CN108619516A

CN108619516A - Her2-565核酸片段及her2-20kd肽段的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用

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Publication number: CN108619516A
Application number: CN201710159797.3A
Authority: CN
Inventors: 张弩
Original assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: Guangzhou Jisai Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2037-03-17
Also published as: CN108619516B; WO2018166492A1

Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及一种HER2‑565核酸片段及HER2‑20KD肽段的抑制剂在制备治疗癌症药物的应用。在阴性表达或极低表达HER2的乳腺癌肿瘤中，存在一种环状模式被首次发现，该新的环状模式是指在被传统方法认为是“HER2阴性”的乳腺癌细胞中，尽管HER2的胞外片段缺失，但其胞内片段却是至少部分客观存在的，并且，该胞内片段对肿瘤细胞活性、增殖及凋亡具有重要的影响。该胞内重要片段的转录产物形成环状，称Cir‑HER2‑565，表达产物称HER2‑20KD，可以作为癌症治疗的新靶点，通过抑制Cir‑HER2‑565核苷酸或HER2‑20KD氨基酸序列，可以治疗HER2阴性表达的癌症。

Description

HER2-565核酸片段及HER2-20KD肽段的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种HER2-565核酸片段及其相应的肽段HER2-20KD的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

人表皮生长因子受体2(HER2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。HER2靶向治疗可以极大的改善HER2阳性乳腺癌患者的预后。HER2的表达情况作为预后和预测生物标志物，15％～30％乳腺癌和10％～30％胃/食管癌会发生HER2基因扩增或过表达，HER2的过度表达也可见于其他肿瘤如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈部；根据美国临床肿瘤学会(ASCO)、美国病理学家协会(CAP)推出的HER2检测指南，目前有两种方法被批准用于HER2检测：免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)，IHC分析乳腺肿瘤组织的HER2表达所有侵袭性乳腺癌患者的HER2状态均应在1个或更多的检测结果的基础上确定。对于HER2蛋白质表达水平，应通过经过验证的IHC方案进行初始检测，HER2表达的评分方法是基于细胞膜染色模式，根据染色的强度分为her2阳性3级别、2级别和0或1+阴性级别。IHC鉴别为疑似阳性的乳腺癌样本应接受FISH的进一步验证，验证其在核酸水平是否为发生阳性扩增。对于HER2基因表达阳性的肿瘤患者陆续有一些靶点药物被开发出来，FDA在1998年，批准“曲妥珠”可以用于有HER2过量表达的乳腺癌的治疗。曲妥珠，它的英文名叫“Trastuzumab”中文商品名叫“赫赛汀”，曲妥珠是一种抗体的药物，它针对性地结合到HER2蛋白在细胞膜外的第4个功能域；2010年，FDA批准曲妥珠可以联合化疗药物(顺铂、氟尿嘧啶)，用于治疗有HER2过量表达的胃癌、和胃食管交界癌；2013年11月，FDA批准帕妥珠可以联合曲妥珠、紫杉萜等，用于有HER2阳性的乳腺癌的治疗。帕妥珠的英文名是“Pertuzumab”；帕妥珠是一个完全人源化的单克隆抗体，它可以结合到HER2蛋白在细胞膜外的第二个功能域。这个功能域的功能，是让HER2能够与EGFR基因家族的各种蛋白单体形成二聚体。

三阴性乳腺癌是指乳腺癌癌组织免疫组织化学检查及FISH(RNA荧光原位杂交)结果为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的1/5-1/4.三阴性乳腺癌具有特殊的生物学行为和临床病理特征，恶性程度较高，缺乏有效的治疗靶标，相比其它类型的乳腺癌临床治疗比较难，术后预后较差，易转移到其他组织。但是业界对HER2的检测采用的方法是免疫组化和荧光原位杂交，如果没有检测到上述的任一序列，则认为其为HER2阴性表达。目前临床如果检测到患者为HER2阴性的乳腺癌患者，尤其是对于三阴性乳腺癌患者，在治疗策略上几乎是束手无策。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HER2-565核酸片段抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的还在于提供一种HER2-20KD肽段的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的还在于提供Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD肽段在癌症筛查/诊断或预测中的应用。

本发明的目的还在于提供Cir-HER2-565特异的siRNA和ASO。

本发明的目的还在于提供一种乳腺癌治疗的系统。

本发明的目的还在于提供针对乳腺癌治疗药物研发方法。

本发明的目的通过以下技术手段实现：

本发明提供了一种HER2-565核酸片段或HER2-20KD肽段的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤为HER2表达相关的肿瘤类型；

优选地，所述的HER2表达相关的肿瘤为HER2的全长片段表达或部分片段表达的乳腺癌，或HER2变异体的全长片段表达或HER2部分片段表达的乳腺癌；

尤其优选地，所述的肿瘤为三阴性乳腺癌。

其中，HER2-565核酸片段是指HER2基因第20到23号外显子的DNA序列或其转录产生的RNA序列；

优选地，所述的HER2-565核酸片段为HER2基因第20到23号外显子的DNA序列，通常由1128bp组成，定位于人类的第17号染色体长臂(chr17:39724726-39725853)区域。进一步地，所述的HER2-565核酸片段的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

或者优选地，所述的HER2-565核酸片段为HER2基因的第20到23号外显子转录后首尾环化形成的转录产物RNA，其为HER2基因的转录的一种环状的RNA分子序列，命名为Cir-HER2-565；通常由565个核苷酸组成；进一步地，所述的转录产物RNA序列如SEQ ID NO：2所示；。

