６
ＮＰＩＶＹＧＶＦＴＴＳＳＮＩＦＫＧＳＡＶＣＭＹＳＭＳＤＶＲＲＶＦＬＧＰＹＡＨＲＤＧＰＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲＰＧＴＣＰＳＫＴＦＧＧＦＤＳＴＫＤＬＰＤＤＶＩＴＦＡＲＳＨＰＡＭＹＮＰＶＦＰＩＮＮＲＰＩＭＩＫＴＤＶＮＹＱＦＴＱＩＶＶＤＲ　（３２１～４３８位）
配列番号：１７
ＥＰＴＴＩＳＡＭＥＬＳＴＫＱＱＱＬＹＩＧＳＴＡＧＶＡＱＬＰＬＨＲ　（４８５～５１６位）
配列番号：１８
ＤＰＹＣＡＷＤＧＳＳＣＳＲ　（５３２～５４４位）
配列番号：１９
ＡＬＶＹＷＱＦＱＲ　（６０５～６１３位）
配列番号：２０
ＴＥＱＧＬＬＬＲ　（６３１～６３８位）
配列番号：２１
ＶＴＬＥＶＩＤＴＥＨＬＥＥＬＬＨＫＤＤＤＧＤＧＳＫＩＫＥＭＳＳＳＭＴＰＳＱＫ　（６６４～７０１位）
配列番号：２２
ＤＦＭＱＬＩＮＨＰＮＬＮＴＭＤＥＦＣＥＱＶＷＫ　（７０６～７２８位）。

　表１に記載の同定されたタンパク質において、最近の研究成果から、軸索誘導分子は、骨芽細胞と破骨細胞との相互作用に関与することが示唆されているため（非特許文献１２～１４）、本発明者らは、軸索誘導分子として知られているＳｅｍａ３Ａ（非特許文献１５～１６）に注目し、Ｏｐｇ欠損頭蓋冠細胞の馴化培地から得た画分８等について更なる解析を行った。

　その結果、ウェスタンブロット分析により、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質は画分８及び９に存在していることが確認された（図９参照）。さらに、Ｓｅｍａ３Ａのデコイレセプターとして機能する可溶性Ｎｒｐ１の添加によって、画分９の破骨細胞分化に対する阻害効果は解消されたため（図１０参照）、画分９のこの阻害効果は主にＳｅｍａ３Ａによるものであることが明らかになった。

　そこで、前記画分に代えて、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質（組換えマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質）を用いて、破骨細胞分化への影響を調べた。その結果、破骨細胞の分化誘導系において、ＲＡＮＫＬ処理をする前に組換えマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質を添加した際には、該組換えマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質は、用量依存的に破骨細胞分化を強く阻害することが明らかになった（図１１参照）。しかし、ＲＡＮＫＬ処理をした後にＳｅｍａ３Ａを添加した場合には、この阻害効果は確認されなかった（図１２参照）。

　また、様々な組織、細胞におけるＳｅｍａ３ａの発現をＢｉｏＧＰＳ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇ／＃ｇｏｔｏ＝ｗｅｌｃｏｍｅ）にて調べたところ、図には示さないが、肺、子宮、膀胱、へその緒、脾臓、リンパ節、大脳皮質、扁桃、嗅球、脊髄及び背側線条体等において、Ｓｅｍａ３ａの発現は認められ、特に骨芽細胞系の細胞にてＳｅｍａ３ａの強い発現が確認された。

　また、定量的ＲＴ－ＰＣＲ及び免疫組織化学により分析した結果、図１３～１５に記載の通り、前記同様に骨芽細胞系の細胞にてＳｅｍａ３ａの強い発現が確認された。一方、破骨細胞においては、Ｓｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ及びタンパク質いずれも検出することはできなかった。さらに、頭蓋冠細胞におけるＳｅｍａ３ａ　ｍＲＮＡ発現は、セマフォリンファミリーの他のメンバーのそれよりも高いことも明らかになった（図１６参照）。

　（実施例２）
　＜Ｎｒｐ１を介した、Ｓｅｍａ３Ａによる破骨細胞分化の制御＞
　実施例１に示した結果を受け、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスの骨の表現型を調べた。得られた結果を図１７～２１に示す。図１７～２１に示す通り、骨の形態学的及び放射線学的分析、並びにマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）により、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウスは、破骨細胞の数及び骨吸収面の増加を伴う、ひどい骨減少性の表現型を有していることが明らかになった。

