JP6910078B2 - Wnt組成物および精製方法 - Google Patents
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Description
Wntタンパク質は、高度に保存された分泌型シグナル伝達分子であって、Frizzledおよび低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)によりコードされる細胞表面受容体に結合するシグナル伝達分子のファミリーを形成する。WNT遺伝子ファミリーは、分泌型シグナル伝達タンパク質をコードする、構造的に類縁の遺伝子からなる。これらのタンパク質は、腫瘍形成、ならびに細胞運命の調節および胚発生時のパターン形成を含む、複数の発生過程に関与している。結合すると、リガンドは、細胞内イベントのカスケードであって、β−カテニンおよびDNA結合性タンパク質であるTCFの核内活性を介して、標的遺伝子の転写を最終的にもたらす、カスケードを誘発する(CleversH、2004年、Wnt signaling: Ig-norrin the dogma、Curr Biol、14巻:R436〜R437頁;Nelson&Nusse、2004年、Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways、Science、303巻:1483〜1487頁;Gordon& Nusse、200
6年、Wnt signaling:Multiple pathways, multiple receptors, and multipletranscription factors、J Biol Chem、281巻:22429〜22433頁)。
Wntタンパク質はまた、骨発生のプログラムと関連した、多種多様な細胞決定にも関与している。例えば、Wntタンパク質は、間葉系前駆細胞の、骨格形成運命へのコミットメントに影響を及ぼす、sox9の発現レベルを調節する。Wntタンパク質は、細胞の、骨芽細胞または軟骨細胞への分化に影響を及ぼす。成体動物では、Wntシグナル伝達が、骨量を調節するという証拠が見られる。例えば、ヒトWntの共受容体であるLRP5内の突然変異は、I型骨粗鬆症、および骨内膜性骨化過剰症または常染色体優性骨硬化症を含む、複数の高骨量症候群のほか、低骨量疾患である、骨粗鬆症−偽性神経膠腫にも関連する。Wnt阻害剤であるDkklの産生の増大は、その顕著な特徴のうちの1つとして、骨吸収を増大させる疾患である、多発性骨髄腫と関連する。さらなる詳細については、S.Minearら、Wnt proteins promote bone regeneration、Sci. Transl. Med.、2巻、29〜30頁(2010年);およびZhaoら、Controllingthe in vivo activity of Wnt liposomes、Methods Enzymol、465巻:331〜47頁(2009年)を参照されたい。
本明細書では、特定の実施形態では、機能的に活性なWnt3aポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む、組成物が開示される。一部の実施形態では、前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、リポソーム膜に取り込まれている(integrated)。一部の実施形態では、前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する。一部の実施形態では、前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない(isnot incorporated)。一部の実施形態では、前記機能
的に活性なWnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドの濃度が、約5μg/μL〜約15μg/μL、または約8μg/μL〜約12μg/μLの間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約12個〜炭素約14個の間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約10℃〜約25℃、約15℃〜約25℃、または約20℃〜約25℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームが、pH約6.5〜約8.0、約7.0〜約7.8、または約7.2〜約7.6の間で正味の電荷0を有する。一部の実施形態では、リン脂質が、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)である。一部の実施形態では、前記リポソームが、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、DMPCおよびコレステロールの濃度が、約70:30〜約100:0の間の比により規定される。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、哺乳動物Wnt3aポリペプチドである。一部の実施形態では、前記哺乳動物が、ヒトである。一部の実施形態では、前記脂質修飾が、パルミトイル化である。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、さらにグリコシル化されている。一部の実施形態では、前記組成物が、安定な組成物である。一部の実施形態では、前記組成物が、活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約106日間安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、約1℃〜約8℃の間の温度で安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、窒素下で安定である。
は、前記Wntポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する。一部の実施形態では、前記Wntポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない。一部の実施形態では、前記Wntポリペプチドが、Wnt3aポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Wntポリペプチドが、Wnt5aポリペプチドまたはWnt10bポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Wntポリペプチドの濃度が、約5μg/μL〜約15μg/μL、または約8μg/μL〜約12μg/μLの間である。一部の実施形態では、前記リポソームがpH約6.5〜約8.0の間で正味の電荷0を有する。一部の実施形態では、前記リポソームがpH約6.5〜約8.0の間で正味の正電荷または正味の負電荷を有する。一部の実施形態では、前記リン脂質が、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)である。一部の実施形態では、前記リポソームが、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、DMPCおよびコレステロールの濃度が、約70:30〜約100:0の間の比により規定される。一部の実施形態では、前記哺乳動物が、ヒトである。一部の実施形態では、脂質修飾が、パルミトイル化である。一部の実施形態では、前記Wntポリペプチドが、さらにグリコシル化されている。一部の実施形態では、前記組成物が、安定な組成物である。一部の実施形態では、前記組成物が、活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約106日間安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、約1℃〜約8℃の間の温度で安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、窒素下で安定である。
利用して、前記Wnt3aポリペプチドを前記イオン交換カラムから溶出させるステップと;(d)ステップ(c)からの前記Wnt3aポリペプチドをリポソームの水溶液と接触させるステップとを含む方法が開示される。一部の実施形態では、前記接触させるステップを、約21℃〜約25℃の間の温度で行う。一部の実施形態では、接触させる時間が、約30分間〜約24時間の間である。一部の実施形態では、前記段階勾配が、第1の勾配および第2の勾配を含む。一部の実施形態では、前記第1の勾配が、50mMの塩化カリウムを含む緩衝溶液を含み、前記第2の勾配が、約150mMの塩化カリウム〜約1.5Mの間の塩化カリウムを含む緩衝溶液を含む。一部の実施形態では、前記緩衝溶液が、界面活性剤(detergent)をさらに含む。一部の実施形態では、前記界面活性剤が、CH
APSまたはTriton X−100である。一部の実施形態では、前記馴化培地が、最大10%のウシ胎仔血清を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。一部の実施形態では、ステップ(c)の後の前記Wnt3aポリペプチドの収率が、約60%〜約90%の間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約12個〜炭素約14個の間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約10℃〜約25℃、約15℃〜約25℃、または約20℃〜約25℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームが、pH約6.5〜約8.0、約7.0〜約7.8、または約7.2〜約7.6の間で正味の電荷0を有する。一部の実施形態では、リン脂質が、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)である。一部の実施形態では、前記リポソームが、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、DMPCおよびコレステロールの濃度が、約70:30〜約100:0の間の比により規定される。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、哺乳動物Wnt3aポリペプチドである。一部の実施形態では、前記哺乳動物が、ヒトである。一部の実施形態では、前記馴化培地が、血清または血清代替物を含む。一部の実施形態では、前記馴化培地が、血清を含む。一部の実施形態では、前記血清が、ウシ胎仔血清である。一部の実施形態では、血清濃度が、前記馴化培地中に約0.1%〜約15%の間である。一部の実施形態では、前記馴化培地が、血清代替物を含む。一部の実施形態では、前記血清代替物が、脂質ベースの代替物である。一部の実施形態では、前記馴化培地が、無血清培地である。一部の実施形態では、脂質修飾が、パルミトイル化である。一部の実施形態では、前記Wnt3aポリペプチドが、さらにグリコシル化されている。一部の実施形態では、Wnt3a生成物を試料混合物から遠心分離により分離する。一部の実施形態では、前記遠心分離の時間が、約1℃〜約8℃の間の温度で最長1時間である。一部の実施形態では、遠心分離後のWnt3a生成物を、無菌1×リン酸緩衝食塩水(PBS)中に再懸濁させる。一部の実施形態では、Wnt3a生成物が、窒素下で安定である。一部の実施形態では、Wnt3a生成物が、約1℃〜約8℃の間の温度で安定である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
機能的に活性なWnt3aポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む、組成物。
(項目2)
前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目1に記載の安定な組成物。
(項目3)
前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、リポソーム膜に取り込まれている、項目1または2に記載の組成物。
(項目4)
前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する、項目1から3のいずれか一項に記載の組成物。
(項目5)
前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない、項目1から4のいずれか一項に記載の組成物。
(項目6)
前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む、項目1から5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目7)
