CN107828882B - miRNA调控血小板凝溶胶蛋白Gelsolin及其在筛选抗血小板药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miRNA在调控Gelsolin的表达水平中的应用及其在抗血小板治疗中的应用，所述miRNA为miR‑124。还涉及通过筛选调节血小板中上述miRNA的试剂从而筛选潜在的抗血小板治疗药物的方法。筛选实验表明川芎嗪、三七总皂苷及阿司匹林可以调节血小板细胞中miR‑124的水平，从而在抗血小板治疗中发挥作用。

Description

miRNA调控血小板凝溶胶蛋白Gelsolin及其在筛选抗血小板 药物中的应用

技术领域

本发明属于血小板调节领域，具体涉及miRNA在调节血小板凝溶胶蛋白Gelsolin及筛选应用于血小板相关疾病尤其时冠心病血瘀证的药物中的应用。

背景技术

冠心病的发生发展与多种因素密切相关，血小板活化在其中起到了关键作用，粥样硬化斑块使冠状动脉血管破损，通过多种途径激活血小板，导致血小板黏附、聚集，形成富含血小板的血栓，使得冠状动脉完全或部分堵塞促使冠心病发生。血瘀证是冠心病最常见的中医证型，既往研究表明其与血液循环障碍、血液高黏滞状态、血小板的活化和黏附聚集、血栓形成等多种病理生理改变过程密切相关。大量临床研究证明了抗血小板治疗在冠心病防治中的重要地位，全球对抗血小板药物的需求日渐增加。尽管现代医学抗血小板药物治疗进展显著，仍存在诸如阿司匹林抵抗、氯吡格雷抵抗或无反应、出血风险等问题亟待解决。阿司匹林是目前心血管病一级预防和二级预防最常用的抗血小板药物，虽然可使高危病人动脉血栓事件发生率降低大约25％，但接受治疗的病人中仍有10％-20％出现复发性血栓事件，称为阿司匹林抵抗或治疗失败。因此，寻找新的安全有效的抗血小板药物对冠心病心血管事件的防治具有重要意义。

血小板是由经历了增殖、分化、细胞核多倍体化及凋亡过程的巨核细胞分裂所形成的，其形成和活化过程均涉及到肌动蛋白细胞骨架的重组。幼巨核细胞可以表达凝溶胶蛋白Gelsolin，但不能表达同属于Gelsolin超家族的微丝切割蛋白(Adseverin)和加帽蛋白G(capG)，若强制表达adseverin可诱导幼巨核细胞成熟形成血小板，同时会下凋Gelsolin的表达，Gelsolin蛋白敲除小鼠损伤后出血时间较正常延长，这说明Gelsolin有可能会抑制幼巨核细胞分化形成血小板的过程。有研究表明Gelsolin在冠心病血瘀证患者血小板中的表达明显高于冠心病非血瘀证患者，提示血小板凝溶胶蛋白与冠心病血瘀证的形成密切相关，其可能是活血化瘀中药抗血小板活化及血栓形成的潜在分子靶标之一。

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。miRNA最早发现于1993年，此后该领域进展迅速，在各方向均取得了巨大成就。在短短20余年间，对miRNA的研究已从实验室进入到临床阶段，目前有很多成功的Ⅰ期临床试验以及正在开展的Ⅱ期临床试验。本发明获得了对血小板细胞中调节凝溶胶蛋白Gelsolin的miRNA，为抗血小板治疗尤其是冠心病血瘀证的治疗提供新的途径。

发明内容

本发明提供了miR-124在制备用于调控Gelsolin的表达水平的试剂中的应用。

提供了miR-124在制备用于抗血小板治疗疾病的药物的应用。

优选地，所述疾病为冠心病血瘀证。其中所述治疗通过调控Gelsolin的表达水平实现。

本发明提供一种筛选影响血小板细胞活力的物质或筛选抗血小板候选药物的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)培养MEG-01细胞，加TPA诱导分化3天；

(2)加不同药物处理细胞，分别处理24h后，取细胞进行后续qRT-PCR检测确定各组细胞中miR-124的相对表达水平。

(3)将显著提高miR-124相对表达水平的药物作为潜在药物进一步研究。

优选地，步骤(1)具体为：MEG-01细胞用含RMPI-1640+10％FBS+4mmol/L L-glutamine的培养液在37℃，5％CO2条件下悬浮培养，每个孔的起始浓度为5×10⁵细胞，TPA终浓度10nM诱导MEG-01细胞分化3d。

