TWI637742B - 用於治療骨質疏鬆之醫藥組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種式I化合物用於製備治療骨質疏鬆之醫藥組合物的用途,其中該醫藥組合物包含該式I化合物或其醫藥上可接受之鹽類。
Description
本發明係關於一種式I化合物用於製備治療骨質疏鬆之醫藥組合物的用途。
骨不僅讓我們有運動功能,並協助血球的生成、儲存礦物質、幫助調節體內的pH值。骨鈣素(osteocalcin),是成骨細胞(osteoblast)複合結構的一種蛋白質,有助於成骨細胞鈣化成骨,是一個骨質增生的標誌。重塑和再吸收的平衡也會藉由荷爾蒙(hormones)調節。骨的重塑作用是一種骨更新進行啟動,以維持骨骼強度和礦物質的動態平衡。重塑的過程由蝕骨細胞(osteoclast)與成骨細胞主導舊骨再吸收並形成新骨,防止骨質微損傷的累加。骨重塑頻率增加在更年期和提早停經的婦女,因為骨重塑頻率增加,造成緩慢的老化,但老化的速率還是比一般人來的快。蝕骨細胞來自造血幹細胞和間質幹細胞,主要負責骨的再吸收,而成骨細胞負責骨的合成與礦化。這兩種細胞一起協助人體持續提供鈣、鎂、磷,這些材料是形成健康骨骼的關鍵。正常的老化過程和更年期相關荷爾蒙雌激素的流失,增加婦女罹患骨質疏鬆症的風險。然而,當雌激素缺乏時,整個調節程序會被中斷,結果會使成骨細胞生產減少,蝕骨細胞增多的情形,造成骨再吸收異常增加。雌激素的流失在5-8年會加速間骨質密度流失。除了雌激素
的流失之外,還有其他多種因素,仍然增加婦女骨質疏鬆症的風險。其中不可修改因素包括:年齡、性別、種族、具家族史的骨質疏鬆症、先前受傷造成骨折等等。骨質弱化的結果造成增加骨折的風險,骨折最常見的部位好發於髖關節、脊椎以及手腕。
骨源細胞(osteoprogenitor cells)維持成骨細胞的產生,使其合成新的骨基質(bone matrix)骨成形表面上,骨細胞(osteocytes)在骨基質內部,支撐骨的結構,並覆蓋靜態骨的表面上形成保護作用。成骨細胞譜系會響應不同種類的荷爾蒙激素,作用機制或細胞激素的訊號做調控。成骨細胞通常受副甲狀腺素(Parathyroid hormone,PTH)、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、三碘甲狀腺胺酸(Triiodothyronine,T3)、四碘甲狀腺胺酸(Thyroxine,T4)、轉化生長因子-β(TGF-β)與1,25-二羥化維生素D(1,25(OH)2D3)的刺激和糖皮質激素的調控,在不同的情況下會有不同的反應。在原發性副甲狀腺亢進的例子中,儘管成骨細胞具有性荷爾蒙的受體並發現性類固醇可能刺激體外成骨細胞攜帶轉化生長因子-β和膠原蛋白,但是沒有直接的証實它如何作用於人體內。
此外,成骨細胞它們自己可以合成和分泌一些生長因子,像是血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、類胰島素生長因子(Insulin-like growth factors,IGFs)、轉化生長因子-β、內皮素-1(endothelin-1)等等。它們也可以自泌影響細胞本身。血管週邊細胞(blood vessel pericytes)再分化過程正確下,可以發育為成骨細胞表現型。間質幹細胞轉變成成骨細胞譜系需要典型的Wnt/β-catenin路徑和相關的蛋白。在軟骨形成、血球細胞的生成以及可能刺激或抑制在成骨細胞分化的不同時
期,Wnt訊號系統都扮演一個重要的調控角色。成骨細胞前驅形態,從紡骨源錘梭狀變成大立方形分化成成骨細胞。成骨細胞的功能在骨重塑的位置上,通常可以檢測出鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)的表現。成熟活化的成骨細胞,合成骨基質具有較大的細胞核,擴大高基氏體的結構和大量的內質網。也會分泌骨鈣素(BGP),大量的第一型膠原蛋白(約90%)和其他基質蛋白,例如:骨結合素(osteonectin)和骨橋蛋白(osteopontin)。
蝕骨細胞是目前已知唯一可以執行骨再吸收功能的細胞。活化多核的蝕骨細胞源自於單核球細胞/巨噬細胞的單核前驅細胞,這些細胞在許多組織鑑定後,其中骨髓內的單核球細胞/巨噬細胞的單核前驅細胞比較容易生成蝕骨細胞。許多生長因子和細胞激素涉及發炎反應和風濕性疾病也已經證實影響蝕骨細胞的分化與功能,或者直接作用在蝕骨細胞的細胞譜系,或間接作用在其他類型細胞,關鍵性調節表現蝕骨細胞因子,細胞核轉錄因子κ B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand,RANKL)或抑制蝕骨細胞的骨保護素(osteoprotegerin,OPG)。細胞核轉錄因子κ B受體活化因子配體和巨噬細胞聚落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)這兩個細胞激素是蝕骨細胞形成的主要因子。蝕骨細胞直徑約20-50mm,並含有1-5個核,當活性被副甲狀腺素(parathyroid hormone,PTH)刺激增強時,細胞核數量更多達20個。當蝕骨細胞啟動溶骨機制時,它會形成異常邊緣皺摺和內部是質子泵浦(proton pump),將H+釋放到細胞外,使外部環境呈現酸性並製造酵素(酸性磷酸酶(acid phosphatase)、蛋白分解酶(proteases)和溶酶體酵素(lysosomal enzymes))。蝕骨細胞的成熟藉由IL-1、IL-6、TGF-α、TNF、淋巴毒素