所述的HER2-20KD肽段的序列如SEQ ID NO：3所示；Cir-HER2-565环状RNA分子通过首尾相连接后，形成一个完整的开放阅读框，编码184个氨基酸，蛋白分子量约20KD，命名HER2-20KD；此小分子蛋白为HER2全长蛋白的C末端的一小段序列，具体位置为HER2蛋白的744到927位置的184个氨基酸序列。

本发明首次发现了HER2基因的一种新的转录产物为环状RNA序列，在本发明中称为Cir-HER2-565(指环状的RNA序列，Circula RNA，CircRNA)。通过研究发现Cir-HER2-565是HER2基因的1种环状模式新的变异体，新的变异体是由HER2基因前体转录本RNA通过反向剪接形成环状模式的RNA的分子。本发明通过进一步研究，新识别的环状RNA分子，可以分别通过反向剪接形成环形的分子。环化模式的变异体是由HER2基因的第20、21、22、23外显子通过首尾环化形成，由565个核苷酸组成我们命名Cir-HER2-565(见图1)。HER2形成环形RNA分子后，形成一个完整的开放阅读框，编码184个氨基酸，蛋白分子量约20KD，下称HER2-20KD肽段或HER2-20KD(见图1)。

如背景技术所称的，目前对于HER2的检测为蛋白质和RNA的检测，如果上述结果均显示为阴性，则该患者被认为属“HER2阴性”。

然而，我们在做乳腺癌研究的时候，我们发现了隐藏于“HER2阴性”乳腺癌细胞中的HER2变异。在阴性表达或极低表达HER2的乳腺癌肿瘤中的一种环状模式被首次发现，该新的环状模式是指在被传统方法认为是“HER2阴性”的乳腺癌细胞中，尽管HER2的胞外片段缺失，但其胞内片段却是至少部分客观存在的，并且，该胞内片段的HER2第20-23号外显子是特别关键的影响肿瘤细胞的结构域，影响其活性、增殖及凋亡等，并且，该片段的转录本RNA通过反向剪接形成环状模式的RNA的分子。

发明人通过进一步研究，发现新识别的环状RNA分子，可以分别通过反向剪接形成环形的分子，然后翻译成分子量为20KD的小分子蛋白，本发明命名为HER2--20KD。HER2-20KD细胞生物学功能研究发现，新型的HER2蛋白(HER2-20KD)能够显著的促进乳腺癌细胞的恶性程度，抑制其表达可以显著抑制乳腺癌细胞的增殖和促进肿瘤的凋亡。

在本发明的一个实施例中，动物实验验证显示，抑制HER2-20KD的表达能明显降低乳腺癌细胞的成瘤能力。

在本发明的一个实施例中，对来自临床上被传统常规方法判定为乳腺癌HER2阴性表达的100个病人样品进行PCR检测发现，相对于癌旁正常组织，在肿瘤组织中HER2mRNA的表达较低，且没表达差异性，但是环形的HER2分子(Cir-HER2-565)有较高丰度的表达，且在肿瘤组织中表达较高。

在一个实施例中，本发明提供了一种新的治疗策略，该策略是以我们独立发现的环形的HER2分子基础；具体指HER2存在形式的环形RNA的核酸序列及氨基酸序列为靶标的治疗方法。该治疗策略对HER2阳性或传统意义上的“HER2阴性”都是有治疗可行性的，但是更重要的是，其对传统意义上的“HER2阴性”的治疗是意义重大的、是对该类癌症的首个治疗方案，这将能拯救原本束手无策的“HER2阴性”病患。新的治疗策略可以为三阴性乳腺癌的临床治疗提供一种崭新的思路，为三阴性乳腺癌的靶向性治疗提供新的策略。

上述的碱基序列或氨基酸序列并不是本发明的限制。在一些HER2变异体中，也可以根据变异体的第20、21、22、23外显子的序列尤其是关键序列(将在以下进行详述)进行抑制剂的设计。

靶向于胞内片段相较于靶向于胞外片段的难度要更高一些。值得庆幸的是，发明人发现上述胞内片段的转录本会形成环状分子，而最为关键的是，阻断其接口位置相接形成环状分子，可以非常有效地达到抑制HER2--20KD表达的作用。这样的手段已经被本发明实验证明了其可行性及可靠性。通过例如siRNA、miRNA、ASO等，可以顺利进入胞内抑制Cir-HER2-565的形成。这成为一个尤其优选的方案。

所述的HER2-565核酸片段抑制剂为抑制HER2-565核酸片段整体的或局部的转录、表达的物质；优选地，所述的物质为小RNA、化合物、核酸适配体、基因编辑工具中的一种或几种。

所述的HER2-20KD肽段抑制剂为抑制HER2-20KD蛋白肽整体的或局部的生成或者活性的物质、小RNA、核酸适配体或者基因编辑工具中的一种或几种；优选地，所述抑制HER2-20KD肽段整体或的或局部的生成或者活性的物质为抗体融合蛋白、多肽、化合物中的一种或几种。

优选地，所述的小RNA为siRNA、ASO、miRNA、shRNA中的一种；更优选地，为siRNA和ASO；更优选siRNA。

siRNA：siRNA是双链RNA(dsRNA)，利用具有同源性的siRNA诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。其原理是siRNA并入RISC(RNA诱导的沉默复合体)中，然后与靶标基因CDS区(多数)或UTR区完全配对，降解靶标基因mRNA，完全抑制基因在细胞内的翻译和表达。

miRNA：是一种21－25nt长的单链小分子RNA，利用miRNA治疗疾病的原理为：miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。与siRNA的不同在于，miRNA与靶mRNA一般不是完全互补配对，并且多结合于3’UTR区。