本发明与现有技术相比具有以下积极效果：提供了一种可调节血小板相关标志物gelsolin表达的miRNA，该miRNA为血小板相关疾病的治疗提供了新的靶标和药物开发途径。

附图说明

图1是各组MEG-01细胞培养状态(200×)

图2是各组细胞CD41/CD61表达情况的流式细胞图

图3是各组细胞CD41/CD61表达情况的柱状图

图4是各组细胞中let-7a、let-7c、miR-150、miR-124和miR-200a的mRNA的相对表达水平

图5是各组细胞Gelsolin表达水平

图6是各组细胞中miR-124对Gelsolin的荧光素酶活性检测

图7是各组细胞中miR-124的mRNA的相对表达水平

图8是各组细胞中Gelsolin的mRNA的相对表达水平

图9是各组细胞Gelsolin蛋白的表达水平

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：人MEG-01巨核细胞的培养和诱导成熟

1、实验分组：1.MEG-01组：MEG-01细胞用RMPI-1640+10％FBS+4mmol/L L-glutamine培养液培养；2.MEG-01/TPA组：MEG-01细胞用含RMPI-1640+10％FBS+4mmol/L L-glutamine的培养液在37℃，5％CO₂条件下悬浮培养，6孔板每个孔的起始浓度为5×10⁵细胞。TPA终浓度10nM诱导MEG-01细胞分化3天。倒置Olympus显微镜采集细胞图像(200×)。

2、FACS表面染色

吸取500μL诱导3天的MEG-01细胞以及空白对照组细胞，首先将此两组细胞分别用含5％血清的PBS(染色液)洗涤1-2次，500g，5min，离心，调整细胞浓度为1×10⁶/mL。每50μL染色液添加2μL anti-human Fc封闭性抗体。将MEG-01细胞用50μL含有封闭性抗体的染色液混悬，4℃孵育30min。每50μL染色液添加2μL的anti-human CD41/CD61-FITC抗体。在上述细胞中再加入步骤4中配制好的50μL染色液混悬，这样体系就是100μL，4℃暗处孵育30min。细胞洗涤两次，500g，5min，离心。500μL PBS混悬立即检测，或可用500μL的4％多聚甲醛固定，4℃冰箱中可保存一周。流式检测。

3、统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差(±S)表示，仅有两组时采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。

4、结果分析

图1是各组MEG-01细胞培养状态；图2、图3为流式细胞术检测CD41/CD61表达情况。从图2和3中可知，与MEG-01组比较，MEG-01/TPA组CD41/CD61表达显著升高。结果表明说明TPA促进MEG-01细胞成熟分化为血小板细胞。

实施例2：MEG-01和MEG-01/TPA细胞中miRNA和Gelsolin蛋白的表达水平研究

1、miRNA表达水平检测

取1×10⁷数量的指数生长期的MEGA-01及MEGA-01/TPA细胞，通过Trizol提取这两种细胞的RNA。

对于miRNA的反转录，每条miRNA需要用到其特异性反转录引物，如表1所示。反转录方法如下：取一定量的的RNA(0.1ng-5μg)，1μL oligo miRNA特异性反转引物加入到RNase free的管子中，并加入一定量的DEPC水，使得终体积为12μL。将管子置于65℃温水中，温浴5min。温浴结束后，将管子快速置于冰上。往管子中加入4μL 5×reaction buffer，2μL 10mM dNTP mix，1μL RNA酶抑制剂以及1μL逆转录酶，轻轻地混匀，置于42℃水浴锅中温浴1小时，然后置于70℃水浴锅中灭活5min。最后保存于-80℃冰箱中。

表1 miRNA特异性反转录引物

配制以下反应体系进行实时荧光定量PCR反应。用漩涡振荡器将管中溶液彻底混合均匀，短暂低速离心。反应条件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，10s；40次循环。其中所使用的实时荧光定量PCR的引物如下表2所示。

表2 qRT-PCR引物序列

2、Western blot测定蛋白表达水平

取分化3天的细胞，小心弃掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸上吸干培养液。每瓶细胞加入3mL、4℃预冷的PBS(pH7.2)洗涤2次；弃净PBS液，置于冰上。加入500μL含PMSF的裂解液，冰上裂解30min。将细胞刮于培养瓶的一侧，用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5mL离心管中(冰上进行)。4℃下12000rpm×5min。将离心后的上清液分装置于-70℃冰箱保存。测定蛋白浓度然后按照下述步骤进行Western blot：

