KR102066158B1 - Ell3 유전자의 과발현 유도를 통한 성체줄기세포의 노화 억제 방법 및 Ell3 유전자의 발현 조절을 통한 분화 촉진 방법 - Google Patents
Ell3 유전자의 과발현 유도를 통한 성체줄기세포의 노화 억제 방법 및 Ell3 유전자의 발현 조절을 통한 분화 촉진 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 성체줄기세포에서 Ell3 (eleven-nineteen lysine-rich leukemia 3) 유전자의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 성체줄기세포의 노화를 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 성체줄기세포에서 Ell3 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 성체줄기세포의 지방세포로의 분화를 촉진하는 방법; 및 성체줄기세포에서 Ell3 유전자의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 성체줄기세포의 골세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 Ell3 (eleven-nineteen lysine-rich leukemia 3) 유전자의 과발현 유도를 통한 성체줄기세포의 노화 억제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Ell3 유전자의 발현 조절을 통한 성체줄기세포의 지방세포 혹은 골세포로의 분화 촉진 방법에 관한 것이다.
성체줄기세포는 배아줄기세포처럼 모든 조직의 세포로 분화는 어렵지만 치료하고자 하는 환자에서 직접 추출하여 사용할 수 있기 때문에 배아줄기세포에 비하여 윤리적인 문제가 적고 면역거부 반응도 적은 장점이 있다. 그러나, 성체줄기세포는 체내에 소량으로 존재하며, 배아줄기세포에 비하여 빠르게 노화되어 증식이 어렵다는 단점이 있다. 따라서, 빠르게 노화되는 문제점을 해결하여 치료효율을 높이는 것은 성체줄기세포를 상용화하는데 있어서 필수적이다.
재생의학에서 성체줄기세포를 사용한 세포치료제 개발에 많은 연구가 진행되고 있다. 성공적인 치료를 위해서는 많은 수의 세포가 필요하고 생체 외 세포증식이 필요하지만, 성체줄기세포는 증식은 제한적이며 또한 장기간의 배양은 성체줄기세포의 변화를 유도할 수도 있다, 노화된 성체줄기세포는 분화 잠재력이 감소하고 이동성과 원점복귀 능력에 있어 장애를 보인다. 또한, 노화된 성체 줄기세포에서 분비되는 물질에 의하여 암세포의 증식 또는 이동을 촉진시키는 것도 보고되고 있어, 성체줄기세포의 노화를 모니터링하고 생체 외 성체줄기세포 배양시 노화를 방지할 수 있는 방법을 개발하는 것은 매우 중요하다.
한편, 반응성 산소종(ROS), 단백질 손상, 미토콘드리아 손상 등으로 인한 성체줄기세포의 노화는 골세포로의 분화(혹은 골형성, Osteogenesis)로부터 지방세포로의 분화(혹은 지방세포형성, Adipogenesis)로 분화경로를 변경시킨다는 것이 보고된 바 있다(Y Li et al, Senescence of mesenchymal stem cells (Review), Int J Mol Med (2017)).
