CN111053906B - 一种调控GSK-3β表达的试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明中公开了调控miR‑215‑5p表达的试剂在制备调控GSK‑3β表达的试剂中的应用。本发明中验证了miR‑215‑5p与GSK‑3β的3’UTR区域存在相互作用，GSK‑3β为hsa‑miR‑215‑5p的直接靶基因，提供了一种通过hsa‑miR‑215‑5p调控GSK‑3β表达的方法。对发现癌症早期诊断灵敏的生物指标和更好的治疗方法有重要的临床意义。

Description

一种调控GSK-3β表达的试剂及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种调控GSK-3β表达的试剂及其应用。
背景技术
糖原合成酶激酶-3(Glycogen systhesis kinase-3，GSK-3)是一种存在于所有真核生物中的多功能丝氨酸/苏氨酸酶。在哺乳动物中有两种由不同基因编码的亚型：GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β在细胞分化、生长、增殖、凋亡、运动，细胞周期的连续性，胚胎发育，胰岛素反应等生理过程中都具有重要作用【1】。无论在生理还是病理情况下，GSK-3β的磷酸化一直被认为是GSK-3β活性调节的主要机制。GSK-3β酪氨酸216位点的磷酸化可以增加其活性，而其丝氨酸9位点的磷酸化则降低GSK-3β的活性，但酪氨酸216位点的磷酸化对GSK-3β活性的调节作用要远远小于丝氨酸9位点对GSK-3β活性的调节作用【2】。
研究发现多条细胞信号通路参与对GSK-3β活性的调节。Wnt信号通路的激活可以抑制GSK-3β的活性。在有Wnt信号刺激的情况下，Wnt蛋白与其受体FZD和LRP5/6结合活化Dsh蛋白，活化的Dsh蛋白解离GSK-3β/APC/Axin复合物，抑制GSK-3β磷酸化β-catenin的活性【3】。PI3K/Akt信号通路是调节GSK-3β丝氨酸9位点磷酸化的主要途径。活化的Akt是GSK-3β的上游因子，与GSK-3β结合后使GSK-3β丝氨酸9位点磷酸化而失活，发挥抗凋亡作用。此外，AKT/mTOR通路也参与对GSK-3β活性的调节【4】。
目前研究表明，GSK-3β具有抑癌和促癌的双重作用。GSK-3β在喉鳞状细胞癌组织中表达的阳性率显著高于癌旁组织和正常黏膜，促进喉鳞状细胞癌的发生【5】。而GSK-3β在肺癌组织中的阳性表达率显著低于癌旁正常肺组织，GSK-3β的低表达与肺癌的侵袭转移密切相关【6】。研究表明GSK-3β的活化可以促进结直肠癌细胞【7】、卵巢癌细胞【8】、甲状腺髓样癌细胞【9】的生存及增殖；相反的，GSK-3β的活化抑制乳腺癌细胞【10】、前列腺癌细胞【11】的生存和增殖。
鉴于GSK-3β基因在癌症的发生发展、侵袭转移中具有重要作用，确认GSK-3β基因的调控基因，对发现癌症早期诊断灵敏的生物指标和更好的治疗方法有重要的临床意义。
【1】杨静,官成浓.GSK-3β对肿瘤细胞的双重调节[J].中国医疗前沿,2013,8(6):14-15.
【2】Hartigan JA,Johnson GV.Transient increases in intracellularcalcium result in prolonged site-selective increases in Tau phosphorylationthrough a glycogen synthase kinase 3beta-dependent pathway[J].J BiolChem.1999,274(30):21395-401.
【3】范鸣玥.血管性痴呆小鼠海马组织病理学变化及Akt-GSK3β细胞信号通路表达变化[D].2012,河北医科大学.
【4】Rokutanda S,Fujita T,Kanatani N,et al.Akt regulates skeletaldevelopment through GSK3,mTOR,and FoxOs[J].Dev Biol.2009,328(1):78-93.
【5】邹良玉,李连贺,岳文慧,韩志鹏,张子惠.MIF、GSK-3β在喉鳞状细胞癌中表达的临床意义及相关性研究[J].山东大学耳鼻喉眼学报,2019,33(2):76-80.
【6】魏志强,齐战.GSK-3β和Snail在肺癌侵袭转移中的作用研究[J].河北医药,2019,41(14):2122-2125.
【7】Shakoori A,Mai W,Miyashita K,et al.Inhibition of GSK-3betaactivity attenuates proliferation of human colon cancer cells in rodents[J].Cancer Sci.2007,98(9):1388-1393.
