CN105754949B - 一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，属于细胞生物学技术领域。本发明构建了含有Sema3A基因序列的重组质粒，通过将Sema3A重组质粒和辅助包装质粒转染进入293T细胞获得Sema3A慢病毒载体，慢病毒载体在polybrene的协助下将Sema3A基因导入脂肪干细胞，显著地促进了脂肪干细胞的成骨分化，同时也抑制了脂肪干细胞向成脂方向的分化，导入Sema3A基因可以更好地将脂肪干细胞应用于促进骨缺损愈合和种植体骨结合，充分发挥脂肪干细胞来源广泛，易于获取的优点。

Description

一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分 化的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力和向多种功能细胞方向分化的细胞。其具有良好的增殖和免疫调节能力和再生各种组织器官的潜能，能显著扩大参与组织修复的细胞数量，科研工作者陆续开发出了基于干细胞多向分化潜能的干细胞技术，包括骨髓移植治疗造血功能障碍，分离培养人体皮肤内的干细胞制作成人工皮肤，用于烧创伤治疗等等。

随着发育的进行，大面积骨缺损在人2岁以后就失去了自然愈合的能力，干细胞被应用到组织工程骨的各种支架材料上，作为促进骨质愈合的种子细胞。科研工作者将来源广，取材方便，伤害性小的脂肪干细胞用于促进骨缺损的愈合，结果证实其对骨缺损愈合起到了一定的促进作用。但脂肪干细胞成骨能力较弱，其更易向脂肪组织分化，这限制了脂肪干细胞在骨缺损愈合方面的应用。因此，脂肪干细胞的分化方向需要进行调整，成脂分化需要得到抑制，成骨能力需要进一步的增强。

目前得到证实调节脂肪干细胞分化的方法主要有四种：一是使用荧光标记流式细胞仪筛选的方式将成骨能力较强的脂肪干细胞从干细胞群体中挑选出来进行扩增然后使用，这种方法每一次使用脂肪干细胞都需要进行荧光标记和流式细胞仪筛选，费时费力，降低了脂肪干细胞取材和使用方便的优势；二是使用成骨诱导液对脂肪干细胞进行成骨诱导，然后再应用到组织工程骨上促进骨缺损的愈合，这种方法只是将脂肪干细胞的成骨能力提前在体外得到发挥，并没有从本质上促进脂肪干细胞的成骨分化，对脂肪干细胞的成脂分化也没有影响；三是使用BMP等能促进脂肪干细胞成骨分化的细胞因子直接添加到培养基中或者以各种缓释的方式在体内对脂肪干细胞发挥作用，这种方式可以从本质上提高脂肪干细胞的成骨分化能力，但是其作用时间有限，促成骨或者抑制成脂的作用难以保持稳定、持久；四是使用小分子化物，例如地塞米松、他汀类药物对脂肪干细胞进行干预提升其成骨能力，这种方法比较简便且花费较少，但是作用效果有限。

因此，能够有效、持久、简便地促进脂肪干细胞成骨分化同时抑制其成脂分化的方法需要探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，该方法能够持久、有效、简便地促进脂肪干细胞成骨分化同时抑制其成脂分化。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，包括以下步骤：

1)将Sema3A的基因序列克隆到质粒上，获取Sema3A重组质粒；

2)将Sema3A重组质粒转化进入细菌，并对Sema3A重组质粒基因进行测序验证；

3)将测序验证过的含有Sema3A重组质粒的细菌进行扩增培养，然后提取扩增培养后细菌内含有的Sema3A重组质粒；

4)将Sema3A重组质粒和辅助包装质粒共转入293T细胞，获取Sema3A慢病毒表达载体；

5)将获取的Sema3A慢病毒表达载体感染脂肪干细胞，促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化。