따라서, 성체줄기세포의 노화에 영향을 주는 유전자를 분자생물학적 수준에서 밝히는 것은 성체줄기세포 배양시 노화를 억제하는 방법의 개발에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 이러한 유전자는 골세포로의 분화 또는 지방세포로의 분화를 선택적으로 촉진하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명자들은 성체줄기세포의 노화 기전을 다양하게 연구하였다. 그 결과, ELL3 유전자(즉, 서열번호 1의 유전자)가 성체줄기세포의 노화와 관련되며, Ell3 유전자 발현의 억제가 성체줄기세포의 노화를 촉진한다는 것을 발견하였다. 또한, Ell3 유전자 발현의 억제는 성체줄기세포의 지방세포로의 분화를 증가시키며, 골세포로의 분화를 감소시킨다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 Ell3 유전자의 과발현 유도를 포함하는 성체줄기세포의 노화 억제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 Ell3 유전자의 발현 억제를 포함하는 성체줄기세포의 지방세포로의 분화를 선택적으로 촉진하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 Ell3 유전자의 과발현 유도를 포함하는 성체줄기세포의 골세포로의 분화를 선택적으로 촉진하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 성체줄기세포에서 서열번호 1의 유전자의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 노화를 억제하는 방법이 제공된다. 본 발명의 노화 억제 방법에 있어서, 상기 성체줄기세포는 지방세포-유래의 성체줄기세포 또는 골수-유래의 성체줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 과발현의 유도는 성체줄기세포를 서열번호 1의 유전자로 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 성체줄기세포에서 서열번호 1의 유전자의 과발현을 유도하는 단계 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 성체줄기세포를 골세포 분화용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 골세포로의 분화를 촉진하는 방법이 제공된다. 본 발명의 골세포로의 분화 촉진 방법에 있어서, 상기 성체줄기세포는 지방세포-유래의 성체줄기세포 또는 골수-유래의 성체줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 과발현의 유도는 성체줄기세포를 서열번호 1의 유전자로 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, (p) 성체줄기세포에서 서열번호 1의 유전자의 발현을 억제하는 단계 및 (q) 단계(p)에서 얻어진 성체줄기세포를 지방세포 분화용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 지방세포로의 분화를 촉진하는 방법이 제공된다. 본 발명의 지방세포로의 분화 촉진 방법에 있어서, 상기 성체줄기세포는 지방세포-유래의 성체줄기세포 또는 골수-유래의 성체줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 발현의 억제는 서열번호 1의 유전자를 표적으로 하는 siRNA로 성체줄기세포를 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다.
ELL3 유전자(즉, 서열번호 1의 유전자)가 성체줄기세포의 노화와 관련된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 즉, Ell3 유전자 발현이 억제될 경우 성체줄기세포의 노화가 촉진된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 또한, Ell3 유전자 발현이 억제될 경우, 성체줄기세포의 지방세포로의 분화가 증가되고, 골세포로의 분화가 감소된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 성체줄기세포의 노화 억제에 유용하게 적용될 수 있으며, 또한 성체줄기세포를 지방세포 또는 골세포로 선택적으로 분화시키는데 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 ADSCs 및 BM-MSCs를 계대배양하여 정량적 역전사-PCR(Quantitative reverse transcription-PCR, qRT-PCR) 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2는 siNS (nonspecific siRNA) 또는 siEll3 (siRNA targeting to Ell3)로 형질감염된 ADSCs 및 BM-MSCs를 배양하였을 때의 계수된 세포수를 나타낸다.
도 3은 siNS 또는 siEll3로 형질감염된 MCF7 및 MCF10A를 배양하였을 때의 계수된 세포수를 나타낸다.
도 4는 ADSCs 및 BM-MSCs를 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 후 48시간 후에 유세포 분석기로 세포주기를 분석한 결과(좌측 패널) 및 이를 정량 분석한 결과(우측 패널)를 나타낸다.
도 5는 MCF7 및 MCF10A를 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 후 48시간 후에 유세포 분석기로 세포주기를 분석한 결과(좌측 패널) 및 이를 정량 분석한 결과(우측 패널)를 나타낸다.
도 6는 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs, BM-MSCs, MCF7 및 MCF10A의 미토콘드리아 막 포텐셜을 JC-1 염색(좌측) 및 유세포 분석(우측)에 의해 평가한 결과를 나타낸다.
도 7은 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs 및 BM-MSCs에 대하여 β-gal 염색을 수행한 결과를 나타낸다. β-gal (+) 세포는 광학 현미경으로 관찰하였으며(좌측), 이를 정량분석(우측)하였다.
도 8은 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs 및 BM-MSCs의 노화-관련 유전자의 발현을 qRT-PCR을 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs의 지방세포 분화효율(adipogenic lineage differentiation efficiency) 및 골세포 분화효율(osteogenic lineage differentiation efficiency)를 2차원 및 3차원 펠렛 배양 하에서, 각각 Oil red O 염색(지방세포)및 Alizarin Red S 염색(골세포)을 통하여 측정한 결과를 나타낸다. 세포는 2주 동안(지방세포) 및 3주 동안(골세포) 배양하였으며, 배지는 2일마다 교체하였다.