【8】Cao Q,Lu X,Feng YJ.Glycogen synthase kinase-3beta positivelyregulates the proliferation of human ovarian cancer cells[J].Cell Res.2006,16(7):671-677.
【9】Kunnimalaiyaan M,Vaccaro AM,Ndiaye MA,et al.Inactivation ofglycogen synthase kinase-3beta,a downstream target of the raf-1pathway,isassociated with growth suppression in medullary thyroid cancer cells[J].MolCancer Ther.2007,6(3):1151-1158.
【10】Farago M,Dominguez I,Landesman-Bollag E,et al.Kinase-inactiveglycogen synthase kinase 3beta promotes Wnt signaling and mammarytumorigenesis[J].Cancer Res.2005,65(13):5792-5801.
【11】Li Y,Wang Z,Kong D,et al.Regulation of FOXO3a/beta-catenin/GSK-3beta signaling by 3,3′-diindolylmethane contributes to inhibition of cellproliferation and induction of apoptosis in prostate cancer cells[J].J BiolChem.2007,282(29):21542-50.
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控GSK-3β表达的试剂及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
调控miR-215-5p表达的试剂在制备调控GSK-3β表达的试剂中的应用。
进一步地，所述调控miR-215-5p表达的试剂为用于过表达miR-215-5p的试剂，所述调控GSK-3β表达的试剂为抑制GSK-3β表达的试剂。
进一步地，所述抑制GSK-3β表达的试剂可用于治疗癌症，所述癌症为结直肠癌、卵巢癌、甲状腺髓样癌、喉鳞状细胞癌。
进一步地，所述过表达miR-215-5p的试剂为携带有核酸的载体，所述载体可实现miR-215-5p过表达。
进一步地，所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。
进一步地，所述调控miR-215-5p表达的试剂为抑制miR-215-5p表达的试剂，所述调控GSK-3β表达的试剂为增强GSK-3β表达的试剂。
进一步地，所述增强GSK-3β表达的试剂可用于治疗癌症，所述癌症为乳腺癌、前列腺癌、肺癌。
进一步地，抑制miR-215-5p表达通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一实现。
过表达miR-215-5p的试剂在制备治疗癌症的药物组合物中的应用，所述癌症为结直肠癌、卵巢癌、甲状腺髓样癌、喉鳞状细胞癌。
抑制miR-215-5p表达的试剂在制备治疗癌症的药物组合物中的应用，所述癌症为乳腺癌、前列腺癌、肺癌。
一种治疗癌症的药物组合物，其中含有抑制GSK-3β表达的试剂和现有抗癌药物，所述抑制GSK-3β表达的试剂为过表达miR-215-5p的试剂，所述药物组合物用于治疗癌症，所述癌症为结直肠癌、卵巢癌、甲状腺髓样癌、喉鳞状细胞癌。
一种治疗癌症的药物组合物，其中含有增强GSK-3β表达的试剂和现有抗癌药物，所述增强GSK-3β表达的试剂为抑制miR-215-5p表达的试剂，所述药物组合物用于治疗癌症，所述癌症为乳腺癌、前列腺癌、肺癌。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种GSK-3β的调控基因miR-215-5p，并验证了miR-215-5p与GSK-3β的3’UTR区域存在相互作用，提供了一种通过hsa-miR-215-5p调控GSK-3β表达的方法。为发现癌症早期诊断灵敏的生物指标和更好的治疗方法有重要的临床意义。
附图说明
图1为miR-215-5p与GSK-3β的3’UTR区域具有三个结合位点图；
图2为GSK-3β3’UTR-野生型质粒空载体图谱(插入目的基因前)；
图3为GSK-3β3’UTR-野生型质粒构建后载体图谱；
图4为GSK-3β3’UTR-突变型质粒空载体图谱(插入目的基因前)；
图5为GSK-3β3’UTR-突变型质粒构建后载体图谱；
图6为Luciferase检测结果图。
具体实施方式
发明人发现miR-215-5p的靶基因为GSK-3β，miR-215-5p与GSK-3β的3’UTR区域具有三个结合位点(如图1所示)，并通过Luciferase报告基因系统验证miR-215-5p与GSK-3β的3’UTR区域存在相互作用。
Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变(监测荧光素酶的活性变化)可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点基因突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