(1)SDS-PAGE电泳分离

将制备好的胶固定到电泳槽上，储液池中倒入电泳液。用微量加样器将制备好的蛋白样品和Marker加入上样孔，各样品总蛋白量为30μg。加样后先恒压80V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压120V至溴酚蓝到凝胶底部，此过程约用时1.5h。

(2)转膜

切胶、剪膜和滤纸：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。将凝胶浸泡于转膜缓冲液中。准备6张略小于待转凝胶的滤纸、1张略大于待转凝胶的PVDF膜、垫片，置于电转缓冲液中平衡10min以上。安装转膜装置：从负极到正极按如下顺序排列：垫片，滤纸，凝胶，PVDF膜，滤纸，垫片，注意每层均要排出气泡；盖上转膜仪的盖子。将夹板放入电转槽中，稳流80mA电转2h。断开电源，取出转好的PVDF膜，做好标记。

(3)抗体结合反应

TBST液洗涤印迹膜5min×3次。放入5％脱脂奶粉/TBST封闭液内，室温封闭1h。加TBST适当稀释的一抗：Gelsolin抗体用1：1000抗体稀释液稀释；α-Tubulin抗体用1：5000抗体稀释液稀释。一抗稀释液按0.05％TBST(mL)：脱脂奶粉(g)＝20：1配制。一抗孵育：将封闭后的膜放入杂交袋中，加入稀释的一抗约1～2mL，4℃孵育过夜。TBST洗涤15min/次×3次。二抗孵育：HRP标记的羊抗兔IgG分别用TBST液1：10000稀释(稀释液同上)，加相应二抗，在室温孵育45min，TBST液洗去二抗，10min/次×3次。

(4)标记物显色

配制显色液，A液和B液各500μL等体积混合。将PVDF膜置于保鲜膜上，用吸水纸轻轻吸干膜表面的液体，按膜：工作液＝10cm²：1mL的比例将ECL工作液覆盖到膜表面，室温孵育5min。在PVDF膜上盖上一层保鲜膜，放入化学发光成像系统曝光成像。设置曝光时间，获得电子图像用于半定量分析。

3、结果分析

(1)各组细胞中let-7a、let-7c、miR-150、miR-124和miR-200a的mRNA的相对表达水平比较：

图4是各组细胞中let-7a、let-7c、miR-150、miR-124和miR-200a的mRNA的相对表达水平。从图中可知，与MEG-01组比较，MEG-01/TPA组细胞的let-7a表达显著降低；miR-124表达显著升高；let-7c、miR-150表达升高，miR-200表达降低，但三者都没有显著差异。

(2)图5和表3是各组细胞Gelsolin的表达水平。从图5中可知，与MEG-01组比较，MEG-01/TPA组细胞的Gelsolin表达降低。

综合1和2的实验结果，直接调控Gelsolin的miRNA选miR-124。

表3各组细胞Gelsolin蛋白灰度分析

实施例3miR-124直接调控Gelsolin表达的验证

1、含3’-UTR的载体和含突变3’-UTR的载体构建

(1)酶切空质粒

对2μg pmirGLO空质粒用PmeI和XbaI双酶切，酶切体系如下：

表4酶切反应体系

37℃过夜酶切，然后，酶切后在EP管中加入5M NaCl 4μL，冰无水乙醇100μL，混匀。放入-80℃冰箱中30min，12000转离心15min，用75％的冰无水乙醇迅速洗两次，吹干。最后用10μL ddH₂O溶解。

(2)合成目的DNA片段

合成下列片段(斜体加粗序列为miRNA结合序列或结合突变序列，下划线序列为NotI酶切识别序列)：

1.GSN-miR-124-WT-Sense chain：

5'-AAACTAGCGGCCGCTAGT

T-3'

2.GSN-miR-124-WT-Antisense chain：

5'-CTAGA

-ACTAGCGGCCGCTAGTTT-3'

3.GSN-miR-124-Mut-Sense chain：

5'-AAACTAGCGGCCGCTAGT

T-3'

4.GSN-miR-124-Mut-Antisense chain：

5'-CTAGA

A-CTAGCGGCCGCTAGTTT-3'