도 10은 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs를 2차원 분화 조건에서 24시간 동안 배양한 후, qRT-PCR 로 각각의 마커 유전자(lineage marker genes)의 발현을 분석한 결과를 나타낸다.
도 11의 A는 siNS 또는 siEll3로 48시간 동안 형질감염시킨 ADSCs에서, Ell3, p53 및 Bcl-2의 발현을 qRT-PCR (좌측) 및 면역조직화학 염색(immunocytochemical staining)(우측)을 통하여 분석한 결과를 나타낸다. 도 11의 B는 siNS 또는 siEll3로 48시간 동안 형질감염시킨 ADSCs에서, siNS 또는 siEll3로 48시간 동안 형질감염시킨 ADSCs에서, Ell3, p53 및 Bcl-2의 발현을 면역블롯(immunoblot)을 통하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 siNS 또는 siEll3로 48시간 동안 형질감염시킨 ADSCs를 0.25μM의 ABT-747로 24시간 동안 처리한 후, PPAR-γ 및 Runx2의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 siNS (nonspecific siRNA) 또는 siEll3 (siRNA targeting to Ell3)로 형질감염된 ADSCs 및 BM-MSCs를 배양하였을 때의 계수된 세포수를 나타낸다.
도 3은 siNS 또는 siEll3로 형질감염된 MCF7 및 MCF10A를 배양하였을 때의 계수된 세포수를 나타낸다.
도 4는 ADSCs 및 BM-MSCs를 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 후 48시간 후에 유세포 분석기로 세포주기를 분석한 결과(좌측 패널) 및 이를 정량 분석한 결과(우측 패널)를 나타낸다.
도 5는 MCF7 및 MCF10A를 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 후 48시간 후에 유세포 분석기로 세포주기를 분석한 결과(좌측 패널) 및 이를 정량 분석한 결과(우측 패널)를 나타낸다.
도 6는 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs, BM-MSCs, MCF7 및 MCF10A의 미토콘드리아 막 포텐셜을 JC-1 염색(좌측) 및 유세포 분석(우측)에 의해 평가한 결과를 나타낸다.
도 7은 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs 및 BM-MSCs에 대하여 β-gal 염색을 수행한 결과를 나타낸다. β-gal (+) 세포는 광학 현미경으로 관찰하였으며(좌측), 이를 정량분석(우측)하였다.
도 8은 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs 및 BM-MSCs의 노화-관련 유전자의 발현을 qRT-PCR을 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs의 지방세포 분화효율(adipogenic lineage differentiation efficiency) 및 골세포 분화효율(osteogenic lineage differentiation efficiency)를 2차원 및 3차원 펠렛 배양 하에서, 각각 Oil red O 염색(지방세포)및 Alizarin Red S 염색(골세포)을 통하여 측정한 결과를 나타낸다. 세포는 2주 동안(지방세포) 및 3주 동안(골세포) 배양하였으며, 배지는 2일마다 교체하였다.
도 10은 siNS 또는 siEll3로 형질감염시킨 ADSCs를 2차원 분화 조건에서 24시간 동안 배양한 후, qRT-PCR 로 각각의 마커 유전자(lineage marker genes)의 발현을 분석한 결과를 나타낸다.