核酸适配体：作用位点为有机小分子、RNA、DNA或蛋白质。具有类似抗体的性质，可以和不同的靶标，如有机小分子、RNA、DNA或蛋白质等进行高亲和力和高特异性结合，组织其发挥功能。

所述的基因编辑如ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)和CRISPR/Cas9(成簇规律间隔短回文重复技术)中的一种。

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是三大基因编辑技术，基因编辑技术是利用非同源末端链接途径(NHEJ)修复和同源重组(HR)修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。因此，这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域，其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA，而TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA结合域识别靶点DNA序列后，核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切，靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。

通过对Cir-HER2-565进行基因编辑，达到基因治疗肿瘤的目的；尤其是乳腺癌；更尤其是三阴性乳腺癌。

siRNA、ASO和miRNA均属于小RNA(小核酸)。作为优选的实施方式，还可以对小RNA进行修饰，以提高小RNA抗核酸酶的活性。在本发明的一实施例中，对siRNA的2氧甲基和硫代磷酸的化学修饰，增强抗核酸酶活性的能力，提高小核酸的稳定性。

优选地，所述的HER2-565核酸片段抑制剂为阻断Cir-HER2-565生成或降解Cir-HER2-565的物质。

所述的抑制剂系针对于所述Cir-HER2-565的全部或部分序列而设计，可选地为与Cir-HER2-565的全部或部分序列互补；

更优选地，所述的抑制剂系针对于Cir-HER2-565环状接口而设计；优选地，针对Cir-HER2-565第545位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计，所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与HER2-565第556位至9位的序列互补。

优选地，所述的抑制剂系针对于Cir-HER2-565的以下关键片段中的一个而设计，或者可选地与Cir-HER2-565的以下序列互补：

a)包含Cir-HER2-565第550位至第15位的序列；

b)包含Cir-HER2-565第554位至第9位的序列；

c)包含Cir-HER2-565第556位至第10位的序列；

d)包含Cir-HER2-565第556位至第13位的序列；

尤其优选地，所述的抑制剂系针对于Cir-HER2-565的以下片段中的一个而设计，或者可选地与Cir-HER2-565的以下序列互补：

SEQ ID NO：20

UGAUCAUGGUCAAAUGAAGCAUACGUGAUG；

优选地，所述的抑制剂为siRNA，该siRNA含有长度为21个核苷酸的第一链，及长度为21个核苷酸的第二链；其中第一链或第二链含有与上述片段互补的序列；其中第一链和第二链至少19个核苷酸是相互互补的。

本发明还提供了一种Cir-HER2-565特异性的siRNA，所述的siRNA，含有长度为21个核苷酸的第一链，及长度为21个核苷酸的第二链；其中第一链或第二链含有Cir-HER2-565片段互补的序列；其中第一链和第二链至少19个核苷酸是相互互补的；所述的Cir-HER2-565如SEQ ID NO：2所示。

所述的siRNA其特征在于，所述的siRNA与Cir-HER2-565第554位至第9位的片段互补；或者Cir-HER2-565第556位至第10位的片段互补，又或者Cir-HER2-565第556位至第13位的片段互补；优选Cir-HER2-565第556位至第13位的片段互补。

进一步地，所述的siRNA，其含有SEQIDNO：4、6或8所示的第一链，以及长度为15-30个核酸的第二链，所述的第一链或者第二链与Cir-HER2-565互补；所述的第一链和第二链至少有19个核酸互补配对形成siRNA duplex；

所述的siRNA诱导表达HER2-20KD的细胞基因沉默；

作为优选地实施方式，所述的siRNA的第一链和/或第二链包含至少一个化学修饰；更优选地，所述的修饰为2氧甲基、硫代磷酸；

优选地，所述的siRNA的第一链如SEQIDNO：4、6或8所示，其对应的第二链依次如SEQIDNO：5、7或9所示。

本发明还提供了一种载体，其含有表达上述的siRNA的第一链或第二链的表达框。

本发明还提供了一种哺乳动物细胞，所述的细胞含有编码上述任一siRNA的表达框；优选地，所述的细胞含有编码SEQIDNO：4、6或8所示第一链的表达框，以及编码长度为15-30个核酸的第二链，所述的第一链或者第二链与Cir-HER2-565互补；所述的第一链和第二链至少有19个核酸互补配对形成siRNA duplex；

所述的siRNA诱导表达HER2-20KD的细胞基因沉默；

所述的siRNA的第一链和/或第二链包含至少一个化学修饰；

所述的修饰为2氧甲基、硫代磷酸

所述的siRNA的第一链如SEQIDNO：4、6、或8所示，其对应的第二链依次如SEQIDNO：5、7.或9所示。

在本发明优选的实施例中，所述的siRNA的第一链如SEQIDNO：4或SEQIDNO：6所述，其对应的第二链依次如SEQIDNO：5或SEQIDNO：7所示。

本发明还提供一种Cir-HER2-565特异性的ASO；所述的ASO为长度为23-26的单链DNA，所述的ASO与Cir-HER2-565RNA片段互补；

进一步地，所述的ASO与Cir-HER2-565第556位至第15位的片段互补；或者Cir-HER2-565第556位至第14位的片段互补；或者Cir-HER2-565第551位至第12位的片段；优选Cir-HER2-565第551位至第13位的片段；

