CN114099711B - vps26a基因在制备促成骨药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体提供了vps26a基因在制备促成骨药物中的应用，通过研究vps26a基因影响种植体周围骨结合的情况，发现vps26a通过Wnt/β‑cantenin促进BMSCs成骨，进一步促进种植体周围骨结合，最终证实vps26a的过表达慢病毒载体促进BMSCs成骨分化，该过表达载体可以为制备促成骨药物提供相应的基础，具有良好的应用前景，vps26a在种植体骨结合方面发挥着重要作用。

Description

vps26a基因在制备促成骨药物中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及vps26a基因在制备促成骨药物中的应用及相关功能的研究。

背景技术

种植体周围新骨形成减少，骨界面的结合强度降低，已成为影响目前临床种植工作展开的一大难题。随着社会发展，人们对于种植以及其预后的要求越来越高，种植体周围愈合不良，骨结合程度差，都影响着患者的生活。

vps26a是细胞内蛋白和生物合成蛋白进入液泡的必要转运蛋白，定位于细胞质和内体，是retromer复合物的组成部分，负责蛋白质从内体向反高尔基体（TGN）的逆向转运，在蛋白运输中发挥重要作用。

但目前对于vps26a的研究有限，并且vps26a在成骨方面的相关研究一直处于空白状态，现有技术中缺乏相应的研究基础。

发明内容

针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人通过研究vps26a基因在种植体周围骨结合的情况，发现vps26a通过Wnt/β-cantenin促进BMSCs成骨，进一步促进种植体周围骨结合，最终证实vps26a的过表达慢病毒载体促进BMSCs成骨分化，该过表达载体可以为制备促成骨药物提供相应的基础，具有良好的应用前景，vps26a在种植体骨结合方面发挥着重要作用。

本发明的主要技术方案如下：

本发明所述的vps26a的过表达慢病毒载体为重组表达质粒与包装系统共同转染宿主细胞后，得到慢病毒载体；

所述的重组表达质粒为在LV17载体的多克隆位点NotI/BamHI中插入Vps26a基因的核苷酸序列所得，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

发明人利用大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行研究，结果证明vps26a通过Wnt/β-cantenin促进BMSCs成骨，进一步促进种植体周围骨结合，vps26a可作为种植体周围骨结合的新靶点，vps26a的过表达慢病毒载体可用于制备促成骨药物。

附图说明

图 1为利用大鼠骨髓间充质干细胞转染vps26a过表达病毒以及overexpression-nc后，使用Western Blot检测两组中成骨因子包括β-catenin,Wntless,ccnd1,Alp,Runx2以及成脂因子包括PPARγ，FABP4的蛋白水平结果示意图，结果表示成骨相关因子的表达增多，同时成脂相关因子的表达量减少；

图2为利用形态学检测油红O染色，评价转染vps26a过表达病毒后的BMSCs成脂分化能力，结果证实vps26a过表达病毒抑制了BMSCs的成脂分化能力，脂滴如箭头指示所示，影响了BMSCs的分化过程；

图3为利用ALP形态学染色，评价转染vps26a过表达病毒后的BMSCs成骨分化能力，结果证实vps26a过表达病毒促进了BMSCs的成骨分化能力，影响了BMDSCs的分化过程；

图4为利用慢病毒过表达及抑制表达vps26a后，大鼠股骨micro CT结果示意图，

其中LV17和LV16为空载体；

图5为利用慢病毒过表达及抑制表达vps26a后，与HA/TCP支架共同培养，植入裸鼠背部皮下后HE染色结果示意图，

其中LV17和LV16为空载体；

图6为对慢病毒过表达及抑制表达vps26a后，通过topflash验证与wnt/β-catenin通路关系示意图；

图7为对抑制表达vps26a后，通过挽救实验来检测β-catenin的变化示意图；

上图中lv-vps26a又称vpa26a over-expression，lv17又称lv-nc和overexpression-nc， lv16又称shScr。

实施方式

以下结合附图对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。应理解，这些实施例仅为了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。实施例中所采用的具体技术均为本领域的常规技术，所采用的生物材料均为发明人在研究过程中从正规途径和合法渠道获得的已知生物材料，发明人列举相关技术如下：但是其他未被列入的具体技术也均为已知技术，发明人不再赘述。下述实施例中lv-vps26a又称vpa26a over-expression，lv17又称lv-nc和overexpression-nc， lv16又称shScr。

实施例1 骨髓间充质干细胞(BMSCs）的培养与诱导

（1）BMSCs的获取、培养

骨髓间充质干细胞全骨髓细胞贴壁法：取21天左右体重约50-70 g的Wistar雄性大鼠，脱颈处死后立即将其浸泡在75%酒精中，消毒10 min，擦干后放入生物安全柜内。使用无菌手术器械剪开下背部皮肤后，剥离周围软组织，将股骨与胫骨完全暴露，完整取出后，浸泡于无菌PBS溶液中备用。用吸有含双抗的15% FBS DMEM完全培养基的5ml无菌注射器插入骨髓腔中进行冲洗。将冲洗得到的细胞悬液置于培养皿中，多次缓慢吹打悬液使其均匀，做好标记后于37℃、含5%二氧化碳的培养箱中培养。