도 11의 A는 siNS 또는 siEll3로 48시간 동안 형질감염시킨 ADSCs에서, Ell3, p53 및 Bcl-2의 발현을 qRT-PCR (좌측) 및 면역조직화학 염색(immunocytochemical staining)(우측)을 통하여 분석한 결과를 나타낸다. 도 11의 B는 siNS 또는 siEll3로 48시간 동안 형질감염시킨 ADSCs에서, siNS 또는 siEll3로 48시간 동안 형질감염시킨 ADSCs에서, Ell3, p53 및 Bcl-2의 발현을 면역블롯(immunoblot)을 통하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 siNS 또는 siEll3로 48시간 동안 형질감염시킨 ADSCs를 0.25μM의 ABT-747로 24시간 동안 처리한 후, PPAR-γ 및 Runx2의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
Ell3는 RNA 폴리머라아제 II 전사 연장 인자(RNA polymerase II transcription elongation factors)의 일레븐-나인틴 라이신-풍부 류케미아(Ell) 군(eleven-nineteen lysine-rich leukemia (Ell) family) 중 하나이며, 정소에 풍부하게 존재한다. 배아줄기세포에서, Ell3는 분화 과정에서 적절한 전사 개시 복합체를 불러모으기 위하여 유전자들을 프라이밍(priming)함으로써 조절 유전자들의 활성화에 중요한 역할을 한다(Lin, C., et al., (2013) The RNA Pol II elongation factor Ell3 marks enhancers in ES cells and primes future gene activation. Cell 152, 144-156). 본 발명에 의해, ELL3 유전자(즉, 서열번호 1의 유전자)가 성체줄기세포의 노화와 관련된다는 것이 새롭게 밝혀졌다. 즉, Ell3 유전자 발현이 억제될 경우 성체줄기세포의 노화가 촉진된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 성체줄기세포에서 서열번호 1의 유전자의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 노화를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 노화 억제 방법에 있어서, 상기 성체줄기세포는 체외로 분리된 인간을 포함한 포유동물의 조직(tissues), 기관(organs)으로부터 통상의 생물학적 및/또는 유전공학적 방법을 통하여 성체줄기세포를 분리함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 성체줄기세포는 지방세포-유래의 성체줄기세포 또는 골수-유래의 성체줄기세포일 수 있다.
또한, 상기 과발현의 유도는 ELL3 유전자, 즉 서열번호 1의 유전자로 성체줄기세포를 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 형질감염은 적절한 유전자 전달 시스템, 예를 들어 서열번호 1의 유전자를 포함하는 적절한 발현 벡터 혹은 바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 형질감염은 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 수행될 수 있으며, 이는 종양성 형질감염(neoplastic transformation)과 관련한 안전성 문제를 회피할 수 있다. 상기 일렉트로포레이션은 공지의 유전자 전달 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 의해, Ell3 유전자 발현이 억제될 경우, 성체줄기세포의 지방세포로의 분화가 증가되고, 골세포로의 분화가 감소된다는 것이 밝혀졌다. 즉, Ell3 유전자의 발현 조절을 통한 선택적인 지방세포로의 분화 혹은 선택적인 골세포로의 분화를 촉진할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 (a) 성체줄기세포에서 서열번호 1의 유전자의 과발현을 유도하는 단계 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 성체줄기세포를 골세포 분화용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 골세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (p) 성체줄기세포에서 서열번호 1의 유전자의 발현을 억제하는 단계 및 (q) 단계(p)에서 얻어진 성체줄기세포를 지방세포 분화용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 지방세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 골세포로의 분화 촉진 방법 및 지방세포로의 분화 촉진 방법에 있어서, 상기 성체줄기세포는 체외로 분리된 인간을 포함한 포유동물의 조직, 기관으로부터 통상의 생물학적 및/또는 유전공학적 방법을 통하여 성체줄기세포를 분리함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 성체줄기세포는 지방세포-유래의 성체줄기세포 또는 골수-유래의 성체줄기세포일 수 있다.
본 발명의 골세포로의 분화 촉진 방법에 있어서, 상기 서열번호 1의 유전자의 과발현의 유도는 상기한 노화 억제 방법에서 설명한 과발현 유도와 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 단계(b)에서 사용되는 골세포 분화용 배지는 성체줄기세포의 골세포로의 분화용 배지로서 알려져 있는 공지의 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 단계(b)는 골세포로의 분화용 배지로서 상업적으로 시판되는 골세포 분화배지, 예를 들어 Thermo A1007201 등의 배지를 사용하여, 제조사의 지침에 따라 배양을 수행함으로써 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 지방세포로의 분화 촉진 방법에 있어서, 상기 서열번호 1의 유전자의 발현의 억제는 서열번호 1의 유전자를 표적으로 하는 siRNA로 성체줄기세포를 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 단계(p)는 서열번호 1의 유전자를 표적으로 하는 siRNA로서 공지의 siRNA, 예를 들어 Dharmacon사 siRNA(L-014601-02-0005)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 성체줄기세포를 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다. 또한, 단계(q)에서 사용되는 지방세포 분화용 배지는 성체줄기세포의 지방세포로의 분화용 배지로서 알려져 있는 공지의 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 단계(q)는 지방세포 분화용 배지로서 상업적으로 시판되는 지방세포 분화배지, 예를 들어 Thermo A1007001 등의 배지를 사용하여, 제조사의 지침에 따라 배양을 수행함으로써 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 구체적인 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 시험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 시험예에 한정되는 것은 아니다.