突变原则为：突变靶序列的标准环(standloop 9-11位)和种子序列(seedregion2-8)同时避免G-U配对。

将上述合成产物稀释成10mM，按照下列体系反应：

表5反应体系

PCR仪反应程序：

(3)目的DNA片段和载体的连接、转化、酶切电泳检测和测序比对

将退火后的片段和载体25℃连接1h。连接体系如下：

表6连接反应体系

连接产物转化DH5a感受态细胞，涂布Ampicillin抗性的LB平板，37℃温箱培养过夜。挑取单个菌落，接种于LB(含Ampicillin)液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。抽提培养好的菌液中的载体DNA，NotI酶切鉴定，酶切正确的菌液送测序。

2、荧光素酶活性测定

(1)实验分组：

Gelsolin(GSN)

A.HEK 293细胞+miRNA mimic NC+GSN-124-WT/pmirGLO；

B.HEK 293细胞+miR-124mimic+GSN-124-WT/pmirGLO；

C.HEK 293细胞+miR-124mimic+GSN-124-Mut/pmirGLO。

表7 miRNA mimic和Mimic NC序列

(2)细胞转染

提前一天将细胞接种于12孔板，1×105个细胞/孔；转染前，吸掉培养基，加入800μL Opti-MEM培养基；将13μL转染试剂lipofectamine2000及2.5μg质粒或mimic、NC、inhibitor(50nM)加入到含200μL Opti-MEM的RNase free的管子中，漩涡振荡混匀，室温静止10-15min；将混和液加入到12孔板中，细胞培养箱中培养6h左右；6h后，吸走培养基，换上新鲜的含10％血清的培养基；37℃，5％CO2培养48h。

(3)Luciferase活性的测定

裂解细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀后，加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，加入适量的报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后，加入适量报告基因细胞裂解液。如果荧光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100μL。充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5min，取上清用于测定。

3、结果分析

图6是各组细胞中miR-124对Gelsolin的荧光素酶活性检测。从图中可以看出，与A组(HEK 293细胞+miRNA mimicNC+GSN-124-WT/pmirGLO)和C组(HEK 293细胞+miR-124mimic+GSN-124-Mut/pmirGLO)相比，B组(HEK 293细胞+miR-124mimic+GSN-124-WT/pmirGLO)细胞中的荧光素酶活性显著降低。

结果表明：miR-124调控Gelsolin的表达。

实施例4miR-124调控血小板中Gelsolin表达的验证

1、实验分组

A.MEG-01/TPA细胞+miRNA mimic NC

B.MEG-01/TPA细胞+miR-124mimic

C.MEG-01/TPA细胞+miRNA inhibitor NC

D.MEG-01/TPA细胞+miR-124inhibitor

MEG-01细胞用含RMPI-1640+10％FBS+4mmol/L L-glutamine的培养液在37℃，5％CO2条件下悬浮培养，每个孔的起始浓度为5×10⁵细胞。TPA终浓度10nM诱导MEG-01细胞分化3天。MEG-01细胞诱导分化三天后转染miRNA mimic或miRNA inhibitor及相应对照，48h后收集细胞。

表8 miRNA mimic和Inhibitor序列

2、qRT-PCR

提取细胞RNA，进行逆转录反应：对于miRNA的反转录，每条miRNA需要用到其特异性反转录引物；对于其他基因的反转录，则用到oligo(dT)引物。

配制以下反应体系进行实时荧光定量PCR反应。

表9 qRT-PCR引物序列

分别得到内参和目的基因的Ct；△Ct＝Ct(目的基因)—Ct(内参基因)；以miRNANC组的△Ct作为基础，△△Ct＝△Ct(各组△Ct)—△Ct(miRNA NC组的△Ct)；—△△Ct为各组△△Ct的相反数；将—△△Ct作为2的指数幂进行计算。

3、Western blot

提取细胞总蛋白；进行Western blot(具体步骤可参见实施例2)。

4、结果分析

图7是各组细胞中miR-124的mRNA的相对表达水平。从图中可知，与MEG-01/TPA细胞+miRNA mimic NC组相比，MEG-01/TPA细胞+miR-124mimic组细胞中miR-124的相对表达水平显著升高；与MEG-01/TPA细胞+miRNA inhibitor NC组相比，MEG-01/TPA细胞+miR-124inhibitor组细胞中miR-124的相对表达水平显著降低。