(lymphotoxin)、副甲狀腺素和副甲狀腺素相關蛋白(Parathyroid hormone-related protein,PTH-rP)的刺激。因此,一些良性或惡性的疾病可能分泌上述的物質,增強溶骨使骨質流失造成骨質疏鬆症。
腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和腫瘤壞死因子受器(tumor necrosis factor receptor,TNFR)家族蛋白扮演很重要的角色,它們控制細胞的死亡、增生、自體免疫、免疫細胞的功能或淋巴器官的形成。近來,這個大家族的新成員已被確定在免疫具關鍵功能並耦合淋巴細胞和其他系統器官,例如:骨重塑和懷孕時乳腺的形成。骨的重塑同時也造成蝕骨細胞進行骨的再吸收與成骨細胞的新骨形成。骨重塑的調節進行透過多種機制,最終匯聚在蝕骨細胞之間的交互作用或它們的前驅細胞與成骨細胞的和骨髓幹細胞之間的交互作用。成骨細胞和蝕骨細胞源自不同的細胞譜系和成熟過程,也就是說成骨細胞源自間質幹細胞,而蝕骨細胞分化自造血單核球細胞/巨噬前驅細胞。
腫瘤壞死因子家族分子-細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體(也稱為OPGL、TRANCE、ODF和TNFSF11)和它的受體-細胞核轉錄因子κB受體活化因子(RANK)都是骨吸收活化的關鍵,亦是調節蝕骨細胞活化和發育所必須。細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨前驅細胞的分化並刺激再吸收的功能和成熟蝕骨細胞的存活。腫瘤壞死因子接受器相關因子(TNF receptor-associated factors,TRAFs)配體蛋白(TRAFs adaptor proteins)在細胞核轉錄因子κB受體活化因子訊息傳導路徑剛開始的時候扮演一個重要的角色。其中腫瘤壞死因子接受器相關因子蛋白在蝕骨細胞之細胞核轉錄因子κB受體活化因子傳遞訊息最為主要,此蛋白可以發送細胞
核轉錄因子κB受體活化因子訊息到下游目標,這些目標包括:細胞核轉錄因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和c-JUN N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)。細胞核轉錄因子κB被保留在細胞質中,在非刺激細胞中當作一個抑制I-κB(inhibitor of kappa light chain gene enhancer in B-Cells)複合物蛋白。刺激細胞核轉錄因子κB活化會誘導I-κB激酶(IKKs)活化,造成磷酸化,隨後蛋白酶體調節I-κB降解。細胞核轉錄因子κB釋出然後進入細胞核與DNA目標位置結合。細胞核轉錄因子κB受體活化因子刺激在分化蝕骨細胞或蝕骨前驅細胞包括磷酸化、I-κB-α的降解、核轉位、細胞核轉錄因子κB蛋白p50、p52和p62與DNA結合。其他細胞內之配體蛋白會與腫瘤壞死因子接受器相關因子蛋白進行交互作用並調控腫瘤壞死因子接受器相關因子在蝕骨細胞的TAK1(TGF-beta activated kinase)和NIK(NF-κB-Inducing Kinase)的功能。XIAP(Xenopus Inhibitor of Apoptosis)和cIAP(Cellular Inhibitors of Apoptosis)是細胞核轉錄因子κB是蝕骨細胞生存路徑的下游標的。所有三個成員MAPK(mitogen activated protein kinase)家族、ERK(extracellular signal regulated kinase),蝕骨細胞或蝕骨前驅細胞由細胞核轉錄因子κB受體活化因子來活化JNK和p38。JNK1對於蝕骨細胞分化影響很重要。JNK上游標的包括MKK7(mitogen-activated protein kinase kinase 7)。負顯性MKK6(mitogen-activated protein kinase kinase 6)調控p38活性並蝕骨細胞化。Raf涉及ERK訊息傳導參與CD40的活化,CD40是一個腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptors,TNFR)家族受體,它與細胞核轉錄因子κB受體活化因子訊息特質相似。腫瘤壞死因子接受器相關因子配體6(TRAF6)的下游細胞核轉錄因子κB受體活化因子訊息路徑TAK1/TAK2活化會誘導