1. 재료 및 시험방법
(1) 세포 배양
지방-유래 중간엽 줄기세포(Adipose derived stem cells, ADSCs)(Cat No.CB-ADMSC-001, SEFO, Seoul, Korea)는 10% 우태혈청(fetal bovine serum)(Cat no.12484-010, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Cat no.15140148, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 함유하는 α-MEM (Cat no.12571-071, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에서 배양하였다. 골수-유래 중간엽 줄기세포(Bone marrow derived stem cells, BM-MSCs)는 Lonza Walkersville Inc. (Cat no. PT-2501, Walkersville, MD, USA)에서 구입하였으며, MSCGM Basal Medium (Cat#: PT-3001; Lonza Walkersville Inc.)에서 가습(humidified) 5% CO2 배양기에서 37℃에서 배양하였다.
MCF7은 10% 우태혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. MCF10A은 10% 말 혈청(horse serum) (Cat no. #16050-122 Invitrogen, CA, USA), 20ng/ml EGF (Cat no. E9644 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.5mg/ml 하이드로코르티손(Cat no. H0888 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 100ng/ml 콜레라 톡신(cholera toxin) (Cat no. c-8052 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10μg/ml 인슐린 (Cat no. I-1882 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 (Cat no. 11320082 Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에서 배양하였다.
(2) 항체 및 면역블롯 분석
본 시험에 사용된 항체는 다음과 같다; 항-ELL3 항체(Cat no.ab67415, Abcam, Cambridge, UK), 항-ß-actin 항체(Santa Cruz, CA, USA Sc-47778), 항-p53 항체(Cat no.#2527, Cell Signaling, MA, USA), 항-BCL2 항체(Cat no.#4223, Cell Signaling, MA, USA) 및 β-actin(sc-47778, Santa Cruz, CA, USA). 면역블롯 분석을 위하여, 세포를 조직 용해 완충액에서 용해시키고(lysed), 총 세포 추출물을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 풀어준 다음, 면역블롯 PVDF 막(Cat No.IPVH00010, Millipore, MA, USA)으로 전사하였다. 막을 항체로 블롯팅하고, 면역활성을 화학발광(enhanced chemiluminescence)(Cat no.34579, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)으로 검출하였다.
(3) Ell3의 siRNA 매개 억제
지방-유래 중간엽줄기세포(ADSCs) 및 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)를 Ell3를 표적으로 하는 siRNA(siRNA targeting to Ell3, siEll3) 또는 비특이적 siRNA(nonspecific siRNA, siNS)로 OPTI-MEM(Invitrogen, CA, USA) 중에서 리포펙타민 3000(Lipofectamine 3000)(Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 공급자의 지침에 따라 형질감염시켰다. 구체적으로, 각각의 세포를 100 mm 배양접시에 약 80~90%의 밀도로 시딩한 다음, siNS(Dharmacon D-001810-01-05)/siELL3(Dharmacon L-014601-02-0005)를 OPTI-MEM(Invitrogen, CA, USA) 배지와 함께 37℃ CO2 인큐베이터에서 6시간 배양한 후, MSCGM Basal Medium (Cat no. PT-3001 Lonza Walkersville Inc.)로 배지를 교체하였다. 다음날, 분화 배지[골분화 배지(Thermo A1007201) 또는 지방세포분화 배지(Thermo A1007001)]로 배지를 교체하고, 2일 마다 배지를 교체하였다. 3차원 펠렛 배양의 경우, 배지를 교체한 다음, 다음날 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 수확하고, 원심분리하여 세포 펠렛 상태로 만든 다음, 펠렛 상태를 유지하면서 분화 배지를 넣어주고 펠렛 배양을 수행하였다. 배지는 2일 마다 교체하였다.