步骤1)中通过设计Sema3A基因的引物序列，以PCR的方法获得大量的Sema3A基因序列；其中，Sema3A引物序列为：

上游引物序列5'TATGAGTGATGTAAGAAGGGTG 3'；

下游引物序列5'CTGGTCGTGGATAAGGGA3'。

PCR反应体系共计20ul，包括：

2×Taq PCR Master Mix 10ul；

浓度0.5uM/L的上下游引物混合物0.5ul；

灭菌双蒸水8.5ul；

合成的cDNA 1ul。

PCR反应程序设定为：

95℃300s；

95℃30s，60℃30s，72℃60s，循环40次；

72℃300s；

4℃冷却。

步骤1)所述的Sema3A重组质粒，是通过DNA限制性内切酶的作用，将酶切后的Pwpi质粒和Sema3A基因片段连接后制得。

步骤2)将Sema3A重组质粒转化进入细菌，是将Sema3A重组质粒转入具有氨苄青霉素抗性的top10大肠杆菌中培养。

步骤4)所述的辅助包装质粒为PsPAX2和PMD2G。

Sema3A重组质粒Pwpi^-Sema3A与辅助包装质粒PsPAX2、PMD2G按6ug:3ug:1ug的用量混合后共转入293T细胞。

感染的脂肪干细胞为从离体组织中分离培养的脂肪干细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，不需要其他的因子或者基因，只需将Sema3A基因单独导入就可以显著促进脂肪干细胞的成骨分化同时抑制其成脂分化，提升脂肪干细胞在骨缺损愈合中的作用；且使用慢病毒载体将Sema3A基因导入到脂肪干细胞内，对于脂肪干细胞基因转导效率高，在慢病毒载体的作用下Sema3A基因也可以整合到脂肪干细胞自身的基因组中，使Sema3A基因得到持久稳定的表达。另外，构建的慢病毒载体可以在-80℃冰箱中长期保存，且构建载体流程清晰固定，方便进行规模化生产。使用慢病毒载体的方法将Sema3A基因导入脂肪干细胞可以有效、持久、简便地促进脂肪干细胞成骨分化同时抑制其成脂分化。

附图说明

图1是酶切前图；

图2是酶切后图；

图3是重组质粒图；

图4是重组质粒转化入细菌图；

图5是提取的重组质粒图；

图6是构建的慢病毒图；

图7为导入Sema3A基因的脂肪干细胞图；

图8是脂肪干细胞诱导成骨分化后图；其中，(a)为Pwpi空白质粒构建的慢病毒感染组；(b)为Pwpi^-Sema3A重组质粒构建的慢病毒感染组；

图9是脂肪干细胞诱导成脂分化后图；(a)为Pwpi空白质粒构建的慢病毒感染组；(b)为Pwpi^-Sema3A重组质粒构建的慢病毒感染组。

其中，1.Pwpi质粒；2.Sema3A基因；3.酶切后的Pwpi质粒；4.酶切后的DNA；5.重组质粒；6.top10大肠杆菌；7.构建的慢病毒；8.导入Sema3A基因的脂肪干细胞。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明公开的采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，包括如下步骤：

1)将Sema3A的基因序列克隆到质粒上，获取Sema3A重组质粒；

2)将Sema3A重组质粒转化进入细菌，并对Sema3A重组质粒基因进行测序验证；

3)将测序验证过的含有Sema3A重组质粒的细菌进行扩增培养，然后提取扩增培养后细菌内含有的Sema3A重组质粒；

4)将Sema3A重组质粒和辅助包装质粒共转入293T细胞，获取Sema3A慢病毒表达载体；

5)将获取的Sema3A慢病毒表达载体感染脂肪干细胞，达到促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的目的。

具体实施过程如下：

1、获取Sema3A基因

使用RNA提取和逆转录试剂盒提取脂肪干细胞的总RNA，并将其逆转录为cDNA，

设计Sema3A的引物序列，以PCR的方法获得大量的Sema3A基因序列，然后使用DNA回收纯化试剂盒按照说明纯化PCR产物，纯化后的Sema3A基因溶液定量后-20℃保存。

其中Sema3A引物序列为：

上游引物序列5'TATGAGTGATGTAAGAAGGGTG 3'；

下游引物序列5'CTGGTCGTGGATAAGGGA3'。

PCR反应体系(20ul)为：

2×Taq PCR Master Mix 10ul，上下游引物混合物0.5ul(浓度0.5uM/L),灭菌双蒸水8.5ul，合成的cDNA 1ul。

PCR反应程序设定为：

95℃300s；

95℃30s，60℃30s，72℃60s，循环40次；

72℃300s；

4℃冷却。

2、获取Sema3A重组质粒

参见图1和图2，将DNA限制性内切酶BamHI和HindIII各1ul、Pwpi质粒1ug和2ul的10×酶切缓冲液加入到无菌的1.5ml离心管中，用灭菌双蒸水加至20ul反应体系，37℃条件下保温2h使其充分酶切，另取一灭菌后1.5ml离心管加入DNA限制性内切酶BamHI和HindIII各1ul、纯化后的Sema3A基因1ug和2ul的10×酶切缓冲液，也用灭菌双蒸水加至20ul反应体系，37℃条件下保温2h使其充分酶切。