　このような表現型の要因を探るべく、先ず、骨髄における破骨前駆細胞の数にＳｅｍａ３Ａの欠損が影響を与えているかどうかを調べた。すなわち、ＣＤ１１ｂ^{ｌｏｗ／－}ＣＤ３ε^－Ｂ２２０^－ｃ^－ｆｍｓ^＋ｃ^－ｋｉｔ^＋細胞（「Ｊａｃｑｕｉｎ，Ｃ．ら、Ｊ　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ　Ｒｅｓ、２００６年、２１巻、６７～７７ページ」参照）の数を調べ、野生型（ＷＴ）マウスとＳｅｍａ３ａ^－／－マウスとを比較したが、それらの数に差はないことが明らかになった（図２１のｂ　参照）。

　次に、骨髄と頭蓋冠細胞との共培養において、破骨細胞の形成を分析した。その結果、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）陽性の多核破骨細胞（ＭＮＣ）の形成が著しく亢進していることが明らかになった（図２２～２４参照）。しかし、ＲＡＮＫＬ及びＭ－ＣＳＦによりＢＭＭｓを刺激した場合には、この破骨細胞の形成の亢進は観察されなかった（図２４参照）。また、野生型骨髄とＳｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞との共培養においても、破骨細胞形成の亢進は観察された。しかし、Ｓｅｍａ３ａ^－／－骨髄と野生型頭蓋冠細胞との共培養においては、かかる亢進は確認されなかった（図２２及び２３参照）。従って、これらの結果から、骨芽細胞系細胞におけるＳｅｍａ３Ａの発現は破骨細胞形成を阻害することが示された。

　また、頭蓋冠細胞におけるＴｎｆｓｆ１１ｂ遺伝子（ＲＡＮＫＬをコードする遺伝子）及びＴｎｆｒｓｆ１１ｂ　ｍＲＮＡの発現の発現、並びに可溶性ＲＡＮＫＬ及びＯｐｇの血清濃度は、Ｓｅｍａ３Ａの欠損により影響を受けていないことを確認した（図２５参照）。

　Ｓｅｍａ３Ａは、神経系及び免疫系において、Ｎｒｐ１及びクラスＡプレキシン（Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４）からなるリガンド結合性サブユニットの受容体複合体と結合し、シグナル伝達サブユニットとして機能することが知られている（「Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．ら、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ、２００８年、８巻、６３２～６４５ページ」参照）。

　そこで、骨芽細胞系細胞から産生されたＳｅｍａ３Ａによる破骨細胞形成の阻害作用の機序を解明するために、ＲＡＮＫＬ刺激前後の前記サブユニットの発現量の変化を調べた。その結果、前記サブユニットの中で、ＲＡＮＫＬ刺激の後、ＢＭＭｓにおけるＮｒｐ１発現は急速かつ顕著に抑制されることが明らかになった（図２６参照）。

　前述の通り、Ｓｅｍａ３Ａが誘導する破骨細胞形成の抑制は、ＲＡＮＫＬ刺激前にＳｅｍａ３Ａを添加した際にのみ観察された（図１１及び１２参照）。そのため、ＲＡＮＫＬ刺激後にはＮｒｐ１のダウンレギュレーションが生じるため、Ｓｅｍａ３Ａによって破骨細胞形成は抑制されないということが想定される。

　そこで、先ずは、Ｎｒｐ１を過剰発現させた際のＳｅｍａ３Ａによる破骨細胞形成に対する阻害効果を調べた。その結果、レトロウィルス導入によりＮｒｐ１を過剰発現させた際には、ＲＡＮＫＬ刺激後にＳｅｍａ３Ａを添加した場合でさえも、破骨細胞への分化は阻害されることが明らかになった（図２７のａ参照）。対して、ｓｈＲＮＡによりＮｒｐ１をノックダウンした際には、破骨細胞分化に対するＳｅｍａ３Ａの阻害効果は解消された（図２７のｂ参照）。

　従って、Ｎｒｐ１の発現レベルと、破骨細胞形成に対するＳｅｍａ３Ａの阻害効果とは相関し、ＲＡＮＫＬのシグナル伝達によって生じるＮｒｐ１のダウンレギュレーションは、Ｓｅｍａ３Ａによる阻害効果を無効にし、適切な破骨細胞分化を誘導するために重要であることが示された。

　Ｎｒｐ１^－／－マウスは胎生致死であり、またＮｒｐ１には血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）結合部位も含まれている（「Ｇｕ，Ｃ．ら、２００３年」参照）。そこで、骨の恒常性とＮｒｐ１との生理学的関連性を調べるため、Ｓｅｍａ結合部位が欠損しているＮｒｐ１変異体とＮｒｐ１とを置換したノックインマウス（Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウス）を分析した。得られらた結果を図２７のｃ及び図２８に示す。