前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、項目1から5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目8)
前記機能的に活性なWnt3aポリペプチドの濃度が、約5μg/μL〜約15μg/μL、または約8μg/μL〜約12μg/μLの間である、項目1から7のいずれか一項に記載の組成物。
(項目9)
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約12個〜炭素約14個の間である、項目1から8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目10)
前記リポソームを構成するリン脂質が、約10℃〜約25℃、約15℃〜約25℃、または約20℃〜約25℃の相転移温度を有する、項目1から9のいずれか一項に記載の組成物。
(項目11)
前記リポソームが、pH約6.5〜約8.0、約7.0〜約7.8、または約7.2〜約7.6の間で正味の電荷0を有する、項目1から10のいずれか一項に記載の組成物。
(項目12)
リン脂質が、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)である、項目1から11のいずれか一項に記載の組成物。
(項目13)
前記リポソームが、コレステロールをさらに含む、項目1から12のいずれか一項に記載の組成物。
(項目14)
DMPCおよびコレステロールの濃度が、約70:30〜約100:0の間の比により規定される、項目12または13に記載の組成物。
(項目15)
前記Wnt3aポリペプチドが、哺乳動物Wnt3aポリペプチドである、項目1から14のいずれか一項に記載の組成物。
(項目16)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目15に記載の組成物。
(項目17)
前記脂質修飾が、パルミトイル化である、項目1から16のいずれか一項に記載の組成物。
(項目18)
前記Wnt3aポリペプチドが、さらにグリコシル化されている、項目1から17のいずれか一項に記載の組成物。
(項目19)
安定な組成物である、項目1から18のいずれか一項に記載の組成物。
(項目20)
活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約106日間安定である、項目1から19のいずれか一項に記載の組成物。
(項目21)
約1℃〜約8℃の間の温度で安定である、項目1から20のいずれか一項に記載の組成物。
(項目22)
窒素下で安定である、項目1から21のいずれか一項に記載の組成物。
(項目23)
機能的に活性な哺乳動物Wntポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記リポソームを構成するリン脂質が約10℃〜約25℃の相転移温度を有する組成物。
(項目24)
機能的に活性な哺乳動物Wntポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが炭素約12個〜炭素約14個の間である組成物。
(項目25)
前記Wntポリペプチドが、リポソーム膜に取り込まれている、項目23または24に記載の組成物。
(項目26)
前記Wntポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する、項目23から25のいずれか一項に記載の組成物。
(項目27)
前記Wntポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない、項目23から26のいずれか一項に記載の組成物。
(項目28)
前記Wntポリペプチドが、Wnt3aポリペプチドである、項目23から27のいずれか一項に記載の組成物。
(項目29)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む、項目28に記載の組成物。
(項目30)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、項目28に記載の組成物。
(項目31)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目28から30のいずれか一項に記載の組成物。
(項目32)
前記Wntポリペプチドが、Wnt5aポリペプチドまたはWnt10bポリペプチドである、項目23から27のいずれか一項に記載の組成物。
(項目33)
前記Wntポリペプチドの濃度が、約5μg/μL〜約15μg/μL、または約8μg/μL〜約12μg/μLの間である、項目23から32のいずれか一項に記載の組成物。
(項目34)
前記リポソームがpH約6.5〜約8.0の間で正味の電荷0を有する、項目23から33のいずれか一項に記載の組成物。
(項目35)
前記リポソームがpH約6.5〜約8.0の間で正味の正電荷または正味の負電荷を有する、項目23から34のいずれか一項に記載の組成物。
(項目36)
前記リン脂質が、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)である、項目23から34のいずれか一項に記載の組成物。
(項目37)
前記リポソームが、コレステロールをさらに含む、項目23から36のいずれか一項に記載の組成物。
(項目38)
DMPCおよびコレステロールの濃度が、約70:30〜約100:0の間の比により規定される、項目36または37に記載の組成物。
(項目39)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目23から38のいずれか一項に記載の組成物。
(項目40)
脂質修飾が、パルミトイル化である、項目23から39のいずれか一項に記載の組成物。
(項目41)
前記Wntポリペプチドが、さらにグリコシル化されている、項目23から40のいずれか一項に記載の組成物。
(項目42)
安定な組成物である、項目23から41のいずれか一項に記載の組成物。
(項目43)
活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約106日間安定である、項目23から42のいずれか一項に記載の組成物。
(項目44)
約1℃〜約8℃の間の温度で安定である、項目23から43のいずれか一項に記載の組成物。
(項目45)
窒素下で安定である、項目23から44のいずれか一項に記載の組成物。
(項目46)
リポソームWnt3aポリペプチドを調製する方法であって、
a)Wnt3aポリペプチドを、哺乳動物細胞を含む馴化培地から採取するステップと;
b)前記Wnt3aポリペプチドを、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したイオン交換カラムに導入するステップと;
c)段階勾配を利用して、前記Wnt3aポリペプチドを前記イオン交換カラムから溶出させるステップと;
d)ステップ(c)からの前記Wnt3aポリペプチドをリポソームの水溶液と接触させるステップと
を含む方法。
(項目47)
前記接触させるステップを、約21℃〜約25℃の間の温度で行う、項目46に記載の方法。
(項目48)
接触させる時間が、約30分間〜約24時間の間である、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記段階勾配が、第1の勾配および第2の勾配を含む、項目46に記載の方法。
(項目50)
前記第1の勾配が、50mMの塩化カリウムを含む緩衝溶液を含み、前記第2の勾配が、約150mMの塩化カリウム〜約1.5Mの間の塩化カリウムを含む緩衝溶液を含む、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記緩衝溶液が、界面活性剤をさらに含む、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記界面活性剤が、CHAPSまたはTriton X−100である、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記馴化培地が、最大10%のウシ胎仔血清を含む、項目46に記載の方法。
(項目54)
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、項目46に記載の方法。
(項目55)
ステップ(c)の後の前記Wnt3aポリペプチドの収率が、約60%〜約90%の間である、項目46に記載の方法。
(項目56)
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約12個〜炭素約14個の間である、項目46に記載の方法。
(項目57)
前記リポソームを構成するリン脂質が、約10℃〜約25℃、約15℃〜約25℃、または約20℃〜約25℃の相転移温度を有する、項目46または56に記載の方法。
(項目58)
前記リポソームが、pH約6.5〜約8.0、約7.0〜約7.8、または約7.2〜約7.6の間で正味の電荷0を有する、項目46、56または57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
リン脂質が、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)である、項目46または56から58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記リポソームが、コレステロールをさらに含む、項目46または56から59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
DMPCおよびコレステロールの濃度が、約70:30〜約100:0の間の比により規定される、項目59または60に記載の方法。
(項目62)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む、項目46に記載の方法。
(項目63)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、項目46に記載の方法。
(項目64)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目46、62、または63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記Wnt3aポリペプチドが、哺乳動物Wnt3aポリペプチドである、項目46、または62から64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記馴化培地が、血清または血清代替物を含む、項目46に記載の方法。
(項目68)
前記馴化培地が、血清を含む、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記血清が、ウシ胎仔血清である、項目68に記載の方法。
(項目70)
血清濃度が、前記馴化培地中に約0.1%〜約15%の間である、項目69に記載の方法。
(項目71)
前記馴化培地が、血清代替物を含む、項目67に記載の方法。
(項目72)
前記血清代替物が、脂質ベースの代替物である、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記馴化培地が、無血清培地である、項目46に記載の方法。
(項目74)
脂質修飾が、パルミトイル化である、項目46から66のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
前記Wnt3aポリペプチドが、さらにグリコシル化されている、項目46から74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
Wnt3a生成物を試料混合物から遠心分離により分離する、項目46から75のいずれか一項に記載の方法。
(項目77)
前記遠心分離の時間が、約1℃〜約8℃の間の温度で最長1時間である、項目76に記載の方法。
(項目78)
遠心分離後のWnt3a生成物を、無菌1×リン酸緩衝食塩水(PBS)中に再懸濁させる、項目46から77のいずれか一項に記載の方法。
(項目79)
Wnt3a生成物が、窒素下で安定である、項目46から78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
Wnt3a生成物が、約1℃〜約8℃の間の温度で安定である、項目46から79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
リポソームWntポリペプチドを調製する方法であって、Wntポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、前記リポソームを構成するリン脂質が、約10℃〜約25℃の相転移温度を有する方法。
(項目82)
リポソームWntポリペプチドを調製する方法であって、Wntポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約12個〜炭素約14個の間である方法。
(項目83)
前記接触させるステップを、約21℃〜約25℃の間の温度で行う、項目81または82に記載の方法。
