CN114164235B - Sdccag3过表达载体在制备调控骨组织成脂药物中的应用 - Google Patents

Sdccag3过表达载体在制备调控骨组织成脂药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体提供了Sdccag3过表达载体在制备调控骨组织成脂药物中的应用，通过建立Sdccag3过表达载体，验证了其可以调控大鼠骨组织的成脂代谢，可以将该过表达载体作为调控骨组织成脂的药物，在相关领域推广应用。

Description

Sdccag3过表达载体在制备调控骨组织成脂药物中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及Sdccag3过表达载体在制备调控骨组织成脂药物中的应用。
背景技术
随着人们生活水平的不断改善，不良生活方式及不健康饮食结构导致的血脂异常成为越来越多人的健康问题，高脂血症已成为人类常见的病理疾病之一。高脂血症表明由于异常的脂肪代谢或功能，血液中脂质或脂蛋白的含量异常升高，其特征是血液循环中的高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)浓度降低，总胆固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酸酯(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白胆固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平升高，它是由饮食失调、肥胖症、遗传性疾病(如家族性高胆固醇血症)或其他疾病(如糖尿病)引起的。由于高脂血症作为与动脉粥样硬化有关的最危险要素，因此其同时作为中风、冠心病、心肌梗塞和心源性猝死的潜在危险因素。
骨髓作为造血的连续来源，其复杂的信号传导机制是调节正常体内定向多谱系平衡的重要关键，经常出现在代谢疾病的稳态不平衡，例如糖尿病。而骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cell，BMSC)是非造血细胞，可作为脂肪形成祖母细胞。BMSCs是脂肪细胞以及其他类型细胞的常见前体，在高血糖或应激信号的诱导下，更倾向于脂肪细胞，从而导致骨脂肪形成的表型，骨髓中分化途径之间的相互平衡被改变，以其他细胞形成为代价，促进了骨髓中的脂肪积聚。许多关键信号通路在BMSCs的成脂分化中发挥一定作用。然而，在代谢应激期间的脂肪形成过程机制仍不清楚。
Sdccag3(serologically defined colon cancer antigen-3，人类结肠癌血清抗原3)是一种定位于早期和可回收内体的内体蛋白，最初被鉴定为为血清学定义结肠癌抗原3。现有技术已发现，其在高脂环境抑制BMSCs向成骨细胞的分化，这与Wnt信号通路中的蓬乱蛋白2(Dishevelled 2，Dvl2)下调相关；同时，在高脂环境下Wnt通路上细胞膜卷曲受体蛋白Fzd9也受到抑制。此外，研究还发现Sdccag3在这一骨代谢过程中发挥重要的作用，并可调节血脂异常下的骨形成功能，这是首次发现Sdccag3在骨骼方面的功能作用。但Sdccag3对于骨髓间充质干细胞成骨、成脂代谢稳态的影响尚无研究，其脂代谢的影响机制需要进一步研究。
发明内容
针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人提供了一种Sdccag3过表达载体在制备调控骨组织成脂药物中的应用，通过建立Sdccag3过表达载体，验证了其可以调控大鼠骨组织的成脂代谢，可以将该过表达载体作为调控骨组织成脂的药物，在相关领域推广应用。
本发明所述的Sdccag3过表达载体为Sdccag3过表达慢病毒载体，具体为重组表达质粒与包装系统共同转染宿主细胞后，得到慢病毒载体；
所述的重组表达质粒为在EF-1a/Luciferase17&Puro载体中多克隆位点NotI/BamHI中插入Sdccag3基因的核苷酸序列所得，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
除此之外，所述Sdccag3过表达载体可调控高脂环境下骨髓间充质干细胞的成脂分化及高脂血症大鼠骨组织的成脂代谢。
利用上述Sdccag3过表达慢病毒载体，发明人验证了其可以抑制高脂血症大鼠骨组织脂肪形成合，证明了其可以作为调控骨组织成脂的药物，并应用于相应疾病的治疗过程，填补了本领域的空白。
附图说明
图1为利用大鼠骨髓间充质干细胞进行高脂或普通成骨诱导7天后，使用实时定量PCR检测两组BMSCs中Sdccag3、PPAR-γ和FABP4 mRNA水平结果示意图，结果表明高脂组成脂相关因子PPAR-γ和FABP4的表达增多，同时Sdccag3的表达量减少；
图2为利用大鼠骨髓间充质干细胞进行高脂或普通成骨诱导14天后，使用实时定量PCR检测两组BMSCs中Sdccag3、PPAR-γ和FABP4 mRNA水平结果示意图，结果表明高脂组成脂相关因子PPAR-γ和FABP4的表达增多，同时Sdccag3的表达量减少；
图3为利用大鼠骨髓间充质干细胞进行高脂或普通成骨诱导7天后，Western Blot实验结果示意图；