作为优选的实施方式，所述的ASO包含至少一个化学修饰；所述的化学修饰为硫代修饰；

作为示范性的实施方式，所述的ASO如SEQ ID NO：12、13、或14所示；在本发明优选的实施例中，所述的ASO选自SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。

本发明还提供了Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD氨基酸序列在癌症筛选/诊断/预测/预后中的应用。

利用现有技术的RNA和/或蛋白检测方法，如常规荧光定量PCR和免疫组化方法可以对Cir-HER2-565核苷酸及HER2-20KD蛋白做检测，从而对HER2相关的癌症进行筛选/诊断/预测/预后。

所述的肿瘤为HER2表达相关的肿瘤类型；优选地，所述的癌症为乳腺癌；更优选地；所述的乳腺癌为三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌为乳腺癌癌组织免疫组织化学检查及FISH(RNA荧光原位杂交)结果为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。

本发明还提供了一种三阴性乳腺癌治疗系统：其特征在于，所述的系统含有检测系统和用药系统。

所述的三阴性乳腺癌检测系统含有：

1)Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD检测构件；

所述的Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD氨基酸序列检测构件为荧光定量PCR和/或免疫组化；

所述的用药系统含有Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD氨基酸序列抑制剂；

优选地，所述的Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD氨基酸序列抑制剂为抑制HER2-20KD肽段整体的或局部的生成或者活性的物质、小RNA、核酸适配体或者基因编辑工具中的一种或几种；

优选地，所述抑制HER2-20KD生成或者活性的物质为抗体融合蛋白、多肽、化合物中的一种或几种；

优选地，所述的小RNA为siRNA、ASO、中的一种；更优选地，为siRNA；。

作为优选的实施方式，所述的检测系统还包括：

2)Her2/neu表达检测构件；

3)雌激素受体(ER)表达检测构件；

4)孕激素受体(PR)表达检测构件。

所述的表达检测构件为免疫组化和荧光原位杂交检测构件中的一种或其组合；

本发明还提供了一种治疗三阴性乳腺癌的药物研发方法，其特征在于，针对Cir-HER2-565核苷酸序列，通过基因干扰或者基因编辑，设计相应的抑制剂或基因治疗工具，如ASO、siRNA等；

基因治疗的靶点为SEQ ID NO：2的任意一段序列；

或者，所述的治疗三阴性乳腺癌的药物研发方法为：针对HER2-20KD，设计相应的HER2-20KD的活性抑制剂。

优选地，所述的HER2-20KD肽段抑制剂为抑制HER2-20KD肽段整体的或局部的生成或者活性的物质、小RNA、核酸适配体或者基因编辑工具中的一种或几种；更优选地，所述抑制HER2-20KD肽段整体的或局部的生成或者活性的物质为抗体融合蛋白、多肽、化合物中的一种或几种；

优选地，所述的小RNA为siRNA、ASO中的一种；更优选地，为siRNA。

本发明取得的有益效果：

1)本发明首次发现了隐藏于HER2阴性乳腺癌细胞中的HER2变异体。该变异体是由Her2基因前体转录本RNA通过反向剪接形成环状模式的RNA的分子：Cir-HER2-565。Cir-HER2-565翻译成分子量为20KD的小分子蛋白：HER2-20KD。Cir-HER2-565和HER2-20KD可以作为三阴性乳腺癌的新的治疗靶点，也可以作为三阴性乳腺癌的诊断/筛查/预测/预后的标志物。

2)本发明实验证实，通过抑制Cir-HER2-565或HER2-20KD，细胞功能学实验及动物实验验证均证实可以显著抑制肿瘤的形成。

3)本发明还提供了抑制Cir-HER2-565的siRNA和ASO，能够可以显著抑制肿瘤的形成。

附图说明

图1 HER2环状RNA形成及测序鉴定；

a HER2基因定位于人类的17号染色体长臂q12区域；在三阴性乳腺癌细胞系BT-483识别发现了环化模式的HER2变异体，此环化模式的变异体是由HER2基因的第20、21、22、23外显子通过首尾环化形成，由565个核苷酸组成我们命名Cir-HER2-565；

b通过sanger法对形成的环状RNA进行测序鉴定。

图2 Cir-HER2-565环状RNA分子结构模式图(HER2形成环形RNA分子后，形成一个完整的开放阅读框，编码184个氨基酸，蛋白分子量约20KD，命名HER2-20KD)。

图3 Cir-HER2-565环状RNA分子成熟的核苷酸序列(加粗的核酸序列为编码蛋白质的序列，划下画线的ATG为起始密码子，TGA为终止翻译的密码子，全长565个核苷酸)。

图4 Cir-HER2-565环状RNA分子编码184个氨基酸序列(Cir-HER2-565环状RNA分子通过收尾连接，形成环状的RNA分子后，编码184个氨基酸序列，针对合成内部的一段氨基酸序列(下划线)，作为抗原，免疫新西兰大白兔制备特异性检测HER2-20KD蛋白的抗体)。

图5 RT-QPCR检测HER2mRNA和Cir-HER2-565在临床组织中的表达情况。

图6 siRNA及ASO沉默Cir-HER2-565环状RNA分子的表达(针对Cir-HER2-565的核酸序列分别设计3条siRNA干扰序列和3条翻译核苷酸序列ASO，转染BT-483乳腺癌细胞，48小时后分别用western blot和RT-QPCR检测siRNA和ASO的作用效果。