发明人先构建了同时突变三个位点的Human GSK-3β的3’UTR突变型质粒及HumanGSK-3β的3’UTR野生型质粒，培养生长状态良好的293T细胞，质粒转染前一天将细胞分入24-well培养板培养，转染当天按实验设计的组别进行质粒转染实验。转染24小时后荧光显微镜下观察细胞内荧光标记基因(如GFP)的表达情况，然后使用“
Figure BDA0002301156790000041
Reporter Assay System(E1910，promega)”试剂盒处理细胞、进行Luciferase表达检测。
结果显示，hsa-miR-215-5p作用后，GSK-3β-3’UTR活性下降，而将GSK-3β-3’UTR进行突变后，在hsa-miR-215-5p作用下，GSK-3β-3’UTR活性较野生型增高，说明hsa-miR-215-5p能够作用于GSK-3β基因的3’UTR区域，引起GSK-3β-3’UTR活性下降，突变位点对与miRNA的结合很重要，可能是其相互作用的位点。
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
实施例1
构建Human GSK-3β的3’UTR野生型及突变型质粒
1.1实验方法
酶切载体使其线性化，设计引物从模板中调取目的片段，胶回收片段和载体后连接重组并转化DH5α感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆，摇菌抽提质粒后测序，最终构建含有目的片段的载体质粒。
1.2克隆制备
1.2.1目的片段扩增
取无菌0.2ml PCR管，配制反应液：
Figure BDA0002301156790000051
按照下列条件设置PCR反应程序：
Figure BDA0002301156790000052
1.2.2DNA电泳回收PCR产物
1)配制1％的DNA琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖干粉，倒入三角瓶中，再加100ml的1×TAE溶液，微波炉加热至完全溶化，稍冷后倒入配胶槽中，加入EB后搅匀插入梳子，等待完全冷却凝固。
2)50μL PCR oligo全部上样，以DNA maker为对照，110V电泳30min。
3)置于凝胶成像仪中拍照。
4)取无菌1.5ml EP管，对目的基因条带进行切胶回收，参考Tiangen的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的用户手册操作。
5)用40μL ddH2O洗脱。
1.2.3酶切
1)根据限制性内切酶选择合适的反应液，配制酶切体系，对载体进行酶切。
Figure BDA0002301156790000061
2)37度水浴孵育2小时以上。
3)回收酶切片段和载体：参考Tiangen的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和普通DNA产物纯化试剂盒的用户手册操作。
1.2.4连接
按照下列配比配制重组反应体系：
Figure BDA0002301156790000062
37℃连接半小时后，准备转化。
1.2.5转化
1)取一支感受态，冰上融化半个小时，每管加10μL连接液，轻轻旋转以混匀，在冰中放置30分钟。
2)水浴锅预热到42℃，热激90秒。
3)快速将管转移到冰浴中，冷却5分钟。
4)每管加600μL无抗性LB培养基，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45分钟复苏。
5)6000g离心2min，用100μL LB重悬已转化的感受态细胞，然后转移到含抗性的LB琼脂培养基上。
6)用涂布涂匀直至液体被吸收。
7)倒置平皿，于37℃培养，16小时。
8)阳性克隆PCR鉴定。
1.2.6阳性克隆的鉴定
按照下列比例配制鉴定体系。
Figure BDA0002301156790000071
先按照所需鉴定克隆数，按上述体系配出总体系，然后分装到每个PCR反应管中，蘸取少量菌体混匀在反应管中，上机反应。
设置PCR反应程序
Figure BDA0002301156790000072
反应结束后跑胶拍照，分析条带鉴定结果，选择阳性克隆接菌抽提测序。
1.2.7GSK-3β3’UTR-野生型质粒构建说明
Figure BDA0002301156790000073
GSK-3β3’UTR-野生型质粒空载体图谱(插入目的基因前)如图2所示；
GSK-3β3’UTR-野生型质粒构建后载体图谱如图3所示。
1.2.8GSK-3β3’UTR-突变型质粒构建说明
Figure BDA0002301156790000074
Figure BDA0002301156790000081
GSK-3β3’UTR-突变型质粒空载体图谱(插入目的基因前)如图4所示；
GSK-3β3’UTR-突变型质粒构建后载体图谱如图5所示。
实施例2
293T细胞质粒转染和Luciferase检测
2.1 293T细胞培养
2.1.1细胞复苏
1)从液氮罐中取出293T细胞冻存管；
2)迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；
3)完全解冻后，1000rpm，离心2min；
4)75％酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台；
5)吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3ml完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO2培养箱培养；
6)次日更换一次培养液后再继续培养。