　前述の通り、Ｓｅｍａ３Ａは、Ｎｒｐ１と結合することによって、図２７のｃ及び図２８に示した結果から明らかなように、破骨細胞形成を阻害するため、Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}細胞において、ＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞分化は、Ｓｅｍａ３Ａによって阻害されなかった。さらには、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス同様に、破骨細胞分化の亢進に伴い、Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスは、骨減少性の表現型を示すことも明らかになった(図２９～３１参照）。

　次に、ＲＡＮＫＬによるＮｒｐ１発現阻害のメカニズムを解明するため、ＮＦ－κＢ、ｃ－Ｆｏｓ及び活性化Ｔ細胞核内因子ｃ１（ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ（ＮＦＡＴ）ｃ１）の関与を調べた。なお、これら全ての因子は、ＲＡＮＫＬによって活性化されることが知られている（非特許文献１　参照）。得られた結果を図３２に示す。

　図３２に示す結果から明らかなように、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＮｒｐ１発現のダウンレギュレーションは、ＮＦ－κＢ阻害剤によって無効になった。しかし、ＮＦＡＴｃ１又はｃ－Ｆｏｓの欠損による影響は認められなかった。

　また、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイによって、ＲＡＮＫＬ刺激後には、Ｎｒｐ１プロモーターのＮＦ－κＢ結合サイト近傍に、ＮＦ－κＢ　ｐ６５がリクルートされ、またＮＦ－κＢ　ｐ６５ほどではないが、ｐ５０もリクルートされることが明らかになった（図３３参照）。さらに、図３４のａに示す通り、レポーター遺伝子アッセイによって、ＮＦ－κＢ　ｐ６５及びｐ５０は、Ｎｒｐ１プロモーターの活性を阻害することも明らかになった。

　また、図３４のｂ及びｃに示す通り、レトロウィルスによって、ＢＭＭｓにおけるｐ６５及びｐ５０を過剰に発現させたところ、ヒストン脱アセチル化に依存して、Ｎｒｐ１のダウンレギュレーションが生じることも明らかになり、ＲＡＮＫＬによって刺激されたＮＦ－κＢにより動員されたコリプレッサーが、Ｎｒｐ１のダウンレギュレーションに関与していることも示された。

　（実施例３）
　＜Ｓｅｍａ３Ａによる破骨細胞形成抑制のメカニズム＞
　破骨細胞分化において、ＲＡＮＫＬと、その受容体であるＲＡＮＫとの結合によって、ＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ経路を刺激するＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＮＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　６；ＴＲＡＦ６）の活性化が生じる（非特許文献１）。さらに、ＲＡＮＫＬは、転写因子ＮＦＡＴｃ１をＮＦ－κＢと協調して誘導するｃ－Ｆｏｓを含むＡＰ－１を活性化することも知られている（非特許文献１及び「Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．ら、Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ、２００２年、３巻、８８９～９０１ページ」参照）。また、ＮＦＡＴｃ１の強い誘導は、ＩＴＡＭを有するアダプターであるＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＮＡＸ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１２　（ＤＡＰ１２））及びＦｃ受容体共通γサブユニット（ＦｃＲγ）によって刺激されるカルシウムシグナル伝達（共刺激シグナル伝達）に依存することも明らかになっている。なお、これらＩＴＡＭを有するアダプターは、ミエロイド細胞で発現されるトリガー受容体（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｃｅｌｌｓ　２（ＴＲＥＭ２））及び破骨細胞関連受容体（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　（ＯＳＣＡＲ））等のイムノグロブリン様受容体と結合する（非特許文献１及び「Ｋｏｇａ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４２８巻、７５８～７６３ページ」参照）。

　そこで、このような破骨細胞形成シグナル伝達を、Ｓｅｍａ３Ａ－Ｎｒｐ１軸（ａｘｉｓ）はどのようにして抑制しているのかを調べるため、先ず、Ｓｅｍａ３Ａ処理による破骨細胞分化関連因子の発現への影響を調べた。得られた結果を図３５のａに示す。

　図３５のａに示した結果から明らかなように、Ｓｅｍａ３ＡはＴｎｆｒｓｆ１１ａ遺伝子又はＣｓｆ１ｒ遺伝子の発現に影響を与えることなく、ＲＡＮＫＬ刺激により誘導されるＣｔｓｋ遺伝子、Ａｃｐ５遺伝子及びＮｆｔａｃ１遺伝子といった破骨細胞遺伝子の発現を著しく低減させた。

　次に、破骨前駆細胞における細胞増殖率及びアポトーシス細胞の割合（％）に対するＳｅｍａ３Ａによる影響を評価した。しかし、Ｓｅｍａ３Ａで処理した細胞と、その対照細胞との間で差は認められなかった（図３５のｂ及びｃ参照）。また、ＭＡＰＫｓ（ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８）及びＩκＢキナーゼが関与するＴＲＡＦ６下流のシグナル伝達に対するＳｅｍａ３Ａによる影響を評価した。しかし、該シグナルのＲＡＮＫＬによる活性化は、Ｓｅｍａ３Ａを有するＢＭＭｓとＳｅｍａ３Ａが欠損しているＢＭＭｓとでは同程度であることが明らかになった（図３６参照）。