(4) 실시간 역전사 PCR (qRT-PCR)
총 mRNA를 TRI-시약(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 분리하였다. 구체적으로, 세포를 Trypsin-EDTA를 사용하여 수확한 다음, DPBS로 세척한 후, Trizol 1 ml로 세포를 풀어준 다음 클로로포름 200 ul를 가하여 페놀을 제거 한 다음, 원심분리하여 상층액을 수확하고, 이소프로판올과 70% 에탄을을 사용하여 정제하였다. 1 ug의 총 RNA를 1st Strand cDNA Synthesis kit(LeGene, San Diego, CA, USA)를 사용하여 공급자의 지침에 따라 역전사시켰다. TOPreal qPCR 2X PreMIX(Enzynomics, Daejeon, Korea) 및 FX96 Real-time System (Bio-Rad Laboratories, Richmond, VA, USA)을 사용하여, qRT-PCR을 3회 수행하였다. 사용된 프라이머 셋트는 다음과 같다: ELL3 정방향 프라이머: CTA CAA GGC CTG ACC AAT CAG G (서열번호 2), ELL3 역방향 프라이머: CTG GAG TTC CTC GCC GAA CTC (서열번호 3) / BCL-2 정방향 프라이머: GTGAACTGGGGGAGGATTGT (서열번호 4), BCL-2 역방향 프라이머: GGAGAAATCAAACAGAGGCC (서열번호 5). 발현 수준은 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드게네이즈(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)로 보정(normalized)하였다.
(5) 세포주기 분석
세포주기 분석을 위하여, 세포를 차가운 70% 에탄올과 함께 2시간 동안 고정한 다음, 요오드화 프로피디움(propidium iodide)(Cat no.p3566, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)으로 PBS 중에서 최종 농도 50 μg/ml로, 20 μg/ml의 RNase 및 10% Triton X-100의 존재하에서, 1시간 동안 37℃에서 염색하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음, 세포주기를 유세포 분석(flow cytometry)을 통하여 분석하였다.
(6) 면역형광 염색
세포를 배양 슬라이드에서 배양한 후, DPBS(Cat no.14190144 Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 희석한 4% 포름알데히드(Cat no. F8775 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 고정하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 0.1% 트윈-20을 사용하여 30분 동안 처리하고(permeabilized), 블록킹 완충액(5% 우 혈청 알부민)을 사용하여 30분 동안 블록킹하였다. 4℃에서 일차 항체와 밤새 인큐베이션한 후, 배양 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고, 형광 이차 항체와 함께 암소에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 슬라이드를 PBS로 3회 세척한 후, DAPI-함유 마운팅 용액(DAPI-containing mounting solution)(H-1200, Vector Laboratories, CA, USA)으로 마운팅시켰다. 형광 현미경(Eclipse TE2000, Nikon Metrology, Brighton, MI, USA)을 사용하여 이미지를 측정하였다.
(7) 분화된 성체줄기세포의 염색
골분화는 Arizarin-Red S로 염색하여 관찰하였으며, 지방세포분화는 Oil-Red O로 염색하여 관찰하였다. 지방세포분화는 14일, 골분화는 21일 동안 분화를 진행하였다. 지방세포분화의 경우 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음, 60% 이소프로판올로 세척하고, Oil-red O 염색 용액으로 15분 동안 염색한 후, 60% 이소프로판올로 세척한 후 현미경으로 관찰하였다. 골분화의 경우, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음, DPBS로 세척하고, Alizarin Red S(pH 4.1-4.3)을 5분간 염색한 후, 정제수로 세척한 후 현미경으로 관찰하였다.