图4为利用形态学检测油红O染色，评价高脂环境下BMSCs成脂分化能力结果示意灰度图，结果证实高脂环境明显促进了BMSCs早期的成脂分化能力，影响了BMSCs向成脂细胞的分化过程；
图5为Sdccag3过表达及抑制表达后RT-PCR检测结果示意图，其中overexpression-nc：Sdccag3过表达阴性对照组；Sdccag3-overexpression：Sdccag3过表达组；knockdown-nc：Sdccag3抑制表达阴性对照组；Sdccag3-knockdown：Sdccag3抑制表达组；
图6为Sdccag3过表达及抑制表达后Western Blot检测结果示意图；
图7为Sdccag3过表达及抑制表达后油红O染色结果示意灰度图；
图8为大鼠高脂组与普通组的相关分子表达RT-PCR结果示意图；
图9为大鼠高脂组与普通组股骨硬组织切片油红O染色结果示意灰度图；结果显示，高脂血症大鼠较普通组大鼠骨组织中脂肪增多；
图10为利用慢病毒载体过表达及抑制表达Sdccag3后，大鼠相关分子表达RT-PCR结果示意图；
图11为利用慢病毒载体过表达及抑制表达Sdccag3后，大鼠股骨硬组织切片油红O染色结果示意灰度图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。应理解，这些实施例仅为了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。实施例中所采用的具体技术均为本领域的常规技术，所采用的生物材料均为发明人在研究过程中从正规途径和合法渠道获得的已知生物材料，发明人列举相关技术如下：但是其他未被列入的具体技术也均为已知技术，发明人不再赘述。
实施例1骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养与诱导
(1)BMSCs的获取、培养
骨髓间充质干细胞全骨髓细胞贴壁法：取21天左右体重约50-70g的Wistar雄性大鼠，脱颈处死后立即将其浸泡在75％酒精中，消毒10min，擦干后放入生物安全柜内。使用无菌手术器械剪开下背部皮肤后，剥离周围软组织，将股骨与胫骨完全暴露，完整取出后，浸泡于无菌PBS溶液中备用。用吸有含双抗的15％FBS DMEM完全培养基的5ml无菌注射器插入骨髓腔中进行冲洗。将冲洗得到的细胞悬液置于培养皿中，多次缓慢吹打悬液使其均匀，做好标记后于37℃、含5％二氧化碳的培养箱中培养。
(2)高脂成骨诱导液、普通成骨诱导液的配制
①称取地塞米松0.00393g于15ml无菌离心管中，称取β-甘油磷酸钠0.206g和维生素C 0.005g于同一15ml无菌离心管中。避光操作；②将离心管喷酒精消毒后移至避光的生物安全柜，用2ml无水乙醇将地塞米松完全溶解后，加入3ml 10％FBS的完全培养基，用10ml注射器及0.22um过滤器将上述混合液过滤除菌，得到5ml且浓度为2×10-3mol/L的地塞米松溶液。然后取5ul该溶液置于另一新离心管中，加入5ml 10％FBS的完全培养基，最终得到得到浓度为2×10-6mol/L的地塞米松溶液，需4℃低温条件下避光保存，2周有效期；③取250ul浓度为2×10-6mol/L的地塞米松溶液，加入到提前配制好的47.25ml 10％FBS的完全培养基中；④用5ml含10％FBS的完全培养基将β-甘油磷酸钠和维生素C完全溶解，用10ml注射器使液体通过0.22um过滤器进行除菌，后取2.5ml上述混合液加入到3)中所得的溶液中，为普通成骨诱导液；⑤将上述DMEM培养液更换为高脂培养液重复上述步骤即可得到高脂成骨诱导液。成骨诱导液需4℃避光保存，1周内使用有效。高脂培养基为PYTHONBI品牌，货号AAPR156。
(3)BMSCs诱导培养
取步骤(1)中传代培养的第三代细胞，将细胞随机分为实验组(高脂组)、对照组(正常组)，分别用步骤(2)配制的高脂成骨诱导液和普通成骨诱导液进行成骨诱导。
(4)高脂环境在BMSCs成脂分化过程中的作用
成骨诱导第7、14天，分别采用RT-PCR、Western blot检测Sdccag3、PPAR-γ、FABP4的基因差异表达，检测结果如图1、2、3所示，结果显示：高脂组Sdccag3基因及蛋白表达下调，相应的PPAR-γ、FABP4基因表达上调，PPAR-γ蛋白表达上调。即高脂环境促进BMSCs成脂分化。
(5)BMSCs成脂能力鉴定
成骨诱导第14天，分别进行油红O染色，观察两组细胞成脂分化情况，染色结果如图4所示。油红O染色结果显示，高脂组红色脂滴(图4高脂组中箭头所指)明显多于普通组；即高脂环境促进BMSCs成脂分化。
实施例2 Sdccag3过表达慢病毒载体的制备
载体构建过程：
基因名称：rat-Sdccag3(NM_001013135.2)-Luc
载体名称：EF-1a/Luciferase17&Puro(下面简称LV17)
克隆位点：NotI/BamHI
目的序列：如SEQ ID NO.1所示；
穿梭质粒构建过程
1.用PCR方法得到rat-Sdccag3(NM_001013135.2)-Luc序列片段
①oligo设计，目的基因上下游引物分别加上LV17载体上NotI和BamHI两侧同源序列，用于载体的亚克隆，引物序列如SEQ ID NO.2和3所示，引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。