图7 MTT检测乳腺癌细胞增殖情况。

图8转染siRNA或ASO后乳腺癌细胞裸鼠成瘤。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

本发明中一些术语的涵义：

三阴性乳腺癌(TNBC)：是指经检测，雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(HER2)均阴性的一种特殊类型乳腺癌。(三阴性乳腺癌是通过免疫组化和荧光原位杂交检测三者都是阴性的而定义出来的一个乳腺癌的类型，由于之前缺乏对特殊的RNA分子的认识，没有识别出HER2基因还存在一种环状的RNA分子，Cir-HER2-565)

核酸片段抑制：是指任何能针对核酸片段的整体或者部分起到阻断或降低转录、表达；或者降低、降解核酸片段或阻止核酸片段形成的作用。

肽段抑制：是指任何能够这对该肽段的整体或者部分起到阻断或降低其表达；或者降低、降解该肽段或阻止该肽段形成的作用。

环状RNA：自2012年，在生物体内陆续发现了大量存在的环形的RNA(Circula RNA，CircRNA)，生物体内的环状RNA是一类具有特殊功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头尾相接形成。以前的研究由于技术水平的限制，没有发现这部分环形RNA的客观存在，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环化的RNA分子，环化RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环化RNA的具体功能尚未有明确，目前只有几种假定的说法1)环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能2)CircRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平3)CircRNA能与蛋白质结合，抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性4)CircRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。

本发明所称的HER2-565核酸片段是指HER2基因第20到23号外显子的DNA序列或其转录产生的RNA序列；HER2-20KD肽段指HER2-565核酸片段表达蛋白产物；

作为优选的方案，本发明的HER2-565核酸片段为RNA，更具体地讲是指HER2基因的第20、21、22、23外显子转录后首尾环化形成的转录产物RNA，称本发明所称的Cir-HER2-565。

实施例1 HER2环状RNA形成及DNA测序鉴定

通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在线数据库软件分析发现HER2基因定位于人的第17号染色体长臂chr17(q12)区域，基因组跨越28685bp，编码最长蛋白1255个氨基酸的变异体共有27个外显子组成；根据环状RNA权威数据库CircBase(http://circrna.org/)收录的HER2环状RNA信息，预测发现HER2基因的第20到23外显子可能通过首尾连接形成闭合的环形RNA分子，长度为565nt，命名Cir-HER2-565(见图1和图2)；通过在环状RNA反向连接位点两侧设计PCR扩增引物，扩增环状RNA的环化位点两翼的序列，经过sanger DNA测序的方法，获得了HER2环状RNA的准确环化位点。设计特异性扩增及检测Cir-HER2-565的PCRDivergent Primers扩增引物序列如下：

SEQ ID NO：16

Cir-HER2-565-F:5'ATGGCGCTGGAGTCCATTCT 3'，

SEQ ID NO：17

Cir-HER2-565-R:5'CCACACCAGCCATCACGTAT 3'

引物的扩增产物大小为233bp，选用actin为内参矫正基因，引物序列如下：

SEQ ID NO：18

H-actin-F:5’ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGAT3’，

SEQ ID NO：19

H-actin-R:5’CTTGCACATGCCGGAGCCGTT 3’

引物的扩增产物大小为109bp；

以三阴性乳腺癌细胞系BT-483的cDNA为模板，PCR扩增目标片段的反应体系及条件描述如下：PCR为30μl总体系，具体是2×PCR MIX(Vazyme公司)15μl，上下游引物(10mM)各1.5μl，cDNA模板1μl，用灭菌水补足30μl体系。反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃15s变性，58℃30s退火，72℃延伸30s,共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后16℃保存。PCR产物经过纯化后做sanger DNA序列测定。

实施例2 Cir-HER2-565及HER2mRNA在临床组织的表达情况

研究对象：在临床组织中的来自临床上被传统常规方法判定为乳腺癌HER2阴性表达的50个病人。

研究方法：采用RT-QPCR检测上述研究对象的癌旁和肿瘤组织样品中的HER2mRNA和Cir-HER2-565，发现相对于癌旁正常组织，在肿瘤组织中HER2mRNA的表达较低且无表达差异性(P>0.05)；环形的Cir-HER2-565分子有较高丰度的表达且相对于癌旁正常组织在肿瘤组织中表达较高(P<0.01))。(见图5)

实施例3 HER2环状RNA翻译小分子蛋白的预测及鉴定

通过对Cir-HER2-565环状RNA分子的核苷酸序列分析发现，RNA发生环化后可以形成一个由ATG-TGA组成的开放阅读框，通过翻译产生一个由184个氨基酸组成的新型的HER2小蛋白，通过蛋白质分子量预测软件http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html预测蛋白的分子量约20KD，命名HER2-20KD(见图3)。

根据HER2-20KD氨基酸序列的组成，设计能用于western blot方法检测的多克隆抗体：具体方法如下：通过化学合成多肽的方法，合成PDLLEKGERLPQPPIC氨基酸序列作为免疫原；注射免疫新西兰大白兔，抗体纯化后用于检测细胞内的HER2-20KD蛋白(见图4)；根据Cir-HER2-565核苷酸序列设计特异性沉默其表达的siRNA和反义寡核苷酸(AntisenseOligonucleotide，ASO)，瞬时转染乳腺癌细胞BT-483，细胞转染最终浓度为100nM，48小时后通过RT-QPCR及western blot检测Cir-HER2在RNA及蛋白水平的变化。