JNK和p38活化。ERK和JNK誘導下游標的轉錄因子AP-1(activating protein-1),它是由c-Fos和c-Jun雙體蛋白組成。ERK誘導並活化c-Fos和NFAT(nuclear factor of activated T-Cells)藉由磷酸化Elk1屬於TFC(ternary complex factor)的一部分,同時JNK增加AP-1轉錄活性經由c-Jun磷酸化。
Src在蝕骨細胞當作細胞核轉錄因子κB受體活化因子在PI3K(phosphatidylinositol-3 kinase)/Akt1訊息的一個調節者。Src許多下游分子中,蛋白質酪胺酸激脢-2(protein tyrosine kinase-2,PYK2)和c-Cbl涉及蝕骨細胞吸附訊息和骨再吸收功能。此外,肌動結合溶膠蛋白(actin-binding protein gelsolin)和PI3K之間的關聯使蝕骨細胞形成重要的肌動蛋白絲(actin filament formation)。Src和PI3K功能在於細胞核轉錄因子κB受體活化因子和吸附訊息融合,傳遞正確訊號到肌動蛋白和細胞骨架組織,有利於蝕骨細胞活化再吸收功能。
蝕骨細胞的活性增加常見於許多骨質減少的疾病,包括:停經後骨質疏鬆症(postmenopausal osteoporosis)、佩吉特氏病(Paget's Disease)、溶骨形轉移癌(lytic bone metastases)或類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA),導致骨再吸收增加和嚴重的骨損害。細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體功能透過自然的誘導受體(natural decoy receptor)護骨素的抑制,防止停經後骨質疏鬆和癌症的轉移,同時對於骨質疏鬆、嚴重的關節炎、骨質流失、骨癌轉移具有良好的治療效果。
骨質疏鬆症常發生於許多中老年人及停經期後的婦女,目前台灣有超過500萬人有潛在的骨質疏鬆,於2020年甚至會達到750萬人,而骨質疏鬆往往容易導致骨折,病患的治療及照護耗費龐大的醫療社會成
本。目前骨質疏鬆治療藥物常有副作用,或效果不佳,或價格高昂,故本技術領域之人欲尋找一種能治療骨質疏鬆、副作用小且價格能壓低的化合物。
骨的重塑是一種短暫的調節過程,造成骨骼組織同時間的再吸收與形成。這個過程大多由蝕骨細胞與成骨細胞構成進行。
當蝕骨細胞進行骨再吸收完成,開始進入重塑進行,此過程約3-5個星期,再吸收部位的表面吸引成骨細胞,多個單核成骨細胞填滿被吸收的部位形成新基質,成骨細胞後續將重塑骨基質和礦化,程序需3-5個月才會完成。
天然植物的某個特定部位,可能存在一些具有生物活性的重要化合物,例如:丹皮酚(paeonol)透過抑制ERK、p38、NF-κB信息路徑減少蝕骨細胞的分化;此外,吡咯奎寧(pyrroloquinoline quinine)和黃連鹼(coptisine)也具抑制蝕骨細胞的分化效果。這些化合物可以藉由抑制蝕骨細胞過度形成,防止骨質流失並有益於治療骨質疏鬆症。
1,25-二羥維生素D3(Vitamin 1,25(OH)2D3)、雌激素(estrogens)、雄激素(androgens)、TGF-α、IGF I/II,已經證實它們可以在體外實驗促進骨細胞的分化。以及發現高鹼性磷酸酶活性和產生骨鈣素。
甜菊糖是天然的甜味劑,它存在於一種名為貝托尼甜葉菊(stevia rebaudiana bertoni)的葉子中,是一種無熱量的代糖,廣泛應用在許多國家的食品和飲料中。一般而言,天然的化合物常被當作製造有效果新藥物的分子模板。而異甜菊醇(isosteviol,ent-16-oxobeyeran-19-oic acid)是一
種ent-beyerane四環雙萜類,是甜菊糖(stevioside)經由酸水解獲得的化合物。過去文獻顯示,異甜菊醇的衍生化合物經過不同的化學修飾,展現多樣的生物活性,包括:抗高血壓、抗發炎反應、抗腹瀉、抗腫瘤、抑制細菌之活性和免疫調節功能。此外,異甜菊醇衍生物對艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus,EBV)早期抗原的活化呈現明顯的抑制效果。
式I化合物之化學式為:ent-16-oxobeyeran-19-N-methylureido分子量為346.51,是由一些異甜菊醇衍生物藉由Ureide基團取代第19碳上的COOH基團方法製備而成。最近有文獻結果顯示,以人類肝癌細胞為研究平台,式I化合物能有效防止B型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的表面抗原(HBs Ag)和B型肝炎病毒核心抗原(HBe Ag)的分泌,並抑制B型肝炎病毒複製基因的表現,同時也具有抑制宿主TLR2/NF-κB訊息路徑的功能。而蝕骨細胞的生成和活化藉由幾種不同關鍵的蛋白激酶訊息路徑;這些蛋白路徑分別是NF-κB kinase、JNK、p38、ERK。所以本發明研發出以天然物為基礎的骨質疏鬆藥物,發展本發明式I化合物成為低副作用的治療骨質疏鬆用藥。
