CN110051677A - 一种栀子苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用 - Google Patents

一种栀子苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于化合药物领域，涉及一种栀子苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用。式I所示化合物或其药学上可接受的盐，或酯，或前药在制备缓解糖皮质激素副作用方面的药物中的用途。本发明化合物在减轻糖皮质激素类药物副作用方面的分子作用机制，对于开发新的药物具有重要的临床意义。

Description

一种栀子苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用
技术领域
本发明涉及一种天然化合物在缓解糖皮质激素副作用方面的应用。
背景技术
自1949年P.Hench、E.Kendal和T.Reichstein首次在Annals of the rheumaticdiseases杂志上报道了运用糖皮质激素类药物治疗风湿性关节炎以来，糖皮质激素类药物以其优良的抗炎活性及免疫抑制作用在临床上广泛运用于炎症、自身免疫性疾病及器官移植中。有报道表明，在美国约有1％的人口正在接受糖皮质激素的长期治疗，社区人群中进行口服糖皮质激素治疗的比例在0.5％-0.9％之间(其中65％为女性)，而该比例在≥50岁的女性人群中则高达2.7％；在涵盖了10个国家的女性骨质疏松症研究中，日常随访的60393名绝经期后女性中约有4.6％的女性正在接受糖皮质激素的治疗。目前临床上使用糖皮质激素治疗的主要原因包括炎症性、风湿性疾病(如风湿性关节炎，多肌痛)、呼吸系统疾病(哮喘症、慢性阻塞性肺病)等。尽管糖皮质激素类药物具有良好的药理活性且在临床上应用广泛，但其在长期应用后的副作用却不容小觑。
糖皮质激素类药物的副作用主要表现在以下几方面：(1)肥胖与库欣综合征；(2)抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴功能；(3)高血脂与高血糖；(4)对心血管系统的影响；(5) 对中枢神经系统的影响；(6)骨质疏松与骨坏死。此外，糖皮质激素能影响骨骼肌的分解代谢并最终导致肌病。而口服糖皮质激素治疗大约会增加患者发生上消化道出血或穿孔事件两倍的风险。因此，临床上应尽量避免口服糖皮质激素与阿司匹林等非甾体抗炎药同时使用。后囊下白内障也是一种在长期运用糖皮质激素治疗后的不良反应之一，这种疾病与糖尿病关系密切但并不与年龄相关；此外，皮质性白内障的发生也与糖皮质激素的使用有关。
Runx2是Runt相关转录因子2，属于Runt相关转录因子家族。Runx2能够上调Col1α1、OPN、BSP、OCN等多种骨基质蛋白基因的表达。研究者运用Runx2-/-小鼠研究Runx2在成骨分化中的作用，发现Runx2-/-小鼠丧失了有效分化出成骨细胞的能力，其骨膜内和软骨内骨化现象消失，结果表明Runx2缺失会抑制成骨细胞的成骨分化从而导致机体发生骨化障碍。Osteopontin(OPN)作为成骨细胞的表型之一，在骨基质的矿化和吸收中都发挥着重要作用。体外研究表明，OPN能诱导成骨细胞的分化并促进矿化组织的重建，是成骨细胞分化成熟的标志之一。Osterix(Osx)是另一种成骨细胞特异性转录因子，是一种经典的成骨细胞标记物，Osx可以促进前成骨细胞分化成成熟成骨细胞和骨细胞。Runx2可以通过与Runx2结合元件直接相互作用激活Osx启动子，Runx2是Osx的上游控制器。目前已有研究表明，超生理剂量的糖皮质激素能显著抑制Runx2基因与蛋白的表达，从而发挥抑制成骨分化的效应。
糖皮质激素所致的以快速骨量丢失为特征的糖皮质激素性骨质疏松(GIOP)是糖皮质激素类药物普遍存在的严重不良反应之一。糖皮质激素性骨质疏松作为仅次于女性绝经后骨质疏松和衰老性骨质疏松的第三大病理性骨量丢失疾病，其占骨质疏松发病总人数的比例高达20％。目前用于治疗GIOP的药物主要有双磷酸盐类(利塞膦酸盐，唑来膦酸等)、维生素D及钙剂、特里帕肽等。虽然上述药物在治疗GIOP方面确实有一定疗效，但依然存在着适用人群受限、给药频繁、耐药、治疗成本高昂、副作用较多等问题。因此，寻找治疗GIOP疗效更显著、副作用更小、来源更广泛、适用人群更广的药物是目前治疗GIOP研究的一个重要方向。