(項目84)
接触させる時間が、約6時間〜約24時間の間である、項目81または82に記載の方法。
(項目85)
前記Wntポリペプチドをリポソームの水溶液に接触させるステップの前に、さらなる精製ステップをさらに含む、項目81または82に記載の方法。
(項目86)
前記さらなる精製ステップが、イオン交換精製ステップ、疎水性精製ステップ、またはアフィニティー精製ステップである、項目85に記載の方法。
(項目87)
前記さらなる精製ステップが、イオン交換精製ステップである、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記イオン交換精製ステップが、前記試料を、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したビーズまたはスルホン化多環芳香族化合物を固定化したカラムと接触させることを含む、項目87に記載の方法。
(項目89)
前記イオン交換精製ステップが、段階勾配を含む、項目87または88に記載の方法。
(項目90)
イオン交換精製緩衝液が、界面活性剤を含む、項目87から89のいずれか一項に記載の方法。
(項目91)
前記界面活性剤が、CHAPSまたはTriton X−100である、項目90に記載の方法。
(項目92)
前記さらなる精製ステップが、疎水性精製ステップである、項目86に記載の方法。
(項目93)
前記疎水性精製ステップが、プロテインAを固定化したビーズまたはプロテインAカラムを含む、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記さらなる精製ステップの後の前記Wntポリペプチドの収率が、約60%〜約99%の間である、項目85から93のいずれか一項に記載の方法。
(項目95)
Wntポリペプチドを、発現細胞系に由来する細胞を含む馴化培地から採取するステップをさらに含む、項目81から94のいずれか一項に記載の方法。
(項目96)
前記発現細胞系が、哺乳動物発現細胞系である、項目95に記載の方法。
(項目97)
前記哺乳動物発現細胞系が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系である、項目96に記載の方法。
(項目98)
前記馴化培地が、血清または血清代替物を含む、項目97に記載の方法。
(項目99)
前記血清が、ウシ胎仔血清である、項目98に記載の方法。
(項目100)
血清濃度が、前記馴化培地中に約0.1%〜約15%の間である、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記馴化培地が、血清代替物を含む、項目98に記載の方法。
(項目102)
前記血清代替物が、脂質ベースの代替物である、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記馴化培地が、無血清培地である、項目97に記載の方法。
(項目104)
前記Wntポリペプチドが、Wnt3aポリペプチドである、項目81から98のいずれか一項に記載の方法。
(項目105)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、項目104に記載の方法。
(項目107)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目104から106のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記Wntポリペプチドが、Wnt5aポリペプチドまたはWnt10bポリペプチドである、項目81から107のいずれか一項に記載の方法。
(項目109)
前記リポソームが、pH約6.5〜約8.0、約7.0〜約7.8、または約7.2〜約7.6の間で正味の電荷0を有する、項目81から108のいずれか一項に記載の方法。
(項目110)
リン脂質が、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)である、項目81から109のいずれか一項に記載の方法。
(項目111)
前記リポソームが、コレステロールをさらに含む、項目81から110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
DMPCおよびコレステロールの濃度が、約70:30〜約100:0の間の比により規定される、項目110または111に記載の方法。
(項目113)
前記Wntポリペプチドが、哺乳動物Wntポリペプチドである、項目81から112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目113に記載の方法。
(項目115)
脂質修飾が、パルミトイル化である、項目81から114のいずれか一項に記載の方法。
(項目116)
前記Wntポリペプチドが、さらにグリコシル化されている、項目81から115のいずれか一項に記載の方法。
(項目117)
Wnt 生成物を試料混合物から遠心分離により分離する、項目81から116のいずれか一項に記載の方法。
(項目118)
前記遠心分離の時間が、約1℃〜約8℃の間の温度で最長1時間である、項目117に記載の方法。
(項目119)
遠心分離後のWnt生成物を、無菌1×PBS中に再懸濁させる、項目81から118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
Wnt生成物が、窒素下で安定である、項目81から119のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
Wnt生成物が、約1℃〜約8℃の間の温度で安定である、項目81から120のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームWntポリペプチドによる処置の後で、前記細胞は、Runx2、Osterix、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、I型コラーゲン、Axin2、Lef1、およびTcf4からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの1または複数の増強された発現レベルを有する組成物。
(項目123)
前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である、項目122に記載の組成物。
(項目124)
前記齧歯動物骨髄細胞が、10カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される、項目123に記載の組成物。
(項目125)
前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である、項目122に記載の組成物。
(項目126)
前記ヒト骨髄細胞が、35歳またはこれより老齢の被験体から得られる、項目125に記載の組成物。
(項目127)
35歳またはこれより老齢のヒト被験体から得られた哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームWntポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、増強された発現レベルで、Runx2、Osterix、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、I型コラーゲン、Axin2、Lef1、およびTcf4からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの1または複数を発現させる組成物。
(項目128)
前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Axin2、Lef1、およびTcf4から選択される、項目122または127に記載の組成物。
(項目129)
前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される、項目122または127に記載の組成物。
(項目130)
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目122から129のいずれか一項に記載の組成物。
(項目131)
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約2%〜約20%または約4%〜約10%の間である、項目130に記載の組成物。
(項目132)
リポソームWntポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、SOX9およびPPARγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルを、さらに有する、項目122から131のいずれか一項に記載の組成物。
(項目133)
前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目132に記載の組成物。
(項目134)
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む、項目122から133のいずれか一項に記載の組成物。
(項目135)
アポトーシスレベルの前記低下が、約50%である、項目134に記載の組成物。
(項目136)
前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む、項目122から135のいずれか一項に記載の組成物。
(項目137)
前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む、項目136に記載の組成物。
(項目138)
前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される、項目137に記載の組成物。
(項目139)
移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約1%〜約20%または約5%〜約12%の間である、項目137または138に記載の組成物。
(項目140)
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目122から139のいずれか一項に記載の組成物。
(項目141)
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目140に記載の組成物。
(項目142)
前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目141に記載の組成物。
(項目143)
前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目141に記載の組成物。
(項目144)
前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である、項目122から143のいずれか一項に記載の組成物。
(項目145)
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目144に記載の組成物。
(項目146)
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目145に記載の組成物。
(項目147)
前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目146に記載の組成物。
(項目148)
前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目146に記載の組成物。
(項目149)
前記哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である、項目122から143のいずれか一項に記載の組成物。
(項目150)
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目149に記載の組成物。
(項目151)
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目150に記載の組成物。
(項目152)
前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目151に記載の組成物。
(項目153)
前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目151に記載の組成物。
(項目154)
リポソームWntポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、35歳より若齢のヒト被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する、項目126または127に記載の組成物。
(項目155)