②将oligo溶解成50M，将oligo分别取相同体积至一1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix。用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，PCR体系如下：
oligo mix 6l
10×Pfu Buffer(Mg2+) 5l
dNTP 1l
B5324-1(SEQ ID NO.2) 1l
B5324-30(SEQ ID NO.3) 1l
ddH2O 36l
Pfu DNA polymerase 0.3l
循环条件：
Figure BDA0003357546810000031
③进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物。
PCR体系如下：
Figure BDA0003357546810000032
Figure BDA0003357546810000041
反应条件与第一轮相同。第一轮PCR可得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物，再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带。
④PCR反应完成后，利用Agarose电泳并切胶回收rat-Sdccag3(NM_001013135.2)-Luc基因片段。
2.目的基因rat-Sdccag3(NM_001013135.2)-Luc克隆到载体LV17中
①用NotI和BamHI对LV17进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：
10×Buffer 5l
DNA 15l
NotI 1l
BamHI 1l
ddH2O 28l
②电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收载体LV17。
③利用
Figure BDA0003357546810000042
Entry One Step Cloning Kit，将扩增好的片段，重组克隆到线性化的LV17载体中，反应体系如下：
5×CE Entry Buffer 4l
LV17 1l
rat-Sdccag3(NM_001013135.2)-Luc 2l
Exnase Entry 2l
ddH2O 11l
使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分。置于37℃反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min。
3.感受态细胞的制备：
①从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。
②在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。
③于4℃,以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
④倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。
⑤以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
⑥于4℃,，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
⑦倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。
⑧每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2(含20％甘油)重悬每份细胞沉淀。
⑨将细胞分装成小份(100μl/支)，放于-70℃冻存。
4.将重组连接产物转化感受态细胞
①从-70℃中取出感受态细胞，将装有感受态细胞的离心管冰上放置4分钟，待感受态细胞解冻后，加入10l重组连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置30分钟。
②将离心管放到预加温到42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置90秒，不要摇动离心管。
③快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟。
④向每支离心管加入800l LB培养基(不含抗生素)，然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45分钟使细菌复苏。
⑤取200l培育后的细胞均匀涂布于含50μg/ml Ampicillin LB平板上，等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。
⑥从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆。