　セマフォリン６Ｄ（Ｓｅｍａ６Ｄ）等のリガンドに応答して生じる、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２複合体形成を介して、ＩＴＡＭシグナルは活性化される。そして、該活性化により、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１は破骨細胞分化を活性化することが明らかになっている（「Ｔａｋｅｇａｈａｒａ，Ｎ．ら、Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、２００６年、８巻、６１５～６２２ページ」参照）。しかしながら、ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２シグナル伝達の代わりに、Ｓｅｍａ３Ａシグナル伝達を調節するＮｒｐ１とＰｌｅｘｉｎ－Ａ１とは構成的に会合していることも知られている（「Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ、２９巻、２００１年、４２９～４３９ページ」参照）。

　そこで、Ｎｒｐ１の発現量を亢進させることにより、Ｎｒｐ１量が増大している状況下におけるＰｌｅｘｉｎ－Ａ１とＴＲＥＭ２との相互作用について調べた。得られた結果を図１８のａに示す。図３７のａに示した結果から明らかなように、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１と結合しているＴＲＥＭ２の量は減少し、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１と結合しているＮｒｐ１の量は増加した。

　また、Ｓｅｍａ３Ａ処理によるＰｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２複合体及びＰｌｅｘｉｎ－Ａ１－Ｎｒｐ１複合体への影響を調べた。得られた結果を図３７のｂに示す。

　図３７のｂに示した結果から明らかなように、ＲＡＮＫＬは、Ｎｒｐ１をダウンレギュレーションすることにより、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２複合体の形成を誘導した。そして、この複合体形成によって、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１－Ｎｒｐ１複合体からＰｌｅｘｉｎ－Ａ１は解離することになった（図３７のｂの「Ｃｏｎｔｒｏｌ」　参照）。しかし、Ｓｅｍａ３Ａ処理により、Ｎｒｐ１のダウンレギュレーションは抑制され、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１－Ｎｒｐ１複合体が維持されたことにより、ＲＡＮＫＬが誘導するＰｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２複合体の形成は阻害された（図３７のｂの「「Ｓｅｍａ３Ａ」　参照）。

　また、図３８に示す通り、細胞表面及び細胞内におけるＮｒｐ１の発現は、ＲＡＮＫＬ処理により著しく低下した。しかし、Ｓｅｍａ３Ａ処理によりＮｒｐ１の細胞内陥入（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が生じることは明らかになっており（Ｎａｒａｚａｋｉ，Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００６年、１０７巻、３８９２～３９０１ページ」参照）、Ｎｒｐ１　ｍＲＮＡの発現量を変化させることなく、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＮｒｐ１のダウンレギュレーションを保護することになる（図３９のａｂ～ｃ及び図４０参照）。

　さらに、図４１のａ～ｃに示す通り、ＲＡＮＫＬによって誘導されるＰＬＣγ２のチロシンリン酸化及びカルシウム振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）は共に、Ｓｅｍａ３Ａ処理によって劇的に阻害されることが明らかになった。

　また、図４２のａ及びｂに示す通り、Ｓｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞との共培養においてでさえ、ＤＡＰ１２欠損骨髄細胞における破骨細胞の分化は増強されていないことも明らかになり、ＤＡＰ１２調節によって誘導されるＩＴＡＭシグナル伝達によって、Ｓｅｍａ３Ａによる阻害効果は調節されていることが示された。

　従って、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１をめぐってＮｒｐ１とＴＲＥＭ２とが拮抗することによって、Ｓｅｍａ３ＡはＰｌｅｘｉｎ－Ａ１－ＴＲＥＭ２－ＤＡＰ１２が誘導する共刺激シグナルの抑制因子として機能することが明らかになった。

　Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ－Ｐｌｅｘｉｎ系はアクチン細胞骨格の再構築を制御することが知られている（非特許文献１６及び「Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．ら、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ、２００８年、８巻、６３２～６４５ページ（以下「Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．ら、２００８年」とも称する）」参照）。そこで、ＢＭＭｓの遊走におけるＳｅｍａ３Ａの影響を調べた。

　その結果、Ｍ－ＣＳＦによって誘導されるＢＭＭｓの遊走において、Ｓｅｍａ３Ａは反発効果を示すことが明らかになった（図４３のａ「ＷＴ」　参照）。これに対し、この反発効果はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}ＢＭＭｓにおいては確認されなかった（図４３のａ「Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}」　参照）。