是以本發明提供一種式I化合物用於製備治療骨質疏鬆之醫藥組合物的用途,其中該醫藥組合物包含該式I化合物或其醫藥上可接受之鹽類,該式I化合物之化學結構如下:
依據本發明,在一較佳實施例中,該醫藥組合物治療骨質疏鬆係透過抑制蝕骨細胞之分化;於另一較佳實施例中,該醫藥組合物治療骨質疏鬆係透過抑制蝕骨細胞之蝕骨能力。
依據本發明,在一較佳實施例中,該式I化合物之劑量為1mg/kg-400mg/kg;在另一較佳實施例中,該式I化合物之劑量為1mg/kg-80mg/kg;在一更佳實施例中,該式I化合物之劑量為1mg/kg-25mg/kg,且該醫藥組合物為口服劑型。人類與各種動物用藥劑量之計算可參照http://www.taiwanbio.com.tw/property_detail.php?sno_property=62,因此此處所述之劑量可依照不同動物做相應調整。
圖1顯示式I化合物對於RAW 264.7細胞之細胞毒性測試。A為藉由MTT偵測法所得之細胞存活率試驗。RAW 264.7細胞培養在不同濃度的式I化合物,72小時後,在每一格加入MTT試劑,使用550nm吸光值偵測,並計算細胞存活率。其結果為三次實驗的平均值;利用Microsoft Office Excel計算平均數值的±SD,同時藉由Student's t-test將數據的差異進行評估;*p<0.05,**p<0.005。B為藉由MTT偵測法所得之細胞存活率試驗。RAW 264.7細胞處理10μg/ml、20μg/ml式I化合物,培養反應3、6、9、12天後,在每一格加入MTT試劑,使用550nm吸光值偵測,並計算細胞存活率。其結果為三次實驗的平均值。
圖2顯示不同濃度式I化合物對於細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞之影響。A顯示RAW 264.7細胞,培養在24孔盤中,每一格含有
1X104細胞數量,100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體或與10μg/ml、20μg/ml式I化合物共同處理6天。抗酒石酸酸性磷酸酶染色後,使用400 X顯微鏡觀察。B顯示抗酒石酸酸性磷酸酶染色陽性多核細胞包含三個細胞核或多核,將被計數當作蝕骨細胞。其結果為三次實驗的平均值;利用Microsoft Office Excel計算平均數值的±SD,同時藉由Student's t-test將數據的差異進行評估;**p<0.005。
圖3顯示細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞處理10μg/ml式I化合物不同時間之影響。A顯示RAW 264.7細胞,培養在24孔盤中,每一格含有1X104細胞數量,100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體或與10μg/ml式I化合物共同處理2、4、6天。抗酒石酸酸性磷酸酶染色後,使用400 X顯微鏡觀察。B顯示抗酒石酸酸性磷酸酶染色陽性多核細胞包含三個細胞核或多核,將被計數當作蝕骨細胞。其結果為三次實驗的平均值;利用Microsoft Office Excel計算平均數值的±SD,同時藉由Student's t-test將數據的差異進行評估;*p<0.05,**p<0.005。
圖4顯示式I化合物影響細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞MAPK蛋白的活化。A顯示RAW 264.7細胞經100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體或與10μg/ml式I化合物共同處理,於不同時間點收取蛋白,並使用西方墨點法偵測MAPK路徑中的ERK、p38、JNK蛋白分子表現。B顯示西方墨點法偵測MAPK路徑中的ERK、p38、JNK蛋白分子表現,Image J進行量化,其結果為三次實驗的平均值;利用Microsoft Office Excel計算平均數值的±SD,同時藉由Student's t-test將數據的差異進行評估;**p<0.005。
圖5顯示式I化合物影響細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞
MAPK下游蛋白及NF-κB的活化。A顯示RAW 264.7細胞經100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體或與10μg/ml式I化合物共同處理24、48小時,反應後收取蛋白,並使用西方墨點法偵測MAPK路徑中下游的NFATc2和c-Fos及NF-κB蛋白分子表現。B顯示西方墨點法偵測MAPK路徑中下游蛋白分子NFATc2和c-Fos及NF-κB蛋白表現,Image J進行量化,其結果為三次實驗的平均值;利用Microsoft Office Excel計算平均數值的±SD,同時藉由Student's t-test將數據的差異進行評估;**p<0.005。