(8) 노화-연관 β-갈락토시데이즈 활성
세포 노화 분석 키트(Cellular Senescence Assay Kit)(Cat no CBA-230, Cell Biolabs, CA, USA)를 사용하여 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 양성 세포를 염색하였다. 세포를 DPBS로 2회 세척한 후 4% 파라포름알데히드를 사용하여 실온에서 5분 동안 고정하였다. 이후, 세포를 PBS로 3회 세척하고, B-Gal 염색 용액 중에서 4시간 동안 37℃ CO2 인큐베이터에서 반응시켰다. 세포를 DPBS로 세척한 후, 광학 현미경 하에서 관찰하였다.
(9) 통계 분석
각각의 실험은 적어도 3회 수행하였다. 두 그룹 사이의 데이터 분석의 통계적 유의성은 Student's t-test를 사용하여 결정하였으며, <0.05의 P 값을 유의성 있는 것으로 간주하였다. 모든 통계 분석은 SAS statistical package, v.9.13 (SAS, Cary, NC, USA)를 사용하여 수행하였다.
2. 시험결과
(1)
ELL3
발현의 억제는
성체줄기세포의
노화를 유도한다.
지방-유래 중간엽줄기세포(ADSCs) 및 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)에서 Ell3의 발현을 감소시켰을 때, ADSCs 및 BM-MSCs의 시험관내 계대 배양에 따라 Ell3의 발현이 감소되었으며(도 1) 또한 세포 증식은 유의성 있게 감소하였다(도 2). 이에 반하여, MCF7, MCF10a와 같은 다른 세포에 siEll3을 형질감염시켰을 때에는 세포 증식에 영향을 미치지 않았으며(도 3), 이는 세포 증식에 대한 ELL3 발현 수준의 영향은 줄기세포에 특이적임을 보여준다. 또한, 이는 성체줄기세포 증식에 대한 Ell3의 특이적인 기능은 세포주기 분석에 의해서도 확인되었다. 즉, Ell3 발현 억제는 ADSCs 및 BM-MSCs의 G0/G1 단계에서 세포 수(cell population)의 증가를 야기하였으나(도 4), Ell3 발현이 억제된 MCF7 및 MCF10a에서는 세포 주기의 변화가 관찰되지 않았다(도 5). 또한, JC-1 염색에 의한 미토콘드리아 막 포텐셜 분석을 통하여 미토콘드리아 활성에 미치는 Ell3 넉다운의 영향을 측정하였다. ADSCs 및 BM-MSCs에서 Ell3의 발현 억제에 의하여 미토콘드리아 막 포텐셜은 유의성 있게 감소한 반면, MCF7 및 MCF10a의 미토콘드리아 활성은 Ell3 발현 억제에 의해 변화되지 않았다(도 6).
siEll3 형질감염에 따른 상기 세포 증식율, 세포 주기 패턴 및 미토콘드리아 막 포텐셜의 변화가 성체줄기세포의 노화에 의한 것인지 확인하기 위하여 β-gal 염색을 수행하였으며, siEll3로 형질감염된 ADSCs 및 BM-MSCs는 노화 세포의 수준이 유의성 있게 증가되었다(도 7). 이에 반하여 siEll3로 형질감염된 MCF7 및 MCF10a에서는 β-gal (+) 세포의 수는 증가되지 않았다(데이터 미기재). 또한, siEll3로 형질감염된 ADSCs 및 BM-MSCs의 siEll3로 형질감염된 ADSCs 및 BM-MSCs의 노화와 관련된 유전자, 즉 Bcl-2, p21, 및 p16의 발현을 qRT-PCR을 통하여 분석하였을 때, ADSCs 및 BM-MSCs 모두에서 Bcl-2, p21, 및 p16의 발현이 유의성 있게 증가하였다(도 8)
따라서, 상기 결과들로부터, Ell3 발현 수준은 성체줄기세포의 노화와 관련되며, Ell3의 넉다운은 성체줄기세포의 노화를 촉진한다.
(2)
Ell3은
골 분화(
osteogenic
differentiation) 및 지방세포 분화(adipogenic differentiation)를 조절한다.