　また、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ－Ｐｌｅｘｉｎシグナル伝達は、Ｒｈｏファミリー低分子ＧＴＰアーゼを制御することも知られている（非特許文献１６及び「Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．ら、２００８年」）。そこで、Ｍ－ＣＳＦによって誘導されるＲｈｏ－Ａ及びＲａｃ－ＧＴＰアーゼの活性化における、Ｓｅｍａ３Ａ処理の影響を調べた。

　その結果、Ｓｅｍａ３Ａ処理によって、Ｍ－ＣＳＦに応じたＲｈｏＡの活性化は無効となった（図４３のｂ参照）。しかし、Ｒａｃの活性化には影響は認められなかったため（図４３のｃ参照）、ＢＭＭｓ遊走に対するＳｅｍａ３Ａの阻害効果に、ＲｈｏＡ活性化の阻害が関与していることが示された。

　（実施例４）
　＜古典的Ｗｎｔ経路を介した、Ｓｅｍａ３Ａによる骨芽細胞分化の制御＞
　図４４及び４５に示す通り、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスは、破骨細胞の表現型に加え、骨芽細胞の表現型及び脂肪細胞の表現型を示すことが明らかになった。すなわち、体重あたりの精巣上体の白色脂肪組織の重量においては有意な差はないが（図４７のｅ及びｊ参照）、骨芽細胞の数は減少しており、脂肪細胞の数は顕著に増加していた（図４６のａ～ｆ及び図４７のａ～ｄ及びｆ～ｉ参照）。

　従って、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスにおけるひどい骨減少性の表現型は、前述の破骨細胞による骨吸収の増強と、骨芽細胞による骨形成の低減とによって生じていると考えられる。

　そこで、Ｓｅｍａ３ａの骨芽細胞分化への影響を調べるため、先ずはＳｅｍａ３ａ^－／－マウス又はＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}マウスから得た頭蓋冠骨を、Ｓｅｍａ３Ａの存在下又は非存在下、骨芽細胞分化培地にて培養した。

　その結果、アルカリホスファタ―ゼ（ＡＬＰ）及び骨結節（ｂｏｎｅ　ｎｏｄｕｌｅ）の形成は、Ｓｅｍａ３ａ^－／－細胞及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}細胞において顕著に減少した。また、Ｓｅｍａ３Ａ処理により、Ｓｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞から骨芽細胞への分化は促進されたが、Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}細胞においては促進されなかった（図４８及び４９参照）。さらに、これら２種の変異細胞において、細胞の増加率及びアポトーシス細胞の割合には影響はないことも確認された（図５０参照）。

　また、図５１及び５２に示した結果から明らかなように、Ｓｅｍａ３ａ^－／－細胞及びＮｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}細胞において、脂肪細胞分化は大いに増強されていた。さらに、Ｓｅｍａ３Ａ処理によって、野生型の細胞及びＳｅｍａ３ａ^－／－細胞からの脂肪細胞への分化は阻害されるが、Ｎｒｐ１^{Ｓｅｍａ－}細胞においては阻害されないことも明らかになった。

　さらに、図５３のａに示した結果から明らかなように、Ｓｅｍａ３ａ^－／－細胞において、骨芽細胞遺伝子　Ｒｕｎｘ２、Ｓｐ７（Ｏｓｔｅｒｉｘをコードする遺伝子）、Ａｌｐｌ及びＢｇｌａｐ（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎをコードする遺伝子）の発現は強く抑制されていた。一方、脂肪細胞遺伝子　Ｐｐａｒｇ、Ｃｅｂｐａ、Ｆａｂｐ４（ａＰ２をコードする遺伝子）及びＬｐｌ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｐａｓｅをコードする遺伝子）の発現は大いに増加していた（図５３のｂ参照）。

　従って、これらの結果から、Ｓｅｍａ３Ａは、Ｎｒｐ１を介して、骨芽細胞分化を活性化し、脂肪細胞分化を阻害することが示された。

　そこで、どのようなシグナル伝達を介して、Ｓｅｍａ３Ａは骨芽細胞分化及び脂肪細胞分化を調節しているのかを明らかにするため、先ず、間葉系細胞分化の調節遺伝子として知られている遺伝子（「Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ら、２０１０年」及び「Ｇｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００６年、９８巻、２５１～２６６ページ（以下「Ｇｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．ら、２００６年」とも称する」）参照）のｍＲＮＡ発現を、野生型の細胞とＳｅｍａ３ａ^－／－細胞とで比較した（図５３のｃ参照）。そして、骨芽細胞においてＳｅｍａ３Ａが活性化する分子経路を洞察するため、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の頭蓋冠細胞における遺伝子発現プロファイリングを行った。得られた結果を図５３のｃ及び図５４のａ、並びに表２及び３に示す。なお、表２には、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の頭蓋冠細胞において発現の亢進が認められた遺伝子を示し、表３には、Ｓｅｍａ３ａ^－／－マウス由来の頭蓋冠細胞において発現の低減が認められた遺伝子を示す。