圖6顯示式I化合物影響細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞的溶蝕骨能力。A顯示RAW 264.7細胞經細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體100ng/ml或與式I化合物10μg/ml共同處理,培養在類骨骼表面合成材質(corning osteo assay surface)培養盤,培養12天後,以40 X顯微鏡觀察。B顯示式I化合物抑制蝕骨細胞的骨吸收活性;其結果為三次實驗的平均值;利用Microsoft Office Excel計算平均數值的±SD,同時藉由Student's t-test將數據的差異進行評估;**p<0.005。骨吸收的範圍,利用Image J進行量化。
圖7顯示各種處理對於老鼠體重之影響,A為老鼠體重,B為老鼠相對體重。
圖8顯示各種處理對於老鼠腰椎與脛骨骨密度之影響,A為老鼠下腰椎(第3至第5腰椎)之相對骨質密度,B為老鼠脛骨之相對骨質密度。
圖9顯示各種處理對於老鼠肝腎毒性之影響,A為各種處理對於老鼠丙胺酸轉胺酶之影響;B為各種處理對於老鼠血尿素氮之影響;C為各種處理對於老鼠血漿肌酸酐之影響。
本發明之實施例將詳細說明如下,請同時參考圖式及詳細說
明。下列實施例之目的非為限制本發明,而僅做為本發明之數種態樣及特徵的代表。
式I化合物製備方法可參見Phytochemistry 2014,99:p.107-114,其結構如下:
細胞培養
本發明使用RAW 264.7小鼠單核球細胞/巨噬細胞株當作蝕骨細胞分化系統實驗模型。RAW 264.7細胞分化成蝕骨類細胞在含有細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體環境下。RAW 264.7來自一隻埃布爾森鼠白血病病毒所誘導的腫瘤取得,從美國物種培養保存中心購得(ATCC;Rockville,MD)。蝕骨細胞的培養,使用RAW 264.7細胞,培養在24孔盤中,每一孔細胞量為1X104cell/ml並培養在含有100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體或與不同濃度的式I化合物一起處理。
細胞毒性試驗
MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)在不含酚紅的培養液中溶解後呈黃色。活細胞粒線體中琥珀酸脫氫酶能將MTT黃色溶液還原為紫色的不可溶性甲瓚(formazan)結晶,沉積於細胞中,生成藍色的甲瓚結晶。甲瓚結晶的生成量與活細胞數目成正比(死細胞中琥珀酸脫氫酶降解,無法將MTT還原)。酸性異丙醇或二甲基亞碸(DMSO)可溶解甲瓚
結晶,使用酵素免疫吸附分析偵測儀測定光吸收值,因此,MTT可用作細胞存活率的指標。
研究式I化合物對RAW 264.7細胞毒性試驗,藉由MTT比色法偵測。首先將RAW 264.7細胞培養在24孔盤中,每一孔細胞量為2X104cell/ml,培養液中含有0、1、5、10、20、40、80μg/ml濃度式I化合物處理3天後去培養液,確立後續實驗適用濃度。其次為了確立式I化合物在我們設計的實驗天數不產生毒性,將RAW 264.7細胞培養在24孔盤中,每一孔細胞量為2X103cell/ml,選用0、10、20μg/ml濃度式I化合物分別處理3、6、9、12天,每三天換一次條件相同的培養液。反應結束製備MTT的培養液以十倍稀釋方式,即1ml培養液含有0.1ml 5mg/ml的MTT加上0.9ml不含FBS的DMEM培養液。之後培養在培養箱37℃,4小時,以上述等量細胞培養液體積加入二甲基亞碸,溶解MTT甲瓚(Formazan),各取100μl到96孔盤,並使用酵素免疫吸附分析偵測儀去偵測570nm吸光值。細胞存活率(%)使用下面公式計算:(細胞經藥物處理後之吸光值/細胞經一般培養液處理後之吸光值)X 100%。
首先我們想要了解式I化合物是否對RAW 264.7細胞具有毒性,並從中挑選適合後續實驗的濃度。式I化合物在含有0、1、5、10、20、40、80μg/ml濃度處理72小時後,使用MTT比色法偵測。結果顯示,式I化合物濃度大約在40μg/ml出現IC50。式I化合物處理濃度高於40μg/ml具細胞毒性,RAW 264.7細胞存活率隨之下降(圖1A),於是我們將選用40μg/ml以下的濃度,進行後面的實驗。為了確立我們挑選的10μg/ml、20μg/ml式I化合物濃度用於後續實驗處理不產生細胞毒性,式I化合物分別處理3、6、9、
12天,每三天換一次條件相同的培養液使用MTT比色法偵測。數據顯示,在3、6、9、12天處理式I化合物10μg/ml濃度,隨著天數增加,不產生細胞毒性,因此後續實驗選用此濃度(圖1B)。
蝕骨細胞分化實驗