2차원 및 3차원 분화 조건 모두에서, Ell3 발현이 억제된 ADSCs는 노화된 성체줄기세포의 전형적인 분화 패턴 즉, 지방생성(adipogenesis)의 증가 및 골생성(osteogenesis)의 감소를 나타내었다(도 9). 지방생성 마커 유전자인 PPAR-γ 및 골생성 마커 유전자인 파이브로넥틴(Fibronectin)의 발현을 분석한 결과, Ell3 발현이 억제된 ADSCs는 지방분화-골분화의 균형을 지방분화 쪽으로 이동시켰다(도 10).
Bcl-2는 노화 세포에서 높게 축적되는 항-세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)이며, p53 단백질은 Bcl-2 활성을 억제하도록 기능하는 것으로 알려져 있다. Ell3 발현을 억제시켰을 때, RNA 및 단백질 수준 모두에서 Bcl-2 발현은 유의성 있게 증가하였으며(도 11의 A), p53 단백질은 고갈되었다(도 11의 B). 또한, Ell3 발현을 억제시킨 ADSCs를, Bcl-2 양성 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 약물인 ABT-737로 처리하였을 때, PPAR-γ의 발현이 유의성 있게 감소하고, Runx2의 발현은 유의성 있게 증가하였다(도 12). 이는 Ell3 발현을 억제시킨 ADSCs를 Bcl-2 양성 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 약물로 처리할 경우 지방분화-골분화의 균형을 회복시킨다는 것을 나타낸다.
따라서, 상기 결과들로부터, Ell3 발현은 노화와 관련되며, 성체줄기세포의 지방분화-골분화의 균형에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> A method for inhibiting senescence of adult step cells through
overexpression of the Ell3 gene and a method for facilitating
differentiation through regulating expression of the Ell3 gene
<130> PN0854
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 2127
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gggttgcagg ttcagctttc acttagagac agcaactcca aattcagggt cgctggggaa 60
actaaggcag gactggggac tctgagtgag aggtcagacg ctggtcgcgg actctttctc 120
ccgagaactg gggatagctc ttccgatagc ccaaagcgat tcatgcggat cctagaagaa 180
agcgccgagg tccgggcggt tggccgggga gagcgaagcg ccgcccacgc ggctgggaaa 240
gcttggggtg gcgctggcgg gaggtggggc cgggggcggg ttcctggcgg agggtggggc 300
agacgtgggt taccgggtgt gccaaccaaa ccctgaacag aggaggtggc ggtggtggcc 360
ctcgcctgtg gcccccgtgc tgcttgcact cgaactcgtc gccatggagg agctccagga 420
gcctctgaga ggacagctcc ggctctgctt cacgcaagct gcccggacta gcctcttact 480
gctcaggctc aacgacgctg ccctgcgggc gctgcaagag tgtcagcggc aacaggtacg 540
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ctgcctcttc tccttcatag tgtcccagtg ttgtcaggag ggcgctggtg gtagcttgga 660
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tccactggca agcaaccaag gacagtcact cccaggatcc tcaagggagc acatggcaca 960
gtgggaagtg agaagccaga cccatgttcc aaacagagaa cctgttcagg cactgccttc 1020
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catcctggag tttgaggaaa agaacagggg cagctgaagt tatcaaggga atttttgagc 1620
ctctgcttag tgaaacacaa aggaacaaag cagctataaa ctaaatagaa tgcaactatc 1680
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ttgaggtttg gttttcatta ttaattttta gggtatgggc actgtgcaaa gactccatag 1800
ctgtgcctag gagtctagga aaagtgacag aggcttggct tttttacctt tagttcagcc 1860
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gacaaaccaa actaagtgaa ttttagcctg gtagcctctc taaggaaaca gtaataataa 1980
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Claims (9)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- (p) 성체줄기세포에서 서열번호 1의 유전자의 발현을 억제하는 단계 및 (q) 단계(p)에서 얻어진 성체줄기세포를 지방세포 분화용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 지방세포로의 분화를 촉진하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 성체줄기세포가 지방세포-유래의 성체줄기세포 또는 골수-유래의 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 발현의 억제가 서열번호 1의 유전자를 표적으로 하는 siRNA로 성체줄기세포를 형질감염시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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Cell., vol.152(1-2): pp.144-156(2013)* |
Dev. Reprod. Vol. 21, No. 3, 335~342(2017)* |
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