将酶切后的两个离心管加热至72℃保持20min使DNA限制性内切酶失活，然后取2ul酶切后的Pwpi质粒溶液、4ul酶切后的Sema3A基因片段溶液、2ul T4噬菌体DNA连接酶、2ul DNA连接酶缓冲液加入到1.5ml离心管中，轻轻混匀后16℃条件下保持12h使酶切后的Pwpi质粒和Sema3A基因片段充分连接，参见图3。

3、重组质粒转化入细菌

取5ul反应12h后的连接产物加入到生长在培养皿中具有氨苄青霉素抗性的top10大肠杆菌感受态细胞上，冰上放置30min后，42℃热激90s，再在冰上放置1min，然后加入1mlLB培养基，于37℃摇床振荡培养60min，然后取80ul转化后的菌液涂在含有氨苄青霉素(100ng/ml)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，参见图4。

4、基因测序验证

使用挑菌环从过夜培养后LB固体培养基上产生的菌落中挑出几个单菌落分别加入到含有2ml LB培养基的摇菌管中，37℃摇床振荡(250r/min)培养12h，将扩增后的菌液取500μL加入到离心管中测序验证构建的Pwpi^-Sema3A重组质粒，再将剩余菌液取1ml加入30％的甘油混匀，保存在-80℃冰箱留菌种。

5、质粒提取

参见图5，将冻存的测序验证后的菌液解冻后取50ul加入到10ml LB培养基中，37℃摇床振荡(250r/min)培养12h，将培养12h后的菌液取1.5ml加入到1.5ml离心管中，常温下离心(12000r/min)2分钟，弃去上清液，使用质粒抽提试剂盒提取菌体中的质粒并定量。

6、获取Sema3A慢病毒载体

参见图6，将提取的Pwpi^-Sema3A重组质粒和辅助包装质粒PsPAX2、PMD2G按照6ug:3ug:1ug的量加入到含有500ul DMEM无血清培养基的离心管中轻轻混匀，同时取24ul的脂质体加入到另一含有500ul DMEM无血清培养基的离心管中轻轻混匀，常温下孵育5min后，将含有质粒的无血清培养基吸出加入到含有脂质体的离心管中，轻轻混匀后常温下孵育20min，将孵育结束的质粒脂质体混合物加入到生长有293T细胞(融合度约60％)和4mlDMEM完全培养基的6cm培养皿中，37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度条件下培养12h后换4ml全新DMEM完全培养基，48h后补液1ml，72小时后收集含有Sema3A慢病毒颗粒的培养液，孔径0.45um滤器过滤后，加入总体积量20％的胎牛血清-80℃冰箱分装保存。

7、Sema3A慢病毒载体感染脂肪干细胞

将从离体脂肪组织中分离培养的脂肪干细胞放入25cm²培养瓶中培养至细胞融合度达到约60％，倒掉旧细胞培养液加入2ml DMEM完全培养基，再加入24ul polybrene溶液(1ug/ul)，轻轻混匀后最后加入1ml 4℃解冻后的含有Sema3A慢病毒载体的培养液，再混匀后37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度条件下培养，12h后换4ml DMEM完全培养基继续培养，每3天换液一次，细胞融合达到80％时胰蛋白酶消化后传代培养，96h后倒置荧光显微下激发绿色荧光验证Sema3A基因通过慢病毒载体成功导入脂肪干细胞，参见图7。

为了验证本发明所述的促进脂肪干细胞成骨分化、抑制其成脂分化方法的效能，我们将脂肪干细胞分为Pwpi空白质粒构建的慢病毒感染组和Pwpi^-Sema3A重组质粒构建的慢病毒感染组，将两组细胞分别铺在直径3.5cm培养皿内。

取两皿细胞，待细胞融合度达到80％使用成骨诱导液(含50mg/ml抗坏血酸、10nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的DMEM完全培养基)进行成骨诱导14天，期间每3天换液一次，诱导结束去除培养液，PBS洗两遍后使用4％多聚甲醛固定15分钟，去除固定液使用浓度为0.1％，pH值为7.2的茜素红染液染色30min，PBS洗去浮色后，使用倒置显微镜观察对比两组骨结节的形成，参见图8，(a)为Pwpi空白质粒构建的慢病毒感染组；(b)为Pwpi^-Sema3A重组质粒构建的慢病毒感染组，发现Pwpi^-Sema3A重组质粒构建的慢病毒感染后的脂肪干细胞骨结节(说明)形成较Pwpi空白质粒构建的慢病毒感染的脂肪干细胞明显增多，证明Sema3A确实可以促进脂肪干细胞的成骨分化。