⑦从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml(含50μg/mlAmpicillin)LB培养基的试管中，
⑧将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250转/分钟，培养16小时。
⑨将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒，(质粒抽提步骤详见质粒小提试剂盒说明书)。
⑩将抽提好的质粒进行双酶切鉴定，每管反应体系如下：
10×Buffer 1l
质粒 1l
NotI 0.5l
BamHI 0.5l
ddH2O 7l
Figure BDA0003357546810000051
酶切37℃，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。
5.重组质粒测序验证并大量抽提
①取200μl阳性克隆对应的菌液送测序，并将剩余的菌液用甘油保存。
②将测序结果与目的基因序列进行比对，正解无误后，用保存的甘油菌液接菌LB培养基，进行大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒(穿梭质粒)。
病毒包装
①293T细胞在10cm培养皿中培养80％至90％融合时，接种15cm培养皿；
②倾去培养液，用1mL D-Hank’s solution洗涤细胞两次；
③加入1mL Trypsin-EDTA solution,混匀后,37℃放置3min；
④小心吸去胰酶溶液，加入2mL含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；
⑤将细胞悬液接种15cm培养皿，加入18mL含10％FBS的DMEM培养液，混匀后于37℃、含5％二氧化碳的培养箱培养过夜；
⑥在一支无菌的5mL离心管中加入1.5mL无血清DMEM，按比例加入含Sdccag3目的序列的穿梭质粒和包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)(常规技术)，混匀，取另一支无菌的5mL离心管，加入1.5mL无血清DMEM，再加入300μL RNAi-Mate，混匀，室温放置5min后将两管混合，室温放置25min；
⑦除去15cm培养皿中的培养液，加入8mL无血清的DMEM培养液；
⑧将转染混合物逐滴加入15cm培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37℃、含5％二氧化碳的培养箱中温育6h；
⑨吸弃转染液，加入18mL含10％FBS的DMEM培养液继续培养72h。
⑩将培养皿中细胞上清液吸到50mL离心管中，4℃，4000rpm，4min，低速离心后，将离心管上清液倒入50mL注射器内，用0.45μm过滤器过滤；滤液在离心机中进行超速离心，4℃，20000rpm，2h，将浓缩液收集分装至出货管中，分装的病毒液贴上标签，-80℃冰箱保存。
实施例3 Sdccag3过表达慢病毒载体在BMSCs成脂分化过程中的作用
具体步骤如下：
将Sdccag3过表达慢病毒载体及其无关序列对照病毒载体转染BMSCs，转染后分组，分别记为Sdccag3-overexpression组和overexpression-nc组；将Sdccag3沉默慢病毒载体和无关序列对照慢病毒载体转染BMSCs，转染后分组，分别记为Sdccag3-konckdown组和konckdown-nc组，转染1天后进行高脂成骨诱导。
高脂成骨诱导结束后，采用RT-PCR、Western blot检测Sdccag3、PPAR-γ、FABP4的基因差异表达，检测结果如图5、6所示，结果显示：Sdccag3-overexpression组Sdccag3基因及蛋白表达上调，相应的PPAR-γ、FABP4基因表达下调，PPAR-γ蛋白表达下调；Sdccag3-konckdow组Sdccag3基因及蛋白表达下调，相应的PPAR-γ、FABP4基因表达上调，PPAR-γ蛋白表达上调，即Sdccag3过表达慢病毒载体抑制高脂环境下BMSCs成脂分化。
油红O染色检测成脂能力，检测结果如图7所示(特别是箭头所示)，结果显示：Sdccag3-overexpression组脂滴少于overexpression-nc组；Sdccag3-konckdow组脂滴多于konckdown-nc组，说明Sdccag3过表达慢病毒载体抑制高脂环境下BMSCs成脂分化。
实施例4高脂血症动物模型建立
26只Wistar雄性4周龄的大鼠，随机分为两组，以普通饲料进行喂养的为普通组大鼠，以高脂饲料进行喂养的为高脂组大鼠。实验中所有大鼠均饲养于灭菌标准鼠笼中，光暗循环为12小时，提供可自由饮用水和相应标准饮食。饲养8周后，所有大鼠在禁食12小时后吸入麻醉下于内眦静脉处取1.0ml血置于2.0ml无菌微量离心管内，冰上静置30min，在离心机中4℃下4000rpm的转速离心20min，吸取上层血清置于新1.5ml无菌微量离心管内，检测血清中TC、LDL-C、HDL-C与TG水平。
血清学生化检测如表1：
表1：普通组、高脂组大鼠血清脂质水平检测结果(mean±SD，单位：mmol/L)
Figure BDA0003357546810000061
*普通组和高脂组具有显著统计学差异(P<0.05).