详细方法：siRNA及反义核苷酸ASO设计及制备：

根据Cir-HER2-565核苷酸序列，使用在线设计软件Circinteractome，针对RNA的环化接口设计3个干扰靶标，然后分别化学合成制备siRNA和ASO小核酸；化学合成的委托上海吉玛制药技术有限公司合成并做核苷酸的2氧甲基和硫代磷酸的化学修饰，增强抗核酸酶活性的能力，提高小核酸的稳定性。

设计的siRNA序列信息如下：

SEQ ID NO：4

siRNA1-sense:5'UCAUGGUCAAAUGAAGCAUtt3'

SEQ ID NO：5

siRNA1-Anti-sense:5'AUGCUUCAUUUGACCAUGAtt3'

SEQ ID NO：6

siRNA2-sense:5'UGGUCAAAUGAAGCAUACGtt3'

SEQ ID NO：7

siRNA2-Anti-sense:5'CGUAUGCUUCAUUUGACCAtt3'

SEQ ID NO：8

siRNA3-sense:5'UCAAAUGAAGCAUACGUGAtt3'

SEQ ID NO：9

siRNA3-Anti-sense:5'UCACGUAUGCUUCAUUUGAtt3'

SEQ ID NO：10

siRNA-NC-sense:5'ACGCUCUGCUCAUCACAUCtt3'

SEQ ID NO：11

siRNA-NC-Anti-sense:5'GAUGUGAUGAGCAGAGCGUtt3'

所述的ASO如下所示：

SEQ ID NO：12

(5)ASO1:5'TCACGTATGCTTCATTTGACCATG3'

SEQ ID NO：13

ASO2:5'ACGTATGCTTCATTTGACCATGATCA3'

SEQ ID NO：14

ASO3:5'ATCACGTATGCTTCATTTGACCA3'

SEQ ID NO：15

ASO-NC:5'TAACACACTCCTCTACTGATA3'

细胞培养及转染：

乳腺癌细胞50万个细胞接种于6孔板培养板中，24h细胞贴壁后可进行转染；转染前，将100微升无血清培养基DMEM和siNRA或ASO制备成混合液；将100微升无血清培养基DMEM和5微升liop2000脂质体均匀混合，做成脂质体混合液；将上述两种混合液等比例混合，室温放置20min；按照转染试剂操作说明书操作；最终6孔板中的孔终体积为1毫升，siNRA或ASO终浓度为100nM，转染6小时候，换成正常培养基(10％胎牛血清加90％DMEM培养基加1％青霉素链霉素)1毫升，细胞培养条件37度，5％二氧化碳。

Western blot：用RAPA提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量法对提取的蛋白进行定量；配置5％SDS-PAGE浓缩胶、15％SDS-PAGE分离胶，上样总蛋白为15微克；采用80V 20分钟、150V 1h跑蛋白电泳；转膜采用100V转膜2h；5％的脱脂牛奶封闭1h；HER2-20KD兔抗抗体(1:1000)、β-actin抗体(abcam货号ab197345)(1:3000)；孵育4度过夜；第二天采用兔二抗(1:10000)常温孵育1h，TBST洗涤5遍每次5min，然后发光，显影，定影。

RT-QPCR详细如下：

荧光定量检测Cir-HER2-565按照荧光定量反应试剂盒Real-time PCR试剂盒(Vazyme公司)的说明书配置反应体系，具体检测反应体系如下：

荧光定量PCR反应条件：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒(此步骤收集荧光信号)；40个循环，然后进行融解曲线分析：温度60℃-95℃收集荧光信号。

实验结果如图6所示，结果显示siRNA的3条序列都能有效的沉默Cir-HER2-565，明显减少其在细胞中的表达量(P<0.01)，siRNA3的效果最佳；ASO1和ASO2能有效减低Cir-HER2-565的表达(P<0.01)，ASO3对Cir-HER2-565的表达抑制效果不明显(P>0.05)，ASO-2抑制Cir-HER2-565的表达效果最明显.)

实施例4 MTT检测细胞增殖

将BT-483乳腺癌细胞以细胞数2000个/孔接种于96孔板中,细胞培养24h后分别加入最终浓度为1微克/毫升，最终培养基为100微升，转染siRNA或ASO后分别于0h、24h、48h、72h、96h后用于MTT测定；每组做3个复孔；检测前加入5mg/mL MTT溶液,4h后以DMSO溶解MTT,并于570nm处测定吸收度(A)值。BT-483乳腺癌细胞的增殖情况如图7所示。实验结果显示，转染siRNA或ASO的乳腺癌细胞相对于对照组，肿瘤细胞的增殖明显降低了很多。表明通过抑制Cir-HER2-565，可以抑制乳腺癌的增殖。

实施例5动物成瘤实验

在BT-483乳腺癌细胞中转染siRNA和ASO后，将各组乳腺癌细胞以200万的细胞量注射免疫缺陷型小鼠，制备乳腺癌移植瘤动物模型，30天后取肿瘤，测定肿瘤的尺寸及重量，结果如图8所示，显示siRNA组和ASO组相对于对照NC组，肿瘤的体积及肿瘤重量明显较小。

总结：

(1)本发明前期在三阴性乳腺癌细胞系BT-483识别发现了环化模式的HER2变异体，此环化模式的变异体是由HER2基因的第20、21、22、23外显子通过首尾环化形成，由565个核苷酸组成我们命名Cir-HER2-565。HER2形成环形RNA分子后，形成一个完整的开放阅读框，编码184个氨基酸，蛋白分子量约20KD，我们命名HER2-20KD，通过制备特异性的检测抗体发现识别了Cir-HER2-565编码的小分子蛋白。