2.1.2细胞传代
1)将生长至90％汇合的细胞进行传代；
2)弃去旧培养液，加入2ml灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液；
3)加入1ml胰酶消化液，37℃消化约1-2min，直到细胞完全消化下来；
4)加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来；
5)混匀细胞后分至两个新的6-cm dish中，补足完全培养基至4ml，继续培养。
2.2目的细胞质粒转染
1)将处于对数生长期的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液；
2)将细胞悬液(细胞数约为2×104，具体根据细胞形态大小而定)接种于24-well培养板中，37℃、5％CO2培养箱培养至细胞融合度达到约60％；
3)使用ROCHE：X-tremegene HP转染试剂进行转染操作：
a)每孔每转染1μg质粒、需要2μl X-tremegene HP，按照此比例，将X-tremegeneHP转染试剂和所需质粒共同溶解于100μl opti-MEM中，混匀，室温静置20min；
b)将孔板中培液换成200μl的opti-MEM培养基；
c)把质粒与X-tremegene HP的混合液加入细胞中，37℃5％CO2培养箱中培养5-6小时后，换成新鲜的含10％血清的完全培养基；
d)转染24-48小时后观察质粒上荧光标记基因的表达情况以判断转染效率。
10.3luciferase检测
1)初次使用
Figure BDA0002301156790000091
Reporter Assay System时，需要将LuciferaseAssay Buffer II提前放于室温下溶解、平衡；将Luciferase Assay Buffer II完全加入到Luciferase Assay Substrate瓶中，完全溶解底物，形成Luciferase Assay Reagent，分装保存于-80℃，一年内有效。
2)裂解细胞前，将Passive Lysis Buffer 5X使用D-Hanks稀释配制成PassiveLysis Buffer 1X；吸去24孔板中培养基，加入300μl的Passive Lysis Buffer 1X，放至4℃冰箱反应20min左右以待细胞充分裂解，吹打混匀，放至-80℃超低温冰箱过夜使其裂解更加彻底。
3)上机检测前，提前将Stop&
Figure BDA0002301156790000092
Buffer放于室温下溶解、平衡，将Stop&
Figure BDA0002301156790000093
Substrate 50X加入到Stop&
Figure BDA0002301156790000094
Buffer中，使其充分溶解，形成稀释成Stop&
Figure BDA0002301156790000095
Substrate 1X Reagent。Stop&
Figure BDA0002301156790000096
Substrate 1X Reagent需要现配现用，配好的Stop&
Figure BDA0002301156790000097
Substrate 1X Reagent在常温下48小时内有效。
4)常温下溶解步骤2)中的细胞裂解液，吸取20μl于Lockwell maxisorp检测板中，加入40μl Luciferase Assay Reagent，震荡混匀后立即使用酶标仪检测fireflyluminescence(萤火虫荧光酶荧光值)，注意该步骤时间不宜超过20分钟。
5)检测firefly luminescence后，再在每孔中加入40μl Stop&
Figure BDA0002301156790000098
Reagent，震荡混匀后立即使用酶标仪检测Renilla luminescence(海肾荧光酶荧光值)。
6)数据收集和分析。
Luciferase检测分组如下：
Figure BDA0002301156790000099
microRNA：hsa-miR-215-5p
实验内容：靶基因和基因3UTR结合活性实验：(hsa-miR-215-5p+h.GSK3B-3UTRLuciferase质粒)
Figure BDA0002301156790000101
Luciferase表达检测结果如图6所示，由图6可知，hsa-miR-215-5p作用后，GSK-3β-3’UTR活性下降10％(P<0.01)，说明hsa-miR-215-5p能够作用GSK-3β-3’UTR区域，引起GSK-3β-3’UTR活性下降；将GSK-3β-3’UTR进行突变后，在hsa-miR-215-5p作用下，3’UTR活性较野生型增高(P<0.01)，说明突变位点对于microRNA的结合很重要，是其相互作用的位点，表明GSK-3β为hsa-miR-215-5p的直接靶基因。

Claims (3)

1.调控miR-215-5p表达的试剂在体外非治疗目的的调控GSK-3β表达中的应用，所述调控miR-215-5p表达的试剂为用于表达和/或过表达miR-215-5p的试剂，所述调控GSK-3β表达为抑制GSK-3β表达。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述过表达miR-215-5p的试剂为携带有核酸的载体，所述载体可实现miR-215-5p过表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。
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