实施例5骨组织取材
实施例4中实验组高脂血症大鼠建模成功后，在10％水合氯醛注射于腹腔进行麻醉后，将股骨软组织迅速分离干净，股骨干骺端充分暴露，截取股骨干骺端，迅速去除多余肌肉和筋膜，各样本取出后分别置于液氮中及4％多聚甲醛中保存，用于后期检测。
实施例6高脂血症对大鼠骨组织成脂代谢的作用
普通组、高脂组大鼠分别采用RT-PCR检测Sdccag3、PPAR-γ、FABP4的基因差异表达，检测结果如图8所示，结果显示：高脂组Sdccag3基因表达下调，相应的PPAR-γ、FABP4基因表达上调。即高脂血症促进大鼠骨组织成脂分化。
实施例7硬组织切片及染色
将实施例5经4％多聚甲醛中将样本固定完成后，使用浓度为50％至100％乙醇进行梯度脱水，进行浸塑液浸泡及聚甲基丙烯酸树脂进行包埋。于硬组织切片机上切割成30μm厚的硬组织切片。使用砂砾为500至4000的砂纸依次打磨，最后抛光，用于后期染色。步骤如下：①按照说明书配制油红O工作液；②用蒸馏水将硬组织切片充分洗涤5min；③使用浓度为60％的异丙醇浸5min；④滴加适量油红O染液于切片组织上染色3min，60％异丙醇进行分化，蒸馏水冲洗2min，显微镜下观察着色效果；⑤滴加适量苏木素染液于切片组织上复染1min，蒸馏水冲洗2min，显微镜下查看着色效果；⑥切片干燥后，封片，置于显微镜下拍照记录。
将上述封片后的切片置于倒置显微镜下，观察骨组织中脂肪染色情况，在100倍显微镜下显示(图9)：高脂组骨组织中红染脂肪明显多于普通组(图中箭头所示)，说明高脂血症促进骨组织中脂肪增多。
实施例7 Sdccag3过表达慢病毒载体在大鼠体内对骨组织成脂代谢的作用
按照实施例4的方法构建高脂血症大鼠模型，随机均分4组，于取材前3、0天在双侧股骨干骺端部位分别肌肉注射Sdccag3过表达慢病毒载体、Sdccag3抑制表达慢病毒载体及其无关序列对照病毒载体，分别记为Sdccag3-overexpression组、overexpression-nc组、Sdccag3-konckdown组和konckdown-nc组，取材时所有大鼠注射10％水合氯醛麻醉、处死，获得骨组织样本。上述慢病毒载体均通过于上海吉玛制药技术有限公司购买获得。
取上述骨组织样本，采用RT-PCR检测Sdccag3及成脂相关因子PPAR-γ、FABP4的基因差异表达。Sdccag3-overexpression组与对照overexpression-nc组的结果如图10所示，结果显示，Sdccag3-overexpression组Sdccag3基因表达上调，PPAR-γ、FABP4基因表达下调，抑制了高脂血症大鼠骨组织的成脂分化作用。Sdccag3-konckdown组与对照konckdown-nc组的结果显示，Sdccag3-konckdown组Sdccag3基因表达下调，PPAR-γ、FABP4基因表达上调，促进了高脂血症大鼠骨组织的成脂分化作用。
取上述Sdccag3-overexpression组、overexpression-nc组、Sdccag3-konckdown组和konckdown-nc组骨组织按照实施例7进行油红O染色，进行形态学的观察。观察结果如图11所示(特别是箭头所示)，结果显示Sdccag3-overexpression组红染脂肪数量减少，脂肪形成明显少于对照组，Sdccag3-konckdown组红染脂肪数量增多，脂肪形成明显多少对照组，进一步证实Sdccag3过表达慢病毒载体抑制高脂血症大鼠骨组织脂肪形成。
序列表
<110> 山东大学
<120> Sdccag3过表达载体在制备调控骨组织成脂药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
atgtcgggct acgcgcggcg gcagggcgcg cccccactat cgcggacgcg gagcctcgta 60
gttcccgacg ctcctgcgtt ctatgagcgc cggtcttgtc tcccccagct agactgtgaa 120
cgcccccatg gcggggacct gcacccccag ttcttcggct ttcggccgac gtttatgtgc 180
tatgtgccca gcccggtgct ggcttcggta ggagacacag attttggcta tggaaagggg 240
aaatgtacta aacaaggccc gtcgggagcc catgagacgc gctttggagg tgacaaactt 300