结果表明：miR-124mimic和miR-124inhibitor有效上调和下调miR-124的mRNA的相对表达水平。

图8是各组细胞中Gelsolin的mRNA的相对表达水平。从图中可知，与MEG-01/TPA细胞+miRNA mimic NC组相比，MEG-01/TPA细胞+miR-124mimic组细胞中Gelsolin的相对表达水平显著降低；与MEG-01/TPA细胞+miRNA inhibitor NC组相比，MEG-01/TPA细胞+miR-124inhibitor组细胞中Gelsolin的相对表达水平显著升高。

结果表明：miR-124mimic和miR-124inhibitor有效下调和上调Gelsolin的mRNA的相对表达水平。

图9是各组细胞Gelsolin蛋白的表达水平。从图中可知，与MEG-01/TPA细胞+miRNAmimic NC组相比，MEG-01/TPA细胞+miR-124mimic组细胞中Gelsolin的相对表达水平显著降低；与MEG-01/TPA细胞+miRNA inhibitor NC组相比，MEG-01/TPA细胞+miR-124inhibitor组细胞中Gelsolin的相对表达水平显著升高。

结果表明：miR-124mimic和miR-124inhibitor有效下调和上调Gelsolin蛋白的表达水平。

实施例5miR-124用于筛选抗血小板药物

1、实验分组

A.MEG-01/TPA细胞+空白对照

B.MEG-01/TPA细胞+川芎嗪

C.MEG-01/TPA细胞+三七总皂苷

D.MEG-01/TPA细胞+阿司匹林

E.MEG-01/TPA细胞+白芨

其中，已知川芎嗪、三七总皂苷、阿司匹林是常见的抗血小板药物，白芨可用于止血。

MEG-01细胞用含RMPI-1640+10％FBS+4mmol/L L-glutamine的培养液在37℃，5％CO2条件下悬浮培养，每个孔的起始浓度为5×10⁵细胞。TPA终浓度10nM诱导MEG-01细胞分化3d。MEG-01细胞诱导分化3d后加不同药物处理细胞。

2、CCK8检测各组细胞活性

各组药物分别作用24h和48h时，取出96孔板，弃去细胞上层培基，每孔加入100μL含0.5％FBS的新鲜培养基，再每孔加入10μL CCK8，37℃孵育4h。

将96孔板放入酶标仪，450nm进行读数。

3、各组细胞miR-124的表达检测

提取细胞RNA，进行逆转录反应：对于miRNA的反转录，每条miRNA需要用到其特异性反转录引物。配制反应体系进行实时荧光定量PCR反应。以U6作为内参基因，确定miR-124的相对表达水平。

4、结果分析

与对照组相比，加入不同浓度的盐酸川芎嗪注射剂、三七总皂苷和阿司匹林药物处理，随着药物处理浓度的增加，细胞活力显著降低，与药物处理24h相比，处理48h的细胞活力降低。结果表明，盐酸川芎嗪注射剂、三七总皂苷和阿司匹林三种药物都抑制细胞活力；随着药物浓度的增加，处理时间的增长，细胞活力降低。而白芨则呈现相反趋势，随着浓度增加，促进细胞活力。

qRT-PCR检测各组细胞中miR-124的mRNA的相对表达水平。结果表明，与对照组相比，分别用盐酸川芎嗪注射剂、三七总皂苷和阿司匹林处理细胞，细胞中miR-124的相对表达水平显著升高；而白芨处理细胞后，细胞中miR-124的表达水平显著降低。

因此通过检测待测药物对于MEG-01/TPA细胞中miR-124表达水平的影响可以筛选潜在的影响血小板细胞活力的物质，进而筛选用于抗血小板药物用于血栓性疾病的治疗。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (3)

1.miR-124在制备用于抗血小板治疗的药物的应用，其中所述药物用于冠心病血瘀证的治疗，其中所述治疗通过调控Gelsolin的表达水平实现。

2.一种筛选影响血小板细胞活力的物质或筛选抗血小板候选药物的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)培养MEG-01细胞，加TPA诱导分化3天；

(2)加不同药物处理细胞，分别处理24h后，取细胞进行后续qRT-PCR检测确定各组细胞中miR-124的相对表达水平；

(3)将显著提高miR-124相对表达水平的药物作为潜在药物进一步研究。

3.如权利要求2所述的方法，其中步骤(1)具体为：MEG-01细胞用含RMPI-1640+10％FBS+4mmol/L L-glutamine的培养液在37℃，5％CO2条件下悬浮培养，每个孔的起始浓度为5×105细胞，TPA终浓度10nM诱导MEG-01细胞分化3d。

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