前記リポソームWntポリペプチドが、Wntポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む、項目122から154のいずれか一項に記載の組成物。
(項目156)
前記リポソームを構成するリン脂質が、約10℃〜約25℃の相転移温度を有する、項目155に記載の組成物。
(項目157)
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約12個〜炭素約14個の間である、項目155または156に記載の組成物。
(項目158)
前記Wntポリペプチドが、Wnt3aポリペプチドである、項目155に記載の組成物。
(項目159)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む、項目158に記載の組成物。
(項目160)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、項目158に記載の組成物。
(項目161)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目158から160のいずれか一項に記載の組成物。
(項目162)
前記Wntポリペプチドが、Wnt5aポリペプチドまたはWnt10bポリペプチドである、項目155に記載の組成物。
(項目163)
哺乳動物骨髄組成物であって、単離哺乳動物骨髄細胞を、ex vivoで、リポソームWntポリペプチドと接触させるステップを含むプロセスによって作製され、ここで、接触させる時間が約30分間〜約4時間の間である、哺乳動物骨髄組成物。
(項目164)
接触させる温度が、約0℃〜約37℃、または約20℃〜約25℃の間である、項目163に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目165)
前記プロセスが、接触させるステップの後で、遊離リポソームWntポリペプチドを除去する洗浄ステップをさらに含む、項目163または164に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目166)
前記プロセスが、前記リポソームWntポリペプチドを骨欠損部位に移植するステップをさらに含む、項目163から165のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目167)
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、Runx2、Osterix、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、I型コラーゲン、Axin2、Lef1、およびTcf4からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの1または複数の増強された発現レベルを有する、項目163から166のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目168)
前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Axin2、Lef1、およびTcf4から選択される、項目163から166のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目169)
前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される、項目163から166のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目170)
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約2%〜約20%または約4%〜約10%の間である、項目167から169のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目171)
リポソームWntポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、SOX9およびPPARγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルをさらに有する、項目163から170のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目172)
前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目171に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目173)
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む、項目163から172のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目174)
アポトーシスレベルの前記低下が、約50%である、項目173に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目175)
前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む、項目163から174のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目176)
前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む、項目175に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目177)
前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される、項目176に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目178)
移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約1%〜約20%または約5%〜約12%の間である、項目176または177に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目179)
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目163から178のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目180)
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目179に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目181)
前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目180に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目182)
前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目180に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目183)
前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である、項目163から182のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目184)
前記自家骨髄細胞が、大腿骨、脛骨、および/または腸骨稜から採取される、項目183に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目185)
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目183または184に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目186)
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目185に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目187)
前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目186に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目188)
前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目186に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目189)
前記単離哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である、項目163から182のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目190)
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目189に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目191)
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目190に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目192)
前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目191に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目193)
前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目191に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目194)
前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である、項目163から193のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目195)
前記齧歯動物骨髄細胞が、10カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される、項目194に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目196)
前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である、項目163から193のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目197)
前記ヒト骨髄細胞が、35歳またはこれより老齢の被験体から採取される、項目196に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目198)
リポソームWntポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、35歳より若齢の被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する、項目196または197に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目199)
前記リポソームWntポリペプチドが、Wntポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む、項目163から198のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目200)
前記リポソームを構成するリン脂質が、約10℃〜約25℃の相転移温度を有する、項目199に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目201)
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約12個〜炭素約14個の間である、項目199または200に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目202)