為了模擬骨的生理機能,我們模擬體內環境並加入一些必須的賀爾蒙進行分化。模擬成骨細胞荷爾蒙環境到蝕骨細胞的分化。單核的蝕骨細胞透過膜融合變成多核蝕骨細胞,並活化蝕骨細胞邊緣變成皺摺狀蝕骨細胞成熟的時間約6天,可分為兩個階段,前面四天是蝕骨前驅細胞的增殖期,後面兩天是蝕骨細胞的分化期。每個階段需要不同的細胞激素或營養物質刺激,例如:增值需要巨噬細胞聚落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF),分化時需要巨噬細胞聚落刺激因子和細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體。此外,不同的蝕骨細胞分化階段表現出特殊的生物化學,像是抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)、降鈣素受器(calcitonin receptors,CTR)等等。藉由抗酒石酸酸性磷酸酶染色評估蝕骨細胞分化的指標。抗酒石酸酸性磷酸酶在蝕骨細胞的邊緣皺摺,當骨在吸收時抗酒石酸酸性磷酸酶會從細胞釋放出來。因此,偵測抗酒石酸酸性磷酸酶的活性表示蝕骨細胞的分化。
酸性磷酸酶(acid phosphatase)在體外pH=4~6可以催化水解磷酸單酯磷酸。利用這個方法加入一個單酯磷酸受質Naphthol AS-BI phosphate,酸性磷酸酶會水解磷酸;殘餘的Naphthol AS-BI與重氮物質和Fast garnet GBC salt形成不溶性棗紅色沉著色素。蝕骨細胞酸性磷酸酶活化位,可以染上棗紅色,對蝕骨細胞具特異性。
觀察式I化合物對蝕骨細胞分化的影響,將RAW 264.7細胞培養在24孔盤中,每一孔細胞量為1X104cell/ml,培養液中含有100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體(for RAW 264.7,Peprotech)或共同處理10、20μg/ml濃度的式I化合物。處理6-7天後進行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。此外,培養液中含有100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體(for RAW 264.7,Peprotech)或共同處理10μg/ml濃度的式I化合物,分別處理2、4、6天後進行抗酒石酸酸性磷酸酶染色,觀察蝕骨細胞分化的情形。
蝕骨細胞形成的偵測藉由量化細胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色陽性率(acid phosphatase kit 387-A,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。將樣本使用固定液固定,使用naphthol AS-BI phosphate染色套組,樣本與染劑反應37℃,1小時,接者使用蘇木紫復染。控制組細胞可能染成陽性紅色,因此,抗酒石酸酸性磷酸酶陽性多核細胞伴隨三或多個細胞核,就可以判定為蝕骨細胞並計數於倒立式相位差顯微鏡下。多核抗酒石酸酸性磷酸酶陽性蝕骨細胞計數方法為一視野下100個RAW 264.7細胞計算多核蝕骨細胞形成個數。蝕骨細胞的形態進一步拍照觀察。
了解式I化合物對RAW 264.7細胞毒性濃度後,我們使用細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體100ng/ml做為蝕骨細胞分化誘導物質,做為正對照組。另外,分別以10、20μg/ml式I化合物濃度一起與細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體共同處理反應6天後,觀察式I化合物對細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞分化的影響;而選用20μg/ml式I化合物是預防選預期濃度(10μg/ml式I化合物)不對蝕骨細胞分化具有影響,因此選用20μg/ml式I化合物一起觀察。使用特殊染色抗酒石酸酸
性磷酸酶染色,以顯微鏡400 X觀察並計數,其結果如圖2A、B。結果顯示,100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體與10μg/ml式I化合物濃度共同處理,會造成細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞分化數量減少。
我們選用100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體與10μg/ml式I化合物分別處理2、4、6天,確立此濃度之式I化合物對於減少細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞分化影響變化。使用特殊染色抗酒石酸酸性磷酸酶染色,以顯微鏡400 X觀察並計數。結果顯示,式I化合物在10μg/ml的濃度下,隨者時間的增加,對於細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導的蝕骨細胞分化具有顯著並抑制的效果(圖3A、B)。藉由這個結果,我們後續的實驗皆使用細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體100ng/ml與10μg/ml式I化合物共同處理做為實驗組。