（2）成骨诱导液的配制

①称取地塞米松0.00393 g于15 ml无菌离心管中，称取β-甘油磷酸钠0. 206 g和维生素C 0.005 g于同一15 ml无菌离心管中。避光操作；②将离心管喷酒精消毒后移至避光的生物安全柜，用2 ml无水乙醇将地塞米松完全溶解后，加入3 ml 10% FBS的完全培养基，用10ml注射器及0.22 um过滤器将上述混合液过滤除菌，得到5 ml且浓度为2×10^-3 mol/ L的地塞米松溶液。然后取5ul该溶液置于另一新离心管中，加入5ml 10% FBS的完全培养基，最终得到得到浓度为2×10^-6mol/L的地塞米松溶液，需4℃低温条件下避光保存，2周有效期；③取250ul浓度为2×10^-6mol/L的地塞米松溶液，加入到提前配制好的47.25ml10% FBS的完全培养基中；④用5 ml含10% FBS的完全培养基将β-甘油磷酸钠和维生素 C完全溶解，用10ml注射器使液体通过0.22 um过滤器进行除菌，后取2.5 ml上述混合液加入到3）中所得的溶液中，为成骨诱导液。

（3）BMSCs诱导培养

取步骤（1）中传代培养的第三代细胞，用步骤（2）配制的成骨诱导液进行成骨诱导。

（4）vps26a在BMSCs成脂成骨分化过程中的作用

将（3）中细胞分为高脂成骨诱导组和普通成骨诱导组，转染vps26a病毒，1天后分别进行高脂诱导和普通成骨诱导，诱导7天后，采用Western blot检测PPAR-γ、FABP4、β-catenin,Wntless,ccnd1,Alp,Runx2的基因差异表达，检测结果如图1所示，结果显示：PPAR-γ、FABP4蛋白表达下调，β-catenin,Wntless,ccnd1,Alp,Runx2表达上调，即vps26a可促进BMSCs向成骨方向分化，抑制其向成脂方向分化。

实施例2 Vps26a过表达慢病毒载体的制备

载体构建过程：

基因名称：Rattus Vps26a

载体名称：LV17

克隆位点：NotI/BamHI目的序列：如SEQ ID NO .1所示；

穿梭质粒构建过程

1.用PCR方法得到Rattus Vps26a序列片段

①oligo设计，目的基因上下游引物分别加上LV17载体上NotI和BamHI两侧同源序列，用于载体的亚克隆，引物序列如SEQ ID NO .2和3所示，引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。

②将oligo溶解成50uM，将oligo分别取相同体积至一1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix。用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，PCR体系如下：

循环条件：

③用B8209-1和B8209-26进行第二轮PCR反应进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物。

PCR体系如下：

反应条件与第一轮相同。第一轮PCR可得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物，再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带。

④PCR反应完成后，利用Agarose 电泳并切胶回收Rattus Vps26a基因片段。

2.目的基因Rattus Vps26a克隆到载体LV17中

①用NotI和BamHI对LV17进行酶切，37℃ 酶切2小时，酶切体系如下：

②电泳，用DNA 凝胶回收试剂盒回收载体LV17。

③利用ClonExpress^® Entry One Step Cloning Kit，将扩增好的片段，重组克隆到线性化的LV17载体中，反应体系如下：

使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分。置于37℃反应30 min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5 min。

3.感受态细胞的制备：

①从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100 ml LB培养基的1 L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转／分)。

②在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至 0℃。

③于 4 ℃, 以4000转／分离心10分钟，回收细胞。

④倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

⑤以10 ml用冰预冷的 0.1 mol／L CaCl₂重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

⑥于 4℃，以4000 转／分离心10分钟，回收细胞。

⑦倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

⑧每50ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的0.1 mol/L CaCl₂(含20%甘油)重悬每份细胞沉淀。

⑨将细胞分装成小份(100ul/支)，放于-70℃冻存。

4.将重组连接产物转化感受态细胞

①从-70℃中取出感受态细胞，将装有感受态细胞的离心管冰上放置4分钟，待感受态细胞解冻后，加入10 ul 重组连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置 30 分钟。

②将离心管放到预加温到 42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置 90 秒，不要摇动离心管。

③快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟。

④向每支离心管加入800ul LB培养基(不含抗生素)，然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45分钟使细菌复苏。

⑤取200 ul培育后的细胞均匀涂布于含50 ug/ml Ampicillin LB平板上，等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。