　図５３のｃ及び図５４のａ、並びに表２及び３に示す通り、遺伝子セット濃縮解析（ｇｅｎｅ　ｓｅｔ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ：ＧＳＥＡ）により、Ｓｅｍａ３ａ^－／－細胞においては、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）シグナル伝達経路及び代謝経路等の脂肪細胞の分化及び機能に関与する遺伝子セットは有意に濃縮されていることが明らかになった。また、Ｓｅｍａ３ａ^－／－細胞においては、Ｗｎｔシグナル伝達経路及びＷｎｔ関連シグナル伝達経路に関与する遺伝子セットは有意にダウンレギュレーションされていることも明らかになった。

　骨芽細胞分化を促進し、脂肪細胞分化を阻害する分子経路として、古典的Ｗｎｔ経路は知られている（「Ｇｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．ら、２００６年」、「Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖ．ら、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、２００６年、１１６巻、１２０２～１２０９ページ」及び「Ｔａｋａｄａ，Ｉ．ら、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ。２００９年、５巻、４４２～４４７ページ」参照）。古典的Ｗｎｔ経路においては、Ｗｎｔ３ａ等のＷｎｔタンパク質が細胞内表面の受容体（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）に結合し、その下流にシグナルが伝達されることにより、βカテニンは核内に蓄積される。そして、この蓄積によって、様々な遺伝子（βカテニン転写標的遺伝子）の発現が促進されることになる。

　そこで、この経路に着目し、古典的Ｗｎｔ経路におけるβカテニンの核内蓄積並びにβカテニン転写標的遺伝子の発現へのＳｅｍａ３Ａの影響を調べた。得られた結果を図５５及び５６に示す。

　図５５に示した結果から明らかなように、殆どのβカテニン転写標的遺伝子のｍＲＮＡは大幅に減少した。そして、Ｓｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞においては、Ｗｎｔ３ａが誘導するβカテニンの核内蓄積は抑制されていた（図５６参照）。

　Ｒａｃグアニルヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）であるＦＡＲＰ２を介して、Ｓｅｍａ３Ａシグナル伝達経路は、Ｒａｃ１の活性化を誘導する（「Ｔｏｙｏｆｕｋｕ，Ｔ．ら、Ｎａｔ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００５年、８巻、１７１２～１７１９ページ」参照）。また、古典的なＷｎｔリガンドに応じて、Ｒａｃ１はβカテニンの核内蓄積を促進することが知られているため（Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｃｅｌｌ、２００８年、１３３巻、３４０～３５３ページ）、次に、Ｓｅｍａ３ａ^－／－細胞における、Ｒａｃ及びＲｈｏＡの活性化を調べた。得られた結果を図５７に示す。

　図５７に示した結果から明らかなように、Ｓｅｍａ３ａ^－／－頭蓋冠細胞において、Ｗｎｔ３ａ処理に応じて、Ｒａｃの活性化は、コントロール（野生型）と比較して、有意に低減していた。しかし、ＲｈｏＡに関しては、低減していなかった。また、Ｓｅｍａ３ａ^－／－細胞において、Ｓｅｍａ３Ａ処理することにより、Ｒａｃの活性化並びにβカテニンの核内移行は促進されることも明らかになった（図５６参照）。

　さらに、ＦＡＲＰ２のドミナントネガティブ体（ΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２、「Ｔａｋｅｇａｈａｒａ，Ｎ．ら、２０１０年」参照）を頭蓋冠細胞において異所的に発現させたところ、Ｓｅｍａ３Ａ存在下においてでさえ、骨芽細胞分化は阻害されることが明らかになった（図５８のａ及びｂ参照）。また、ΔＧＥＦ－ＦＡＲＰ２を過剰発現させた際に、βカテニンの核内蓄積は減少することが観察され、さらに、Ｓｅｍａ３Ａにて処理しても、βカテニンの核内局在に影響がないことが明らかになった（図５９のａ及びｂ参照）。

　従って、これらの結果から、骨芽細胞分化において、ＦＡＲＰ２によるＲａｃ１の活性化を介して、Ｓｅｍａ３Ａは古典的Ｗｎｔ／βシグナル伝達経路を刺激することが示された。

　（実施例５）
　＜骨量増加剤としてのＳｅｍａ３Ａ＞
　骨代謝におけるＳｅｍａ３Ａ投与のインビボでの効果を調べるため、先ず、組換えマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質又は生理食塩水を１週間に１回、マウスに静脈注射した。得られた結果を図２９～３２に示す。