式I化合物影響細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞分化之路徑與情形利用西方墨點法了解,細胞的轉變透過階段性的控制,細胞的蛋白訊息路徑常啟動不同的蛋白,造成細胞不同的反應。在過去的科學文獻發現MAPKs三種蛋白,ERK(extracellular signal regulated kinase)、p38和JNK已經被證實可以調節蝕骨細胞的分化。此外,本發明也將探討MAPKs下游蛋白c-Fos和NFATc2,以及觀察NF-κB的表現情形。因此,我們想了解,使用式I化合物後,是否會導致上述蝕骨細胞相關蛋白活化或抑制,並影響蝕骨細胞分化訊息路徑運作。
研究式I化合物影響細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘
導蝕骨細胞MAPKs路徑的蛋白表現,使用西方墨點法來進行實驗;將RAW 264.7細胞在冰冷的PBS沖洗,加入細胞溶解緩衝液,緩衝液成份包含:10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)、1.5mM MgCl2、0.5mM dithiothreitol(DTT)、0.5μg/ml leupeptin和6.4% Nonidet P-40並在冰上反應15分鐘。使用刮勺將細胞刮起來,收集至1.5ml離心管,使用震盪器將細胞充分打碎;使用12,000rpm,4℃離心10分鐘;取上清液至新的1.5ml離心管;與1X sodiumdodecyl sulfate(SDS)sample buffer一起煮沸,然後使用10~12% SDS-PAGE進行電泳。蛋白的分子量大小藉由SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate/polyacrylamide gel)電泳分離;隨後轉漬至PVDF(polyvinylidene difluoride membrane)膜上。之後轉漬膜使用5%脫脂牛奶粉在Tris-buffered saline含0.5% Tween-20(TBST)阻斷(block)1小時,之後與primary rabbit:anti-phospho-ERK Ab、anti-phospho-JNK Ab、anti-phospho-p38 Ab、anti-c-fos Ab、anti-NFATc2 Ab(1:500,Cell Signaling)、anti-ERK Ab、anti-JNK Ab、anti-p38 Ab(1:1000,Cell Signaling)、anti-NF-κB p65 Ab(1:1000,Cell Signaling)、anti-βactin Ab(1:10000,Cell Signaling)在搖動平台上50-60rpm,4℃,反應24小時。之後用TBST沖洗15分鐘三次,轉印膜與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)接合anti- rabbit antibody(Santa Cruz Biotechnology)(稀釋1:2000)在室溫反應一個小時。轉印膜再一次沖洗並將膜上佈滿化學冷光試劑ECL與感光底片於暗房反應適當時間後,底片與顯影劑反應。抗體結合的蛋白經底片感光後呈現帶狀,利用帶狀密度進行量化。
根據先前文獻提到,RAW 264.7細胞分化成蝕骨細胞,大多由細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導,經MAPK路徑或NF-κB路徑等
等完成蝕骨細胞的分化。MAPK家族包括:ERK、p38、JNK為最主要蝕骨細胞分化的關鍵分子。MAPK的下游分子:c-Fos和NFATc2也參與蝕骨細胞的分化。此外,我們藉由NF-κB p65的蛋白表現探討NF-κB活性。
將RAW 264.7細胞處理100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體或與10μg/ml式I化合物共同處理,觀察式I化合物是否抑制MAPK家族蛋白與NF-κB活性,影響蝕骨細胞分化減少的情形。細胞分別處理0、5、15、30、45、60分鐘後,收取蛋白進行西方墨點法,分析蛋白分子表現情形。
從實驗結果顯示,我們可以發現ERK、p38、JNK(圖4A、B),當細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體共同處理式I化合物,減少ERK、p38、JNK磷酸化蛋白分子的表現。