⑥从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆。

⑦从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml (含50 ug/mlAmpicillin) LB 培养基的试管中。

⑧将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250转/分钟，培养16小时。

⑨将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒，（质粒抽提步骤详见质粒小提试剂盒说明书）。

⑩将抽提好的质粒进行双酶切鉴定，每管反应体系如下：

⑪酶切37℃，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。

5.重组质粒测序验证并大量抽提

①取200ul 阳性克隆对应的菌液送测序，并将剩余的菌液用甘油保存。

②将测序结果与目的基因序列进行比对，正解无误后，用保存的甘油菌液接菌LB培养基，进行大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒（穿梭质粒）。

病毒包装

①293T 细胞在 10 cm 培养皿中培养80%至90% 融合时，接种 15cm培养皿。

②倾去培养液，用 1 mL D-Hank’s solution 洗涤细胞两次。

③加入 1 mL Trypsin-EDTA solution, 混匀后,37℃ 放置3min。

④小心吸去胰酶溶液，加入 2 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。

⑤将细胞悬液接种 15 cm 培养皿，加入 18 mL 含 10% FBS 的DMEM 培养液，混匀后于37℃、含5%二氧化碳的培养箱培养过夜。

⑥在一支无菌的 5 mL 离心管中加入 1.5 mL 无血清 DMEM，按比例加入含Vps26a目的序列的穿梭质粒和包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），混匀，取另一支无菌的5mL离心管，加入1.5mL无血清 DMEM，再加入 300 uL RNAi-Mate，混匀，室温放置5min 后将两管混合，室温放置 25min。

⑦除去 15 cm 培养皿中的培养液，加入 8 mL 无血清的 DMEM 培养液。

⑧将转染混合物逐滴加入 15 cm 培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱中温育6h。

⑨吸弃转染液，加入 18 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养液继续培养 72h。

⑩将培养皿中细胞上清液吸到 50 mL 离心管中，4℃， 4000rpm，4 min，低速离心后，将离心管上清液倒入 50 mL 注射器内，用 0.45um过滤器过滤；滤液在离心机中进行超速离心，4℃，20000 rpm，2h，将浓缩液收集分装至出货管中，分装的病毒液贴上标签，-80℃冰箱保存。

实施例3 vps26a过表达慢病毒在BMSCs分化过程中的作用

具体步骤如下：

将vps26a过表达慢病毒载体及其无关序列对照病毒载体转染BMSCs，转染后分组，分别记为vps26a-expression组（实验组）和overexpression-nc组（对照组），转染1天后，对实验组和对照组分别进行高脂诱导与普通成骨诱导。

诱导结束后，采用Western blot检测vps26a、PPAR-γ、FABP4、ccnd1、Alp、Runx2等基因差异表达，检测如图1所示，结果显示：vps26a- overexpression组vps26a蛋白表达上调后，PPAR-γ、FABP4蛋白表达下调，同时ccnd1、ALP、Runx2蛋白表达上调，即vps26a过表达慢病毒载体抑制BMSCs成脂分化，同时促进成骨分化。

油红O染色检测成脂能力，检测如图2所示，结果显示：vps26a- overexpression组脂滴少于overexpression-nc组，说明vps26a过表达慢病毒载体抑制高脂环境下BMSCs成脂分化。

ALP染色检测成骨能力，检测如图3所示，结果显示：vps26a- overexpression组成骨多于overexpression-nc组，说明vps26a过表达慢病毒载体促进BMSCs成骨分化。

实施例4 动物模型建立

16只Wistar雄性4周龄的大鼠，随机分为四组，以普通饲料进行喂养的。实验中所有大鼠均饲养于灭菌标准鼠笼中，光暗循环为12小时，提供可自由饮用水和相应标准饮食。饲养8周后，于肌肉注射实验组lv-vps26a、shvps26a以及对照组LV17（vps26a载体病毒）、LV16（shvps26a载体病毒）。注射病毒三天后，在10%水合氯醛注射于腹腔进行麻醉后，于大鼠股骨干骺端植入种植钉，14天后取材。

实施例5骨组织取材

实施例4中建模成功后，将股骨软组织迅速分离干净，股骨干骺端充分暴露，截取股骨干骺端，迅速去除多余肌肉和筋膜，各样本取出后分别置于液氮中及4%多聚甲醛中保存，用于后期检测。

实施例6 micro CT分析

对植入种植钉的股骨行micro CT分析，结果如图4所示vps26a过表达组种植体周围新骨形成增多，骨小梁排列致密。

实施例7裸鼠皮下异位成骨

在体外对BMSCs细胞分别转染lv-vps26a、LV17、shvps26a、LV16病毒（共分为4组）后，放入HA/TCP支架共同培养，加入成骨诱导7天后，植入裸鼠背部皮下。移植后6w收集移植物。