栀子是药食两用的传统中药，药用栀子是茜草科植物的干燥成熟果实。栀子中含有40 余种生理活性物质，有效成分为环烯醚萜类物质，而栀子苷是其活性最高的成分之一。栀子苷具有抗炎，抗氧化和抗肿瘤活性等多种药理作用。作为一种资源丰富且天然的无毒化学物，栀子苷具有极高的药用和食用价值及广泛的应用前景。本发明的发明人经过创造性劳动，发现了本发明化合物在减轻糖皮质激素类药物副作用方面的分子作用机制，对于开发新的药物具有重要的临床意义。
发明内容
在一方面，本发明涉及式I所示化合物在制备缓解糖皮质激素副作用方面的药物中的用途：
在一方面，本发明涉及缓解糖皮质激素副作用的治疗方法，所述方法包括向受试者施用有效量的式I所示化合物，或其药学上可接受的盐或酯，或其药学上可接受的前药。
根据前述任一方面，所述缓解糖皮质激素副作用通过调节Runx2表达实现，优选通过促进Runx2表达实现，尤其是在糖皮质激素存在下促进Runx2表达实现，例如通过促进Runx2 mRNA表达，或者促进Runx2的蛋白表达。
根据前述任一方面，所述缓解糖皮质激素副作用通过调节Osteopontin(OPN)蛋白表达实现，优选通过促进OPN蛋白表达实现，尤其是在糖皮质激素存在下促进OPN蛋白表达实现。
根据前述任一方面，所述缓解糖皮质激素副作用通过调节Osterix(Osx)蛋白表达实现，优选通过促进Osx蛋白表达实现，尤其是在糖皮质激素存在下促进Osx蛋白表达实现。
根据前述任一方面，所述缓解糖皮质激素副作用通过缓解糖皮质激素导致的ERK磷酸化抑制实现，优选通过升高ERK的磷酸化水平实现，尤其是在糖皮质激素存在下升高ERK 的磷酸化水平实现。
根据前述任一方面，糖皮质激素副作用选自：肥胖与库欣综合征、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能抑制、抑郁症、记忆缺失、高血脂、高血糖、心血管系统疾病、骨骼肌的分解代谢、骨质疏松、股骨头坏死、成骨分化抑制、消化道出血、皮质性白内障中的至少一种。
根据前述任一方面，糖皮质激素选自泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松。
在一方面，本发明涉及式I所示化合物在制备用于治疗地塞米松造成的Runx2表达抑制相关疾病的药物中的用途。
在一方面，本发明涉及式I所示化合物在制备用于治疗地塞米松造成的OPN表达抑制相关疾病的药物中的用途。
在一方面，本发明涉及式I所示化合物在制备用于治疗地塞米松造成的Osx表达抑制相关疾病的药物中的用途。
在一方面，本发明涉及式I所示化合物在制备用于治疗地塞米松造成的ERK磷酸化抑制相关疾病的药物中的用途。
根据前述任一方面，所述疾病选自肥胖与库欣综合征、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能抑制、抑郁症、记忆缺失、高血脂、高血糖、心血管系统疾病、骨骼肌的分解代谢、骨质疏松、股骨头坏死、成骨分化抑制、消化道出血、皮质性白内障。
在一方面，本发明涉及式I所示化合物在制备用于缓解由地塞米松诱导的成骨细胞矿化结节形成阻抑的药物中的用途。
在一方面，本发明涉及式I所示化合物在制备用于调节Runx2表达的试剂中的用途，优选升高Runx2的表达，尤其是在糖皮质激素存在下促进Runx2表达。
在一方面，本发明涉及式I所示化合物在制备用于调节OPN蛋白表达的试剂中的用途，优选升高OPN蛋白表达，尤其是在糖皮质激素存在下促进OPN蛋白表达。
在一方面，本发明涉及式I所示化合物在制备用于调节ERK磷酸化的试剂中的用途，优选升高ERK的磷酸化水平，尤其是在糖皮质激素存在下升高ERK的磷酸化水平。
在一方面，本发明涉及治疗Runx2表达抑制相关疾病、OPN蛋白表达抑制相关疾病、ERK磷酸化抑制相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明式I所示化合物。
根据前述任一方面，所述疾病选自肥胖与库欣综合征、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能抑制、抑郁症、记忆缺失、高血脂、高血糖、心血管系统疾病、骨骼肌的分解代谢、骨质疏松、股骨头坏死、成骨分化抑制、消化道出血、皮质性白内障中的至少一种。