前記Wntポリペプチドが、Wnt3aポリペプチドである、項目199に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目203)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む、項目202に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目204)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、項目202に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目205)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目202から204のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目206)
前記Wntポリペプチドが、Wnt5aポリペプチドまたはWnt10bポリペプチドである、項目199に記載の哺乳動物骨髄組成物。
(項目207)
被験体における骨欠損を処置する方法であって、
a)哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ex vivoで、リポソームWnt3aポリペプチドと接触させるステップと;
b)前記試料を洗浄して、遊離リポソームWnt3aポリペプチドを除去するステップと;
c)前記リポソームWnt3aポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップと
を含む方法。
(項目208)
接触させる温度が、約0℃〜約37℃、または約20℃〜約25℃の間である、項目207に記載の方法。
(項目209)
接触させる時間が、約30分間〜約4時間の間である、項目207に記載の方法。
(項目210)
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強されたRunx2、Osterix、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、I型コラーゲン、Axin2、Lef1、およびTcf4からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの1または複数の発現レベルを有する、項目207に記載の方法。
(項目211)
前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Axin2、Lef1、およびTcf4から選択される、項目207に記載の方法。
(項目212)
前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される、項目207に記載の方法。
(項目213)
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約2%〜約20%または約4%〜約10%の間である、項目207または210から212のいずれか一項に記載の方法。
(項目214)
リポソームWnt3aポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、SOX9およびPPARγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルをさらに有する、項目207または210から213のいずれか一項に記載の方法。
(項目215)
前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目214に記載の方法。
(項目216)
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む、項目207または210から215のいずれか一項に記載の方法。
(項目217)
アポトーシスレベルの前記低下が、約50%である、項目216に記載の方法。
(項目218)
前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む、項目207または210から217のいずれか一項に記載の方法。
(項目219)
前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む、項目218に記載の方法。
(項目220)
前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される、項目219に記載の方法。
(項目221)
移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約1%〜約20%または約5%〜約12%の間である、項目219または220に記載の方法。
(項目222)
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目207から221のいずれか一項に記載の方法。
(項目223)
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目222に記載の方法。
(項目224)
前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目223に記載の方法。
(項目225)
前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目223に記載の方法。
(項目226)
前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である、項目207から225のいずれか一項に記載の方法。
(項目227)
前記自家骨髄細胞が、大腿骨、脛骨、および/または腸骨稜から採取される、項目226に記載の方法。
(項目228)
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目226または227に記載の方法。
(項目229)
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目228に記載の方法。
(項目230)
前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目229に記載の方法。
(項目231)
前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目229に記載の方法。
(項目232)
前記単離哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である、項目207から225のいずれか一項に記載の方法。
(項目233)
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目232に記載の方法。
(項目234)
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目233に記載の方法。
(項目235)
前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目234に記載の方法。
(項目236)
前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目234に記載の方法。
(項目237)
前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である、項目207から236のいずれか一項に記載の方法。
(項目238)
前記齧歯動物骨髄細胞が、10カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される、項目237に記載の方法。
(項目239)
前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である、項目207から236のいずれか一項に記載の方法。
(項目240)
前記ヒト骨髄細胞が、35歳またはこれより老齢の被験体から採取される、項目239に記載の方法。
(項目241)
リポソームWnt3aポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、35歳より若齢のヒト被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する、項目239または240に記載の方法。
(項目242)
前記リポソームWnt3aポリペプチドが、Wnt3aポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む、項目207から241のいずれか一項に記載の方法。
(項目243)
前記リポソームを構成するリン脂質が、約10℃〜約25℃の相転移温度を有する、項目242に記載の方法。
(項目244)
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約12個〜炭素約14個の間である、項目242または243に記載の方法。
(項目245)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む、項目242に記載の方法。
(項目246)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、項目242に記載の方法。
(項目247)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目242、245または246のいずれか一項に記載の方法。
(項目248)
被験体における骨欠損を処置する方法であって、
a)哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ex vivoで、リポソームWntポリペプチドと接触させるステップと;
b)前記試料を洗浄して、遊離リポソームWntポリペプチドを除去するステップと;
c)前記リポソームWntポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップと
を含む方法。
(項目249)
接触させる温度が、約0℃〜約37℃、または約20℃〜約25℃の間である、項目248に記載の方法。
(項目250)
接触させる時間が約30分間〜約4時間の間である、項目248に記載の方法。
(項目251)
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、Runx2、Osterix、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、I型コラーゲン、Axin2、Lef1、およびTcf4からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの1または複数の増強された発現レベルを有する、項目248に記載の方法。
(項目252)
前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Axin2、Lef1、およびTcf4から選択される、項目248に記載の方法。
(項目253)
前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される、項目248に記載の方法。
(項目254)
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約2%〜約20%または約4%〜約10%の間である、項目248または251から253のいずれか一項に記載の方法。
(項目255)
リポソームWntポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、SOX9およびPPARγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルを、さらに有する、項目248または251から254のいずれか一項に記載の方法。
(項目256)
前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目255に記載の方法。
(項目257)
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む、項目248または251から256のいずれか一項に記載の方法。
(項目258)
アポトーシスレベルの前記低下が、約50%である、項目257に記載の方法。
(項目259)
前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む、項目248または251から258のいずれか一項に記載の方法。
(項目260)
前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む、項目259に記載の方法。
(項目261)
前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される、項目260に記載の方法。
(項目262)
移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約1%〜約20%または約5%〜約12%の間である、項目260または261に記載の方法。
(項目263)