实施例8 硬组织切片及染色

将实施例7获得的移植物经4%多聚甲醛中将样本固定完成后，使用浓度为50%至100%乙醇进行梯度脱水，进行浸塑液浸泡及聚甲基丙烯酸树脂进行包埋。于硬组织切片机上切割成30um厚的硬组织切片。使用砂砾为500至4000的砂纸依次打磨，最后抛光，用于后期染色。步骤如下：

①脱蜡，脱蜡二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟，事先准备好盖玻片。②覆水，100%（Ⅰ、Ⅱ）90%、80%、70%酒精各5分钟，自来水冲洗5分钟×3。③苏木精染色5分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。 ④5%乙酸分化1分钟，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜色变浅了一些，成为蓝色。⑤返蓝：返蓝液，实验室没有，也可不用。⑥伊红染色1分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。⑦脱水：70%、80%、90%、100%酒精各10秒，二甲苯1分钟，可以在通风橱自然晾干再封片，约5分钟左右。⑧滴上中性树胶，封片，用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡。

将上述封片后的切片置于倒置显微镜下，观察骨组织中成骨情况，如图5所示vps26a过表达组新骨形成增多，骨小梁排列致密；而shvps26a抑制表达组新骨形成较少。

实施例9 TOPFOP（双萤光素酶实验）

对于BMSCS进行病毒转染，分为4组：lv-vps26a、LV17（lv-nc）、shvps26a、LV16（shScr）,于第二天加入top flash萤火虫质粒以及海肾质粒，两天后一二组加入DKK1（wnt抑制剂），三四组加入wnt3a（wnt激动剂），一天后进行TOPFLASH荧光素酶基因报告测定。如图6所示 vps26a与wnt通路关系密切。

实施例10挽救实验

对细胞BMSCS转染shvps26a以及对照病毒LV16后，三天后加入wnt3a，七天后提取蛋白行Western Blot。结果如图7所示shvps26a抑制了wnt3a诱导处理后β-catenin的水平，并且经wnt3a处理过后的BMSCS/shVPS26A/wnt3a细胞，可观察到β-catenin的上调受到抑制。

上述研究结果证明vps26a通过Wnt/β-cantenin促进BMSCs成骨，进一步促进种植体周围骨结合，vps26a可作为种植体周围骨结合的新靶点，vps26a的过表达慢病毒载体可用于制备促成骨药物。

序列表

<110> 山东大学

<120> vps26a基因在制备促成骨药物中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atgagttttc ttggaggctt ttttggtccc atctgtgaga tcgatgttgc ccttagtgat 60

ggggagacca ggaaaatggc agaaatgaaa acggaagatg gcaaagtaga aaaacactat 120

ctcttctatg atggggaatc tgtctcagga aaggtaaacc tagcctttaa gcagcctgga 180

aagaggctag agcatcaagg aattagaatt gaatttgtag gtcaaattga gcttttcaat 240

gacaagagta atactcatga atttgtaaac ctagtgaagg aactagcctt gcctggagag 300

ctgactcaga gcagaagcta tgactttgaa ttcatgcaag ttgaaaagcc atatgagtca 360

tacatcggtg ccaatgtccg cctgaggtat ttccttaagg tgaccattgt gagaagactg 420

acagacttag tgaaagagta cgatcttatt gttcaccagc tcgccaccta cccagaggtc 480

aacaactcca ttaaaatgga ggtgggaatt gaagactgtc tgcacataga gtttgagtac 540

aataagtcca agtatcattt aaaggatgta attgttggaa aaatttactt cttattagta 600

agaataaaaa tacaacacat ggagttacag ctgatcaaga aagagatcac aggaattgga 660

cccagcacca caacagagac agaaacaatc gctaagtatg aaataatgga tggggcgcca 720

gtaaaaggag aatctattcc gataagattg ttcttagcag ggtatgaccc aacccccaca 780

atgagagatg tgaacaagaa gttttcagta aggtactttt tgaacctcgt gcttgttgat 840

gaggaggaca gaaggtactt caagcagcag gagattatcc tgtggagaaa agcacctgag 900

aaactgagaa aacagaggac gaactttcac cagcgatttg aatctccaga atcgcaggcg 960

tctgcagaac agcctgagat gtaa 984

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

agggttccaa gcttaagcgg ccgcg 25

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

atcagtagag agtgtcggat ccttacatct caggctgttc 40

Claims (1)

1.vps26a基因在制备促成骨药物中的应用，其特征在于：将vps26a的过表达慢病毒载体用于制备促成骨药物，所述的vps26a的过表达慢病毒载体为重组表达质粒与包装系统共同转染宿主细胞后，得到慢病毒载体；所述的重组表达质粒为在LV17载体的多克隆位点NotI/BamHI中插入Vps26a基因的核苷酸序列所得，Vps26a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。