　図６０に示した結果から明らかなように、４週間かけてＳｅｍａ３Ａを投与したマウスにおいて、当該マウスの大腿骨遠位部における骨梁の骨量及び骨梁パラメーターの増加が認められた（図６０及び６１参照）。さらに、骨形態計測的分析によって、破骨細胞パラメーターは低減し、骨芽細胞パラメーターは増強されていることが明らかとなった（図６２～６５参照）。また、骨髄において、骨前駆細胞を含む間葉系細胞及び破骨前駆細胞の数には、Ｓｅｍａ３Ａの投与による影響は認められなかった（図６６参照）。しかし、Ｓｅｍａ３Ａ処理マウス由来の骨髄間葉系細胞は、インビトロにおいて、脂肪細胞の代わりに骨芽細胞に分化する傾向であることが認められた（図６７及び６８参照）。

　従って、Ｓｅｍａ３Ａを投与することによって、骨芽細胞による骨形成は刺激されると共に、破骨細胞による骨吸収は阻害され、骨量増加の効果がもたらされることが示された。

　次に、ドリルで皮質骨に穴を開けることにより調製した骨再生モデル（文献３４）において、Ｓｅｍａ３Ａによる治療効果を調べた。得られた結果を図６９に示す。

　図６９及び７０に示す通り、μＣＴ分析により、Ｓｅｍａ３Ａ処理マウスは、生理食塩水処理マウスよりも、再生した皮質骨の量は多いことが明らかになった（図６９のａ及びｂ　参照）。また、組織形態計測的分析により、損傷部位周辺において、骨芽細胞が付着している表面の面積は増大し、破骨細胞が付着している表面の面積は減少していることも明らかになった（図７０のａ～ｃ　参照）。

　従って、これらの結果から、損傷部位へのＳｅｍａ３Ａ局所投与によっても、骨再生は促進されることが明らかになった。

　次に、骨粗しょう症モデルにおける、Ｓｅｍａ３Ａによる治療効果を調べた。すなわち、卵巣摘出マウス（ＯＶＸ)に組換えマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質又はビークル（溶媒）を１週間に１回、マウスに静脈注射し、卵巣摘出（閉経）により生じる骨量減少に対するＳｅｍａ３Ａの影響を調べた。得られた結果を図７１～７４に示す。

　図７１及び７２に示した結果から明らかなように、４週間かけてＳｅｍａ３Ａを投与した卵巣摘出マウスにおいて、ビークルを投与した卵巣摘出マウスと比して、大腿骨遠位部における骨梁の骨量及び骨梁パラメーターの増加が認められた。さらに、Ｓｅｍａ３Ａを投与した卵巣摘出マウスにおいては、骨形態計測的分析によって、ビークルを投与した卵巣摘出マウスよりも、破骨細胞パラメーターは低減し、骨芽細胞パラメーターは増強されていることが明らかとなった（図７３及び７４参照）。

　従って、骨粗しょう症においても、Ｓｅｍａ３Ａを投与することによって、骨芽細胞による骨形成は刺激されると共に、破骨細胞による骨吸収は阻害され、骨量増加の効果がもたらされることが示された。

　（実施例６）
　＜ヒトＳｅｍａ３Ａによる、破骨細胞分化の抑制並びに骨芽細胞分化の促進＞
　マウスＳｅｍａ３ＡとヒトＳｅｍａ３Ａとはアミノ酸レベルで９５％の相同性を有している。また、Ｓｅｍａ３Ａの受容体として機能するＮｒｐ1のアミノ酸配列においても、ヒトとマウスとの間で９３％の相同性を有している。従って、マウスにおいて明らかになった、Ｓｅｍａ３Ａ－Ｎｒｐ１による骨形成の促進並びに骨吸収の抑制は、ヒトにおいても保存された機能である蓋然性は極めて高い。この点について確認した。すなわち、ヒト前破骨細胞から破骨細胞への分化に対する、組換えヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質処理による影響について評価した。得られた結果を図７５に示す。また、ヒト間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化に対する、組換えヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質処理による影響についても評価した。得られた結果を図７６に示す。

　図７５及び７６に示した結果から明らかなように、前記マウス同様に、ヒトＳｅｍａ３Ａにより破骨細胞分化は抑制され、骨芽細胞分化は促進されることが確認された。

　（実施例７）
　＜骨代謝マーカーとしてのＳｅｍａ３Ａ＞
　成長（老化）に伴い、骨量は減少し、骨粗しょう症（老人性骨粗しょう症）が生じることが知られている。また、女性の場合には、閉経後に骨密度が著しく減少することによって、骨粗しょう症（閉経後骨粗しょう症）が生じることがある。そこで、Ｓｅｍａ３Ａの血中（血清）濃度の経週変化及び閉経前後の変化を調べた。得られた結果を図７７に示す。