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目248から262のいずれか一項に記載の方法。
(項目264)
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目263に記載の方法。
(項目265)
前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目264に記載の方法。
(項目266)
前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目264に記載の方法。
(項目267)
前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である、項目248から266のいずれか一項に記載の方法。
(項目268)
前記自家骨髄細胞が、大腿骨、脛骨、および/または腸骨稜から採取される、項目267に記載の方法。
(項目269)
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目267から268のいずれか一項に記載の方法。
(項目270)
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目269に記載の方法。
(項目271)
前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目270に記載の方法。
(項目272)
前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目270に記載の方法。
(項目273)
前記単離哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である、項目248から266のいずれか一項に記載の方法。
(項目274)
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目273に記載の方法。
(項目275)
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目274に記載の方法。
(項目276)
前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目275に記載の方法。
(項目277)
前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目275に記載の方法。
(項目278)
前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である、項目248から277のいずれか一項に記載の方法。
(項目279)
前記齧歯動物骨髄細胞が、10カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される、項目278に記載の方法。
(項目280)
前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である、項目248から277のいずれか一項に記載の方法。
(項目281)
前記ヒト骨髄細胞が、35歳またはこれより老齢の被験体から採取される、項目280に記載の方法。
(項目282)
リポソームWntポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、35歳より若齢の被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する、項目280または281に記載の方法。
(項目283)
前記リポソームWntポリペプチドが、Wntポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む、項目248から282のいずれか一項に記載の方法。
(項目284)
前記リポソームを構成するリン脂質が、約10℃〜約25℃の相転移温度を有する、項目283に記載の方法。
(項目285)
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約12個〜炭素約14個の間である、項目283または284に記載の方法。
(項目286)
前記WntポリペプチドがWnt3aポリペプチドである、項目283に記載の方法。
(項目287)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%の配列同一性を含む、項目286に記載の方法。
(項目288)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、項目286に記載の方法。
(項目289)
前記Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号1に示されるアミノ酸残基77に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目286から288のいずれか一項に記載の方法。
(項目290)
前記Wntポリペプチドが、Wnt5aポリペプチドまたはWnt10bポリペプチドである、項目283に記載の方法。
(項目291)
項目23から45に記載のリポソームWntポリペプチドを含む骨移植片材料を作製するためのキット。
(項目292)
項目1から22に記載のリポソームWnt3aポリペプチドを含む骨移植片材料を作製するためのキット。
(項目293)
項目127から162に記載の単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物を含む骨移植片材料を作製するためのキット。
本明細書では、リポソームWntポリペプチドを作製するのに使用するための、組成物、方法、プロセス、およびキットが開示される。本明細書ではまた、骨移植片材料を作製するための、組成物、方法、プロセス、およびキットも開示される。一部の実施形態では、組成物は、機能的に活性な哺乳動物Wntポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含み、リポソームを構成するリン脂質は、約10℃〜約25℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、組成物は、機能的に活性な哺乳動物Wntポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含み、リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さは、炭素約12個〜炭素約14個の間である。一部の実施形態では、組成物はまた、機能的に活性なWnt3aポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含み、機能的に活性なWnt3aポリペプチドは、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む。
本方法について記載する前に、このような方法は、変化することが当然であるので、本発明は、記載される特定の方法に限定されるものではないことを理解されたい。また、本発明の範囲を限定するのは、付属の特許請求の範囲だけであるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態だけについて記載することを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
プチドであって、天然配列のポリペプチドとの配列同一性が100%未満であるポリペプチドを意味する。このような変異体は、例えば、天然配列のN末端もしくはC末端または内部に1または複数のアミノ酸残基が付加されていたり、約1〜300アミノ酸残基が欠失している、より長いまたはより短いポリペプチドを含む。変異体ポリペプチドは、天然のポリペプチド配列と比較して、1もしくは複数のアミノ酸置換を伴うポリペプチド、またはポリペプチド配列の誘導体であって、結果として得られる産物が、非自然発生のアミノ酸を有するように、アミノ酸残基を共有結合的に修飾した誘導体を含む。
Wnt3aの分子クローニングおよび特徴付けについては、Saitohら、Biochem Biophys Res Commun、2001年、284巻(5号):1168〜75頁により記載された。天然ヒトWnt3aとは、352アミノ酸(配列番号1)からなる、脂質修飾された増殖因子であって、幹細胞の活性化またはそれらの自己再生の刺激において有効な増殖因子である。場合によって、その疎水性の性質に起因して、活性のWnt3aポリペプチドまたは他のWntポリペプチドは、スケーラブルなレベルで、均一性まで精製することが困難である。本明細書の一態様では、Wntポリペプチドを精製するための方法が記載される。場合によって、精製法により、ヒトWntポリペプチドの純度および収率が改善される。一部の実施形態では、精製されたWntポリペプチドを、治療レジメンの一部として使用する。一部の実施形態では、精製されたWntポリペプチドを、治療ポリペプチドとして使用する。
II(任意選択で、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む)、CD 293 AGT(商標)培地、アデノウイルス発現培地(AEM)、FreeStyle(商標)293発現培地、EX−CELL(登録商標)302無血清培地、EX−CELL(登録商標)325 PF CHO無血清培地、EX−CELL(登録商標)CD CHO−2動物成分非含有培地、EX−CELL(登録商標)CD CHO−3培地、およびEX−CELL(登録商標)CDHO DHFR−動物成分非含有培地を含む。
ルコシド、オクチルチオグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、Triton
X−100、Triton X−114、Tween20、およびTween80を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、界面活性剤は、CHAPSまたはTriton X−100である。一部の実施形態では、界面活性剤は、CHAPSである。CHAPSとは、膜タンパク質の可溶化に有用な双性イオン性界面活性剤である。一部の実施形態では、Wntポリペプチドはまた、グリコシル化およびパルミトイル化を介して翻訳後修飾もなされる。
ミトイル化させたCys77をアラニン(C77A)で置換した、マウスWnt3aタンパク質の突然変異体形態が、Wntシグナル伝達を活性化させる能力の減殺を示すが、培養培地に正常に分泌されることについて報告した。さらに、研究は、Cys77残基のパルミトイル化が、生物学的活性に重要であることも示した。
本明細書では、骨欠損部位における使用のための骨移植片材料を作製するための方法、プロセス、組成物、およびキットが開示される。本明細書ではまた、哺乳動物骨髄細胞を増強するための方法、プロセス、組成物、およびキットも開示される。場合によって、骨欠損とは、天然骨の修復性成長を刺激および誘導するのに移植材料が必要とされる骨折などの骨損傷を指す。
42号、I巻、647〜669頁を参照されたい)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接は関与(involved)しないが、Fc受容体(FcR)の結合、抗体の抗体依存性細胞傷害作用への関与(participation)、補体依存性細胞傷害作用の誘発、および肥満
細胞の脱顆粒など、多様なエフェクター機能を呈示する。
、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、NationalInstitute of Health、Bethesda、Md.);および/または「超可変ループ」に
由来するアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、および91〜96(L3);ならびに重鎖可変ドメイン内の(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3);ClothiaおよびLesk(1987年)
、J. Mol. Biol.、196巻:901〜917頁)を含む。「フレームワーク」または「
FR」残基とは、本明細書でみなされる通り、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
るその能力を反映する残りの「Fc」断片とを伴う、抗原結合性断片をもたらす(produce)。ペプシン処理は、2つの抗原結合性(combining)部位を有し、抗原を架橋することがやはり可能な、F(ab’)2断片をもたらす(yield)。
91年)を参照されたい)、ウェスタンブロット(例えば、Sambrookら(1989年)、Molecular Cloning, A LaboratoryManual、3巻、18章(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、N.Y.)を参照されたい)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などのクロマトグラフィー、または当技術分野で公知の他のアッセイにより決定する。したがって、検出アッセイは、免疫ブロット法、免疫拡散、免疫電気泳動、または免疫沈降などであるがこれらに限定されないステップを伴う。