另外取两皿细胞，待细胞融合度达到100％使用成脂诱导液(含0.05mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、50ug/ml胰岛素、10umol/L地塞米松、10umol/L罗格列酮的DMEM完全培养基)进行成脂诱导9天，期间每3天换液一次，诱导结束去除培养液，PBS洗两遍后使用4％多聚甲醛固定15分钟，去除固定液使用浓度为0.6％油红O染液染色30min，75％的酒精洗去浮色后，PBS洗去酒精脱色液，使用倒置显微镜观察对比两组脂滴的形成，参见图9，(a)为Pwpi空白质粒构建的慢病毒感染组；(b)为Pwpi^-Sema3A重组质粒构建的慢病毒感染组，发现Pwpi^-Sema3A重组质粒构建的慢病毒感染后的脂肪干细胞脂滴(说明)形成较Pwpi空白质粒构建的慢病毒感染的脂肪干细胞明显减少，证明Sema3A在促进脂肪干细胞成骨分化的同时也可以抑制脂肪干细胞成脂分化。

综上所述，本发明使用PCR的方法获取Sema3A基因；将Sema3A基因克隆到质粒上，获取Sema3A重组质粒；将Sema3A重组质粒通过转化进入细菌；对Sema3A重组质粒基因测序验证；提取细菌内含有的Sema3A重组质粒；将Sema3A重组质粒和辅助包装质粒共转入293T细胞，获取Sema3A慢病毒表达载体；将获取的Sema3A慢病毒表达载体感染脂肪干细胞。本发明构建了含有Sema3A基因序列的重组质粒，通过将Sema3A重组质粒和辅助包装质粒转染进入293T细胞获得Sema3A慢病毒载体，慢病毒载体在polybrene的协助下将Sema3A基因导入脂肪干细胞，显著地促进了脂肪干细胞的成骨分化，同时也抑制了脂肪干细胞向成脂方向的分化，导入Sema3A基因可以更好地将脂肪干细胞应用于促进骨缺损愈合和种植体骨结合，充分发挥脂肪干细胞来源广泛，易于获取的优点。

Claims (8)

1.一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将Sema3A的基因序列克隆到质粒上，获取Sema3A重组质粒；

所述的Sema3A重组质粒，是通过DNA限制性内切酶的作用，将酶切后的Pwpi质粒和Sema3A基因片段连接后制得；

2)将Sema3A重组质粒转化进入细菌，并对Sema3A重组质粒基因进行测序验证；

3)将测序验证过的含有Sema3A重组质粒的细菌进行扩增培养，然后提取扩增培养后细菌内含有的Sema3A重组质粒；

4)将Sema3A重组质粒和辅助包装质粒共转入293T细胞，获取Sema3A慢病毒表达载体；

5)将获取的Sema3A慢病毒表达载体感染脂肪干细胞，促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化。

2.根据权利要求1所述的采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，步骤1)中通过设计Sema3A基因的引物序列，以PCR的方法获得大量的Sema3A基因序列；其中，Sema3A引物序列为：

上游引物序列5'TATGAGTGATGTAAGAAGGGTG 3'；

下游引物序列5'CTGGTCGTGGATAAGGGA 3'。

3.根据权利要求2所述的采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，PCR反应体系共计20μl，包括：

2×Taq PCR Master Mix 10μl；

浓度0.5μM/L的上下游引物混合物 0.5μl；

灭菌双蒸水 8.5μl；

合成的cDNA 1μl。

4.根据权利要求2所述的采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，PCR反应程序设定为：

95℃300s；

95℃30s，60℃30s，72℃60s，循环40次；

72℃300s；

4℃冷却。

5.根据权利要求1所述的采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，步骤2)将Sema3A重组质粒转化进入细菌，是将Sema3A重组质粒转入具有氨苄青霉素抗性的top10大肠杆菌中培养。

6.根据权利要求1所述的采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，步骤4)所述的辅助包装质粒为PsPAX2和PMD2G。

7.根据权利要求6所述的采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，Sema3A重组质粒与辅助包装质粒PsPAX2、PMD2G按6μg:3μg:1μg的用量混合后共转入293T细胞。

8.根据权利要求1所述的采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，感染的脂肪干细胞为从离体组织中分离培养的脂肪干细胞。

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