附图说明
图1：栀子苷对MC3T3-E1细胞增殖的影响。
图2：栀子苷对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响，图2A：细胞染色结果，图2B：定量分析结果。(**P<0.01vs OIM；##P<0.01vs DEX)；OIM：成骨诱导；DEX：地塞米松。
图3：栀子苷对MC3T3-E1细胞矿化的影响，图3A：细胞染色结果，图3B：定量分析结果。(**P<0.01vs OIM；##P<0.01vs DEX)；OIM：成骨诱导；DEX：地塞米松。
图4：栀子苷对MC3T3-E1细胞OPN、Runx2、Osx基因表达的影响，图4A：对Runx2 基因表达的影响，图4B：对Osx基因表达的影响，图4C：对OPN基因表达的影响。
(*P<0.05,**P<0.01vs OIM；#P<0.05,##P<0.01vs DEX)；OIM：成骨诱导；DEX：地塞米松。
图5：栀子苷对MC3T3-E1细胞OPN、Runx2、Osx蛋白表达的影响，图5A：蛋白质印迹结果，图5B：定量分析结果。(**P<0.01vs OIM；#P<0.05vs DEX)；OIM：成骨诱导； DEX：地塞米松。
图6：栀子苷对MC3T3-E1细胞ERK信号通路中ERK磷酸化的影响，图6A：蛋白质印迹结果，图6B：定量分析结果。(**P<0.01vs OIM；#P<0.05vs DEX)；OIM：成骨诱导；DEX：地塞米松。
具体实施方式
术语“药学上可接受的盐或酯”表示本发明式I化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐或酯，和碱加成盐。这些盐或酯可以在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备。特别是，可以通过独立使纯化的游离碱形式的化合物与适宜的有机或无机酸反应，和将如此形成的盐或酯分离，来制备酸加成盐或酯。示例性酸加成盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、naphthylate、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐(lactiobionate)、氨基磺酸盐、丙二酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、亚甲基-双-b-羟基萘甲酸盐、龙胆酸盐、异硫代硫酸盐、二对甲苯酰酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐月桂基磺酸盐(quinateslaurylsulphonate)等(参见例如，Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.，66：1-9(1977)和Remington′s PharmaceuticalSciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页，据此整体通过引用并入本文)。也可以通过独立进行使纯化的酸形式的化合物与适宜的有机或无机碱反应，和分离如此形成的盐，来制备碱加成盐。碱加成盐包括药学上可接受的金属盐和胺盐。适宜的金属盐包括钠、钾、钙、钡、锌、镁和铝盐。钠和钾盐为优选。适宜的无机碱加成盐是由金属碱制备的，所述金属碱包括氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁和氢氧化锌。适宜的胺碱加成盐是由胺制备的，所述胺具有足够的碱性以形成稳定的盐，并且优选包括由于其药用的低毒性和可接受性而在医药化学中常用的那些胺，所述胺的实例包括氨、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟基甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵、三乙胺、二苄胺、二苯羟甲胺、脱氢松香胺、N-乙基哌啶、苄胺、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性氨基酸例如赖氨酸和精氨酸、二环己基胺等。