研究式I化合物影響蝕骨細胞MAPK家族下游蛋白與NF-κB蛋白活性的改變。根據文獻Bone 2011,48:1336-1345所選用的條件,將RAW 264.7細胞處理100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體或與10μg/ml式I化合物共同處理24小時、48小時,收取蛋白進行西方墨點法,分析MAPK家族下游c-Fos和NFATc2以及NF-κB p65蛋白分子表現情形。ERK、p38、JNK所調控下游蛋白c-Fos和NFATc2,也在細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體共同處理式I化合物48小時,蛋白表現因為抑制而明顯減少的情形(圖5A、B)。此外,式I化合物會影響NF-κB蛋白減少的表現。在細胞核轉錄因子KB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞分化平台NF-κB p65受到式I化合物影響,在48小時蛋白減少表現(圖5A、B)。根據上述蛋白表現的結果,式I化合物透過抑制MAPK家族蛋白或NF-κB路徑,使細胞核轉錄因子κB受體活化因子配
體誘導成熟蝕骨細胞減少。
式I化合物影響細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體誘導蝕骨細胞的溶蝕骨能力蝕骨細胞是一種多核細胞,它分化自巨噬細胞聚落刺激因子和細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體的刺激,分化之後蝕骨細胞邊緣皺摺形成一個再吸收的凹溝,在細胞膜和礦化骨表面。在這個空間中,蝕骨細胞分泌一些酵素和酸。這些酸會活化酵素啟動骨礦物基質溶蝕。在本發明中,我們購買類骨骼表面合成材質(corning osteo assay surface)培養盤,將細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體或與式I化合物共同處理RAW 264.7細胞12天後,培養過程中每3天更換一次相同條件之培養液,觀察蝕骨細胞的分化與凹溝的形成。
為了確認式I化合物分化蝕骨細胞的骨吸收能力影響,我們將RAW 264.7培養在含有人造骨材質的24孔盤(osteo assay plate,24well;corning incorporated)中,每一孔細胞量為2X103cell/ml。培養液中含有100ng/ml細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體(for RAW 264.7;Peprotech)或共同處理10μg/ml濃度的式I化合物。每三天換培養液(含有上述處理藥物),培養12天後,將每個孔用PBS沖洗,用5%次氯酸鈉反應5分鐘後,將孔盤內細胞去除。每孔的凹坑的數量在顯微鏡40 X下計數並進一步拍照觀察。
顯微鏡下,每一個亮點都是蝕骨細胞溶蝕人造骨材質的能力;在含有細胞核轉錄因子κB受體活化因子配體與式I化合物處理條件下,我們可以看到蝕骨細胞溶蝕骨能力被式I化合物抑制,人造骨材質的溶蝕面積大幅減少(圖6A、B)。這些結果顯示式I化合物不僅具減少蝕骨細胞的形
成也會有效抑制蝕骨細胞的溶蝕能力。
動物實驗
誘發骨質疏鬆動物模式與實驗方式:
1.購入6個月大的Sprague-Dawley(SD)雌大鼠。
2.將大鼠分為7組,其中第1組給予假性手術,而第2-7組則進行雙側卵巢摘除手術。
3.手術後第六天,第1、2組每天分別口服1mL/kg之空白試劑(Vehicle);第3、4組每周分別注射唑來磷酸(Zoledronic Acid)與保骼麗(Prolia);與第5-7組每三天分別口服1、3、10mg/kg之式I化合物。
4.每一周測量體重與骨密度,並抽取血液至第118天。
5.將老鼠犧牲,提取腎臟、肝臟、大鼠脛骨。
6.將資料進行統整處理。
實驗分組如表1
空白試劑為乙醇:PEG 400:生理食鹽水=10:20:70(v/v/v)
實驗結果如圖7-9所示。圖7顯示各種處理對於老鼠體重之影響,A為老鼠體重,B為老鼠相對體重;圖8顯示各種處理對於老鼠腰椎與脛骨骨密度之影響,A為老鼠下腰椎(第3至第5腰椎)之相對骨質密度,B為脛骨之相對骨質密度,結果顯示式I化合物能增加10%脛骨骨密度(與實驗組相比);圖9顯示各種處理對於老鼠肝腎毒性之影響,A為各種處理對於老鼠丙胺酸轉胺酶之影響;B為各種處理對於老鼠血尿素氮之影響;C為各種處理對於老鼠血漿肌酸酐之影響。
結果:在此試驗中,我們測試了不同劑量之式I化合物對於卵巢摘除老鼠之下腰椎與脛骨骨密度之醫療效果,而在卵巢摘除後的第19週,不同劑量之式I化合物皆能夠改善因卵巢摘除而造成的脛骨骨密度下降(圖8B)。動物實驗亦證實式I化合物不像市售藥物保骼麗或是唑來磷酸會顯著影響小鼠體重表現(保骼麗會增加體重,唑來磷酸會減少體重)(圖7),且式I化合物與其他市售藥物相比能降低其肝腎毒性(較保骼麗少肝毒性與較唑來磷酸少腎毒性)(圖9)。
雖然本發明以前述之實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可作些許之更動與潤飾,因此本發明之專利保護範圍須視本說明書所附之申請專利範圍所界定者為準。
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