(2)通过对来自临床上被传统常规方法判定为乳腺癌HER2阴性表达的50个病人样品进行PCR检测，发现相对于癌旁正常组织，在肿瘤组织中HER2mRNA的表达较低且无表达差异性，但是环形的HER2分子有较高丰度的表达且在肿瘤组织中表达较高(见图5)。

(3)针对Cir-HER2-565核苷酸序列，设计抑制其表达的siRNA和反义核苷酸，可以降解其在乳腺癌细胞中的表达水平(见图6)，细胞功能学实验及动物实验验证，抑制Cir-HER2-565的表达可以显著抑制肿瘤细胞的增殖及裸鼠移植瘤的形成(见图7和图8)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学附属第一医院

<120> HER2-565核酸片段及HER2-20KD肽段的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用

<130> PT20162495

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 565

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gaagcatacg tgatggctgg tgtgggctcc ccatatgtct cccgccttct gggcatctgc 60

ctgacatcca cggtgcagct ggtgacacag cttatgccct atggctgcct cttagaccat 120

gtccgggaaa accgcggacg cctgggctcc caggacctgc tgaactggtg tatgcagatt 180

gccaagggga tgagctacct ggaggatgtg cggctcgtac acagggactt ggccgctcgg 240

aacgtgctgg tcaagagtcc caaccatgtc aaaattacag acttcgggct ggctcggctg 300

ctggacattg acgagacaga gtaccatgca gatgggggca aggtgcccat caagtggatg 360

gcgctggagt ccattctccg ccggcggttc acccaccaga gtgatgtgtg gagttatggt 420

gtgactgtgt gggagctgat gacttttggg gccaaacctt acgatgggat cccagcccgg 480

gagatccctg acctgctgga aaagggggag cggctgcccc agccccccat ctgcaccatt 540

gatgtctaca tgatcatggt caaat 565

<210> 2

<211> 565

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gaagcauacg ugauggcugg ugugggcucc ccauaugucu cccgccuucu gggcaucugc 60

cugacaucca cggugcagcu ggugacacag cuuaugcccu auggcugccu cuuagaccau 120

guccgggaaa accgcggacg ccugggcucc caggaccugc ugaacuggug uaugcagauu 180

gccaagggga ugagcuaccu ggaggaugug cggcucguac acagggacuu ggccgcucgg 240

aacgugcugg ucaagagucc caaccauguc aaaauuacag acuucgggcu ggcucggcug 300

cuggacauug acgagacaga guaccaugca gaugggggca aggugcccau caaguggaug 360

gcgcuggagu ccauucuccg ccggcgguuc acccaccaga gugaugugug gaguuauggu 420

gugacugugu gggagcugau gacuuuuggg gccaaaccuu acgaugggau cccagcccgg 480

gagaucccug accugcugga aaagggggag cggcugcccc agccccccau cugcaccauu 540

gaugucuaca ugaucauggu caaau 565

<210> 3

<211> 184

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys

1 5 10 15

Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys

20 25 30

Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser Gln Asp

35 40 45

Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu Glu

50 55 60

Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val

65 70 75 80

Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu

85 90 95

Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly Lys Val Pro

100 105 110

Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg Phe Thr His

115 120 125

Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr

130 135 140

Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu Ile Pro Asp

145 150 155 160

Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile

165 170 175

Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys

180

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ucauggucaa augaagcaut t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

augcuucauu ugaccaugat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

uggucaaaug aagcauacgt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cguaugcuuc auuugaccat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ucaaaugaag cauacgugat t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ucacguaugc uucauuugat t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgcucugcu caucacauct t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaugugauga gcagagcgut t 21

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcacgtatgc ttcatttgac catg 24

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acgtatgctt catttgacca tgatca 26

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atcacgtatg cttcatttga cca 23

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

uaacacacuc cucuacugau a 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atggcgctgg agtccattct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccacaccagc catcacgtat 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acagagcctc gcctttgccg at 22

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cttgcacatg ccggagccgt t 21

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgatcatggt caaatgaagc atacgtgatg 30

Claims

1.HER2-565核酸片段抑制剂或HER2-20KD肽段抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用；所述的肿瘤为HER2表达相关的肿瘤类型；其中，HER2-565核酸片段是指HER2基因第20到23号外显子的DNA序列或其转录产生的RNA序列；HER2-20KD肽段指HER2-565核酸片段表达蛋白产物；

尤其优选地，所述的肿瘤为三阴性乳腺癌；

优选地，所述的HER2-565核酸片段的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；

优选地，所述的HER2-565核酸片段为HER2基因的第20、21、22、23外显子转录后首尾环化形成的转录产物RNA，称Cir-HER2-565，由565个核苷酸组成；优选地，所述的转录产物RNA序列如SEQ ID NO：2所示；

优选地，所述的HER2-20KD肽段的序列如SEQ ID NO：3所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的HER2-565核酸片段抑制剂为抑制HER2-565核酸片段整体的或局部的转录或表达的物质；优选地，所述的物质为小RNA、化合物、核酸适配体、基因编辑工具中的一种或几种；

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的HER2-565核酸片段抑制剂为阻断Cir-HER2-565生成、或降解Cir-HER2-565的物质；