USA、86巻:1173〜1177頁)、Q−ベータレプリカーゼ(Lizardiら(198
8年)、Bio/Technology、6巻:1197頁)、ローリングサークル複製(米国特許第5,854,033号)、または他の任意の核酸増幅法による核酸増幅プロセスの後で、当業者に周知の技法を使用する、増幅された分子の検出を伴う。これらの検出スキームは、このような分子が極めて少数で存在する場合、核酸分子の検出にとりわけ有用である。本発明の特定の態様では、バイオマーカーの発現を、定量的蛍光RT−PCR(すなわち、TaqMan0 System)により評価する。
本明細書のある特定の実施形態では、本明細書で記載される、1または複数の方法、プロセス、および組成物を伴う使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験管などの、1または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法で使用される個別の要素のうちの1つを含む容器を受容するように区画されたキャリングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一部の実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成される。
ヒトWnt3aポリペプチドの産生および精製
ヒトWNT3Aとは、脂質修飾されたヒト幹細胞増殖因子であって、成体幹細胞を活性化させ、それらの自己再生および生存を刺激するのに有効なヒト幹細胞増殖因子である。天然ヒトWNT3Aの352アミノ酸のポリペプチドは、グリコシル化およびパルミトイル化により翻訳後修飾されている。疎水性ポリペプチドは、スケーラブルなレベルで、均一性まで精製することが困難でありうる。
ヒトWNT3Aポリペプチドを、チャイニーズハムスター卵巣細胞系に導入し、32〜37℃の範囲にわたる温度で、付着細胞として増殖させた。懸濁液中のCHO細胞が、WNT3Aを効率的に分泌するのかどうかを査定するために、懸濁液中で増殖させたCHO細胞について調べた(図9)。
WNT3Aの特徴付け:SDS−PAGE/ウェスタンブロット:SDS PAGE解析およびクーマシーブルーによる染色解析のために、WNT3Aの精製画分を回収し、クーマシーブリリアントブルーおよび硝酸銀で染色された、12%のSDSポリアクリルアミドゲルにより、WNT3Aポリペプチドの純度について解析した(図2)。図2に示される通り、精製画分を回収し、クーマシーブリリアントブルーおよび硝酸銀で染色された、12%のSDSポリアクリルアミドゲルにより、WNT3Aポリペプチドの純度について解析した。WNT3Aの推定純度は、70%であった。Pierce660タンパク質アッセイキットおよび280nmにおける吸光度を使用して、全タンパク質濃度を測定した。各アッセイでは、BSA検量線を作成して、全タンパク質濃度を推定した。WNT3Aポリペプチド濃度は、定量的ウェスタンブロットおよびWNT3A検量線を使用して決定した。
を、5mMのDTTで還元し、55℃で30分間にわたりインキュベートした。次いで、試料を、室温まで冷却させ、次いで、アクリルアミド(15mM)を使用して、室温で30分間にわたりアルキル化させた。次いで、試料を、50mMの重炭酸アンモニウム、pH8.0で、尿素<1Mの濃度まで希釈し、1μgのトリプシンプロテアーゼ(Promega)を添加した。消化は、37℃で一晩にわたり実施した。反応は、50%のギ酸を添加することによりクェンチングし、ペプチドを速やかに清浄化させ、C18マイクロカラム(NEST group)上で濃縮した。
combined reporter gene assay system(Applied Biosysytems)を使用して、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの発現レベルを定量した。生物発光は、dual light ready luminometer(Berthold)上の三連の読取りにより定量した。WNT3A(ng/uL)およびL−WNT3Aの活性は、WNT3Aポリペプチドの段階希釈により作成された検量線から規定した(図5)。時間経過を伴う実験では、WNT3A活性を、活性パーセントとして表した。活性パーセントは、以下の通りに計算した:
LSLレポーター細胞アッセイおよびPAGE−ウェスタンブロット解析に基づくと、発酵に由来する馴化培地は、4℃で最短2カ月間にわたり安定であった。LSLレポーター細胞アッセイおよびPAGE−ウェスタンブロット解析に基づくと、L−WNT3Aは、4℃で>106日間にわたり安定であった(図6)。LSLレポーター細胞アッセイおよびPAGE−ウェスタンブロット解析に基づくと、23℃で、L−WNT3Aの半減期は、>48時間であった(青線、図7)。23℃で、5分間以内にその活性を喪失した、リポソームを伴わないWNT3Aポリペプチドと比較されたい。
LSLレポーター細胞系を使用して、Wntポリペプチドおよびアゴニストの活性を評価した。L−WNT3Aについての以下の特徴付けは、以下のレポーターアッセイを使用して行った。LSLレポーター細胞系およびHEK293レポーター細胞系を使用して、細胞を、アッセイウェル1つ当たり5.0×104個で播種し、WNT3AおよびL−WNT3Aの活性を定量した。これらの条件下で、WNT3AおよびL−WNT3Aは、Wntシグナル伝達を活性化させる同様の能力を示した(図13)。
LSL細胞およびHEK293T細胞を、WntおよびWntアゴニストに対して感受性となるように操作し、これにより、用量、薬物効果、および臨床応答の間の関係についての、ささやかながらも有意味なデータをもたらした。in vivoにおける、Wnt刺激に対する細胞応答をより緊密に模倣するため、Wntの標的遺伝子であるAxin2の発現を、経路活性の尺度として使用して、マウス胚性線維芽細胞(MEF)についてアッセイした。
高温では、多くのタンパク質が変性し、体温でこのような変性を回避することが、タンパク質治療剤の持続期間を拡張する鍵である。リポソームパッケージングにより、Wnt3aの生物学的活性が保存され、この処方物は、複数の骨損傷適用において有効性を持ちうる。Wnt3aの、リポソームに対するアフィニティーおよびこの会合の安定性について特徴付けた。L−WNT3AによるWnt経路活性化の反応速度および動態が裏付けられた。
LSLレポーター細胞アッセイおよびPAGE−ウェスタンブロット解析に基づくと、Wnt3aは、リポソームと急速に会合し、この会合は、ポリペプチドの活性を維持する一因となった。当初、Wnt3a活性は、上清中で観察された。約30分間の経過にわたり、Wnt3aポリペプチドは、上清からペレットに、約3×10−3nM/秒の速度で移動した(図18A)。6時間後までに、Wnt3a活性のうちの90%は、ペレット中で観察された。同様に、ウェスタンブロット解析は、ポリペプチドのうちの90%が、ペレット中で見出されることを示した(図18B)。23℃で24時間後、リポソームは、水性の上清から遠心分離により分離された。ペレット中に、目視可能なポリペプチドの沈殿は観察されなかった。ウェスタンブロットにより、Wnt3aの大半は、リポソームペレット中に存在することが裏付けられた(図18C)。図18Dは、実験終了時における、上清中およびペレット中のWnt3a活性を示す。
材料および供給元
CHO細胞:Invitrogen
プラスミドベクター:Promega
脂質:Avanti Polar Lipids
Blue Sepharose精製カラム:
WNT3A標準物質:Stem R&D
LSL細胞:
超遠心分離機:
略号
BGM:骨移植片材料
BGMACT:L−WNT3A活性化骨移植片材料
CHO:チャイニーズハムスター卵巣
CM:馴化培地
Fz:WNT受容体である、Frizzled
HEK:ヒト胎児由来腎臓
LSL:マウスL細胞(mouse L cell)
L−WNT3A:リポソームWNT3A
MEF:マウス胚性線維芽細胞
ヒトWnt3aポリペプチドは、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系の、ヒトWnt3a核酸を保有するプラスミドによるトランスフェクションを介して産生させた。リポフェクチンベースのトランスフェクション法を使用した。プラスミドは、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下に置いた。Wnt3aで形質転換されたCHO細胞を、付着培養物中、またはDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)+10%のウシ胎仔血清(FBS)、GlutaMax(商標)(グルタミンベースのジペプチド)、抗生剤(例えば、ドキシサイクリン)、G418、非必須アミノ酸、ブラストサイジン(blasticidine)、および血清を含有する培養培地中の懸濁培養物中、約32〜37℃の範囲にわたる温度で増殖させた。CHO細胞から分泌されるWnt3aの量は、それらを付着培養物として増殖させたのか、懸濁培養物として増殖させたのかに依存した。ドキシサイクリンは、培地に、CHO細胞により産生されるヒトWnt3aの量をモジュレートしうる範囲の濃度で添加した。培養培地は、CHO細胞がWnt3aを分泌する培養期間を通して存在する、ウシ胎仔血清(FBS)を含んだ。細胞は、最長10日間にわたり増殖させることができ、その後、細胞の新たなアリコートを使用した。
動物
全ての手順は、Stanford Committee on Animal Researchにより承認されたプロトコールに従った。ベータ−アクチン増強緑色蛍光タンパク質(ACTB−eGFP;The Jackson Laboratory、Sacramento、California)およびCD1が野生型の同系マウスを使用した。マウス<3カ月齢を若齢と考え、マウス>10カ月齢を老齢と考えた。Axin2CreERT/+およびR26RmTmG/+マウスは、Jackson Labsから購入した。老齢野生型Lewisラット(Charles Rivers、MA製の「リタイアードブリーダー」)は、AAUCガイドラインおよびIUPACガイドラインに従う脊椎固定術のために利用した。
この研究では、ラットおよびマウスの両方を採用した。マウスモデルの使用により、広範なスペクトルにわたる分子解析が可能となるが、自家移植片は、これらの小型動物には高度に侵襲性であるため、自家移植を実施する場合は、ラットを使用し(例えば、図20および25)、先進的な分子的技法を採用する場合は、同系マウスを使用した(図21〜24)。全ての例において、骨移植片材料(BGM)は、骨長手方向に引き裂き、骨内膜面を、鋭利な器具で静かにこすり取り、骨髄内容物を、回収ディッシュに潅流することにより、大腿骨、脛骨、および腸骨稜から採取した。この方法では、ヒトにおいて使用されるリーマー/潅流/吸引(RIA)法を模倣した。
組織試料は、TRIzol溶液中でホモジナイズした。RNAを単離し、逆転写を実施した。定量的リアルタイムPCRは、Prism 7900HT Sequence Detection SystemおよびPower SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)を使用して実行した。遺伝子発現のレベルは、ΔΔCT法およびそれらのGAPDH値に照らした標準化により決定した。全ての反応は、三連で実施し、平均および標準偏差を計算した。
BGMを、若齢(N=5)マウスおよび老齢(N=5)マウスから採取し、次いで、10%のウシ胎仔血清(FBS)、100U/mLのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に入れ、5%のCO2中、37℃でインキュベートした。24時間後、非付着細胞を除去し、培地を置きかえ、付着細胞を、それらがコンフルエンスに達するまで継代培養した。培地は、3日ごとに交換した。一部の実験では、継代3代目の後の細胞を、L−PBSまたはL−WNT3A(有効濃度=0.03μg/mL)で処置した。これらの実験では、細胞を24時間後に回収し、RIPA緩衝液を使用して溶解させた。ウェスタン解析のために、全タンパク質を抽出した。パンアクチンを、内部対照として使用して、タンパク質の完全性を確認した。WNT3A、非リン酸化β−カテニン、およびAxin2に対する抗体を使用した。積分強度は、ImageJにより解析して、ウェスタンブロット法による結果を定量した。
場合によって、腎被膜下アッセイ(SRCA)を採用して、その分化潜在能についてアッセイした。同系宿主マウスに麻酔剤を吸入させた後、胸郭に対してすぐの尾側の左脇腹に皮膚切開を施した。腹腔を開いて、腎臓を露出させた。腎被膜に小さな切開を施し、軟性プラスチックチューブを使用して、BGMを、被膜下に、注意深く入れた。次いで、腎臓を、腹腔に戻し、腹膜および皮膚を、縫合糸により閉止した。鎮痛のために、ブプレノルフィン(0.05mg/kg)を使用した。