gaagaccttg aagaagccaa tccattctcc ttcaaagagt ttttgaaaac caagaacctc 360
agcctgtcaa aagaagacac agccaccagt cgaatttacc cgaaggaggc ctcgaggcac 420
ccactgggac tagaccacaa ctcccctgtc tcccagccca tgggatatgg cctggaatat 480
cagcagccat tttttgaaga cccaacaaga gccagcaacc tagaggagga tgaagaggac 540
gggtggagca gagcctacct gccgtctgcc gtggagcaga ctcactccac gagagccacg 600
cagaactcat cgccctgtgg cacctacctt tccttctttt ccaacgcgtc agagctggca 660
ggtcctgagt ctttgccccc atggacactg agtgacactg actccaggct ctccccagcg 720
tctccagctg ggaatcctaa tgtagacttt gcagctcatg aagaatcctt aggggacaga 780
cacctgcgga cgctgcagtt aagttacgaa gcactgaaag atgaaaactc taagctcaga 840
agaaagctaa gtgaggttca gagcttctct gaaactcaaa cagaaatggt gaggacgctc 900
gaacggaagt tggaggcgaa gatgatcaag gaagagagtg acttccatga cctggagtca 960
gtagtccagc aagtcgaaca gaacctcgaa ctgatgacca aacgggctgt aaaagcagaa 1020
aatcatgtca tgaagctgaa acaggaagta aatttgctcc aggcacagct ctccaacttc 1080
aagcgagaaa acgaagccct tcggtcaggc cagggtgcca gccttaccgt ggtgaagcag 1140
aacaccgatg tggccttgca gaacctccat gttgtcatga acagtgcaca cgcatctata 1200
aagcagctgg tgtctggagc agagacactg aaccttgttg ctgaaatcct caagtctatc 1260
gacagaatta ctgaagttaa ggatgaggca gactcttga 1299
<210> 2
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
agggttccaa gcttaagcgg ccgcgccacc atgtcgggct acgcgcggcg gcaggg 56
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
atcagtagag agtgtcggat cctcaagagt ctgcctc 37

Claims (2)

1.Sdccag3过表达载体在制备抑制骨组织成脂药物中的应用，所述的Sdccag3过表达载体为重组表达质粒与包装系统共同转染宿主细胞后，得到的慢病毒载体；
所述的重组表达质粒为在EF-1a/Luciferase17&Puro载体中多克隆位点NotI/BamHI中插入Sdccag3基因的核苷酸序列所得，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.根据权利要求1所述Sdccag3过表达载体在制备抑制骨组织成脂药物中的应用，其特征在于：所述Sdccag3过表达载体可抑制高脂环境下骨髓间充质干细胞的成脂分化及高脂血症大鼠骨组织的成脂代谢。
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Sdccag3促进高脂血症实验大鼠种植体骨结合实验研究;任会萍;硕士电子期刊;摘要 *
Sdccag3及相关非编码RNA对高脂血症大鼠种植体骨整合的影响机制研究;刘飞;硕士电子期刊;摘要 *
高脂血症大鼠种植体周围骨组织中的基因共表达网络研究及机制初探;董晓菲;硕士电子期刊;摘要 *

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