优选地，所述的抑制剂系针对于所述Cir-HER2-565的全部或部分序列而设计，可选地为与Cir-HER2-565的全部或部分序列互补；

更优选地，所述的抑制剂系针对于Cir-HER2-565环状接口而设计；优选地，针对Cir-HER2-565第545位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计，所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Cir-HER2-565第556位至9位的序列互补；

更优选地，所述的抑制剂系针对于Cir-HER2-565的以下关键片段中的一个而设计，或者可选地与Cir-HER2-565的以下序列互补：

a)包含Cir-HER2-565第550位至第15位的序列；

b)包含Cir-HER2-565第554位至第9位的序列；

c)包含Cir-HER2-565第556位至第10位的序列；

d)包含Cir-HER2-565第556位至第13位的序列；尤其优选地，所述的抑制剂系针对于Cir-HER2-565的以下片段中的一个而设计，或者可选地与Cir-HER2-565的以下序列互补：

SEQ ID NO：20

UGAUCAUGGUCAAAUGAAGCAUACGUGAUG；

优选地，所述的抑制剂为siRNA，该siRNA含有长度为21个核苷酸的第一链，及长度为21个核苷酸的第二链；其中第一链或第二链含有与上述关键片段互补的序列；其中第一链和第二链至少19个核苷酸是相互互补的。

4.一种Cir-HER2-565特异性的siRNA，所述的siRNA，含有长度为21个核苷酸的第一链，及长度为21个核苷酸的第二链；其中第一链或第二链含有Cir-HER2-565片段互补的序列；其中第一链和第二链至少19个核苷酸是相互互补的；所述的Cir-HER2-565如SEQ ID NO：2所示。

5.如权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA与Cir-HER2-565第554位至第9位的片段互补，或者Cir-HER2-565第556位至第10位的片段互补，又或者Cir-HER2-565第556位至第13位的片段互补；优选与Cir-HER2-565第556位至第13位的片段互补。

6.如权利要求5所述的siRNA，其含有SEQ ID NO：4、6或8所示的第一链，以及长度为15-30个核酸的第二链，所述的第一链或者第二链与Cir-HER2-565互补；所述的第一链和第二链至少有19个核酸互补配对形成siRNA duplex；

优选地，所述的siRNA诱导表达HER2-20KD的细胞基因沉默；

优选地，所述的siRNA的第一链和/或第二链包含至少一个化学修饰；

优选地，所述的修饰为2氧甲基、硫代磷酸；

优选地，所述的siRNA的第一链如SEQ ID NO：4、6或8所示，其对应的第二链依次如SEQID NO：5、7或9所示；更优选地，所述的siRNA的第一链如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所述，其对应的第二链依次如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示。

7.一种载体，其含有表达如权利要求5-6任一所述的siRNA的第一链和/或第二链的表达框。

8.一种哺乳动物细胞，所述的细胞含有编码SEQ ID NO：4、6或8所示第一链的表达框，以及编码长度为15-30个核酸的第二链，所述的第一链或者第二链与Cir-HER2-565互补；所述的第一链和第二链至少有19个核酸互补配对形成siRNA duplex；

优选地，所述的siRNA诱导表达HER2-20KD的细胞基因沉默；

优选地，所述的修饰为2氧甲基、硫代磷酸；

优选地，所述的siRNA的第一链如SEQ ID NO：4、6、或8所示，其对应的第二链依次如SEQID NO：5、7或9所示。

9.一种Cir-HER2-565特异性的ASO；所述的ASO为长度为23-26的单链DNA，所述的ASO与Cir-HER2-565RNA片段互补；

优选地，所述的Cir-HER2-565如SEQ ID NO：2所示；

优选地，所述的ASO与Cir-HER2-565第556位至第15位的片段互补；或者Cir-HER2-565第556位至第14位的片段互补；或者Cir-HER2-565第551位至第12位的片段；优选Cir-HER2-565第551位至第13位的片段；

优选地，所述的ASO包含至少一个化学修饰；所述的化学修饰为硫代修饰；

优选地，所述的ASO如SEQ ID NO：12、13、或14所示；更优选SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。

10.Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD氨基酸序列检测试剂在制备癌症筛选/诊断/预测/预后诊断剂或诊断系统中的应用。

11.一种乳腺癌治疗系统：其特征在于，所述的系统含有检测系统和用药系统；

所述的检测系统含有：

1)Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD检测构件；

优选地，所述的用药系统含有Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD抑制剂；

优选地，所述的Cir-HER2-565核苷酸和/或HER2-20KD氨基酸序列检测构件为荧光定量PCR和/或免疫组化；

优选地，所述的小RNA为siRNA、ASO、中的一种；更优选地，为siRNA；

优选地，所述的检测系统还包括：

2)Her2/neu表达检测构件；

3)雌激素受体表达检测构件；

4)孕激素受体表达检测构件；

优选地，所述的表达检测构件为免疫组化和荧光原位杂交检测构件中的一种或其组合。

12.一种治疗乳腺癌的药物研发方法，其特征在于，针对Cir-HER2-565核苷酸序列，通过基因干扰或者基因编辑，设计相应的抑制剂或基因治疗工具；

优选地，针对如权利要求3所述的Cir-HER2-565核苷酸序列关键片段而设计抑制剂或基因治疗工具；

优选地，所述的乳腺癌为三阴性乳腺癌。

13.一种治疗三阴性乳腺癌的药物研发方法，其特征在于，针对HER2-20KD，设计相应的HER2-20KD的活性抑制剂；