　図７７に示す通り、成長に伴い、Ｓｅｍａ３Ａの血中濃度が低下すること、並びに卵巣摘出（閉経）による骨粗しょう症モデルにおいては該血中濃度が増加することが明らかになった。この結果から、骨のモデリング・リモデリングが旺盛である成長段階でみられる高いＳｅｍａ３Ａの発現が、老化に伴った骨代謝回転の低下から血中濃度が低下し、卵巣摘出モデルでの骨減少の際には代償的にＳｅｍａ３Ａの発現が亢進することが考えられる。また、かかる結果に基づき、Ｓｅｍａ３Ａを骨代謝マーカーとして利用できることが示唆された。

　以上説明したように、骨芽細胞系細胞から発現しているセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）は、骨吸収の阻害と骨形成の促進とを同時に行うことによって、強い骨保護作用を発揮していることを見出した（図１～３　参照）。さらに、Ｓｅｍａ３Ａを全身投与（静脈注射）しても、骨損傷部に局所投与しても、骨量を増加させることができることも明らかにした。

　従って、本発明によれば、骨吸収を抑制しつつ、骨形成を促進することにより、骨量を増加させることが可能となるため、本発明の組成物は、骨折、骨欠損、骨粗しょう症、骨軟化症、骨減少症、腰背痛、骨ページェット病、硬直性脊椎炎、関節リウマチ、変形性関節症、初期／転移性骨腫瘍、歯周病、インプラント歯周炎等の治療及び予防、並びにインプラントに際しての歯槽骨の再建において有用である。

配列番号：１
＜２２３＞　人工的に合成されたｓｈＮｒｐ１センス鎖オリゴヌクレオチドの配列
配列番号：２
＜２２３＞　人工的に合成されたｓｈＮｒｐ１アンチセンス鎖オリゴヌクレオチドの配列
配列番号：３
＜２２３＞　人工的に合成されたｓｈＣｏｎｔｒｏｌセンス鎖オリゴヌクレオチドの配列
配列番号：４
＜２２３＞　人工的に合成されたｓｈＣｏｎｔｒｏｌアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドの配列
配列番号：５
＜２２３＞　Ｎｒｐ１領域１を増幅するための、人工的に合成されたフォワードプライマーの配列
配列番号：６
＜２２３＞　Ｎｒｐ１領域１を増幅するための、人工的に合成されたリバースプライマーの配列
配列番号：７
＜２２３＞　Ｎｒｐ１領域２を増幅するための、人工的に合成されたフォワードプライマーの配列
配列番号：８
＜２２３＞　Ｎｒｐ１領域２を増幅するための、人工的に合成されたリバースプライマーの配列
配列番号：９
＜２２３＞　Ｎｒｐ１領域３を増幅するための、人工的に合成されたフォワードプライマーの配列
配列番号：１０
＜２２３＞　Ｎｒｐ１領域３を増幅するための、人工的に合成されたリバースプライマーの配列
配列番号：１１
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド１の配列
配列番号：１２
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド２の配列
配列番号：１３
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド３の配列
配列番号：１４
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド４の配列
配列番号：１５
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド５の配列
配列番号：１６
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド６の配列
配列番号：１７
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド７の配列
配列番号：１８
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド８の配列
配列番号：１９
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド９の配列
配列番号：２０
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド１０の配列
配列番号：２１
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド１１の配列
配列番号：２２
＜２２３＞　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定されたＳｅｍａ３Ａペプチド１２の配列

Claims

　セマフォリン３Ａを有効成分として含有する、骨量を増加させるための組成物。
　セマフォリン３Ａを有効成分として含有する、骨量の低減を伴う疾患を治療又は予防するための組成物。
　セマフォリン３Ａを対象に投与し、対象の骨量を増加させるための方法。
　セマフォリン３Ａを対象に投与し、対象の骨量の低減を伴う疾患を治療又は予防するための方法。
　骨量を増加させる活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｎｒｐ１タンパク質に試験化合物を接触させる工程、
（ｂ）Ｎｒｐ１タンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、
を含む方法。
　骨量を増加させる活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、さらに
（ｃ）前記工程（ｂ）において選択された化合物を、破骨細胞分化系に接触させ、破骨細胞分化を検出し、該分化を抑制する化合物を選択する工程、及び/又は、
（ｄ）前記工程（ｂ）において選択された化合物を、骨芽細胞分化系に接触させ、骨芽細胞分化又は脂肪細胞分化を検出し、骨芽細胞分化を促進する化合物又は脂肪細胞分化を抑制する化合物を選択する工程
を含む、請求項５に記載の方法。