本文所用的术语“药学上可接受的前药”表示可根据本发明使用的化合物的前药，以及，在可能的情况下，本发明化合物的两性离子形式，所述前药，在合理的医学判断范围内，适合用于与人和低级动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等，与合理的利益 /风险比率相称，并对预期的使用是有效的。术语“前药”表示迅速在体内转化，例如通过在血液中水解，产生上式母体化合物的化合物。可以通过体内代谢裂解而迅速转化的官能团，形成与本发明化合物的羧基反应的一类基团。所述官能团包括，但不限于，如烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、丁酰基等)、未取代的和取代的芳酰基(例如苯甲酰基和取代的苯甲酰基)、烷氧基羰基如乙氧基羰基)、三烷基甲硅烷基(例如三甲基和三乙基甲硅烷基)、与二羧酸形成的单酯(例如琥珀酰基)等这类的基团。由于本发明有用的化合物的可代谢裂解基团在体内容易被裂解，所以携带这样的基团的化合物可以作为前药。携带代谢可裂解基团的化合物具有可以表现出提高的生物利用度的优点，所述优点是由于存在代谢可裂解基团而给予母体化合物提高的溶解度和/或吸收率的结果。下列文献提供了前药的详尽论述：Design of Prodrugs， H.Bundgaard编辑，Elsevier(1985)；Methods in Enzymology，K.Widder等人编辑， Academic Press，42，第309-396(1985)；A Textbook of Drug Designand Development， Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard编辑，第5章；“Design andApplications of Prodrugs”第113-191页(1991)；Advanced Drug Delivery Reviews，H.Bundgard，8，第1-38页(1992)； Journal of Pharmaceutical Sciences，77：285(1988)；Nakeya等人，Chem.Pharm.Bull.， 32：692(1984)；Higuchi等人，“Pro-drugs as NovelDelivery Systems”，A.C.S.Symposium Series的第14卷，以及Bioreversible载体in DrugDesign，Edward B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association and PergamonPress(1987)，上述文献通过引用整体并入本文。
前药的实例包括但不限于，本发明化合物中的醇和胺官能团的乙酸酯(盐)、甲酸酯(盐) 和苯甲酸酯(盐)衍生物。
术语“治疗有效量”是指描述有效产生所需治疗效果的本发明化合物的量。这样的量通常依若干因素变化，而所述变化是在已知本文提供的描述的普通技术人员能够确定和计算的范围内。这些因素包括，但不限于：特定的个体及其年龄、体重、身高、一般身体状况和医疗经历，所使用的特定化合物，化合物配制于其中的载体，所选择的化合物的施用途径，以及被治疗的病症的性质和严重性。
术语“药物组合物”意指包含式(I)化合物以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或赋形剂，例如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。悬浮剂的实例包括乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶、或这些物质的混合物。通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等，能够确保预防微生物的作用。最好包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，能够使注射剂型延长吸收。适宜的载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括水、乙醇、多元醇、它们的适宜的混合物、植物油(例如橄榄油)、和注射有机酯例如油酸乙酯。赋形剂的实例包括乳糖、枸橼酸钠、碳酸钙、磷酸二钙。崩解剂的实例包括淀粉、藻酸和一些复合硅酸盐。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石以及高分子量聚乙二醇。