DKK1のアデノウイルス構築物および陰性対照であるFcのアデノウイルス構築物を作製した。アデノウイルス構築物を、293T細胞にトランスフェクトした。2日後、細胞を回収し、溶解させ、遠心分離により沈殿させた。精製アデノウイルスをアリコートにし、−80℃で保存した。Wntの阻害は、in vitroにおける、BGMの、Ad−Dkk1および対照Ad−Fcとの、2時間にわたるインキュベーションにより達成し、次いで、BGMアリコートを、頭蓋冠欠損に移植した。
マウスに麻酔をかけ、3mmの切開を施して、頭頂骨を露出させた。マイクロダイセクション用尖頭器を使用して、直径を2mmとする、環状の全層欠損を創出したが、硬膜は攪乱させなかった。BGMアリコートを、Ad−Dkk1および対照Ad−Fcと共に、2時間にわたりインキュベートした。次いで、BGMアリコートを、頭蓋冠欠損に移植し、縫合糸により皮膚を閉止した。手術からの回復後、鎮痛のために、マウスにブプレノルフィンを施した。
70〜100mg/kgのケタミンと、5〜10mg/kgのキシラジンとのカクテルを使用して、Lewisラットに麻酔をかけた。次いで、ラットの腰部領域を剃毛し、Betadineに浸漬したガーゼで消毒した。皮膚を切開する前に、ラットに、鎮痛剤である0.02mg/kgのブプレノルフィンをSC/IP注射した。まず、骨移植片材料(BGM)を、腸骨稜から採取した。略述すると、左腸骨棘を触診し、垂直方向の皮膚切開を施し、腸骨棘の背側隆起にアクセスし、ブラントダイセクションにより露出させた。付着した筋肉および骨膜を持ち上げ、0.3gのBGMを、彫骨鉗子で採取し、少量に分配した。次いで、BGMを、100μLのL−PBSまたは100μL[0.15μg/mL]のL−Wnt3aと共にインキュベートする一方で、横突起を露出させた。
組織は、4%のパラホルムアルデヒド(PFA)中、4℃で一晩にわたり固定した。試料は、19%のEDTA中で、1日間にわたり脱灰した。検体は、昇順のエタノール系列により脱水してから、パラフィン包埋した。8ミクロンの厚さの長型切片を切り出し、組織学のために、Superfrost−plusスライド上に回収した。サフラニンO染色、アニリンブルー染色、およびゴモリ染色を実施した。組織切片は、Leica DM5000Bデジタルイメージングシステムを使用して写真撮影した。
アルカリホスファターゼ(ALP)活性は、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸(BCIP)、およびNTM緩衝液(100mMのNaCl、100mMのTris pH9.5、5mMのMgCl)中のインキュベーションにより検出した。酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)活性は、製造元の指示書に従って、白血球酸ホスファターゼ染色キットを使用して観察した。現像の後、スライドを、エタノールの希釈系列中で脱水し、Citrisolv中で清浄化し、Permount封入剤でカバースリップ処理した。TUNEL染色のために、0.1%のTriton X−100および0.1%のクエン酸ナトリウムを使用して、切片を透過処理し、TUNEL反応混合物(In Situ Cell Death Detection Kit)と共にインキュベートした。切片は、DAPI封入剤で封入し、落射蛍光顕微鏡下で視覚化した。
組織切片を脱パラフィンし、PBS中で再水和させた。内因性ペルオキシダーゼ活性を、3%の過酸化水素により、5分間にわたりクェンチングし、次いで、PBS中で洗浄した。スライドを、5%のヤギ血清により、室温で1時間にわたりブロッキングした。適切な一次抗体を添加し、4℃で一晩にわたりインキュベートした。次いで、試料を、適切なビオチニル化二次抗体およびアビジン(advidin)/ビオチニル化酵素複合体と共にイン
キュベートし、DAB基質キットで現像した。使用される抗体は、GFP抗体、ならびにDLK1抗体、Runx2抗体、Sox9抗体、およびPPAR−γ抗体を含んだ。
走査および解析は、公表されているガイドラインに準拠した。ラットに、2%のイソフルランで麻酔をかけ、52μmの分解能で、micro−コンピュータ断層撮影データ収集システム(Inveon)により走査した。各試料内で生じた移植片成長を規定するために、時点POD2およびPOD49の走査データを、Osirixソフトウェアバージョン5.8にエクスポートし、セグメンテーションのために、同じ配向性で登録した。形成された新たな骨を、移植された初期のBGM体積と比較した。データセット間の差異は、XLStatソフトウェアバージョン内のマン−ホイットニー検定を利用することにより決定した。p値<0.05を、統計学的に有意と考えた。
GFP染色、BrdU染色、TUNEL染色、DLK1染色、オステオカルシン染色、およびアニリンブルー染色を定量した。Photoshop CS5を使用して、損傷部位における関心領域(ROI)内のピクセル数を決定した。magic wandツールを使用して、ROI内の陽性ピクセルの面積を定めた。陽性シグナルピクセルの、ROIピクセルに対する比を、百分率として表した。損傷部位にわたり等間隔を置いた、少なくとも5つの切片を定量して、各試料の平均値を決定した。各群に5例ずつの試料を組み入れた(n=5)。結果は、平均±SDとして提示する。本明細書で記載される通り、スチューデントのt検定を使用して、差異を定量した。P≦0.05を、有意と考えた。
場合によって、自家移植片を採取するのに最適な解剖学的部位は、ドナー部位の罹患状態および骨備蓄の利用可能性を含む、多数の因子に依存する。改変リーマー潅流吸引(RIA)法を使用して、BGMを、3カ所の解剖学的部位から採取したところ、大腿骨、腸骨稜、および脛骨は、組織学的外見が顕著に異なるBGMをもたらすことが注目された。大腿骨のBGMは、若齢動物から採取する場合であってもなお、造血細胞に加えて、脂肪細胞も含有した(図20A)。腸骨稜のBGMは大部分、緊密な付着細胞で覆われた骨梁断片を含んだ(図20B)。脛骨に由来するBGMは、大量の線維性間質、および小型の無核細胞を含有した(図20C)。定量的RT−PCRを使用して、内因性骨形成遺伝子の発現を査定し、3つの供給源のうち、腸骨稜のBGMが、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンを、有意に高レベルで発現させることを見出した(図20D)。
Axin2CreERT2;R26mTmGレポーターマウスを使用して、組換えを誘導し、これにより、骨膜(図21A)内および骨内膜(図21B)内のGFP+ve前骨芽細胞を同定した。骨内膜内のGFP+ve細胞の頻度は、約0.1%であった(図21C)。GFP+ve細胞はまた、採取されたばかりのBGM内でも同定された(図21D)。したがって、異種性BGM内の細胞のサブセットは、Wnt応答性である。
ヒトでは、骨治癒率は、年齢と共に低下する。BGMの骨形成能の、同様な加齢に伴う低下はまた、マウスにおいても見出された。採取されたばかりのBGMagedは、骨形成遺伝子である、アルカリホスファターゼ、Osterix、およびオステオカルシンの、採取されたばかりのBGMyoungと比較して有意に低い発現レベルを示した(図22A)。
BGMの内因性Wnt応答性および骨形成能は、年齢と共に減殺される。Wntシグナル伝達の低減が、この加齢に伴う骨形成潜在能の低下に寄与するのかどうかについて調べるために、BGM内の内因性Wntシグナル伝達を遮断した。また、in vivoにおけるWntシグナル伝達を、一過性に消滅させるのに、Wntの過剰発現に対する阻害剤であるDkk1も使用した。Ad−Dkk1またはAd−Fc(対照)を、若齢マウスの骨髄腔に送達し、次いで、24時間後にBGMyoungを採取し、アリコートを、臨界サイズ(非治癒性)の骨格欠損に移植した。
図23J〜図23Lにより、内因性Wntシグナル伝達は、BGMの骨形成能を活性化させうることが示された。また、Wntによる刺激が、BGMの有効性を増強するのに十分であるのかどうかについても調べた。BGMagedを採取し、L−WNT3AまたはリポソームPBS(L−PBS)で処置し、次いで、37℃でインキュベートした(図24A)。絶対qRT−PCR解析により、Axin2発現のわずかな上昇が明らかにされた(図24B)。Lef1は、L−WNT3Aに応答して、わずかに上昇した(図24B)。ウェスタン解析は、ベータカテニンタンパク質およびAxin2タンパク質のいずれもが、L−WNT3Aに応答して上昇することを指し示した(図24C)。
また、BGM内の細胞集団であって、L−WNT3Aに媒介される骨形成能の増大の一因となる集団も同定した。標準的な手順を利用して、2つの幹細胞集団をBGMから単離し、L−PBS(対照としての)またはL−WNT3Aを使用して、それらのWnt応答性に基づき査定した。
Wnt3aの、無血清CHO細胞に特異的なベクターからの発現
Wnt3aを分泌するCHO懸濁(CHO−S)細胞はまた、Invitogen製の発現培地など、適切な発現培地中、無血清条件下でも培養しうるであろう。cGMPに適合するCHO−S細胞系、およびWNT3Aをクローニングする2種類のベクターを使用した。1つのベクターは、哺乳動物への分泌シグナルと、CMVプロモーターの下流にある目的の遺伝子とを含有する遺伝子の迅速なクローニングを可能とする、TOPO(登録商標)適応型バイシストロニックプラスミドである、pOptivecであった。ジヒドロ葉酸レダクターゼ選択マーカーにより、迅速な選択が可能となる。このベクターを、CHO−S細胞の一過性トランスフェクションのために使用した。別のベクターは、pTargeTであった。このベクターを、CHO−S細胞の一過性トランスフェクションのために使用し、また、WNT3Aを発現させる安定的な細胞系を創出するのにも使用した。
脂質が規定された代替物による血清の置きかえ
それらを、規定されたセットの脂質で置きかえうるのかどうかを決定するために、血清中の脂質成分について調べる。木炭剥離により、非極性の親油性材料(ウイルス、増殖因子、ホルモン)を、血清から除去する。CHO細胞を、10%のFBS中で増殖させる対照条件と比較して、木炭により剥離されたFBS中で増殖させたCHO細胞は、Wnt3aを分泌しない。これらのデータは、血清の親油性成分が、Wnt3aの分泌に要請されるという結論を裏付ける。コレステロール、トコフェロール、および非動物由来の脂肪酸(リノール(inoleic)酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、お
よびステアリン酸)を含有するLipid Mixture1(Sigma)の補充により、CHO細胞の増殖速度が改善され、Wnt3aの分泌が、CHO細胞に回復される。
血清依存性の段階的な低減
また、WNT3Aを産生するための、血清非依存的なプロセスに到達するための手段としての逐次培養についても調べる。CHO細胞の増殖速度は、血清の低減と同時的に低減され、結果として、馴化培地を回収するための時間枠をシフトさせることが重要となる。場合によって、細胞を、0.5%のFBSに適応させる。
Claims (13)
- 被験体における骨欠損の処置のための組成物であって、哺乳動物Wnt3aポリペプチドと、リポソームを含有する水溶液とを含み、
前記リポソームは、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)であるリン脂質を含み、前記リポソームは、コレステロールを含み、DMPCとコレステロールの濃度が、70:30〜90:10の間の比によって規定され、
前記組成物は、哺乳動物骨髄幹細胞を含む試料を前記組成物とex vivoで接触させ;そして、前記組成物が、骨欠損部位に移植されるときに、骨欠損の処置を提供するものであることを特徴とする、組成物。 - 前記接触させる温度が、0℃〜37℃、または20℃〜25℃である、請求項1に記載の組成物。
- 前記接触させる時間が、30分間〜4時間である、請求項1に記載の組成物。
- 前記哺乳動物の骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記哺乳動物の骨髄細胞が自家骨髄細胞である、請求項1に記載の組成物。
- Wnt3aポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸残基209に対応するアミノ酸位置において修飾された脂質である、請求項1に記載の組成物。
- 前記脂質の修飾がパルミトイル化である、請求項6に記載の組成物。
- 前記Wntポリペプチドがさらにグリコシル化される、請求項6に記載の組成物。
- 安定な組成物である、請求項1に記載の組成物。
- 活性の実質的な喪失を伴わずに最長約106日間安定である、請求項1に記載の組成物。
- 約1℃〜約8℃の間の温度で安定である、請求項1に記載の組成物。
- 窒素下で安定である、請求項1に記載の組成物。
- 前記哺乳動物骨髄細胞が35歳またはこれより老齢の被験体から採取される、請求項1に記載の組成物。
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