术语“药学上可接受”意指在合理的医疗判断范围内，适用于与人和低等动物细胞接触而没有过度的毒性、刺激性、变应性反应等，且与合理的益处/风险比相应。
术语“药学上可接受的剂型”意指本发明化合物的剂型，包括例如片剂、糖锭剂、散剂、酏剂、糖浆剂、液体制剂(包括混悬剂、喷雾剂、吸入片剂、锭剂、乳剂、溶液剂、颗粒剂、胶囊剂和栓剂)以及用于注射的液体制剂，包括脂质体制剂。一般可在Remington’sPharmaceutical Science，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版中发现配制技术和制剂。
本发明的化合物可以按照各种公知的方法制备，没有特别限定。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
实施例1 MC3T3-E1细胞增殖实验
1.1药物与试剂
MC3T3-E1细胞株(中国科学院细胞库)，α-MEM培养基(不含Vc)(美国GIBCO)，澳洲胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，地塞米松(Dexamethasone，Dex)(美国Sigma)，抗坏血酸(vitamin C，Vc)(美国Sigma)，β-甘油磷酸钠(美国Sigma)NBT/BCIP混合试剂(美国Sigma)，茜素红，CCK-8(Cell Counting Kit-8)(日本同仁)，碱性磷酸酶活性检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，无水乙醇，栀子苷(成都贝斯特试剂有限公司)。
1.2 MC3T3-E1细胞培养
使用含10％胎牛血清的α-MEM培养基(不含Vc)于37℃，5％CO2培养箱中培养MC3T3-E1细胞，每3d换液，细胞长至铺满瓶底约90％时，用0.25％胰酶消化，离心，收集细胞，进行以下的实验。
1.3 CCK-8检测细胞增殖
将消化后的细胞用α-MEM完全培养基制备成均匀的单细胞悬液，使细胞密度调整为 2500个/孔；取96孔板，每孔接种100μl细胞悬液，放入二氧化碳孵育箱中培养。分组处理：接种24h后，细胞贴壁，将细胞分组，分组如下：①α-MEM培养处理组(Control组)，②1μM栀子苷α-MEM培养处理组，③5μM栀子苷α-MEM培养处理组，④10μM栀子苷α-MEM培养处理组，⑤25μM栀子苷α-MEM培养处理组，⑥50μM栀子苷α-MEM培养处理组，⑦75μM栀子苷α-MEM培养处理组，⑧100μM栀子苷α-MEM培养处理组。于给药后72h，运用CCK-8法检测细胞增殖情况，加入100μl CCK-8工作液，放入孵育箱继续培养1.5h，到达孵育时间后，取出96孔细胞培养板，在酶标仪450nm波长处测量各孔的吸光度，比较各组之间OD(optical density)值。
结果如图1显示，1-100μM栀子苷对MC3T3-E1细胞增殖均没有抑制作用，说明 1-100μM栀子苷对MC3T3-E1细胞没有明显毒性。
实施例2细胞碱性磷酸酶染色以及活性检测
碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞早期分化的标志性糖蛋白，其活性与细胞成骨分化活性密切相关。成骨分化及功能成熟的早期阶段可作为评估骨形成及骨转换的指标之一。但超生理量的糖皮质激素的作用下，体外成骨分化过程中的碱性磷酸酶的活性会受到抑制并影响细胞的成骨分化。本实验中采用碱性磷酸酶染色和碱性磷酸酶活性定量检测，研究栀子苷对地塞米松所致的MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性抑制的影响。
细胞消化接种：取生长良好的MC3T3-E1，消化计数后，以2×104个/孔接种于24孔板，转至二氧化碳孵育箱中培养。分组如下：①OIM诱导液培养处理组，②DEX(1μmol/L)培养处理组+OIM诱导液培养处理组，③10μmol/L栀子苷+DEX(1μmol/L)+OIM诱导液培养处理组，④25μmol/L栀子苷+DEX(1μmol/L)+OIM诱导液培养处理组。
碱性磷酸酶染色：给药处理5天后，进行碱性磷酸酶染色活性检测，吸去原培养基，每孔加入PBS洗涤两次，70％乙醇固定15分钟，每孔加入碱性磷酸酶缓冲液5分钟，重复两次；每孔加入300μl NBT/BCIP染色液；37℃下避光孵育15～30min，或至明显蓝色颗粒生成；弃去染色液，每孔加入1ml蒸馏水终止反应，重复两次，显微镜下观察并拍照。使用碱性磷酸酶活性试剂盒检测样品中的碱性磷酸酶活性，在405nm测定吸光度，根据酶活性定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性。
本实验发现浓度为1μM地塞米松处理后，与诱导组相比，MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶的活性明显下降，当加入不同浓度的栀子苷后，碱性磷酸酶的活性得到一定程度地恢复，结果表明栀子苷在一定程度上能缓解因地塞米松所导致的ALP活性抑制。结果如图2显示，地塞米松可抑制MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性，栀子苷可对抗地塞米松对MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活抑制作用。
实施例3矿化结节染色以及定量检测
矿化结节在成骨分化晚期出现，是成骨细胞分化过程中产生的羟基磷灰石晶体和无定型磷酸钙分泌至细胞外基质中，与骨钙素、骨桥蛋白、胶原等结合形成羟基磷灰石结晶，是成骨分化晚期指标之一。因此，本实验采用茜素红染色及钙结节定量来研究栀子苷对地塞米松抑制MC3T3-E1细胞矿化的影响。
细胞消化接种：取生长良好的MC3T3-E1细胞，消化计数后，以5×104个/孔接种于24 孔板，分组同实施例2，转至二氧化碳孵育箱中培养，给药处理14天后，运用茜素红染色法观察细胞的矿化。每孔PBS洗涤细胞两次，每孔加入70％乙醇，固定15min，吸去固定液，每孔加入0.5％茜素红溶液，37℃避光孵育15～30min，或至桔黄色出现，晾干，显微镜下观察并拍照。钙结节染色定量：将上述染色后的细胞，每孔加入10％氯化十六烷基吡啶溶液，在室温下孵育30min，使结晶物充分溶解后在酶标仪562nm波长处测量各孔的吸光度，比较各组之间OD值。
结果如图3显示，1μM地塞米松可抑制MC3T3-E1细胞矿化，当加入不同浓度的栀子苷后，MC3T3-E1细胞的矿化程度得到一定程度的恢复，表明栀子苷在一定程度上能很好的缓解地塞米松抑制MC3T3-E1细胞矿化形成减少情况。
实施例4栀子苷对MC3T3-E1细胞OPN、Runx2、Osx基因表达以及ERK磷酸化的影响
实时定量PCR检测
MC3T3-E1细胞消化后以105个/孔接种于6孔板，次日换液，分组同实施例2。于第3天按以Trizal提取细胞总RNA，按照cDNA合成试剂盒将所得总RNA反转录为cDNA。 cDNA，使用实时荧光定量PCR试剂盒和7500 Real Time PCR仪进行RT-PCR反应，检测成骨不同阶段的关键指标Runx2、Osx和OPN的mRNA表达情况。目的基因引物序列如下：Runx2上游“5’-gaatgcactacccagccac-3’”，下游“5’-tggcaggtacgtgtggtag-3’”；Osx上游“5’-aggaggcacaaagaagccatac-3’”，下游“5’-agggaagggtgggtagtcatt-3’”；OPN上游“5’-tccaaagccagcctggaac-3’”，下游“5’-tgacctcagaagatgaactc-3’”内参β-actin上游“5’-gccaaccgtgaaaagatg-3’”，下游“5’-accagaggcatacagggacag-3’”。预变性：95℃，30s，扩增：95℃，5s，60℃，34s，40个循环进行基因扩增。以β-actin为内参，应用2-△△Ct 相对定量法，检测各组基因mRNA的相对表达量。
蛋白质印迹法检测
MC3T3-E1细胞消化后以105个/孔接种于6孔板，次日换液，分组同实施例2。
诱导分化5d后用RIPA法裂解细胞，提取总蛋白质。BCA法测定蛋白浓度，蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)检测细胞中的目标蛋白质含量。样品加入上样缓冲液后95℃加热5min变性。每孔上样30μL总蛋白进行SDS-PAGE。电泳后半干转蛋白至裁剪好的电转膜上，电转完毕后，将电转膜置于5％的脱脂奶粉或者2％牛血清白蛋白(BSA)封闭， 37℃2h。一抗蛋白分别是Runx2(Cell Signal Technology,1:1000)，Osx(Cell Signal Technology,1:1000)，OPN(Cell Signal Technology,1:1000)，ERK(Cell Signal Technology,1:1000),p-ERK(Cell Signal Technology,1:1000),β-actin(Cell Signal Technology,1:1000)4℃环境孵育过夜，室温孵育对应的二抗2h，ECL发光试剂盒进行显影。
统计学分析
采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析，组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD多重检验法。P<0.05表示差异有统计学意义。
结果如图4所示，地塞米松可下调MC3T3-E1细胞OPN、Runx2、Osx基因表达，栀子苷可对抗地塞米松对MC3T3-E1细胞OPN、Runx2、Osx基因表达抑制作用。
结果如图5显示，地塞米松可下调MC3T3-E1细胞OPN、Runx2、Osx蛋白表达，栀子苷可对抗地塞米松对MC3T3-E1细胞OPN、Runx2、Osx蛋白表达抑制作用。
结果如图6所示，地塞米松可抑制MC3T3-E1细胞ERK磷酸化，栀子苷可对抗地塞米松对MC3T3-E1细胞ERK磷酸化抑制作用。

Claims (10)

1.式I所示化合物或其药学上可接受的盐，或酯，或前药在制备缓解糖皮质激素副作用方面的药物中的用途：
2.根据权利要求1的用途，所述缓解糖皮质激素副作用通过调节选自Runx2蛋白、OPN蛋白、和/或Osx蛋白的蛋白表达或调节ERK磷酸化实现，优选地，通过促进Runx2蛋白、OPN蛋白、和/或Osx蛋白表达或升高ERK的磷酸化水平实现。
3.根据权利要求1或2的用途，所述糖皮质激素副作用选自：肥胖与库欣综合征、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能抑制、抑郁症、记忆缺失、高血脂、高血糖、心血管系统疾病、骨骼肌的分解代谢、骨质疏松、股骨头坏死、成骨分化抑制、消化道出血、皮质性白内障中的至少一种，优选骨骼肌的分解代谢、骨质疏松、股骨头坏死、成骨分化抑制中的至少一种，更优选骨质疏松或成骨分化抑制。
4.式I所示化合物在制备用于治疗糖皮质激素造成的Runx2表达抑制相关疾病，或OPN表达抑制相关疾病，或Osx表达抑制相关疾病，或ERK磷酸化抑制相关疾病，或成骨细胞矿化结节形成阻抑的药物中的用途。
5.根据前述权利要求任一项的用途，所述糖皮质激素选自泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松，优选泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松，最优选地塞米松。
6.根据前述权利要求任一项的用途，所述疾病选自肥胖与库欣综合征、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能抑制、抑郁症、记忆缺失、高血脂、高血糖、心血管系统疾病、骨骼肌的分解代谢、骨质疏松、股骨头坏死、成骨分化抑制、消化道出血、皮质性白内障中的至少一种。
7.式I所示化合物在制备用于调节Runx2表达的试剂中的用途。
8.式I所示化合物在制备用于调节OPN蛋白表达的试剂中的用途。
9.式I所示化合物在制备用于调节Osx蛋白表达的试剂中的用途。
10.式I所示化合物在制备用于调节ERK磷酸化的试剂中的用途。
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